מחקר זה נתמך על ידי נבחרת מוסדות של בריאות לנטרל תוכנית הסוכנויות הסכם # AOD13015-001. ברצוננו להודות סטפני פרוברג והרסט פיטר על המאמצים שלהם והמומחיות הפקות וידאו.

<ol>
	<li>Randleman, B., Hampton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drugs, Diseases and Procedures. , (2011).</li><li>Fish, R., Davidson, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+ocular+thermal+and+chemical+injuries,+including+amniotic+membrane+therapy.">Management of ocular thermal and chemical injuries, including amniotic membrane therapy.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 21 (4), 317-321 (2010).</li><li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+treatment+strategies+for+hydrofluoric+acid+burns:+current+status+and+future+prospects.">A review of treatment strategies for hydrofluoric acid burns: current status and future prospects.</a> Burns. 40 (8), 1447-1457 (2014).</li><li>Gaytan, B. D., Vulpe, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+toxicology:+tools+to+advance+the+future+of+toxicity+testing.">Functional toxicology: tools to advance the future of toxicity testing.</a> Frontiers in Genetics. 5, 110 (2014).</li><li>North, M., Vulpe, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+toxicogenomics:+mechanism-centered+toxicology.">Functional toxicogenomics: mechanism-centered toxicology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 4796-4813 (2010).</li><li>McManus, M. T., Sharp, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+mammals+by+small+interfering+RNAs.">Gene silencing in mammals by small interfering RNAs.</a> Nature Reviews Genetics. 3 (10), 737-747 (2002).</li><li>Bassik, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+mammalian+genetic+interaction+map+reveals+pathways+underlying+ricin+susceptibility.">A systematic mammalian genetic interaction map reveals pathways underlying ricin susceptibility.</a> Cell. 152 (4), 909-922 (2013).</li><li>Solaimani, P., Damoiseaux, R., Hankinson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+high-throughput+screen+identifies+proteins+necessary+for+the+AHR-dependent+induction+of+CYP1A1+by+2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin.">Genome-wide RNAi high-throughput screen identifies proteins necessary for the AHR-dependent induction of CYP1A1 by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin.</a> Toxicological Sciences. 136 (1), 107-119 (2013).</li><li>Cox, J. A., Gooding, R., Kolakowski, J. E., Whitmire, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemical Terrorism Risk Assessment; CSAC 12-006. , (2012).</li><li>Zang, R., Li, D., Tang, I., Wang, J., Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-Based+Assays+in+High-Throughput+Screening+for+Drug+Discovery.">Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery.</a> International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. 1, 31-51 (2012).</li><li>Ray, R., Hauck, S., Kramer, R., Benton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+convenient+fluorometric+method+to+study+sulfur+mustard-induced+apoptosis+in+human+epidermal+keratinocytes+monolayer+microplate+culture.">A convenient fluorometric method to study sulfur mustard-induced apoptosis in human epidermal keratinocytes monolayer microplate culture.</a> Drug and Chemical Toxicology. 28 (1), 105-116 (2005).</li><li>Ruff, A. L., Dillman, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sulfur+mustard+induced+cytokine+production+and+cell+death:+investigating+the+potential+roles+of+the+p38,+p53,+and+NF-kappaB+signaling+pathways+with+RNA+interference.">Sulfur mustard induced cytokine production and cell death: investigating the potential roles of the p38, p53, and NF-kappaB signaling pathways with RNA interference.</a> Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 24 (3), 155-164 (2010).</li><li>Smith, W. J., Gross, C. L., Chan, P., Meier, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+human+epidermal+keratinocytes+in+culture+as+a+model+for+studying+the+biochemical+mechanisms+of+sulfur+mustard+toxicity.">The use of human epidermal keratinocytes in culture as a model for studying the biochemical mechanisms of sulfur mustard toxicity.</a> Cell Biology and Toxicology. 6 (3), 285-291 (1990).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Toxnet. , (2016).</li><li>Bancroft, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Medical Department of the United States Army in the World War. 14, (1926).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chloropicrin Risk Characterization Document. , (2012).</li><li>Aigueperse, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fluorine Compounds, Inorganic. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry. , (2000).</li><li>Sotozono, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second+Injury+in+the+Cornea:+The+Role+of+Inflammatory+Cytokines+in+Corneal+Damage+and+Repair.">Second Injury in the Cornea: The Role of Inflammatory Cytokines in Corneal Damage and Repair.</a> Cornea. 19 (6), S155-S159 (2000).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidelines and Recommendations for Dharmacon siRNA Libraries. , (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Lipofectamine RNAiMAX Reagent. , (2017).</li><li>Denizot, F., Lang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+colorimetric+assay+for+cell+growth+and+survival.+Modifications+to+the+tetrazolium+dye+procedure+giving+improved+sensitivity+and+reliability.">Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability.</a> Journal of Immunological Methods. 89 (2), 271-277 (1986).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit, 5,000 Assay Points. , (2016).</li><li>Araki-Sasaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+SV40-immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+its+characterization.">An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Ruff, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+mouse+model+for+sulfur+mustard-induced+ocular+injury+and+long-term+clinical+analysis+of+injury+progression.">Development of a mouse model for sulfur mustard-induced ocular injury and long-term clinical analysis of injury progression.</a> Cutaneous and Ocular Toxicology. 32 (2), 140-149 (2013).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GeneTitan MC Instrument North America/Japan (110V). , (2018).</li><li>Zhang, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pair+of+new+statistical+parameters+for+quality+control+in+RNA+interference+high-throughput+screening+assays.">A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays.</a> Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).</li><li>He, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Sodium+Fluoride+on+the+Proliferation+and+Gene+Differential+Expression+in+Human+RPMI8226+Cells.">Effect of Sodium Fluoride on the Proliferation and Gene Differential Expression in Human RPMI8226 Cells.</a> Biological Trace Element Research. 167 (1), 11-17 (2015).</li><li>Tabuchi, Y., Yunoki, T., Hoshi, N., Suzuki, N., Kondo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+gene+networks+involved+in+sodium+fluoride-elicited+cell+death+accompanying+endoplasmic+reticulum+stress+in+oral+epithelial+cells.">Genes and gene networks involved in sodium fluoride-elicited cell death accompanying endoplasmic reticulum stress in oral epithelial cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 15 (5), 8959-8978 (2014).</li><li>Pesonen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloropicrin-induced+toxic+responses+in+human+lung+epithelial+cells.">Chloropicrin-induced toxic responses in human lung epithelial cells.</a> Toxicology Letters. 226 (2), 236-244 (2014).</li><li>Wilhelm, S. N., Shepler, K., Lawrence, L. J., Lee, H., Seiber, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fumigants: Environmental Fate, Exposure, and Analysis. 652, (1997).</li><li>Adamek, E., Pawlowska-Goral, K., Bober, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+effects+of+fluoride+ions+on+enzyme+activity.">In vitro and in vivo effects of fluoride ions on enzyme activity.</a> Annales Academiae Medicae Stetinensis. 51 (2), 69-85 (2005).</li><li>Heard, K., Hill, R. E., Cairns, C. B., Dart, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+neutralizes+fluoride+bioavailability+in+a+lethal+model+of+fluoride+poisoning.">Calcium neutralizes fluoride bioavailability in a lethal model of fluoride poisoning.</a> Journal of Toxicology: Clinical Toxicology. 39 (4), 349-353 (2001).</li><li>Sparks, S. E., Quistad, G. B., Casida, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloropicrin:+reactions+with+biological+thiols+and+metabolism+in+mice.">Chloropicrin: reactions with biological thiols and metabolism in mice.</a> Chemical Research in Toxicology. 10 (9), 1001-1007 (1997).</li><li>Sparks, S. E., Quistad, G. B., Li, W., Casida, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloropicrin+dechlorination+in+relation+to+toxic+action.">Chloropicrin dechlorination in relation to toxic action.</a> Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 14 (1), 26-32 (2000).</li><li>Byron, K. A., Varigos, G., Wootton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrocortisone+inhibition+of+human+interleukin-4.">Hydrocortisone inhibition of human interleukin-4.</a> Immunology. 77 (4), 624-626 (1992).</li><li>van der Poll, T., Lowry, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-induced+interleukin+8+production+by+human+whole+blood+is+enhanced+by+epinephrine+and+inhibited+by+hydrocortisone.">Lipopolysaccharide-induced interleukin 8 production by human whole blood is enhanced by epinephrine and inhibited by hydrocortisone.</a> Infection and Immunity. 65 (6), 2378-2381 (1997).</li><li>Solomon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Doxycycline+inhibition+of+interleukin-1+in+the+corneal+epithelium.">Doxycycline inhibition of interleukin-1 in the corneal epithelium.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 41 (9), 2544-2557 (2000).</li><li>Mishra, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+oxidative+stress-induced+epigenetic+modifications+in+pancreatic+epithelial+cells.">Mitochondrial oxidative stress-induced epigenetic modifications in pancreatic epithelial cells.</a> International Journal of Toxicology. 33 (2), 116-129 (2014).</li><li>Stockholm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+of+phenotypic+heterogeneity+in+a+clonal+cell+population+in+vitro.">The origin of phenotypic heterogeneity in a clonal cell population in vitro.</a> PLoS One. 2 (4), e394 (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ATCC Animal Cell Culture Guide. , (2014).</li><li>Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+technique+for+reducing+edge+effect+in+cell-based+assays.">A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).</li><li>Mpindi, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+normalization+methods+on+high-throughput+screening+data+with+high+hit+rates+and+drug+testing+with+dose-response+data.">Impact of normalization methods on high-throughput screening data with high hit rates and drug testing with dose-response data.</a> Bioinformatics. 31 (23), 3815-3821 (2015).</li><li>Zhang, X. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illustration+of+SSMD,+z+score,+SSMD*,+z*+score,+and+t+statistic+for+hit+selection+in+RNAi+high-throughput+screens.">Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens.</a> Journal of Biomolecular Screening. 16 (7), 775-785 (2011).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.
כתב ויתור: הדיעות במאמר זה הם אלה של והמלצה ולא לשקף את המדיניות הרשמית של המחלקה של הצבא, ההגנה או ממשלת ארה ב. מחקר זה נתמך על ידי הסכם הסוכנויות בין NIH/NIAID את USAMRICD, באופן חלקי על ידי פעילות התוכנית השתתפות מחקר לתארים מתקדמים-ארה ב צבא רפואי מחקר מכון כימי ההגנה מנוהל על ידי האלון רכס מכון המדע והחינוך באמצעות הסכם הסוכנויות בין משרד האנרגיה האמריקני USAMRMC.

במסמך זה אנו מתארים תוצאות ושיטות שלנו על הפיתוח של תפוקה גבוהה קרנית תא אפיתל הקרנת מודל המחקר של פציעות HF ו- CP. אנו מציגים גם את התוצאות מהמסך הראשי siRNA HF להיפצע. היו אתגרים רבים לפיתוח מודלים HTS לצורך המחקר של פציעות טיק. שיטות שיכולנו למצוא בספרות הקשורים בחקר HF, HFA או CP במודלים התרבות התא היו מועיל. רוב במבחנה מחקרים על יון הפלואוריד לערב תאים אוראלי, מנוצל נתרן פלואוריד ולא HF או HFA (עבור כמה דוגמאות, ראה28,29). כמה המתודולוגיה על במבחנה החשיפה של תאי אפיתל כנגד ברונכיט CP שפורסם על-ידי. Pesonen et al. 30. בסופו של דבר, מצאנו שיטות ספציפיות אין בספרות הקשורים בחקר HTS HF, HFA או CP, הרוב המכריע של אתגרים ומשתנים הקשורים בחקר אלה חשיפה לרעלים בפיתוח HTS נדרש. תשומת לב מיוחדת הוקדשה להשגת רמה גבוהה של עקביות חשיפה לאורך זמן, לוחות הקרנה רבים הדרושים למחקר HTS מוצלחת.
סוג אחד של אתגר נתקלה היה קשור היישום של toxicant למערכות התרבות תאים. כמה חשיפה לרעלים הם תגובתי עם או לא יציב בפתרונות מימית. חשיפה לרעלים שבחרנו למחקר הם לא נחשבים אלה בעיות יציבות. המחקר החקלאי חוקרים photohydrolysis של CP הראו שיש פתרון 0.001 M של CP במים half-life של h 31.1 כאשר נחשף למקור אור קסנון (אור השמש בעוצמה של יום מעונן) של לאקס 1100 במשך 10 ימים, 12 שעות לכל יום31. אין מדיד הידרוליזה היה מעל 10 יום באותה תקופה כאשר הפתרון היה מאוחסן בחושך. יונים פרוטון, פלואוריד של HFA יציבים בבירור במים. עם זאת, ישנם שיקולים נוספים יציבות ביחס דילולים toxicant עשוי מדיום התרבות תאים. מצאנו שהיה שינוי הראשונית של cytotoxicity במידה מסוימת בעת חשיפה לרעלים היו קודם מדולל במדיום התרבות התא זה מייצבת ואז אחרי תקופה קצרה של זמן. אנו מאמינים כי זה עקב כריכת toxicant או למעקב complexing עם המרכיבים במדיום. תא בינוני מכיל סידן, מגנזיום, חלבון, וכו ידועים לקיים אינטראקציה עם ה32,יון הפלואוריד33. CP נודעת תגובות חמצון עם תיולים ביולוגי, אך זה עלול גם לאגד את ה-DNA, חלבונים ו34,אחרים נוקלאופילים עם35. לאחר תגובות ואינטראקציות אלו יש להשלים או להגיע שיווי משקל, מייצבת כמות toxicant זמין ומייצב ובכך cytotoxicity לכאורה. בתחילה חרשנו את השימוש דילולים תמיסת מלח ומים של חשיפה לרעלים עבור מניות עבודה המשמש עבור חשיפות כדי למנוע את toxicant אינטראקציות עם המרכיבים בינוני ב דילולים עבודה. השימוש של תמיסת מלח ישמר גם הרכיב חומצה הפגיעה HFA עבור חשיפות שבוצעה על-ידי המרת בינוני. מצאנו כי התגובות מוות תא חשיפה לרעלים, ומים מלוחים דילולים היו משתנה יותר מאשר שיטת תא בינוני תרבות דילולים עם exchange בינונית (נתונים לא מוצג). לגבי שיטת החשיפה ספייק עם HFA, ההשתנות יכול להיות בגלל חוסר עקביות הדקר פיזור טוב מובילים אל המטרות סלולר מתחרה עם המרכיבים בינונית עבור יון הפלואוריד זמינים. הסיבות השונות ב- HFA חשיפות על ידי חילופי בינוני עם דילולים מלוחים HFA אינם ברורים לחלוטין. בכל מקרה, שיטות חשיפה באמצעות דילולים מלוחים עבור HFA היו נטושים, לא בחנו את CP. הרעילות של שלנו דילולים HFA בינוני כנראה מקרוב מחקה מחקרים באמצעות סודיום פלואוריד כי המדיום תא אנשים רגילים פרוטונים חינם בדילולים HFA שלנו.
אתגרים נוספים נתקלנו שהיו קשורים עידון של הדגמים התרבות תאים לשימוש ב- HTS. זה הכרחי לשנות את המרכיבים בינוני התרבות התא עבור תאים ניסויים, במיוחד הידרוקורטיזון ואנטיביוטיקה. אנחנו מנוצל רמה נמוכה של הידרוקורטיזון (0.5 µg/mL) במהלך לימודי חשיפה כדי לדכא את הדקר ומדי פעם בייצור ציטוקינים אצל תמימה SV40-HCEC. זו כמות נמוכה של הידרוקורטיזון לא השפיעה לרעה את תגובות התאים toxicant והיה מתחת רמות לרוב נעשה שימוש כדי לדכא את ייצור ציטוקינים על ידי תאים בתרבית בתגובה ממריץ36,37. הסיבות בדיוק למה תאים נאיביים SV40-HCEC מדי פעם לייצר עודפי ציטוקינים לא ידועים, אך זה אפשרי כי התאים רגישים variably גורמי קלים להתרחש במהלך תא passaging, ציפוי. מעבדות רבות כוללות באופן שגרתי אנטיביוטיקה תא תרבות תחזוקה בינוני, אבל קצת אנטיביוטיקה, tetracyclines בפרט, הוכחו שהפגינו השפעות אנטי דלקתיות על תאים בתרבית תאים אפיתל הקרנית38כולל. באופן כללי, המעבדה שלנו מונע את השימוש באנטיביוטיקה במידת האפשר מאז אלה יכול באופן פוטנציאלי וחיסול מחקרים. אנחנו גם חקר את הסחף פנוטיפי על מעברים מרובים של התאים שלנו בתרבות. זה נפוץ מונצחים תאים לעבור סחיפה גנטית ו/או פנוטיפי על מעברים מרובים, אם לא מתוחזק בשלב מעריכית, אם מותר להגיע confluency, או אם נחשפים מסוימים לחצים סביבתיים39,40 ,41. לכן, זה קריטי במהלך מסך תפוקה גבוהה כי שורות תאים מתוחזקים כראוי וכי המסך הושלמה באמצעות מספרים המעבר תא לשמור על התגובה פנוטיפי ידוע. אפקטי קצוות צלחת רב טוב הוא התופעה כי התאים גדלו ב הבארות המתחם החיצוני של צלחות רב טוב לעיתים קרובות אינם מגיבים אותו הדבר או עם עקביות אותו כתאי גדלו ב פנים בארות42. ישנם תרגילים סטטיסטי, כגון פולנית החציוני, זה יכול להיות מנוצל כדי למזער את אפקטי קצוות על ערכת הנתונים43. עם זאת, אין שום תרגיל סטטיסטי כי יכול לחסל את אפקטי קצוות יעד מסוים או פקד אם זה נבדק תמיד בבאר קצה, ומשתנה הפריסה צלחת בין משכפל לעבור מטרות או פקדים ליד קצה בארות אינה לוגיסטית מעשי או העלות האפקטיבית. זה לדעתנו זה ההחלטה לכלול את השימוש קצה בארות מבוססת תא מבחני HTS צריך להיעשות בזהירות. מצאנו את זה צורך לבטל את השימוש בתאי צמח בבארות קצה עבור פקדים, מטרות.
HTS תא דגם וחשיפה המתודולוגיה שלנו עבור במבחנה HF פציעה שימש כדי להשלים בהצלחה את המסך siRNA העיקרי של מטרות 3120. SSMD שימש לבחירה פגע כי הוצע במיוחד כדי למדוד את סדר הגודל של ההבדל בין פקד של siRNA27. התוצאות שלנו עבור תא הכדאיות להראות שהיה הקשר הליניארי העלילה הכפולה-פנס בין SSMD לבין קיפול-שינוי עבור כמעט כל המטרות. מסיבה זו, השתמשנו את קריטריון יחיד של SSMD עבור מבחר כניסות עבור נקודת קצה זו. הנתונים IL-8 שונה בכך כמה מטרות היו תופעות חלש אך עקבי בעוד אחרים הראו אפקטים חזקים אבל לא עקבי. לכן, השתמשנו קיפול-שינוי והן SSMD עבור קריטריוני הבחירה פגע עבור נקודת קצה זו. הערכים SSMD פגע הבחירה עבור שניהם הכדאיות התא והוא IL-8 נתונים נבחרו בגלל המכנסונים בין 1 ו- 1.645 (או-1-1.65) להשיג גילוי שווא נמוכה של אי-גילוי המחירים44. היו כמה מטרות שהיו להיטים ב תא הכדאיות והן נתונים IL-8. במקרים אלה, ניתנה העדפה עבור הכללה בספריה deconvolution מטרות אלה זה המופעל ההשפעות שלהם באותו כיוון של שיפור הבריאות הכללית (הכדאיות משופר ו- IL-8 ירידה) או בהחרפת פציעה (גדל מוות של תאים, מוגבר IL-8). בסך הכל, בחרנו סך של 250 מטרות בין הכדאיות תא IL-8 נקודות קצה כדי להפוך את הספרייה deconvolution HF פציעה. המסך הראשי על הפגיעה במבחנה CP מתבצעת.
לסיכום, פיתחנו חשיפה ותרבות תנאים מתאימים לצורך המחקר HTS לפגיעה עינית HF ו CP. מספר משתנים תנאי חשיפה והתרבות היו מעודן, אופטימיזציה, ואומת הדגמים היו להיות מתאים ללימודי HTS מאת Z' גורם ניתוח. יש לנו עוד הוכחה השירות של מודלים אלה על-ידי השלמת המסך הראשי של ספריית siRNA במודל HF. ישנם הרבה פציעות, מחלות של לא או עניין מיוחד התרופות או תעשיית הביוטכנולוגיה, פציעה toxicant מאת CP ו- HF כללו ולאחר הופעתו של רובוטיקה benchtop מקלה על המחקר HTS של פציעות ומחלות במעבדה כמעט כל . נתוני גנומית תפוקה גבוהה ערכות יכול מאוד לתרום להבנת התפקידים גנים ספציפיים לשחק מפציעה או מחלה שיכולה לסייע להתמקד ביעילות רבה יותר בצע על מחקרים במבחנה או ויוו .

Toxicant-induced חבלה עינית היא מקרה חירום אמיתי עינית כימיקלים יש פוטנציאל לגרום נזק לרקמות משמעותי במהירות. למרבה הצער, טיפולים toxicant-induced פציעה הקרנית רק תומכות באופן כללי כפי הרפוי ספציפי לא קיים כדי לטפל בפציעות אלה. אסטרטגיית הטיפול הנוכחי הוא לא ספציפית וכולל בעיקר אקטואלי טיפולים רפואיים כגון חומרי סיכה, אנטיביוטיקה, ואחריו cycloplegics דלקתיות (למשל, סטרואידים) פעם הקרנית יש מחדש epithelialized1 ,2. למרות האפשרויות הטובות ביותר הנוכחי טיפולית זמינה, הפרוגנוזה לטווח ארוך היא ירודה עקב ערפול הקרנית מתקדמת ו-2,כורוידאלית3.
מודלים בעלי חיים באופן מסורתי שימש לחקור רעילה ולהבין מנגנונים של פציעה. עם זאת, מחקרים שנעשו בבעלי חיים הם זמן רב ויקר. ישנם גם המאמצים לצמצום הניסויים בחיות. לדוגמה, להגיע חקיקה (EC 1907/2006) באיחוד האירופי כולל מגוון הוראות שנועדו להפחית את הניסויים בחיות. התנאים כוללים דרישה לחברות לשתף את הנתונים כדי למנוע חיות בדיקות וקבלת אישור מהסוכנות הכימיקלים האירופי לפני ביצוע בדיקות המוצע על בעלי חיים. לפי קביעותיה של יד, ניסויים בבעלי חיים צריך להיות המוצא האחרון. יש גם אירופה קוסמטיקה תקנה (EC 1223/2009) בהדרגה בדיקה של קוסמטיקה בבעלי חיים. כאשר נערכים מחקרים שנעשו בבעלי חיים, הם מונחים על ידי העקרונות של 3Rs (עידון, צמצום, והחלפת), המספקות מסגרת עבור ביצוע מחקר בבעלי חיים אנושית יותר, להפחית את מספר בעלי החיים שבהם משתמשים ושימוש חלופות לניסויים בבעלי חיים במידת האפשר. מסיבות אלו, בתחום של הרעלים יש ביקשו לאמץ מבחני במבחנה יכולה לספק תובנות המנגנונים המולקולריים של רעילות, יכולה להיעשות תפוקה גבוהה4. זה גישה פונקציונלית הרעלים שבו חשיפה לרעלים מוגדרים על-ידי הפונקציה שלהם במקום אך ורק הכימיה שלהם. לקחו צעד נוסף, פונקציונלי toxicogenomics מבקשים להבין את תפקידים גנים ספציפיים לשחק את ההשפעות של חשיפה לרעלים5. עם היישום של טכנולוגיה siRNA, מסכי לחקור את פונקציית ג'ין מולקולרית, תאית התגובות חשיפה לרעלים יכול להיעשות על תפוקה גבוהה. siRNA הם כפול מולקולות RNA נטושים המהווים 19-25 נוקלאוטידים ארוך זה את היתרון של ג'ין תעתיק פוסט נוכח תאים בתרבית של כל6שתיקה מסלול. אלה הם לאכסון גרם, שנועדו למטרה גנים ספציפיים. כאשר הציג לתוך תא, siRNA מעובד, גדיל אחד, סטרנד מדריך, הוא נטען לתוך המתחם שתיקה RNA-induced (RISC). SiRNA מנחה את RISC לאזור משלימים ב מולקולת mRNA, RISC מבזה את ה-mRNA. התוצאה היא הפחתת ביטוי גנים ספציפיים. ואז ניתן יהיה ללמוד וכתוצאה מכך הפחתת ביטוי גנים ספציפיים בתאים חשוף toxicant כדי לברר את הפונקציה של הגן הזה התגובה התאית toxicant. גישה כזו שימש להבין עוד יותר את המנגנונים של רגישות ריצין ומעגל תלויי-אמפר לשעה של7,CYP1A18.
הרשימה הערכת הסיכון טרור כימי (CTRA), את הרישומים כימיקלים תעשייתיים רעילים (טיק) יש מפורטות כימיקלים בחירה המבוססת על שלהם רעילות ופוטנציאל להשתחרר במהלך טרור, לוחמה או אירוע תאונה תעשייתית9. אנחנו הם מיישמים תפוקה גבוהה של siRNA ההקרנה (HTS) toxicogenomic גישת המחקר של CTRA רשימה חשיפה לרעלים, אשר זוהו להיות בסיכון גבוה של שימוש באירוע טרור. טוקסיקולוגיה מסורתי החותר להבין את ההשפעות השליליות שיש כימיקלים על היצורים החיים; עם זאת, יש לנו שאיפה נוספת להבין את המנגנונים של פגיעה לצורך הסברה הפיתוח של הרפוי, גישות טיפוליות, וייתכן, כדי לגלות את מולקולות אשר ניתן לפלח לפיתוח טיפולית. את המאמץ הזה במובנים מסוימים עשויים להיחשב מקביל לשימוש של ההקרנה siRNA תפוקה גבוהה והתא המבוסס על מבחני תהליך הגילוי סמים10. ההבדל גדול יהיה שגילוי סמים בדרך כלל מחפש מטרה יחידה טיפולית גילוי ואילו בגישה שלנו זה במידת מה לא סביר שיהיה שם יעד יחיד עם ערך טיפולי רב לטיפול של חשיפה toxicant. אנו צופים כי כל פרדיגמה טיפול יעיל לחשיפה toxicant ידרוש גישה רב-תחומית כדי להשיג ערך טיפולי רב, toxicogenomic נתונים חיוני יכול לעדכן את הפרדיגמה של טיפול יעיל.
Benchtop אוטומציה מביא תפוקה גבוהה מתודולוגיה מעבדות בחוץ תעשיות פרמצבטיות או ביוטכנולוגיה. מחקרים במבחנה במכון שלנו היו מבחני מסורתי אשר תפוקה נמוכה11,12,13. בשנים האחרונות, המעבדה שלנו עברה לקביעת השימוש benchtop רובוטיקה לבצע סינון siRNA תפוקה גבוהה. במסמך זה, אנו מציגים את העידון של התא עינית מודלים ופיתוח של במבחנה שיטות חשיפה מימן פלואוריד (HF) ו chloropicrin (CP) מתאימה להקרנה siRNA תפוקה גבוהה. המטרה שלנו היא לזהות מולקולות המסדירים הסלולר פגיעה בתגובה חשיפה לרעלים אלו. המטרות של הספרייה siRNA בחרנו כוללים G-חלבון בשילוב קולטנים חלבונים kinases, פרוטאזות, phosphatases, תעלות יונים, מטרות נוספות שעשויות להיות druggable. HF ו- CP נבחרו למחקר נצליב CTRA רשימת סוכנים עם הדיווחים ToxNet של תאונות תעשייתיות כדי למצוא את אלה שמציגים הסיכון הגדול ביותר לפגיעה עינית באמצעות אדים חשיפה9,14. CP (כתיב כימי Cl3מפקדת2, מספר CAS 76-06-2) שימש במקור גז מדמיע ב מלחמת העולם הראשונה15. הוא משמש כיום וגם fumigant החקלאי של פונקציות כמו nematicide ', ' פטריות, חרקים16. מימן פלואוריד (HF) משמש בתהליכי כולל אלקילציה בתי זיקוק לנפט, fluorination אלקטרוכימי של תרכובות אורגניות17. HF (נוסחת הכימי HF, מספר CAS 62778-11-4) הוא גז אבל בצורתו מימית הוא חומצה הידרופלואורית (HFA, CAS מספר 7664-39-3). לכן, אנחנו נבחר להשתמש HFA בתא שלנו בתוך מודלים חשיפה. SV40 גדול T אנטיגן מונצחים תאי אפיתל הקרנית אדם קו ש-SV40-HCEC נבחר למחקר. תא הכדאיות ו- the marker דלקתיות IL-8 נבחרו כמו נקודות הקצה כי מטרות המעורבים פציעה הסלולר אמורה להשתקף בשעת המוות התא ואת התגובה דלקתיות. באופן ספציפי, אם המטרה לשחק תפקיד מגן חשיפה toxicant, מוות של תאים ו/או ייצור ציטוקינים דלקתיים צריך להגדיל כאשר הביטוי היעד מעוכבת על ידי siRNA. ההפך יהיה נכון לגבי מטרות כי תפקיד שלילי. בנוסף, דלקת כרונית מופיע לשחק תפקיד בפתולוגיה הקרנית לאחר חשיפה, התערבות במשעולים מוות התא עשוי לשפר את התוצאה הקלינית2,18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:879px;" width="880">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Bravo liquid handing platform</td>
			<td style="width:247px;">Agilent or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">G5409A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Bravo plate shaker</td>
			<td style="width:247px;">Agilent or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">Option 159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Bravo 96LT disposable tip head</td>
			<td style="width:247px;">Agilent or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">Option 178</td>
			<td>96-channel large tip pipetting head unit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Bravo 96ST disposable tip head</td>
			<td style="width:247px;">Agilent or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">Option 177</td>
			<td>96-channel small tip pipetting head unit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Bravo 384ST disposable tip head</td>
			<td style="width:247px;">Agilent or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">Option 179</td>
			<td>384-channel small tip pipetting head unit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Bravo 96 250 &#956;L sterile barrier tips</td>
			<td style="width:247px;">Agilent or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">19477-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Bravo 384 30 &#956;L sterile barrier tips</td>
			<td style="width:247px;">Agilent or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">19133-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Bravo 384 70 &#956;L sterile barrier tips</td>
			<td style="width:247px;">Agilent or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">19133-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">EnSpire multimode plate reader</td>
			<td style="width:247px;">Perkin Elmer or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">2300-0000</td>
			<td>AlphaLISA assay detector with high power laser excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit&#160;</td>
			<td style="width:247px;">Perkin Elmer or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">AL224F</td>
			<td>no-wash bead-based assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates</td>
			<td style="width:247px;">Perkin Elmer or equivalent</td>
			<td>6008359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td style="width:247px;">Invitrogen or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">13778500</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:247px;">Invitrogen or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">TrypLE Express</td>
			<td style="width:247px;">Gibco or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">12605010</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">IncuCyte Zoom</td>
			<td style="width:247px;">Essen Instruments or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">ESSEN BIOSCI 4473</td>
			<td>Incubator-housed automated microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Chloropicrin</td>
			<td style="width:247px;">Trinity Manufacturing or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Acute toxicity and irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">DMEM-F12 cell culture medium</td>
			<td style="width:247px;">Invitrogen or equivalent</td>
			<td>11330-057</td>
			<td>Contains HEPES</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:247px;">Invitrogen or equivalent</td>
			<td>1891471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Human epidermal growth factor (cell culture grade)</td>
			<td style="width:247px;">Invitrogen or equivalent</td>
			<td>E9644-.2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Recombinant human insulin (cell culture grade)</td>
			<td style="width:247px;">Invitrogen or equivalent</td>
			<td>12585-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade)</td>
			<td style="width:247px;">Invitrogen or equivalent</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Hydrocortisone (cell culture grade)</td>
			<td style="width:247px;">Sigma or equivalent</td>
			<td>H0888-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Glucose&#160; (cell culture grade)</td>
			<td style="width:247px;">Sigma or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">PBS&#160; (cell culture grade)</td>
			<td style="width:247px;">Sigma or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">P5493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">siRNA</td>
			<td style="width:247px;">Dharmacon or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiazolyl blue tetrazolium bromide</td>
			<td style="width:247px;">Sigma or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">M5655</td>
			<td>MTT assay substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">siRNA buffer</td>
			<td style="width:247px;">Thermo or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">B002000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">96-well cell culture plates</td>
			<td style="width:247px;">Corning or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">CLS3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">T150 cell culture flasks</td>
			<td style="width:247px;">Corning or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">CLS430825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">BSL-2 cell culture hood</td>
			<td style="width:247px;">Nuaire or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">NU-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">300 mL robotic reservoirs</td>
			<td style="width:247px;">Thermo or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">12-565-572&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">96 baffled automation reservoirs</td>
			<td style="width:247px;">Thermo or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">1064-15-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">500 mL sterile disposable storage bottles</td>
			<td style="width:247px;">Corning or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">CLS430282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Microplate heat sealer</td>
			<td style="width:247px;">Thermo or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">AB-1443A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Microplate heat sealing foil</td>
			<td style="width:247px;">Thermo or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">AB-0475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Cardamonin</td>
			<td style="width:247px;">Tocris or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">2509</td>
			<td>Anti-inflammatory, used as positive control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">SKF 86002&#160;</td>
			<td style="width:247px;">Tocris or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">2008</td>
			<td>Anti-inflammatory, used as positive control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">DMSO</td>
			<td style="width:247px;">Sigma or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">48% hydrofluoric acid</td>
			<td style="width:247px;">Sigma or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">339261</td>
			<td>Corrosive and acute toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">1000 &#956;L Single channel pipettors</td>
			<td style="width:247px;">Rainin or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">200 &#956;L Single channel pipettors</td>
			<td style="width:247px;">Rainin or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">17014391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">20 &#956;L Single channel pipettors</td>
			<td style="width:247px;">Rainin or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">17014392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">1000 &#956;L 12-channel pipettors</td>
			<td style="width:247px;">Rainin or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">17014497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">200 &#956;L 12-channel pipettors</td>
			<td style="width:247px;">Rainin or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">17013810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">20 &#956;L 12-channel pipettors</td>
			<td style="width:247px;">Rainin or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">17013808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Pipettor tips 1000 &#956;L</td>
			<td style="width:247px;">Rainin or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">17002920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Pipettor tips 200 &#956;L</td>
			<td style="width:247px;">Rainin or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">17014294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Pipettor tips 20 &#956;L</td>
			<td style="width:247px;">Rainin or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">17002928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Chemical fume hood</td>
			<td style="width:247px;">Jamestown Metal Products</td>
			<td style="width:119px;">MHCO_229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">384-well sample storage plates</td>
			<td style="width:247px;">Thermo or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">262261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:247px;">Sigma or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">S6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:247px;">Thermo or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Serological pipettes 50 mL</td>
			<td style="width:247px;">Corning or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">07-200-576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Serological pipettes 25 mL</td>
			<td style="width:247px;">Corning or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">07-200-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Serological pipettes 10 mL</td>
			<td style="width:247px;">Corning or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">07-200-574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Serological pipettes 5 mL</td>
			<td style="width:247px;">Corning or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">07-200-573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cells</td>
			<td style="width:247px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>These cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Sceptor Handheld Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:247px;">Millipore or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">PHCC20060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument</td>
			<td style="width:247px;">Affymetrix or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">00-0372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Affymetrix 24- and 96-array plates</td>
			<td style="width:247px;">Affymetrix or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">901257; 901434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Draegger tube HF</td>
			<td style="width:247px;">Draeger or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">8103251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Draegger tube CP</td>
			<td style="width:247px;">Draeger or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">8103421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Draegger pump</td>
			<td style="width:247px;">Draeger or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">6400000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">Clear Plate seals</td>
			<td style="width:247px;">Resesarch Products International or Equivalent</td>
			<td style="width:119px;">202502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Reagent reservoirs</td>
			<td style="width:247px;">VistaLab Technologies or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">3054-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Xlfit</td>
			<td style="width:247px;">IDBS or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Excel add-in used for automated curve fitting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput sirna screening for chloropicrin and hydrogen fluoride-induced cornea epithelial cell injury

Toxicant-induced חבלה עינית היא מקרה חירום אמיתי עינית כימיקלים יש פוטנציאל לגרום נזק לרקמות משמעותי במהירות. טיפולים toxicant-induced פציעה קרניות הן בדרך כלל תומכת הרפוי ספציפי לא קיים כדי לטפל בפציעות אלה. ב המאמצים לפתח טיפולים ותרופות לטיפול בחשיפה, זה יכול להיות חשוב כדי להבין את המנגנונים הסלולר המולקולריים של הפציעות. אנו מציעים כי ניצול תפוקה גבוהה קטן מעכבות ההקרנה RNA (siRNA) יכול להיות כלי חשוב זה יכול לעזור להבהיר את המנגנונים המולקולריים של פגיעה אפיתל הקרנית כימיים במהירות רבה יותר. siRNA הם כפול נטושים מולקולות RNA 19-25 נוקלאוטידים ארוך, לנצל את הגן post-transcriptional להשתיק מסלול ארוך mRNA אשר יש הומולוגיה ל siRNA. ואז ניתן יהיה ללמוד וכתוצאה מכך הפחתת ביטוי גנים ספציפיים בתאים חשוף toxicant כדי לברר את הפונקציה של הגן הזה התגובה התאית toxicant. פיתוח, אימות של במבחנה חשיפה מודלים ושיטות תפוקה גבוהה הקרנת (HTS) של מימן פלואוריד-(HF) ו- chloropicrin-(CP) המושרה חבלה עינית מוצגים במאמר זה. למרות בחרנו אלה שני חשיפה לרעלים, השיטות שלנו חלים במחקר של חשיפה לרעלים אחרים עם שינויים מזעריים פרוטוקול החשיפה toxicant. SV40 גדול T אנטיגן מונצחים תאי אפיתל הקרנית אדם קו ש-SV40-HCEC נבחר למחקר. תא הכדאיות וייצור IL-8 נבחרו נקודות קצה בפרוטוקול ההקרנה. מספר אתגרים הקשורים עם הפיתוח של חשיפה toxicant, שיטות התרבות תאים מתאימים ללימודי HTS מוצגים. הקמת HTS מודלים עבור חשיפה לרעלים אלו מאפשר מחקרים נוספים להבין טוב יותר את מנגנון הפגיעה, למסך הרפוי פוטנציאל כימי חבלה עינית.

Watch this Scientific Journal Video about High Throughput SiRNA Screening for Chloropicrin and Hydrogen Fluoride-Induced Cornea Epithelial Cell Injury at JoVE.com

High Throughput SiRNA Screening for Chloropicrin and Hydrogen Fluoride-Induced Cornea Epithelial Cell Injury

תפוקה גבוהה קטן מעכבות RNA ההקרנה היא כלי חשוב זה יכול לעזור להבהיר את המנגנונים המולקולריים של פגיעה אפיתל הקרנית כימיים במהירות רבה יותר. במסמך זה, אנו מציגים את הפיתוח ואת האימות של חשיפה מודלים ושיטות להקרנה תפוקה גבוהה של מימן פלואוריד - ו chloropicrin-induced פציעה אפיתל הקרנית.

תפוקה גבוהה SiRNA ואיתור Chloropicrin ופציעות תאים אפיתל הקרנית מימן פלואוריד-Induced

Toxicant-induced ocular injury is a true ocular emergency because chemicals have the potential to rapidly inflict significant tissue damage. Treatments ...

high-throughput-sirna-screening-for-chloropicrin-hydrogen-fluoride

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

5.8K Views.  US Army Medical Research Institute of Chemical Defense. תפוקה גבוהה קטן מעכבות RNA ההקרנה היא כלי חשוב זה יכול לעזור להבהיר את המנגנונים המולקולריים של פגיעה אפיתל הקרנית כימיים במהירות רבה יותר. במסמך זה, אנו מציגים את הפיתוח ואת האימות של חשיפה מודלים ושיטות להקרנה תפוקה גבוהה של מימן פלואוריד - ו chloropicrin-induced פציעה אפ...

Video: High Throughput SiRNA Screening for Chloropicrin and Hydrogen Fluoride-Induced Cornea Epithelial Cell Injury

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

תפוקה גבוהה הקרנת ו biosensing עם פלורסנט ג elegans מתחים

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

תפוקה גבוהה Overexpression פלסמיד שמרים מסך

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

הקרנת תפוקה גבוהה של פעילות Endoglucanase פטרייתיים ב Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

הקרנת תפוקה גבוהה למאפנני מולקולה הקטנה של ערוצי אשלגן מיישרים פנימה

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

הקרנה פונקציונלית תפוקה גבוהה באמצעות assay בלוציפראז Dual-זוהר תוצרת בית

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

שחזור של לבבות למבוגרים דג הזברה עבור יישומי תפוקה גבוהה

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

זיהוי של זוגות קינאז-מצע שימוש הקרנת תפוקה גבוהה


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

הקרנה רב-אנזים באמצעות מערכת הקרנת אנזים הגנטי תפוקה גבוהה

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived inheritance encoded in protein conformation (rather than sequence) has long been viewed as paradigm-shifting but rare. The best characterized examples of such epigenetic elements are prions, which possess a self-assembling behavior that can drive the heritable manifestation of new phenotypes. Many archetypal prions display a striking N/Q-rich sequence bias and assemble into an amyloid fold. These unusual features have informed most screening efforts to identify new prion proteins. However, at least three known prions (including the founding prion, PrPSc) do not harbor these biochemical characteristics. We therefore developed an alternative method to probe the scope of protein-based inheritance based on a property of mass action: the transient overexpression of prion proteins increases the frequency at which they acquire a self-templating conformation. This paper describes a method for analyzing the capacity of the yeast ORFeome to elicit protein-based inheritance. Using this strategy, we previously found that &gt;1% of yeast proteins could fuel the emergence of biological traits that were long-lived, stable, and arose more frequently than genetic mutation. This approach can be employed in high throughput across entire ORFeomes or as a targeted screening paradigm for specific genetic networks or environmental stimuli. Just as forward genetic screens define numerous developmental and signaling pathways, these techniques provide a methodology to investigate the influence of protein-based inheritance in biological processes.

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

This protocol describes a high-throughput methodology to functionally screen for protein-based inheritance in S. cerevisiae.

תפוקה גבוהה SiRNA ואיתור Chloropicrin ופציעות תאים אפיתל הקרנית מימן פלואוריד-Induced

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video