This research was supported by grants from the Intelligent Synthetic Biology Center of Global Frontier Project (2011-0031944), the Next-Generation Biogreen 21 Program (PJ009524), NRF-2015M3D3A1A01064875 and the KRIBB Research Initiative Program.

1. הכנת הספרייה metagenomic עם PNP-GESS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות ספריה metagenomic ב E. coli עם וקטור fosmid באמצעות ערכת ייצור הספרייה fosmid פי פרוטוקול של היצרן 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 100 μl של הספרייה לאחסון ב -70 ° C, אשר מהווה מקור של תאי ספרייה metagenomic. הערה: הצפיפות האופטית של מדגם נמדד באורך גל של 600 ננומטר (OD 600) של מניית ספרייה זה עומדת על כ -100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר 100 μl של הספרייה metagenomic המניות על הקרח ולחסן בבקבוק 500 מ&quot;ל המכיל 50 מ&quot;ל לוריא- Bertani (LB) ו chloramphenicol 12.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ואחריו 37 הדגירה מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר התאים צינור חרוטי 50 מ&quot;ל על ידי צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 20 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה במהירות 50 מ&quot;ל מים מזוקקים קרים כקרח (DW) ו צנטריפוגות XG ב 1000 במשך 20 דקות ב 4 ° C שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מילuspend גלולה ב 50 DW μl קר כקרח עם 10% (v / v) גליצרול. השתמש 50 μl של aliquot תא זה עבור electroporation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התערובת של תאים electrocompetent 50 μl ו pGESS (E135K) DNA 5 (100ng) בתוך קובט electroporation קרים כקרח electroporate (1.8 ק ו / ס&quot;מ, 25 μF) את התערובת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף במהירות 1 מ&quot;ל סופר מרק אופטימלי עם דיכוי catabolite (SOC) בינוני ו resuspend התאים בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת התאים לתוך 14 מ&quot;ל צינור מסביב לתחתית בעזרת פיפטה לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים 500 μl של תאים התאושש על צלחת מרובעת LB 20 x 20 ס&quot;מ המכיל chloramphenicol 12.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ו אמפיצילין 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל. דגירת צלחת ב 30 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרדו את מושבות באמצעות מגרד תא ולאסוף תאים לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל באמצעות אמצעי אחסון תא קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 20 דקות ב 4 °. Resuspend גלולה ב 10 מ&quot;ל אמצעי אחסון תא קר כקרחלהגיע OD של 600 100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 20 μl של תאים לאחסון ב -70 ° C. </li></ol> 2. הסרת תוצאות חיוביות שגויות מספריית metagenomic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את תאי ספריית metagenomic מניות (משלב 1.13) המכילים fosmid DNA metagenomic ו pGESS (E135K) על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 10 μl של התאים 2 מ&quot;ל LB המכיל אמפיצילין 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ו chloramphenicol 12.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​בתוך שפופרת 14 מ&quot;ל מסביב לתחתית. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל&quot;ד במשך 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, מפעיל את מחשב FACS ולפתוח את תוכנת FACS מחדל. השתמש בהגדרות הבאות: קוטר נחיר, 70 מיקרומטר; פינת פיזור קדימה (FSC-A) רגישות, 300 הגברת V-לוגריתמים; פינת פיזור בצד (SSC-A) רגישות, 350 הגברת V-לוגריתמים; והעמסת isothiocyanate שטח (FITC-A) רגישות, 450 הגברת V-לוגריתמים; פרמטר הסף, FSC-ערך 5. הערה: גדרות טיפוסיות מובאותעבור מכשיר FACS כפי שמופיע בטבלה של חומרים. התאם את ההגדרות עבור התקני FACS אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את תאי ספריית metagenomic משלב 2.2 ידי הוספת 5 μl של המדגם לצינור 5 מיליליטר עגול תחתון המכיל 1 מיליליטר PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את מדגם הספרייה מדולל על בנמל הטעינה של מכשיר FACS ולחץ על כפתור Load על לוח מחווני רכישת תוכנת FACS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את קצב אירוע 1,000 - 1,500 אירועים / sec ידי לחיצה ושליטה על כפתורי קצב הזרימה על לוח המחוונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור יומן מדורג FSC-A לעומת יומן מדורג SSC-A עלילת פיזור בגיליון גלובלי על ידי לחיצה על כפתור מגרש דוט בסרגל הכלים. התאם את שער הפיזור R1 להקיף את אירועי הגופייה (אוכלוסיית חיידקים) באמצעות הלחצן שער המצולע בסרגל הכלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש היסטוגרמה עם ספירת תאים לעומת יומן מדורג FITC-A בגיליון העבודה על ידי לחיצה על כפתור היסטוגרמה. לאחר מכן, להתאים את מתח FITC מן Cytomeכרטיסיית גדרות ter על החלון מפקח הבקרה כזה כי שיאו של ב&quot;התפלגות הפעמון הוא פחות מ -10 2-A FITC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור-A FSC מדורג יומן vs. ביומן FITC-העלילה על ידי לחיצה על כפתור מגרש דוט בגליון העבודה הגלובלי. הגדרת R2 שער מיון על המגרש באמצעות הלחצן שער המצולע בסרגל הכלים כך שהשער ממוקם בין + 5% ו -5% תאים ממרכז החלוקה (תאי 10% בסך הכילו סביב הפסגה של הפעמון עקום בצורה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צינור אוסף המכיל 1.2 מ&quot;ל LB המכיל 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ו אמפיצילין chloramphenicol 12.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל במוצא המכשיר FACS ולמיין את 10 6 תאים העונים הן R1 ו- R2 שערים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צינור איסוף, כובע, ו מערבולת בעדינות. </li></ol> 3. הקרנת אנזים metagenomic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים ממוינים (משלב 2.11) בשעה 37 ° C עם רועד ב 200 סל&quot;ד עד 600 OD מגיע 0.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μl להעתיק פתרון אינדוקציה כדי להגביר את מספר עותק fosmid התאי. דגירת התאים עבור hr 3 נוסף ב 37 מעלות צלזיוס עם הרועד ב 250 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין תאים למיון, להוסיף 0.5 מ&quot;ל של תאים בתרבית ו מצע המתאים (אצטט -nitrophenyl p, p -nitrophenyl-β-D-cellobioside, או פוספט פניל) לתוך צינור 14 מ&quot;ל מסביב לתחתית בריכוז סופי של 100 מיקרומטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדגם שליטה, להוסיף 0.5 מ&quot;ל של תאים בתרבית משלב 3.2 לתוך צינור 14 מ&quot;ל מסביב לתחתית. מוסיפים את נפח זהה של PBS כמו נפח המצע בשלב 3.3. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שני דגימות ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל&quot;ד במשך 3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים מכינים את מכונת FACS עם אותו תצורות כמו שלב 2.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של תאים (למיון) ותאי הבקרה שני צינורות 5 מ&quot;ל מסביב לתחתית המכילה 1 מ&quot;ל PBS, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור המכיל תאים שליטה על tהוא טוען היציאה של FACS ולחץ על הכפתור Load בלוח המחוונים רכישת התוכנה FACS. כוונון קצב אירוע 1,000 - 3,000 אירועים / sec ידי שליטת כפתורי קצב זרימה על לוח המחוונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יומן צור מדורגי FSC-A לעומת יומן מדורג SSC-A עלילת פיזור על ידי לחיצה על כפתור מגרש דוט בגיליון העבודה הגלובלי של התוכנה ולהתאים את שער הפיזור R1 להקיף את אירועי הגופייה (אוכלוסיית חיידקים) באמצעות הלחצן שער המצולע על סרגל כלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יומן צור מדורגי FSC-A לעומת יומן מדורג FITC-A עלילת פיזור על ידי לחיצה על כפתור מגרש דוט בגיליון העבודה ולקבוע R2 שער מיון על המגרש באמצעות הלחצן מצולע השער בסרגל הכלים כך פחות מ -0.1% של תאים שליליים מזוהים בתוך שער R2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את הצינור מלא המדגם עם צינור מדגם המיון, להתאים את קצב אירוע 1,000 - 3,000 אירועים / sec על ידי שליטה על כפתורי קצב הזרימה על לוח המחוונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צינור איסוף המכיל 0.5מיליליטר LB במוצא מכשיר FACS ולמיין את 10 4 תאי עונים הם שערי R1 ו- R2. הערה: קריטריון המיון יכול לנוע בין 0.1% עליונים עד 5% של-A FITC בשער R2. בפרוטוקול זה, תאי 1% עליונים נאספו תוצאות חיוביות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צינור איסוף, כובע, ו מערבולת בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים את דגימות 0.5 מ&quot;ל שנאספו על שתי צלחות אגר (90 מ&quot;מ צלחות פטרי) המכיל LB, 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​אמפיצילין, 12.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​chloramphenicol דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת הצורך, לבצע סיבובים נוספים של מיון FITC-A העשרה על ידי חזרה על שלבים 3.1-3.14. </li></ol> 4. Hit בחירת אישור פעילות האנזים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cytometry זרימת הניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהצלחת וטופחה על שלב 3.14, בחר מושבה מראה שום קרינה באמצעות בורר מושבה תחת התצפית של גל 488 ננומטר של נורת ה- LED. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן את המושבה שנבחר 14 מ&quot;ל roאונד תחתית שפופרת המכילה 2 מ&quot;ל LB המכיל 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל אמפיצילין ו -12.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל chloramphenicol על 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל&quot;ד עד OD שלה 600 מגיע 0.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μl להעתיק פתרון אינדוקציה כדי להגביר את מספר עותק fosmid התאי. דגירת התאים עבור hr 3 נוסף ב 37 מעלות צלזיוס עם הרועד ב 250 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין צינור מסביב לתחתית 14 מ&quot;ל ולהוסיף 1 מ&quot;ל של תאים בתרבית (שלב 4.1.3). הוסף מצע מתאים (תצטט p -nitrophenyl, p -nitrophenyl- β -D-cellobioside, או פוספט פניל) בריכוז סופי של 100 מיקרומטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור פקד, להוסיף תאים בתרבית 1 מ&quot;ל משלב 4.1.3 לתוך 14 מ&quot;ל צינור מסביב לתחתית ולהוסיף אותו נפח של PBS כמו נפח המצע בשלב 4.1.4. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שני דגימות ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 200 סל&quot;ד במשך 3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים מכינים את מכונת FACS עם אותו תצורות כמו שלב 2.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 μl של תאים שטופלו מלאה המצע עד 5 מ&quot;ל צינורות מסביב לתחתית המכילה 1 מ&quot;ל PBS, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את התאים מלאים המכיל צינור על בנמל הטעינה של מכשיר FACS ולחץ על כפתור Load בלוח מחווני רכישת תוכנת FACS. התאם את קצב אירוע 1,000 - 3,000 אירועים / sec באמצעות כפתורי קצב זרימה על לוח המחוונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כפתור רכישה למדוד-A FITC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את הצינור מדגם שליטה עם הצינור מדגם מטופלים המצע. התאם את קצב אירוע 1,000 - 3,000 אירועים / sec באמצעות כפתורי קצב זרימה על לוח המחוונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כפתור רכישה למדוד-A FITC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה את הקרינה של שתי הקבוצות של תאים על ידי התוויית היסטוגרמה של ספירת תאים לעומת ביומן מדורג-A FITC. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחני אחרים כדי לאשר פעילות האנזים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור זיהוי נוסף של המועמדים אנזים שנבחרו, לחלץ DNA fosmid באמצעות פרו מיצוי סטנדרטיפרוצדורות מן ערכות ההפקה המסחרית ולנתח את רצף נוקליאוטידים, או לבדוק את פעילות האנזים במבחנה 6,7. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Eggeling, L., Bott, M., Marienhagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+screening+methods-biosensors.">Novel screening methods-biosensors.</a> Curr. Opin. Biotech. 35, 30-36 (2015).</li><li>Uchiyama, T., Abe, T., Ikemura, T., Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate-induced+gene-expression+screening+of+environmental+metagenome+libraries+for+isolation+of+catabolic+genes.">Substrate-induced gene-expression screening of environmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes.</a> Nat. Biotechnol. 23 (1), 88-93 (2005).</li><li>Van Sint Fiet, S., van Beilen, J. B., Witholt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+biocatalysts+for+chemical+synthesis.">Selection of biocatalysts for chemical synthesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (6), 1693-1698 (2006).</li><li>Binder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+approach+to+identify+genomic+variants+of+bacterial+metabolite+producers+at+the+single-cell+level.">A high-throughput approach to identify genomic variants of bacterial metabolite producers at the single-cell level.</a> Genome Biol. 13 (5), R40 (2012).</li><li>Choi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+generalized+and+High-throughput+Enzyme+Screening+System+Based+on+Artificial+Genetic+Circuits.">Toward a generalized and High-throughput Enzyme Screening System Based on Artificial Genetic Circuits.</a> ACS Synthetic Biology. 3 (3), 163-171 (2014).</li><li>Lee, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+psychrophilic+alkaline+phosphatase+from+the+metagenome+of+tidal+flat+sediments.">A novel psychrophilic alkaline phosphatase from the metagenome of tidal flat sediments.</a> BMC Biotechnology. 15 (1), (2015).</li><li>Warnecke, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+and+functional+analysis+of+hindgut+microbiota+of+a+wood-feeding+higher+termite.">Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite.</a> Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).</li><li>Kim, U. J., Shizuya, H., de Jong, P. J., Birren, B., Simon, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+propagation+of+cosmid+sized+human+DNA+inserts+in+an+F+factor+based+vector.">Stable propagation of cosmid sized human DNA inserts in an F factor based vector.</a> Nucleic Acids Research. 20 (5), 1083-1085 (1992).</li><li>Jemli, S., Ayadi-Zouari, D., Hlima, H. B., Bejar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalysts:+application+and+engineering+for+industrial+purposes.">Biocatalysts: application and engineering for industrial purposes.</a> Crc. Cr. Rev. Biotechn. 36 (2), 246-258 (2014).</li><li>Lorenz, P., Eck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomics+and+industrial+applications.">Metagenomics and industrial applications.</a> Nat. Rev. Microbiol. 3 (6), 510-516 (2005).</li><li>Uchiyama, T., Miyazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Product-induced+gene+expression,+a+product+responsive+reporter+assay+used+to+screen+metagenomic+libraries+for+enzyme+encoding+genes.">Product-induced gene expression, a product responsive reporter assay used to screen metagenomic libraries for enzyme encoding genes.</a> Applied and environmental microbiology. 76 (21), 7029-7035 (2010).</li><li>Mohn, W. W., Garmendia, J., Galvao, T. C., De Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveying+bio-transformations+with+&#224;+la+carte+genetic+traps:+translating+dehydrochlorination+of+lindane+(gamma-hexachlorocyclohexane)+into+lacZ-based+phenotypes.">Surveying bio-transformations with &#224; la carte genetic traps: translating dehydrochlorination of lindane (gamma-hexachlorocyclohexane) into lacZ-based phenotypes.</a> Environmental microbiology. 8 (3), 546-555 (2006).</li><li>Tang, S. Y., Cirino, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+application+of+a+mevalonate-responsive+regulatory+protein.">Design and application of a mevalonate-responsive regulatory protein.</a> Angew Chem. Int. Ed. 50 (5), 1084-1086 (2011).</li><li>Jha, R. K., Kern, T. L., Fox, D. T., Strauss, C. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+an+Acinetobacter+regulon+for+biosensing+and+high-throughput+enzyme+screening+in+E.+coli+via+flow+cytometry.">Engineering an Acinetobacter regulon for biosensing and high-throughput enzyme screening in E. coli via flow cytometry.</a> Nucleic Acids Res. 42 (12), 8150-8160 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

הגדלת יעילות של biocatalysts ייצור היא מפתח להצלחה-כימי ביו מבוסס תעשיית 9 ו metagenome נחשב לאחד מקור האנזים הטבעי הטוב ביותר. במובן זה, זה הכרחי כדי הקרנת אנזימים רומן מן metagenome שבו רוב המשאבים הגנטיים לא נחקר 10. כמה שיטות הקרנה פותחו ישירות לזהות מוצרי אנזים באמצעות activators תעתיק 11, 12 אולם טכניקות אלו דורשות מערכת תעתיק המטבוליט-תגובה ספציפית. מצד שני, GESS הוא החלים רחב בהתאם לשימוש של פנול או PNP מתויג מצעים. למרות שרוב האנזימים דיווחו לייצר תרכובות פנול או PNP במאגר ברנדה (טבלה 1), (כולל שלוש דוגמאות בעבודה זו) שייכים hydrolase (מספר 3 EC) אנזימים בכיתה, לחקור מצעים פנוליות מגוונת יותר ואפילו בעיצוב מלאכותית מצע העמיד כדילמקד פעילות אנזים, כחלופות של מצעים טבעיים, יכולות להאריך את תחולת מערכת ההקרנה באופן משמעותית. שים לב בבחירת פנול מתאים או PNP מתויג מצע היא אחד הצעדים המכריעים של יישום PNP-GESS מאז חדירות הממברנה ותוצאה הסלולר של המצע באופן משמעותי להשפיע על פרוטוקול ההקרנה. כאן, אנו מראים כי חשובים בתעשייה שלושה סוגים שונים של אנזימים יכולים להיות מזוהים באופן תפוקה גבוהה באמצעות מערכת הקרנה אחת. הגישה של שימוש FACS, בנוסף הקרנת התפוקה הגבוהה של אנזימי metagenomic, יכולה לחול גם על הנדסת רגולטורים תעתיק (TRS) עבור סגוליות TR שינו. דוגמה אחת היא מחקר שבו גרסה שונה AraC כי זוהה mevalonate במקום arabinose היה מבודד באמצעות FACS, ולאחר מכן מועסקים לתאים מסך ייצור mevalonate 13. כמו כן, השינוי הספציפי של TRs אפשר Furthהנדסה אה של פעילות האנזים. Auto-מוסדר TR, PcaU, תוכנן כדי לזהות 3,4-dihydroxybenzoate (34DHB) ולאחר מכן להחיל אותו למסך אנזימי dehydratase dehydroshikimate (AsbF) ב פעילות מקסימלית שלהם של המרת dehydroshikimate אנדוגני 34DHB 14. הרעיון הבסיסי של מחקרים אלה דומים לזה של PNP-GESS, מאז PNP-GESS משתמשת גרסת DmpR לזהות PNP ומראה ביצועי תפוקה גבוהה הקרנת מספריה גנטית בקנה מידה גדולה. עם זאת, הנדסה סגולית עלולה לגרום חיוביות שגויות לא מכוונות בין הלהיטים, כיוון שהיא עלולה לעורר ביטוי כתב על ידי מעוררי אחרים כתוצאה סגולית התרחב. לכן, רצוי לחקור את אורתוגונליות של תגובת TR לפני TR מוחל. מצד שני, הגדלת רגישות וטווח דינמי של TR יכול לפצות על הדור חיובי כוזב. לדוגמה, הרגישות של GESS שופרה על ידי החדרת RBS אופטימיזציה terminator sequences לתוך המערכת. תוצאות חיוביות שגויות של מערכת ההקרנה ואולי באות תקלה של המעגל הגנטי, כימיקלים פנוליות מכוונים הפעלת TR, צמיחת תאים הטרוגנית, ודיפוזיה חינם של פנול או PNP. תהליכי הסלקציה השליליים של צעדים 2.1 - 2.9 ציפו כדי להסיר תאים חיוביים כוזבים שחרור קרינה ללא טיפול מצע. תאים חיוביים הכוזבים אלה יכולים גם להיות מופחתים על ידי למקסם את יחס האות לרעש של המעגל הגנטי. יחד עם הנדסת RBS ו terminator, השימוש במדיה M9-גלוקוז שפר בצורה משמעותית את האות (פי 7 יותר מאשר תקשורת LB) ב PNP-GESS ביצועים 5. אבל, בפרוטוקול זה, LB שימש כפשרה בין ביטוי גנים metagenomic ידוע ועוצמת אות GESS. חקירת תנאים עדינים יותר של צמיחת תאי PNP-GESS ותוצאת מצע-גלוקוז M9 מאפשרת לשפר את עוצמת האות. רגולציה הדוקה של זמן תגובה של המצעים, בשלב 3.5, היאכמו כן, חשוב למנוע תוצאות חיוביות שגויות מופעלות על ידי פנול או דיפוזיה PNP. GESS מאפשרת המרה של תפקוד האנזים לתוך ביטוי חלבון הכתב בתיווך שעתוק ברמה מתא בודד אבל זיהוי עקיף באמצעות חלבון הכתב יכול להיות אחת המגבלות המולדות. אז, ב assay האנזים במבחנה LC / GC-MS ניתוח של מוצר צריך להיות במעקב במשך לזיהוי ודאי של מועמד אנזים המשוערת 6,7. כמו כן ניתן להשתמש GESS ללא הצורך בניתוח FACS היקר על ידי הצמדה לכתבים חלופיים כגון גנים עמידים לאנטיביוטיקה או אנזימי chromogenic עם כתבי ניאון. לשיפור נוסף של יישומי GESS, יש צורך להקים שיטה לאפיין פעילות אנזים ולזהות את האנזימים באופן תפוקה גבוהה. יחד עם טכנולוגיות תפוקה גבוהה אחרים, כגון רצף של הדור הבא, GESS יהיה אסטרטגיה בשימוש נרחב עבור חלבון enzyהנדסה זרז אותי בענף מבוסס-ביולוגיה.

טכניקת assay שפותחה לאחרונה תפוקה גבוהה תא בודד מאפשרת אנזימי רומן שיוקרו מספריה גנטית בקנה מידה גדולה מבוססת על הפעילות התפקודית שלהם 1. ברמת התא הבודדה, חלבונים בויסות שעתוק מועסקים כדי לעורר ביטוי גני כתב על ידי חישת מולקולות קטנות מיוצרות כתוצאה של פעילות אנזים היעד. הגישה מוקדם אחד המעורבים את הבידוד של אופרון משפיל-פנול מ Ralstonia eutropha E2 באמצעות הביטוי הגנטי-induced המצע ההקרנה (SIGEX) שיטה, שבה המצע גורם הביטוי של עיתונאי חלבון 2. NhaR של Pseudomonas putida שמש כדי לבחור dehydrogenase benzaldehyde 3, ו LysG מ glutamicum Corynebacterium נוצל להקרנת התפוקה הגבוהה של L- ליזין-ייצור זן חדש מספרי מוטציה מגוונות 4. בעבר, screeni אנזים גנטימערכת ng (GESS) הוצעה כפלטפורמת הקרנה החלימה בדרך כלל 5. מערכת זו משתמשת רגולטור dimethylphenol הכרה-פנול, DmpR, של פ putida. DmpR (E135K), ו מוטציה של DmpR, יכול להיות מועסק גם GESS (PNP-GESS) לצורך זיהוי של p -nitrophenol (PNP). בנוכחות אנזימי יעד ייצור תרכובות פנוליות, GESS ב E. קולי תאים פולטים אותות קרינה, מה שמאפשר את הבידוד המהיר של תאים בודדים באמצעות סדרן תא מופעל פלואורסצנטי (FACS). אבל הביטוי של אנזים metagenomic שנראה חלש יותר מזו של אנזימים רקומביננטי קונבנציונליים; ולכן, תוכננה GESS לזהות תרכובות פנוליות ברגישות המקסימלית על ידי חוקר את השילוב של אתר ריבוזומלי מחייב (RBS) ורצפים terminator יחד עם תפעול אופטימלי בתנאים 5. אחד היתרונות הבסיסיים של GESS היא שיטה אחת זה תיאורטי מאפשרת הקרנת ovאה מ -200 סוגים שונים של אנזימים באתר ברנדה (טבלה 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013.7) על ידי העסקת מצעים שונים פשוט. זה היה הראו כי cellulase, lipase, ו hydrolase parathion מתיל (MPH) ניתן לאתר באמצעות PNP-GESS עם מצעים מתאימים של בוטיראט p -nitrophenyl, p -nitrophenyl-cellotrioside, ו parathion מתיל, בהתאמה 5. לאחרונה, הוכח כי phosphatase אלקליין (AP), אשר הוא אחד האנזימים רומן שזוהו באמצעות PNP-GESS, הוא AP thermolabile הראשון נמצא metagenomes ימיים קר המותאמות 6. הנה, הפרטים של תהליך המיון מוצג עם PNP-GESS גילוי הפעילויות של שלושה סוגים שונים של lipase enzymes-, cellulase, ו phosphatase אלקליין -ואז במהירות בזיהוי אנזימים מועמדים חדשים מספריה metagenomic 5,6. התהליכים כוללים עיבוד מקדים metagenome עם PNP-GESS ותפעול flow סדרן cytometry. בעוד הלהיטים המתקבלים יהיו צורך הרצף של זיהוי נוסף, פרוטוקול זה מכסה את ההליך עד מדרגות אישור פעילות אנזים באמצעות cytometry זרימה.

<table><tbody><tr><td>CopyControl</td><td>Epicentre</td><td>CCFOS110</td><td>Fosmid library production kit&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CopyControl Induction Solution</td><td>Epicentre</td><td>CCIS125</td><td>Fosmid copy induction solution</td></tr><tr><td>EPI300</td><td>Epicentre</td><td>EC300110</td><td>Electrocompetent cell</td></tr><tr><td>pCC1FOS</td><td>Epicentre</td><td>CCFOS110</td><td>Fosmid vector</td></tr><tr><td>Gene Pulser Mxcell</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Electroporation cuvette and electroporate system</td></tr><tr><td>FACSAria III</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>Flow Cytometry (FACS machine)</td></tr><tr><td>AZ100M</td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscope&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>UltraSlim&amp;nbsp;</td><td>Maestrogen</td><td></td><td>LED illuminator</td></tr><tr><td>50-ml conical tube</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>14-ml round-bottom tube&amp;nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-ml round-bottom tube</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-nitrophenyl phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7653</td><td>Substrate</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-nitrophenyl &amp;beta;-D-cellobioside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5759</td><td>Substrate</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-nitrophenyl butylate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N9876&amp;nbsp;</td><td>Substrate</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB)</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>Tryptone 10 g/L, Yeast extract 5 g/L, Sodium Chloride 10 g/L</td></tr><tr><td>Super Optimal broth (SOB)</td><td>BD Difco</td><td>244310</td><td>Tryptone 20 g/L, Yeast extract 5 g/L, Sodium Chloride 0.5 g/L, Magnesium Sulfate 2.4 g/L, Potassium Chloride 186 mg/L</td></tr><tr><td>Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC)</td><td></td><td>SOB, 0.4 % glucose</td><td></td></tr><tr><td>2x Yeast Extract Tryptone (2xYT)</td><td>BD Difco</td><td>244020</td><td>Pancreatic digest of Casein 16 g/L, Yeast extract 10 g/L, Yeast extract 5 g/L</td></tr><tr><td>Cell storage media</td><td></td><td></td><td>2x YT broth, 15% Glycerol, 2% Glucose</td></tr><tr><td>pGESS(E135K)</td><td></td><td></td><td>A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator.&lt;br/&gt; See the reference 5 in the manuscript for more details.</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>Flow Cytometry Software Version 7.0</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td>0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0.024% KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;OP&lt;sub&gt;4, &lt;/sub&gt;pH 7.4</td></tr></tbody></table>

multi-enzyme screening using a high-throughput genetic enzyme screening system

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

השלושה המצעים פנוליות נבחנו לזהות אנזימי metagenomic רומן מספריה metagenome של משקעים שטוחים גאות אוקיינוס ​​Taean, דרום קוריאה על ידי ביצוע הפרוטוקול המוצע. לבניית הספרייה, ממוצע 30 - 40 רצפי metagenome kb הוכנסו fosmids, אשר מבוססים על E. coli F replicon גורם והציג כעותק יחיד בתא. שים לב fosmids היה בשימוש נרחב לבניית ספריות גנומית מורכבת בשל התפשטות 8 היציבה שלהם. איור 1 מציג תרשים זרימה קצרה של פרוטוקול ההקרנה כוללת הסילוק של תוצאות חיוביות שגוי עם מיון שלילי (איור 1 א) ואחריו מבחר להיט חיובי עם R1 ו- R2 מיון שערים (איור 1 ב &#39;). הלהיטים הוערכו על ידי השוואת הקרינה של הדגימות עם ובלי מצעים(איור 1 ג). במקרה של הקרנה בתיווך יצטט p -nitrophenyl, חמישה מועמדים של lipase אושרו שבו הקרינה של תאים שטופלו מצע הייתה גבוהה מזו של תאים מלאים (איור 2 א). למרות ההפצות הרחבות של השלושה המועמדים של cellulase באיור 2 ב &#39;, הם גם הראו הבדלים מובהקים של עוצמת FITC הממוצעת של האוכלוסיות. ארבעה מועמדים phosphatase גם הראה רמת הקרינה גבוהה בהשוואה לתאי הביקורת (איור 2 ג). ההבדל קרינה יותר בין תאים שליליים ומועמד פעילות האנזים החזקה ניתן להסיק מאז כתב הקרינה של PNP-GESS תערוכות תגובות כמוני הריכוזים פנול 5. בפרוטוקול זה, רק את ההבדלים הקרינה אוששו באמצעות זרימת cytometry אבל מבחני זיהוי שונים ניתן ליישם<html> שעות כאמור בשלב 4.2. איור 3 מדגים את הדוגמה של AP זיהוי 6. שיבוט שנבחר בין ארבעים ושבע מושבות פלורסנט מאוד מההקרנה היה רצף ו ORF של המועמד AP זוהה. ORF מוכנס לתוך וקטור הפלסמיד אושר לקיים פעילות AP עם cytometry זרימה. באיור 3, להיט תערוכות אותות קרינה חזקים יותר מאשר תאי נושאים פלסמיד ריק (שלילית). ניתוח נוסף של רצף בפעילות האנזימטית במבחנה גילה כי AP זה היה דומה במידה רבה לזה נקודות גישה ידועות אחרות במאפייניו האנזימטית למעט פעילות קטליטית גבוהה בטמפרטורות נמוכות (35 מעלות צלזיוס) לבין יציבות תרמית מדהימה (65 מעלות צלזיוס) תוך 15 דקות 6 . בנוסף, סוכנות ידיעות AP הוקרן הייתה דומה זמינה מסחרי נקודות גישת הסרת פוספטים מסוף מקצוות מלוכדים ובוטים של DNA פלסמיד לינארית 6. דק-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54059/54059fig1.jpg" /> איור 1:. תהליך מיון אנזים Multi (א) הסרת תאים חיוביים שגויים מראים קרינה בלי מצע. שער המיון ממוקם באמצע צפיפות אוכלוסיית תאים כך שהשער כולל 10% של התאים הכוללים. (ב) מיון ניאון גבוהה (FITC-A) תאים (חיובי) סיפוק שערים R1 ו- R2 בנוכחות מצע מתאים. (ג) לאחר הבחירה ובידוד תא בודד, את הפעילות של האנזימים המועמדים נבדקת עם ובלי המצע (מסומן כמו W / מצעי W / O, בהתאמה). הבדל האיתות הברור בין שני המדגמים מרמז וקטור fosmid של התאים מכיל מידע גנטי יעד של עניין. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54059/54059fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> </p&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54059/54059fig2.jpg" /> איור 2: הערכת פעילות אנזים שימוש cytometry זרימה מועמדים אנזים metagenomic הוקרן ידי PNP-GESS עם שלושה מצעים שונים (א) אצטט p -nitrophenyl (pNPA), (ב) p -nitrophenyl-β-D-cellobioside (pNPG2), ו. (C) פוספט פניל. כל המועמדים להראות הבדל איתות ברור בין תאים עם ובלי מצע. פקדים הם התאים ללא טיפול המצע המתאים להם. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54059/54059fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54059/54059fig3.jpg" /> איור 3: אני phosphatase אלקלייןdentification. לוח שמאלי מציג הבדל קרינה הברור בין התאים המכילים את האנזים פגע וקטור פלסמיד ריק (Negative). מימין, assay phosphatase של תאים מחסה הגן המועמד phosphatase ב וקטור פלסמיד על אגר LB המכיל פוספט 5-bromo-4-כלורו-3-indolyl כמו מצע colorimetric מוצג. מושבות כחולות עולות כי התאים שנבחרו המכילים את גן metagenomic קידוד phosphatase. ראה 6 לקבלת פרטים נוספים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54059/54059fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> מספר EC </td><td> תיאור </td><td> מספר אנזימים לייצור p-nitrophenol </td><td> מספר אנזימים לייצור פנול </td></tr><tr><td> EC 1 &lt;/ Td&gt; <td> 1.3 </td><td> ממלא מקום על קבוצת CH-CH של תורמים </td><td> - </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Oxidoreductases </td><td> 1.11 </td><td> Peroxygenase </td><td> 2 </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td rowspan="2"> 1.14 </td><td> ממלא מקום על תורמים לזווג, עם התאגדות או </td><td rowspan="2"> - </td><td rowspan="2"> 2 </td></tr><tr><td></td><td> הפחתה של חמצן מולקולרי </td></tr><tr><td> EC 2 </td><td> 2.3 </td><td> Acyltransferases </td><td> 1 </td><td> - </td></tr><tr><td> טרנספראז </td><td> 2.4 </td><td> Glycosyltransferases </td><td> 8 </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td> 2.5 </td><td> קבוצות אלקיל או aryl העברה, למעט קבוצות מתיל </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td></td><td> 2.7 </td><td> העברת קבוצות המכילים זרחן </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td></td><td> 2.8 </td><td> העברת קבוצות המכילות גופרית </td><td> 3 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> EC 3 </td><td> 3.1 </td><td> חוק על אג&quot;ח אסתר </td><td> 67 </td><td> 16 </td></tr><tr><td> Hydrolases </td><td> 3.2 </td><td> Glycosylases </td><td> 75 </td><td> 21 </td></tr><tr><td></td><td> 3.4 </td><td> חוק על קשרים פפטידיים - peptidase </td><td> 26 </td><td> 4 </td></tr><tr><td></td><td> 3.5 </td><td> חוק על קשרי פחמן-חנקן, למעט אג&quot;ח פפטיד </td><td> 5 </td><td> 3 </td></tr><tr><td></td><td> 3.6 </td><td> חוק על אנהידריד חומצה </td><td> 4 </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td> 3.7 </td><td> חוק על קשרי פחמן-פחמן </td><td> 2 </td><td> - </td></tr><tr><td> EC 4 </td><td> 4.1 </td><td> lyases פחמן-פחמן </td><td> - </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Lyases </td><td> 4.2 </td><td> lyases פחמן-חמצן </td><td> 1 </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td> 4.3 </td><td> lyases פחמן-חנקן </td><td> 1 </td><td> - </td></tr><tr><td colspan="3"> מספר סיכום ביניים של אנזימים </td><td> 197 </td><td> 53 </td></tr><tr><td colspan="3"> סה&quot;כ אנזימים (למעט אנזימי חפיפה) </td><td colspan="2"> 211 </td></tr></tbody></table> טבלה 1: מספר אנזימים המייצרים p -nitrophenol או פנול ממסד הנתונים ברנדה.

Watch this Scientific Journal Video about Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System at JoVE.com

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

הקרנה רב-אנזים באמצעות מערכת הקרנת אנזים הגנטי תפוקה גבוהה

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

multi-enzyme-screening-using-high-throughput-genetic-enzyme-screening

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.7K Views.  Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology. This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-β-D-cellobioside, and phenyl phosphate). 

Video: Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper and food industries. A deeper understanding of CAZymes is important from both fundamental biology and industrial standpoints. Vast numbers of CAZymes exist in nature (especially in microorganisms) and hundreds of thousands have been cataloged and described in the carbohydrate active enzyme database (CAZy). However, the rate of discovery of putative enzymes has outstripped our ability to biochemically characterize their activities. One reason for this is that advances in genome and transcriptome sequencing, together with associated bioinformatics tools allow for rapid identification of candidate CAZymes, but technology for determining an enzyme's biochemical characteristics has advanced more slowly. To address this technology gap, a novel high-throughput assay kit based on insoluble chromogenic substrates is described here. Two distinct substrate types were produced: Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates (made from purified polysaccharides and proteins) and Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates (made from complex biomass materials). Both CPH and ICB substrates are provided in a 96-well high-throughput assay system. The CPH substrates can be made in four different colors, enabling them to be mixed together and thus increasing assay throughput. The protocol describes a 96-well plate assay and illustrates how this assay can be used for screening the activities of enzymes, enzyme cocktails, and broths.

A high-throughput assay for enzyme screening is described. This multiplexed ready-to-use assay kit comprises of pre-chosen Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates and complex Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates. Target enzymes are polysaccharide degrading endo-enzymes and proteases.

הקרנת תפוקה גבוהה של אנזימים פחמימות-משפיל שימוש רומן מסיסים chromogenic המצע Assay ערכות

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Biochemistry

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi) holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable cancer cell vulnerabilities. Limiting the potential of this technology is the inability to rapidly delineate the mechanistic basis of phenotypic outcomes and thus inform the development of molecularly targeted therapeutic strategies. We outline here methods to deconstruct cellular phenotypes induced by RNAi-mediated gene targeting using multiplexed reporter systems that allow monitoring of key cancer cell-associated processes. This high-content screening methodology is versatile and can be readily adapted for the screening of other types of large molecular libraries.

Achieving a systems level understanding of cellular processes is a goal of modern-day cell biology. We describe here strategies for multiplexing luciferase reporters of various cellular function end-points to interrogate gene function using genome-scale RNAi libraries.

פלטפורמת הקרנה מבוססת לוציפראז Multiplexed לחקירת מלחמה בסרטן הקשורים להעברת אותות בתאים בתרבית

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

Medicine

A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel production 1. Chemical methods to modify or degrade cellulose typically require strong acids and high temperatures. As such, enzymatic methods have become prominent in the bioconversion process. While the identification of active cellulases from bacterial and fungal isolates has been somewhat effective, the vast majority of microbes in nature resist laboratory cultivation. Environmental genomic, also known as metagenomic, screening approaches have great promise in bridging the cultivation gap in the search for novel bioconversion enzymes. Metagenomic screening approaches have successfully recovered novel cellulases from environments as varied as soils 2, buffalo rumen 3 and the termite hind-gut 4 using carboxymethylcellulose (CMC) agar plates stained with congo red dye (based on the method of Teather and Wood 5). However, the CMC method is limited in throughput, is not quantitative and manifests a low signal to noise ratio 6. Other methods have been reported 7,8 but each use an agar plate-based assay, which is undesirable for high-throughput screening of large insert genomic libraries. Here we present a solution-based screen for cellulase activity using a chromogenic dinitrophenol (DNP)-cellobioside substrate 9. Our library was cloned into the pCC1 copy control fosmid to increase assay sensitivity through copy number induction 10. The method uses one-pot chemistry in 384-well microplates with the final readout provided as an absorbance measurement. This readout is quantitative, sensitive and automated with a throughput of up to 100X 384-well plates per day using a liquid handler and plate reader with attached stacking system.

This protocol describes a high throughput screen for cellulolytic activity from a metagenomic library expressed in Escherichia coli. The screen is solution based and highly automated, and uses one-pot chemistry in 384 well microplates with the final readout as an absorbance measurement.

מסך התפוקה גבוהה עבור Biomining פעילות cellulase מספריות Metagenomic

Cellulose, the most abundant source of organic carbon on the planet, has wide-ranging industrial applications with increasing emphasis on biofuel ...

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

תפוקה גבוהה Overexpression פלסמיד שמרים מסך

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

הקרנת תפוקה גבוהה של פעילות Endoglucanase פטרייתיים ב Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

הקרנה פונקציונלית תפוקה גבוהה באמצעות assay בלוציפראז Dual-זוהר תוצרת בית

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

זיהוי של זוגות קינאז-מצע שימוש הקרנת תפוקה גבוהה


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived inheritance encoded in protein conformation (rather than sequence) has long been viewed as paradigm-shifting but rare. The best characterized examples of such epigenetic elements are prions, which possess a self-assembling behavior that can drive the heritable manifestation of new phenotypes. Many archetypal prions display a striking N/Q-rich sequence bias and assemble into an amyloid fold. These unusual features have informed most screening efforts to identify new prion proteins. However, at least three known prions (including the founding prion, PrPSc) do not harbor these biochemical characteristics. We therefore developed an alternative method to probe the scope of protein-based inheritance based on a property of mass action: the transient overexpression of prion proteins increases the frequency at which they acquire a self-templating conformation. This paper describes a method for analyzing the capacity of the yeast ORFeome to elicit protein-based inheritance. Using this strategy, we previously found that &gt;1% of yeast proteins could fuel the emergence of biological traits that were long-lived, stable, and arose more frequently than genetic mutation. This approach can be employed in high throughput across entire ORFeomes or as a targeted screening paradigm for specific genetic networks or environmental stimuli. Just as forward genetic screens define numerous developmental and signaling pathways, these techniques provide a methodology to investigate the influence of protein-based inheritance in biological processes.

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

This protocol describes a high-throughput methodology to functionally screen for protein-based inheritance in S. cerevisiae.

הקרנה תפוקה גבוהה של חלבון מבוססת ירושה cerevisiae ס

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived ...

Genetic Screens

Genetic screens are critical tools for defining gene function and understanding gene interactions. Screens typically involve mutating genes and then assessing the affected organisms for phenotypes of interest. The process can be &#8220;forward&#8221;, where mutations are generated randomly to identify unknown genes responsible for the phenotypes, or it can be &#8220;reverse&#8221;, where specific genes are targeted for mutation to observe what phenotypes are produced.Here, JoVE reviews various types of genetic screens, including those that depend on either loss-of-function or gain-of-function mutations, which respectively decrease or increase the activity of genes. We then explore general protocols for forward and reverse screens in a popular model organism, the nematode worm. Finally, we highlight how screens are applied in research today, for example to better understand gene interactions that may contribute to neurodegenerative diseases.

Forward and Reverse Genetic Screens

מסכים גנטיים

Genetic screens are critical tools for defining gene function and understanding gene interactions. Screens typically involve mutating genes and then ...