Questa ricerca è stata sostenuta dalla nazionale istituti di salute contrastare programma Interagency accordo # AOD13015-001. Vorremmo ringraziare Stephanie Froberg e Peter Hurst per l'impegno e la competenza sulla produzione video.

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.
DISCLAIMER: le opinioni espresse in questo articolo sono quelle degli autori e non riflettono la politica ufficiale del dipartimento dell'esercito, dipartimento della difesa o il governo degli Stati Uniti. Questa ricerca è stata sostenuta da un accordo tra agenzie tra NIH/NIAID e il USAMRICD e in parte da un appuntamento per il programma di partecipazione di ricerca post-laurea presso esercito medico Research Institute della chimica difesa amministrata dal rovere Istituto di crinale per scienza e formazione attraverso un accordo tra agenzie tra l'US Department of Energy e USAMRMC.

Qui descriviamo i nostri metodi e risultati sullo sviluppo di una cellula epiteliale di cornea elevato throughput screening modello per lo studio delle lesioni HF e CP. Inoltre presentiamo i risultati dalla schermata principale siRNA per lesioni HF. C'erano molte sfide per lo sviluppo di modelli HTS per lo studio delle lesioni TIC. Metodi che potremmo trovare nella letteratura relazionata allo studio di HF, HFA o CP in modelli di coltura cellulare erano di poco aiuto. Maggior parte dei studi in vitro sullo ione fluoruro coinvolgono cellule orali e utilizzate il fluoruro di sodio e non HF o HFA (per alcuni esempi, vedere28,29). Alcuni metodologia sull'esposizione in vitro di cellule epiteliali bronchiali al CP è stata pubblicata da Pesonen et al. 30. in definitiva, abbiamo non trovato nessun metodi specifici in letteratura relazionata allo studio HTS di HF, HFA o CP, e la maggior parte delle sfide e variabili relazionate allo studio di queste sostanze tossiche in sviluppo HTS richiesto. Particolare attenzione è stata dedicata a raggiungere l'elevato grado di coerenza di esposizione attraverso il tempo e numerose piastre di screening necessari per uno studio HTS successo.
Un tipo di sfida incontrato era imparentato con l'applicazione del tossico a sistemi di coltura cellulare. Alcune sostanze tossiche sono reattivi con o instabile in soluzioni acquose. Le sostanze tossiche che abbiamo selezionato per lo studio non sono considerati come aventi questi problemi di instabilità. Uno studio agricolo indagando photohydrolysis di CP ha mostrato che una soluzione 0.001 M di CP in acqua aveva un tempo di dimezzamento di 31,1 h quando esposto ad una sorgente luminosa del xeno di 1100 lux (intensità di luce del sole di una giornata nuvolosa) per 10 giorni, 12 ore al giorno31. Non c'era nessuna idrolisi misurabili rispetto allo stesso periodo di 10 giorni, quando la soluzione è stata conservata al buio. Lo ione fluoruro e protone di HFA sono chiaramente stabile in acqua. Ci sono, tuttavia, considerazioni di maggiore stabilità per quanto riguarda le diluizioni tossico nel mezzo di coltura cellulare. Abbiamo trovato che c'era un cambiamento iniziale di citotossicità in una certa misura, quando le sostanze tossiche in primo luogo sono stati diluiti in mezzo di coltura cellulare che poi si stabilizza dopo un breve periodo di tempo. Crediamo che questo sia dovuto il legame tossico o complessanti con costituenti nel mezzo. Medium cellulare contiene calcio, magnesio, proteine, ecc che sono noti per interagire con il fluoruro ioni32,33. CP è noto per avere reazioni ossidative con tioli biologici, ma può anche associare il DNA, proteine e altri nucleofili34,35. Una volta che queste reazioni e interazioni hanno completato o raggiunto l'equilibrio, la quantità di sostanza tossica disponibile stabilizza e così si stabilizza la citotossicità apparente. Inizialmente abbiamo esplorato l'uso di soluzione salina e acqua diluizioni di sostanze tossiche per gli stock di lavoro utilizzato per esposizioni per evitare interazioni tossico con medie costituenti in diluizioni di lavoro. L'uso di soluzione salina sarebbe anche preservare la componente acida della ferita HFA per esposizioni eseguite da exchange medie. Abbiamo trovato che le risposte di morte delle cellule alle sostanze tossiche in acqua e soluzione saline diluizioni erano più variabile rispetto al metodo che utilizzate diluizioni di terreno di coltura cellulare con cambio medio (dati non mostrati). Per quanto riguarda il metodo di esposizione di picco con HFA, la variabilità può essere a causa di un'incoerenza nel picco disperdente nel bene a bersagli cellulari in competizione con medie costituenti per lo ione fluoruro disponibili. Le ragioni per la variabilità nelle esposizioni HFA da media exchange con diluizioni saline HFA non sono completamente chiare. In ogni caso, metodi di esposizione utilizzando diluizioni saline per HFA erano abbandonati e non esplorati per CP. La tossicità del nostro diluizioni HFA in mezzo probabilmente strettamente imita gli studi facendo uso di fluoruro di sodio perché medium delle cellule buffer il protone libero nel nostro diluizioni HFA.
Altre sfide che abbiamo incontrato erano legate alla raffinatezza dei modelli di coltura cellulare per l'uso in HTS Ci è sembrato necessario modificare i costituenti di terreno di coltura delle cellule per le celle di sperimentazione, in particolare l'idrocortisone e antibiotici. Abbiamo utilizzato un basso livello di idrocortisone (0,5 µ g/mL) durante gli studi di esposizione per sopprimere il picco occasionale nella produzione di citochina visto in ingenuo SV40-HCEC. Questa bassa quantità di idrocortisone non ha colpito avversamente le risposte delle cellule al tossico ed era di sotto livelli in genere usati per sopprimere la produzione di citochine dalle cellule coltivate in risposta a stimolante36,37. Non si conoscono i motivi esatti perché le cellule naive SV40-HCEC occasionalmente producono citochine in eccesso, ma è possibile che le cellule sono variabilmente sensibile ai fattori di stress minori che si verificano durante la cella di passaggio e di placcatura. Molti laboratori sono ordinariamente antibiotici in mezzo di manutenzione di coltura cellulare, ma alcuni antibiotici, tetracicline, in particolare, sono state indicate per esibire gli effetti anti-infiammatori sulle cellule coltivate tra cui cellule epiteliali corneali38. In generale, il nostro laboratorio evita l'uso di antibiotici quando possibile, poiché questi possono potenzialmente confondere gli studi. Inoltre abbiamo studiato la deriva fenotipica sopra passaggi multipli delle nostre cellule in coltura. È comune per le cellule immortalizzate per subire deriva genetica e/o fenotipica sopra passaggi multipli, se non mantenute nella fase esponenziale, in se di raggiungere confluency, o se esposti a determinati fattori di stress ambientale39,40 ,41. Pertanto, è fondamentale durante un schermo di throughput elevato che le linee cellulari sono adeguatamente mantenute e che lo schermo viene completato utilizzando numeri di passaggio delle cellule che mantengono la risposta fenotipica conosciuta. Effetti di bordo piastra multi-pozzetto è il fenomeno che le cellule coltivate in pozzetti di piastre multi-pozzetto perimetro esterno spesso non rispondono lo stesso o con la stessa consistenza le cellule coltivate in interni pozzi42. Ci sono esercizi di statistici, come il mediano polacco, che possono essere utilizzate per ridurre al minimo gli effetti di bordo su un set di dati43. Tuttavia, non esiste nessun esercizio statistico che può eliminare effetti di bordo su un obiettivo particolare o un controllo, se è sempre testato in un pozzo di bordo e variando il layout di piastra tra replica per spostare gli obiettivi o i controlli al largo di pozzi di bordo non è logisticamente pratico o costo effettivo. È nostra opinione che la decisione di includere l'uso dei pozzi di bordo nelle analisi cell-based di HTS dovrebbe essere fatto con cautela. Ci è sembrato necessario per eliminare l'uso di cellule cresciute in pozzi di bordo per i controlli e gli obiettivi.
La nostra metodologia HTS modello e l'esposizione di cellule per in vitro lesioni HF è stato utilizzato per completare con successo lo schermo primario siRNA di 3120 bersagli. SSMD è stato utilizzato per la selezione ha colpito perché è stato proposto in modo specifico per misurare la grandezza della differenza tra un controllo e un siRNA27. I nostri risultati per attuabilità delle cellule indicano che c'era una relazione lineare nella trama dual-torcia tra SSMD e piega-cambiamento per praticamente tutti gli obiettivi. Per questo motivo, abbiamo usato l'unico criterio di SSMD per colpire selezione per questo endpoint. I dati di IL-8 ha differito da in quanto alcuni obiettivi ha avuto effetti deboli ma costanti, mentre altri hanno mostrato effetti forti ma incoerenti. Di conseguenza, abbiamo usato sia piega-cambiamento e SSMD per i criteri di selezione hit per questo endpoint. I valori SSMD utilizzati per colpire selezione per entrambi la vitalità cellulare e dati di IL-8 sono stati scelti perché tagli tra 1 e 1.645 (o -1 e-1.65) ottenere basso scoperta falsa e non-scoperta tariffe44. C'erano alcuni obiettivi che sono stati successi in dati di IL-8 sia la vitalità cellulare. In questi casi, è stata data la preferenza per l'inclusione nella libreria di deconvoluzione al conseguimento degli obiettivi che ha esercitato i loro effetti nella stessa direzione di migliorare la salute generale (una migliore redditività e in diminuzione di IL-8) o esacerbare la ferita (morte aumentata delle cellule e aumentato IL-8). Nel complesso, abbiamo selezionato un totale di 250 destinazioni tra l'attuabilità delle cellule e gli endpoint di IL-8 per rendere la libreria di deconvoluzione per infortunio di HF. La schermata principale per la ferita in vitro CP è in corso.
In sintesi, abbiamo sviluppato l'esposizione e la cultura condizioni idonee per lo studio HTS della ferita oculare di HF e CP. Diverse variabili in condizioni di esposizione e la cultura sono state raffinate e ottimizzate, e i modelli sono stati convalidati per essere adatto a studi HTS di Z' analisi dei fattori. Abbiamo ulteriormente dimostrato l'utilità di questi modelli completando la schermata principale di una libreria di siRNA nel modello HF. Ci sono molti infortuni e malattie che sono di no o limitato interesse farmaceutico o industria biotech, lesioni tossico di CP e HF incluso e l'avvento della robotica benchtop facilita lo studio HTS di infortuni e malattie in qualsiasi laboratorio . Dati genomici elevato throughput insiemi possono notevolmente contribuire alla comprensione dei ruoli che specifici geni giocano a infortunio o malattia che può aiutare a concentrarsi in modo più efficiente seguono gli studi in vitro o in vivo .

Lesione oculare indotta da tossico è una vera emergenza oculare perché prodotti chimici hanno il potenziale per rapidamente infliggere danni ai tessuti significativi. Purtroppo, trattamenti per lesione corneale indotta da tossico sono generalmente solidale solo come terapie specifiche non esistono per trattare queste lesioni. L'attuale strategia di trattamento è aspecifica e comprende principalmente trattamenti topici terapeutici come lubrificanti, antibiotici, e cycloplegics seguita da antinfiammatori (ad es., steroidi) una volta la cornea ha re-epithelialized1 ,2. Nonostante il migliore trattamento terapeutico opzioni correnti disponibili, prognosi a lungo termine è generalmente scarsa a causa di appannamento corneale progressiva e neovascolarizzazione2,3.
Modelli animali sono stati utilizzati tradizionalmente per tossicità chimica di studiare e comprendere i meccanismi della ferita. Tuttavia, gli studi sugli animali sono lunghe e costose. Ci sono anche gli sforzi per ridurre la sperimentazione animale. Ad esempio, la normativa REACH (CE 1907/2006) dell'Unione europea ha disposizioni destinate a ridurre la sperimentazione. Le disposizioni sono un requisito che aziende condividono dati al fine di evitare la sperimentazione animale e ottenere l'approvazione dall'Agenzia chimica europea prima di eseguire i test proposti sugli animali. Ai sensi delle disposizioni del regolamento REACH, sperimentazione animale dovrebbe essere l'ultima risorsa. C'è anche il regolamento Cosmetici europeo (CE 1223/2009) che gradualmente la sperimentazione dei cosmetici negli animali. Quando vengono effettuati studi sull'animale, sono guidati dai principi di 3R (raffinatezza, riduzione e sostituzione), che forniscono un quadro per eseguire ricerca animale più umana, riducendo il numero di animali utilizzati e l'utilizzo delle alternative non animali ove possibile. Per questi motivi, il campo della tossicologia ha cercato di adottare saggi in vitro che possono fornire la comprensione nei meccanismi molecolari di tossicità e possono essere fatto in maggiore velocità di trasmissione4. Si tratta di un approccio funzionale tossicologia cui sostanze tossiche sono definite dalla loro funzione, piuttosto che esclusivamente da loro chimica. Compiuto un passo in avanti, funzionale toxicogenomics cercano di capire il ruolo che specifici geni svolgono negli effetti di sostanze tossiche5. Con l'applicazione della tecnologia siRNA, schermi per studiare la funzione del gene nelle risposte molecolari e cellulari alle sostanze tossiche possono essere fatto in alto throughput. siRNA sono molecole di RNA incagliati doppi che sono 19-25 nucleotidi lunghi che sfruttano la presente in tutte le cellule di mammiferi6via post silenziamento trascrizionale del gene. Questi sono sinteticamente fatto e progettati per indirizzare un gene specifico. Quando introdotti in una cella, viene elaborato il siRNA e un filo, il filo guida, viene caricato il complesso di silenziamento indotto da RNA (RISC). Gli siRNA dirige il RISC ad una regione complementare in una molecola di mRNA, e il RISC degrada il mRNA. Questo comporta la riduzione dell'espressione del gene specifico. La conseguente riduzione dell'espressione del gene specifico può essere studiata quindi nelle cellule esposte tossico per accertare la funzione di quel gene nella risposta cellulare alla sostanza tossica. Tale approccio è stato utilizzato per capire meglio i meccanismi di suscettibilità di ricina e l'induzione di AHR-dipendente di CYP1A17,8.
L'elenco di valutazione di rischio del terrorismo chimico (CTRA) e gli elenchi di prodotti chimici industriali tossici (TIC) sono riportati in dettaglio selezionare prodotti chimici basati sulla loro tossicità e il potenziale per essere rilasciato nel corso di un terrorista, guerra o incidente industriale evento9. Stiamo applicando un throughput elevato di siRNA (HTS) toxicogenomic metodo per lo studio delle sostanze tossiche di elenco CTRA, che sono stati identificati per essere ad alto rischio di uso in un atto terroristico della selezione. Tossicologia tradizionale cerca di comprendere gli effetti avversi che hanno sostanze chimiche sugli organismi viventi; Tuttavia, abbiamo un ulteriore desiderio di comprendere i meccanismi della ferita allo scopo di informare lo sviluppo di terapeutica e approcci terapeutici e possibilmente, per scoprire le molecole che possono essere mirate per lo sviluppo terapeutico. Questo sforzo in un certo senso può essere considerato analogo all'uso di screening su vasta scala siRNA e saggi di cellulare basato nella droga scoperta processo10. Una differenza principale sarebbe che l'individuazione della droga tipicamente cerca una destinazione singolare per la scoperta terapeutica, considerando che il nostro approccio è alquanto improbabile che ci sarebbe una destinazione singolare con alto valore terapeutico per il trattamento dell'esposizione tossico. Prevediamo che qualsiasi paradigma di trattamento efficace per l'esposizione tossico richiederebbe un approccio multi-angolare per raggiungere alto valore terapeutico, e toxicogenomic dati vitale possono informare un paradigma di trattamento efficace.
Automazione del laboratorio porta metodologia throughput elevato ai laboratori fuori le industrie farmaceutiche o biotecnologiche. Gli studi in vitro al nostro Istituto sono state storicamente le analisi tradizionali che sono di bassa velocità effettiva11,12,13. Negli ultimi anni, il nostro laboratorio ha eseguito la transizione per l'utilizzo della robotica da banco per eseguire screening su vasta scala siRNA. Qui, presentiamo la raffinatezza dei modelli cellulari oculare e lo sviluppo in vitro di metodi di esposizione per acido fluoridrico (HF) e cloropicrina (CP) adatto per screening su vasta scala siRNA. Il nostro obiettivo è quello di identificare molecole che regolano la lesione cellulare in risposta a queste sostanze tossiche. Gli obiettivi della biblioteca siRNA che abbiamo selezionato sono recettori accoppiati a proteine G, proteinchinasi, proteasi, fosfatasi, canali ionici e altri potenzialmente bersagli. HF e CP sono stati selezionati per lo studio incrociando CTRA elenco agenti con i rapporti ToxNet degli incidenti industriali per trovare quelli che presentano il maggior rischio di lesioni oculari tramite vapore esposizione9,14. CP (formula chimica Cl3CNO2, numero CAS 76-06-2) è stato originariamente utilizzato come un gas lacrimogeni in WWI15. Attualmente è stato utilizzato come un fumigante agricolo e funzioni come un insetticida, fungicida e nematocida16. Acido fluoridrico (HF) è utilizzato nei processi tra cui di alchilazione in raffinerie di petrolio e fluorurazione elettrochimica di composti organici17. HF (formula chimica HF, numero CAS 62778-11-4) è un gas, ma nella sua forma acquosa è l'acido fluoridrico (HFA, CAS 7664-39-3 di numero). Pertanto, abbiamo scelto di utilizzare HFA nella nostra cella in modelli di esposizione. Il grande T antigene SV40 immortalato linea di cellule epiteliali corneali umane CHE SV40-HCEC è stato selezionato per lo studio. La vitalità cellulare e il marcatore infiammatorio IL-8 sono stati selezionati come endpoint perché gli obiettivi che sono coinvolti nella lesione cellulare dovrebbero riflettersi nella morte delle cellule e la risposta infiammatoria. In particolare, se una destinazione dovesse svolgere un ruolo protettivo nell'esposizione tossico, morte delle cellule e/o la produzione di citochine infiammatorie dovrebbe aumentare quando l'espressione di destinazione è inibita da siRNA. Il contrario sarebbe vero per gli obiettivi che giocano un ruolo negativo. Inoltre, l'infiammazione cronica sembra svolgere un ruolo nella patologia della cornea dopo l'esposizione e l'intervento nelle vie di morte delle cellule può migliorare il risultato clinico2,18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:879px;" width="880">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Bravo liquid handing platform</td>
			<td style="width:247px;">Agilent or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">G5409A</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Bravo plate shaker</td>
			<td style="width:247px;">Agilent or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">Option 159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Bravo 96LT disposable tip head</td>
			<td style="width:247px;">Agilent or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">Option 178</td>
			<td>96-channel large tip pipetting head unit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Bravo 96ST disposable tip head</td>
			<td style="width:247px;">Agilent or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">Option 177</td>
			<td>96-channel small tip pipetting head unit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Bravo 384ST disposable tip head</td>
			<td style="width:247px;">Agilent or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">Option 179</td>
			<td>384-channel small tip pipetting head unit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Bravo 96 250 &#956;L sterile barrier tips</td>
			<td style="width:247px;">Agilent or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">19477-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Bravo 384 30 &#956;L sterile barrier tips</td>
			<td style="width:247px;">Agilent or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">19133-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Bravo 384 70 &#956;L sterile barrier tips</td>
			<td style="width:247px;">Agilent or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">19133-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">EnSpire multimode plate reader</td>
			<td style="width:247px;">Perkin Elmer or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">2300-0000</td>
			<td>AlphaLISA assay detector with high power laser excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit&#160;</td>
			<td style="width:247px;">Perkin Elmer or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">AL224F</td>
			<td>no-wash bead-based assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates</td>
			<td style="width:247px;">Perkin Elmer or equivalent</td>
			<td>6008359</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td style="width:247px;">Invitrogen or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">13778500</td>
			<td>Transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:247px;">Invitrogen or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">TrypLE Express</td>
			<td style="width:247px;">Gibco or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">12605010</td>
			<td>Cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">IncuCyte Zoom</td>
			<td style="width:247px;">Essen Instruments or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">ESSEN BIOSCI 4473</td>
			<td>Incubator-housed automated microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Chloropicrin</td>
			<td style="width:247px;">Trinity Manufacturing or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Acute toxicity and irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">DMEM-F12 cell culture medium</td>
			<td style="width:247px;">Invitrogen or equivalent</td>
			<td>11330-057</td>
			<td>Contains HEPES</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:247px;">Invitrogen or equivalent</td>
			<td>1891471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Human epidermal growth factor (cell culture grade)</td>
			<td style="width:247px;">Invitrogen or equivalent</td>
			<td>E9644-.2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Recombinant human insulin (cell culture grade)</td>
			<td style="width:247px;">Invitrogen or equivalent</td>
			<td>12585-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade)</td>
			<td style="width:247px;">Invitrogen or equivalent</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Hydrocortisone (cell culture grade)</td>
			<td style="width:247px;">Sigma or equivalent</td>
			<td>H0888-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Glucose&#160; (cell culture grade)</td>
			<td style="width:247px;">Sigma or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">PBS&#160; (cell culture grade)</td>
			<td style="width:247px;">Sigma or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">P5493</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">siRNA</td>
			<td style="width:247px;">Dharmacon or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiazolyl blue tetrazolium bromide</td>
			<td style="width:247px;">Sigma or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">M5655</td>
			<td>MTT assay substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">siRNA buffer</td>
			<td style="width:247px;">Thermo or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">B002000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">96-well cell culture plates</td>
			<td style="width:247px;">Corning or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">CLS3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">T150 cell culture flasks</td>
			<td style="width:247px;">Corning or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">CLS430825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">BSL-2 cell culture hood</td>
			<td style="width:247px;">Nuaire or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">NU-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">300 mL robotic reservoirs</td>
			<td style="width:247px;">Thermo or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">12-565-572&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">96 baffled automation reservoirs</td>
			<td style="width:247px;">Thermo or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">1064-15-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">500 mL sterile disposable storage bottles</td>
			<td style="width:247px;">Corning or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">CLS430282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Microplate heat sealer</td>
			<td style="width:247px;">Thermo or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">AB-1443A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Microplate heat sealing foil</td>
			<td style="width:247px;">Thermo or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">AB-0475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Cardamonin</td>
			<td style="width:247px;">Tocris or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">2509</td>
			<td>Anti-inflammatory, used as positive control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">SKF 86002&#160;</td>
			<td style="width:247px;">Tocris or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">2008</td>
			<td>Anti-inflammatory, used as positive control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">DMSO</td>
			<td style="width:247px;">Sigma or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">48% hydrofluoric acid</td>
			<td style="width:247px;">Sigma or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">339261</td>
			<td>Corrosive and acute toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">1000 &#956;L Single channel pipettors</td>
			<td style="width:247px;">Rainin or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">17014382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">200 &#956;L Single channel pipettors</td>
			<td style="width:247px;">Rainin or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">17014391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">20 &#956;L Single channel pipettors</td>
			<td style="width:247px;">Rainin or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">17014392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">1000 &#956;L 12-channel pipettors</td>
			<td style="width:247px;">Rainin or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">17014497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">200 &#956;L 12-channel pipettors</td>
			<td style="width:247px;">Rainin or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">17013810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">20 &#956;L 12-channel pipettors</td>
			<td style="width:247px;">Rainin or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">17013808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Pipettor tips 1000 &#956;L</td>
			<td style="width:247px;">Rainin or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">17002920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Pipettor tips 200 &#956;L</td>
			<td style="width:247px;">Rainin or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">17014294</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Pipettor tips 20 &#956;L</td>
			<td style="width:247px;">Rainin or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">17002928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Chemical fume hood</td>
			<td style="width:247px;">Jamestown Metal Products</td>
			<td style="width:119px;">MHCO_229</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">384-well sample storage plates</td>
			<td style="width:247px;">Thermo or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">262261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:247px;">Sigma or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">S6191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:247px;">Thermo or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">14-959-49A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Serological pipettes 50 mL</td>
			<td style="width:247px;">Corning or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">07-200-576</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Serological pipettes 25 mL</td>
			<td style="width:247px;">Corning or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">07-200-575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Serological pipettes 10 mL</td>
			<td style="width:247px;">Corning or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">07-200-574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Serological pipettes 5 mL</td>
			<td style="width:247px;">Corning or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">07-200-573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cells</td>
			<td style="width:247px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>These cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Sceptor Handheld Automated Cell Counter</td>
			<td style="width:247px;">Millipore or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">PHCC20060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument</td>
			<td style="width:247px;">Affymetrix or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">00-0372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Affymetrix 24- and 96-array plates</td>
			<td style="width:247px;">Affymetrix or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">901257; 901434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Draegger tube HF</td>
			<td style="width:247px;">Draeger or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">8103251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Draegger tube CP</td>
			<td style="width:247px;">Draeger or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">8103421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Draegger pump</td>
			<td style="width:247px;">Draeger or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">6400000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:347px;">Clear Plate seals</td>
			<td style="width:247px;">Resesarch Products International or Equivalent</td>
			<td style="width:119px;">202502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Reagent reservoirs</td>
			<td style="width:247px;">VistaLab Technologies or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">3054-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Xlfit</td>
			<td style="width:247px;">IDBS or equivalent</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Excel add-in used for automated curve fitting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput sirna screening for chloropicrin and hydrogen fluoride-induced cornea epithelial cell injury

Lesione oculare indotta da tossico è una vera emergenza oculare perché prodotti chimici hanno il potenziale per rapidamente infliggere danni ai tessuti significativi. Trattamenti per lesione corneale indotta da tossico sono generalmente solidale come nessun terapeutica specifica esiste per il trattamento di queste lesioni. Negli sforzi per sviluppare trattamenti e terapie di cura per l'esposizione, può essere importante capire i meccanismi cellulari e molecolari di queste lesioni. Proponiamo che l'utilizzo di screening inibitorio piccoli RNA (siRNA) su vasta scala può essere uno strumento importante che potrebbe contribuire a delucidare più rapidamente i meccanismi molecolari di lesioni epiteliali cornea chimica. siRNA sono doppio incagliati molecole RNA che sono 19-25 nucleotidi lunghi e utilizzano il percorso per degradare mRNA il silenziamento genico post-trascrizionale che hanno omologia al siRNA. La conseguente riduzione dell'espressione del gene specifico può essere studiata quindi nelle cellule esposte tossico per accertare la funzione di quel gene nella risposta cellulare alla sostanza tossica. Lo sviluppo e la validazione di modelli di esposizione in vitro e metodiche per l'alto throughput screening (HTS) di fluoruro di idrogeno (HF) e cloropicrina-(CP) indotto ferita oculare sono presentati in questo articolo. Sebbene abbiamo scelto queste due sostanze tossiche, i nostri metodi sono applicabili allo studio di altre sostanze tossiche con lievi modifiche al protocollo esposizione tossico. Il grande T antigene SV40 immortalato linea di cellule epiteliali corneali umane CHE SV40-HCEC è stato selezionato per lo studio. La vitalità cellulare e la produzione di IL-8 sono stati selezionati come endpoint nel protocollo di screening. Diverse sfide associate con lo sviluppo dell'esposizione tossico e metodi di coltura cellulare adatti per studi HTS sono presentati. La creazione di modelli HTS per queste sostanze tossiche consente ulteriori studi per capire meglio il meccanismo della ferita e alla schermata per potenziali terapie per ferita oculare chimica.

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High Throughput SiRNA Screening for Chloropicrin and Hydrogen Fluoride-Induced Cornea Epithelial Cell Injury

Screening RNA inibitorio piccolo su vasta scala è uno strumento importante che potrebbe contribuire a delucidare più rapidamente i meccanismi molecolari di lesioni epiteliali cornea chimica. Qui, presentiamo lo sviluppo e la convalida dei modelli di esposizione e dei metodi per lo screening di elevato throughput di indotta da acido fluoridrico e cloropicrina lesioni epiteliali cornea.

High Throughput Screening SiRNA per lesione delle cellule epiteliali cloropicrina e Cornea indotta da acido fluoridrico

Toxicant-induced ocular injury is a true ocular emergency because chemicals have the potential to rapidly inflict significant tissue damage. Treatments ...

high-throughput-sirna-screening-for-chloropicrin-hydrogen-fluoride

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

5.8K Views.  US Army Medical Research Institute of Chemical Defense. Screening RNA inibitorio piccolo su vasta scala è uno strumento importante che potrebbe contribuire a delucidare più rapidamente i meccanismi molecolari di lesioni epiteliali cornea chimica. Qui, presentiamo lo sviluppo e la convalida dei modelli di esposizione e dei metodi per lo screening di elevato throughput di indotta da acido fluoridrico e cloropicrina lesioni epiteliali cornea.

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High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes. However, many compounds identified in screens using cell culture models are often found to be toxic or pharmacologically inactive in vivo1-2. Screening in whole animal models can help avoid these pitfalls and streamline the path to drug development.
C. elegans is a multicellular model organism well suited for HTS. It is small (&lt;1 mm) and can be economically cultured and dispensed in liquids. C. elegans is also one of the most experimentally tractable animal models permitting rapid and detailed identification of drug mode-of-action3.
We describe a protocol for culturing and dispensing fluorescent strains of C. elegans for high-throughput screening of chemical libraries or detection of environmental contaminants that alter the expression of a specific gene. Large numbers of developmentally synchronized worms are grown in liquid culture, harvested, washed, and suspended at a defined density. Worms are then added to black, flat-bottomed 384-well plates using a peristaltic liquid dispenser. Small molecules from a chemical library or test samples (e.g., water, food, or soil) can be added to wells with worms. In vivo, real-time fluorescence intensity is measured with a fluorescence microplate reader. This method can be adapted to any inducible gene in C. elegans for which a suitable reporter is available. Many inducible stress and developmental transcriptional pathways are well defined in C. elegans and GFP transgenic reporter strains already exist for many of them4. When combined with the appropriate transgenic reporters, our method can be used to screen for pathway modulators or to develop robust biosensor assays for environmental contaminants. 
We demonstrate our C. elegans culture and dispensing protocol with an HTS assay we developed to monitor the C. elegans cap &#x2018;n&#x2019; collar transcription factor SKN-1. SKN-1 and its mammalian homologue Nrf2 activate cytoprotective genes during oxidative and xenobiotic stress5-10. Nrf2 protects mammals from numerous age-related disorders such as cancer, neurodegeneration, and chronic inflammation and has become a major chemotherapeutic target11-13.Our assay is based on a GFP transgenic reporter for the SKN-1 target gene gst-414, which encodes a glutathione-s transferase6. The gst-4 reporter is also a biosensor for xenobiotic and oxidative chemicals that activate SKN-1 and can be used to detect low levels of contaminants such as acrylamide and methyl-mercury15-16.

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

A procedure for liquid-based culturing and dispensing of C. elegans strains expressing fluorescent reporter proteins is described that does not require expensive sorting equipment. This approach can be applied to numerous inducible C. elegans genes for drug discovery or biosensing of contaminants.

High-throughput screening e biopercezione con fluorescente C. elegans Ceppi

High-throughput screening (HTS) is a powerful approach for identifying chemical modulators of biological processes.  However, many compounds identified in ...

Ricerca

Biologia

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

High-throughput iperespressione schermo lievito plasmidi

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

Throughput Screening elevati di attività Endoglucanase fungine in Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

High-throughput screening per la piccola molecola modulatori di canali di potassio Inward Rectifier

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with Parkinson&#39;s disease. 293T cells are transiently transfected with plasmids from an arrayed ORF expression library, together with luciferase reporter plasmids, in a one-gene-per-well microplate format. Firefly luciferase activity is assayed after 48 hr to determine the effects of each library gene upon alpha-synuclein transcription, normalized to expression from an internal control construct (a hCMV promoter directing Renilla luciferase). This protocol is facilitated by a bench-top robot enclosed in a biosafety cabinet, which performs aseptic liquid handling in 96-well format. Our automated transfection protocol is readily adaptable to high-throughput lentiviral library production or other functional screening protocols requiring triple-transfections of large numbers of unique library plasmids in conjunction with a common set of helper plasmids. We also present an inexpensive and validated alternative to commercially-available, dual luciferase reagents which employs PTC124, EDTA, and pyrophosphate to suppress firefly luciferase activity prior to measurement of Renilla luciferase. Using these methods, we screened 7,670 human genes and identified 68 regulators of alpha-synuclein. This protocol is easily modifiable to target other genes of interest.

We present a rapid and inexpensive screening method for identifying transcriptional regulators using high-throughput robotic transfections and a homemade dual-glow luciferase assay. This protocol rapidly generates direct side-by-side functional data for thousands of genes and is easily modifiable to target any gene of interest.

High-throughput screening funzionale utilizzando una casalinga Dual-glow Luciferase Assay

We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Recupero di Zebrafish adulti cuori per applicazioni ad alta velocità effettiva

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Screening ad alto rendimento per i modulatori chimici di Genes post-trascrizionale regolamentati

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identificazione delle coppie Kinase-substrato Usando High Throughput Screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a large-scale metagenomic library1. We previously proposed a genetic enzyme screening system (GESS) that uses dimethylphenol regulator activated by phenol or p-nitrophenol. Since a vast amount of natural enzymatic reactions produce these phenolic compounds from phenol deriving substrates, this single genetic screening system can be theoretically applied to screen over 200 different enzymes in the BRENDA database. Despite the general applicability of GESS, applying the screening process requires a specific procedure to reach the maximum flow cytometry signals. Here, we detail the developed screening process, which includes metagenome preprocessing with GESS and the operation of a flow cytometry sorter. Three different phenolic substrates (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate) with GESS were used to screen and to identify three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase), respectively. The selected metagenomic enzyme activities were confirmed only with the flow cytometry but DNA sequencing and diverse in vitro analysis can be used for further gene identification.

This work presents a method of high-throughput screening using a universal genetic enzyme screening system that can be theoretically applied to over 200 enzymes. Here, the single screening system identifies three different enzymes (lipase, cellulase, and alkaline phosphatase) by simply changing the substrate used (p-nitrophenyl acetate, p-nitrophenyl-&#946;-D-cellobioside, and phenyl phosphate).

Multi-enzima screening utilizzando un high-throughput genetica Enzyme Screening System

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived inheritance encoded in protein conformation (rather than sequence) has long been viewed as paradigm-shifting but rare. The best characterized examples of such epigenetic elements are prions, which possess a self-assembling behavior that can drive the heritable manifestation of new phenotypes. Many archetypal prions display a striking N/Q-rich sequence bias and assemble into an amyloid fold. These unusual features have informed most screening efforts to identify new prion proteins. However, at least three known prions (including the founding prion, PrPSc) do not harbor these biochemical characteristics. We therefore developed an alternative method to probe the scope of protein-based inheritance based on a property of mass action: the transient overexpression of prion proteins increases the frequency at which they acquire a self-templating conformation. This paper describes a method for analyzing the capacity of the yeast ORFeome to elicit protein-based inheritance. Using this strategy, we previously found that &gt;1% of yeast proteins could fuel the emergence of biological traits that were long-lived, stable, and arose more frequently than genetic mutation. This approach can be employed in high throughput across entire ORFeomes or as a targeted screening paradigm for specific genetic networks or environmental stimuli. Just as forward genetic screens define numerous developmental and signaling pathways, these techniques provide a methodology to investigate the influence of protein-based inheritance in biological processes.

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

This protocol describes a high-throughput methodology to functionally screen for protein-based inheritance in S. cerevisiae.

High Throughput Screening SiRNA per lesione delle cellule epiteliali cloropicrina e Cornea indotta da acido fluoridrico

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