עבודה זו נתמכה על ידי אתחול בכספי האוניברסיטה של נבאדה, רינו ועל ידי NIGMS של המכון הלאומי לבריאות תחת גרנט מספר P20 GM103650.

1. בנייה של ארנה התנהגות והכנת חומרה כדי לאפשר Optogenetic גירוי בזירה התנהגות
<ol><li>כדי לבנות של ארנה התנהגות הפרעות-אור, לבנות תיבה עם ממד של 89 x 61 x 66 ס מ3 (35" L x 24" W x 26" H) עשוי פלקסיגלס בצבע שחור גליונות אקרילי (בעובי 3 מ מ) (ראה טבלה של חומרים). חומרים כדי לבנות תיבה כזו צריכה להיות זמינה בחנויות חומרה מקומיים. מקם תיבה זו על גבי שולחן בחדר התנהגות (איור 1א').</li>
	<li>מאונט מצלמה USB 3.0 CCD בשחור-לבן מצויד של IR לונג-830 ננומטר מסנן של העדשה F1.4 C-mount של 8 מ מ (ראה טבלה של חומרים) ממרכז התקרה של הקופסה השחורה. המקום LED אינפרא אדום שתי רצועות (ראה טבלה של חומרים) על השולחן-על מנת להאיר את הזחלים בזירה כהה (איור 1א').</li>
	<li>כדי לבנות את פלטפורמת LED, להשיג 22 ס"מ × 22 ס"מ מרובע אלומיניום צלחת (עדיף בספריי עם גימור שחור מט לחסל כל השתקפויות). במרכז הצלחת, שימוש בחותך מתכת, לחתוך חור גדול מספיק כדי להתאים סביב מצלמת CCD.</li>
	<li>מכסים את לוחית המתכת עם אדום נורות LED (ראה טבלה של חומרים). הלחמה חוטים רצועת אור LED בסדרה ולהאכיל את החוטים רצועת לתוך ממסר optocoupler נשלט על ידי מיקרו מעבד 2B פאי פטל (ראה טבלה של חומרים) (איור 1B ו- 2).</li>
	<li>להתקין ולקבוע את תצורת מערכת ההפעלה אובונטו חבר/Raspian ג'סי \ לינוקס מבוסס על מעבד פאי פטל לפני התחברות השליחים optocoupler רצועות LED. לצרף ספק כוח לשלטון את רצועות LED, את optocoupler (איור 2) (ראה טבלה של חומרים). הר פלטפורמת LED מסביב למצלמה CCD (איור 1B). הערה: מערכת ההפעלה אובונטו חבר v16.04 זמינה בחופשיות. קבוצת פקודות פיתון מבוסס פשוטות ניתן בקלות להתאים לתבניות תוכנית של גירויים אור LED (ראה קובץ של תחביר).</li>
	<li>ודא irradiance הומוגנית בנקודות שונות בזירה התנהגות. למדוד את irradiance מוחלט על פני השטח של הזירה בעזרת ספקטרומטר וקבע שזה יהיה ~1.3 W/m2 לאורך כל השטח של הזירה. הערה: בעוצמה זו, ללא שינויים משמעותיים נצפו הטמפרטורה במהלך הניסויים. המחקר עוד10 בקרינה גבוהה יותר של ~1.9 W/m2 והוא ציין אין שינויי טמפרטורה במהלך הניסויים.</li>
</ol>2. הכנה של הזחלים דרוזופילה ניתוח התנהגות
<ol><li>לשמור על הזבובים על תקן מזון לעוף (ראה טבלה של חומרים) 25 ° C, 50-60% לחות יחסית, ואת מחזור/כהה 12 h/12 שעות.</li>
	<li>
על מנת להביע את CsChrimson עם זוג יחיד ORNs, לחצות נקבות בתולה משורת UAS-עירויים-CsChrimson זכרים מ קו OrX-Gal4 ('X' מקביל אחד של קולטן ריח זחל 21 (או) הגנים באים לידי ביטוי באופן ייחודי בכל אחד 21 זוגות של ORNs)9,11.
	<ol>
<li>. לסירוגין, כדי להביע את CsChrimson של כל ORNs הזחל 21, צלב נקבות בתולה מן UAS-עירויים-CsChrimson קו זכרים מ קו Orco-Gal4 ('Orco' הוא הקולטן שיתוף מתבטאת כל ORNs 21).</li>
		<li>להשתמש UAS-עירויים-CsChrimson קו בפני עצמו כפקד בניסויים אלה. הערה: המניות לטוס המפורטים להלן הינם כולם זמינים במרכז בלומינגטון דרוזופילה מניות (ראה טבלה של חומרים).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ברגע זבובים זכרים ונקבות צלב מותרים להזדווג ולהטיל ביצים במשך 48 שעות, העברה מבוגרים בקבוקון טריים.
	<ol>
<li>אל פני השטח של הבקבוקון מזון המכילים ביצים, להוסיף µL 400 של תערובת המכילה 400 מיקרומטר כל טרנס רשתית (ATR) מומס דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) וסוכרוז 89 מ מ מומס במים מזוקקים. הערה: כמות קטנה של סוכרוז מקדם האכלה זחל של הפתרון ATR. ATR היא קופקטור הדרושים עבור upregulating קולטני CsChrimson ביטוי9,10. ATR הוא רגיש אור.</li>
		<li>ברגע ATR מתווסף הבקבוקונים מזון המכילים ביצים, דגירה הבקבוקונים בחושך h 72 נוספים. הערה: כאשר מחקר זה ומחקרים שני הנ ל יש לא נצפו השפעות על התנהגות זחל עקב ATR האכלה, היא מומלצת שליטה על ההשפעות של ATR האכלה במינים בדיקת קווים על אותה כמות של התערובת הנ ל שאינו מכיל ATR.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לחלץ הזחלים השלישי-לחלל (h ~ 120 אחרי הנחת הביצה) מפני השטח של אוכל לעוף על-ידי צף אותם באמצעות פתרון סוכרוז צפיפות גבוהה (15%). שימוש של P1000 micropipette להפריד את הזחלים צף על פני השטח של הפתרון סוכרוז לתוך גביע זכוכית 1000 מ.</li>
	<li>לשטוף את הזחלים 3 – 4 פעמים על ידי החלפת טריים 800 מ ל מים מזוקקים במיכל זכוכית בכל פעם. לאפשר הזחלים לנוח 10 דקות לפני העמדת אותם וזמינותו התנהגות.</li>
</ol>3. התנהגות Assay
<ol><li>לשמור על טמפרטורה עקבית (בין 22 – 25 ° C) ולחות (בין 50 ל 60% RH) בחדר התנהגות.</li>
	<li>
הכן זחל בינוני סריקה על ידי שפיכת 150 מ ל agarose נמס (1.5%) למרובע 22 ס"מ, 22 ס"מ פטרי. צלחת פטרי אחת ויוצקים על כל ניסיון של וזמינותו, 8-10 ניסויים לכל ניסוי. לאפשר agarose לחזק להתקרר למשך 1-2 ש ח בחודש צלחות פטרי לפני השימוש בהם התנהגות וזמינותו.
	<ol>
<li>העברה לא יותר מ 20 הזחל השלישית-לחלל שומר. על פרופיל מרכז של פטרי (איור 1C). מכסים את צלחת פטרי עם המכסה. הצב הפטרי בזירה התנהגות תחת מצלמת CCD. הערה: בהתאם הניסוי, מבחני התנהגות בדרך כלל מתבצעות למשך 3-5 דקות. אם odorant משמש וזמינותו לספק הדרכה רמזים, זה נצפתה כי מעבר הצבע ריח וכתוצאה מכך נשאר יציב במשך כ 5 דקות1. עוד פעמים assay אינם מומלצים. לא נצפו השפעות מזיקות על הזחלים עקב התייבשות או מחשיפה ממושכת 630 ננומטר האורות האדומים בתוך נקודות זמן אלה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להפוך ON 850 ננומטר אינפרא אדום מקור אור LED להמחיש הזחלים וידאו. הפעל את מצלמת CCD להקליט תנועת הזחל.</li>
	<li>באמצעות התוכנה המשויכים המעבד פאי פטל, תוכנית ההליך לניהול תבניות המתאימות של גירוי אור אדום. הערה: קבוצת פקודות פיתון מבוסס פשוטות ניתן בקלות להתאים לתבניות תוכנית של גירויים אור LED (ראה קובץ של תחביר).</li>
</ol>4. עיבוד נתונים וניתוח
<ol><li>לייבא את הווידאו המוקלט בכל ניסוי כל תוכנה תכנות זמינים כמו Matlab.</li>
	<li>לקבל קואורדינטות XY של כל זחל בסרט כפונקציה של הזמן. בהתבסס על הגבולות של תוכנת מעקב, 15-20 ג'-לחלל הזחלים ניתן לעקוב ב1,יברמה8. הערה: מערכת פשוטה קודים Matlab ('Tracklarva') כי ניתן להתאים בקלות בהתאם לתנאים המתאימים (ראה קובץ של תחביר) מסופק. תוכנית זו משלבת את כל המבחנים בניסוי והתפוקות של קואורדינטות XY של זחל בכל משך כל זמן וזמינותו (ראה לתחביר קוד להלן). לסירוגין, אחד יכול להשתמש במספר תוכניות מבוססות קוד פתוח זמינים לכול לחוקרים. למשל JAABA (http://jaaba.sourceforge.net/)12.</li>
	<li>
השתמש את קואורדינטות XY שנוצר כדי להתוות מסלולים זחל נוספת לנתח ומכניקה זחל.
	<ol>
<li>ניתוח התנהגות, להשתמש הסטטיסטיקה ניווט כגון מהירות, עקמומיות נתיב, זווית כותרת, כדי לחלק מסלולים זחל בודדים לתוך לסירוגין רצפים של פועל, והופך.</li>
		<li>מסלולים מוגדרים תקופות מתמשך של תנועה קדימה. תורים נפרדים עוקבות. מסתבר מסומנות בדגל כאשר שינויים מסלול כיוון זוויות היו > 45 מעלות (ראה קובץ של תחביר).</li>
	</ol>
</li>
	<li>חישוב ממוצע הערכים עבור מהירות ריצה, ריצה באורך, כיוון הריצה ופרמטרים אחרים כנדרש. הערה: ערכה של תחביר פשוט לחלץ 'פועל' ואת 'עוצר' מ מסלולים זחל מסופק (ראה קובץ של תחביר). פשוט Matlab או Excel פונקציות בסיס ניתן ליישם את הנתונים שחולצו להפעלת לחשב ערכים עבור 'מהירות ריצה', ' אורך ' ועוד.</li>
	<li>לייצג את הנתונים עבור כל מדד התנהגותית אומר ± ב- SEM...</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mathew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+among+sensory+receptors+in+a+Drosophila+olfactory+circuit.">Functional diversity among sensory receptors in a Drosophila olfactory circuit.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2134-2143 (2013).</li><li>Ramaekers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+maps+without+cellular+redundancy+at+successive+levels+of+the+Drosophila+larval+olfactory+circuit.">Glomerular maps without cellular redundancy at successive levels of the Drosophila larval olfactory circuit.</a> Current biology : CB. 15, 982-992 (2005).</li><li>Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular,+anatomical,+and+functional+organization+of+the+Drosophila+olfactory+system.">Molecular, anatomical, and functional organization of the Drosophila olfactory system.</a> Current biology : CB. 15, 1535-1547 (2005).</li><li>Kreher, S. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+odor+coding+in+the+Drosophila+larva.">The molecular basis of odor coding in the Drosophila larva.</a> Neuron. 46, 445-456 (2005).</li><li>Kreher, S. A., Mathew, D., Kim, J., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+sensory+input+into+behavioral+output+via+an+olfactory+system.">Translation of sensory input into behavioral output via an olfactory system.</a> Neuron. 59, 110-124 (2008).</li><li>Hallem, E. A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+of+odors+by+a+receptor+repertoire.">Coding of odors by a receptor repertoire.</a> Cell. 125, 143-160 (2006).</li><li>Monte, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+larval+olfactory+response+in+Drosophila+and+its+genetic+basis.">Characterization of the larval olfactory response in Drosophila and its genetic basis.</a> Behav Genet. 19, 267-283 (1989).</li><li>Gershow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+airborne+cues+to+study+small+animal+navigation.">Controlling airborne cues to study small animal navigation.</a> Nature methods. 9, 290-296 (2012).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature methods. 11, 338-346 (2014).</li><li>Hernandez-Nunez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse-correlation+analysis+of+navigation+dynamics+in+Drosophila+larva+using+optogenetics.">Reverse-correlation analysis of navigation dynamics in Drosophila larva using optogenetics.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAABA:+interactive+machine+learning+for+automatic+annotation+of+animal+behavior.">JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior.</a> Nature methods. 10, 64-67 (2013).</li><li>Newquist, G., Novenschi, A., Kohler, D., Mathew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contributions+of+Olfactory+Receptor+Neurons+in+a+Drosophila+olfactory+circuit.">Differential contributions of Olfactory Receptor Neurons in a Drosophila olfactory circuit.</a> eNeuro. 3, (2016).</li><li>Schulze, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamical+feature+extraction+at+the+sensory+periphery+guides+chemotaxis.">Dynamical feature extraction at the sensory periphery guides chemotaxis.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Tastekin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+Subesophageal+Zone+in+Sensorimotor+Control+of+Orientation+in+Drosophila+Larva.">Role of the Subesophageal Zone in Sensorimotor Control of Orientation in Drosophila Larva.</a> Current Biology. 25, 1448-1460 (2015).</li><li>Famiglietti, E. V., Kolb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+ON-and+OFF-center+responses+in+retinal+ganglion+cells.">Structural basis for ON-and OFF-center responses in retinal ganglion cells.</a> Science. 194, 193-195 (1976).</li><li>Luo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+thermotaxis+in+Caenorhabditis+elegans+is+mediated+by+distinct+sensorimotor+strategies+driven+by+the+AFD+thermosensory+neurons.">Bidirectional thermotaxis in Caenorhabditis elegans is mediated by distinct sensorimotor strategies driven by the AFD thermosensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2776-2781 (2014).</li><li>Berck, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wiring+diagram+of+a+glomerular+olfactory+system.">The wiring diagram of a glomerular olfactory system.</a> eLife. 5, (2016).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

כאן, אנחנו תיאר שיטה המאפשרת לשקילת דרוזופילה התנהגות זחל בתגובה optogenetic בו זמנית ההפעלה של נוירונים חוש הריח. שתואר קודם לכן זחל מעקב אחר שיטות1,8 להשתמש בטכנולוגיה משלוח ריח שונה כדי להפעיל את ORNs. עם זאת, שיטות אלה לא יכולים לשלוט על ירידה לפרטים או דפוסי הטמפורלי של הפעלת ולהתמכר. השיטה שלנו גוברת על גירעונות אלה באמצעות גירויים קלים במקום ריח גירויים לשליטה מדויקת יותר של הפעלת ולהתמכר.
החומרים הדרושים כדי לבנות את הזירה התנהגות ניתן להשיג בקלות בחנות לחומרי בניין מקומיים ודורש מאמץ מינימלי באסיפה. האלקטרוניקה דרושים כדי להכין את המודול optogenetics הינם גם זמינים בקלות, נבנה. השיטה המתוארת כאן משתמש באור אדום להפעלת של אופסין # רודופסין אדום-העביר ערוץ (CsChrimson) לידי ביטוי נוירונים ספציפיים. ההתנהגות זחל הנוצרת בתגובה ההפעלה ולהתמכר המתאימים נרשם באמצעות מצלמת CCD ונמדד באמצעות תוכנות מותאמות אישית בכתב שסופק כאן. השיטה שלנו מאפשר לחוקרים לבקש תשובות לשאלות מספר שלא היו אפשריים בעבר: 1) מהי ההשפעה של גירוי חוש הריח אחר דפוסים על היכולת של החיה לנווט לעבר ריח? 2) דומה ON-מרכז ותאים גנגליון OFF-מרכז הרשתית בתרבית של16, האם יש ORNs להגיב באופן ספציפי ירידה גירויים חוש הריח בנוסף ORNs להגיב עלייה גירויים חוש הריח? לבסוף, השיטה שלנו מאפשרת מגוון רחב של יישומים עתידיים, כולל מדידת ההשפעה של נוירונים במורד הזרם במעגל חוש הריח (מערכת העצבים ההיקפית, סוכנות ההגירה) לניווט זחל.
אמנם ישנם מספר יתרונות לשיטה שלנו, אנו להכיר את מגבלות מסוימות. לא ברור אם ריכוז תופעות שנצפו עם odorants ניתן בקלות לשכפל באמצעות מערכת זו. בזמן ההתקנה הנוכחית שלנו אינו מאפשר זאת, המודול optogenetics יכול להיות בקלות שונה כדי להתאים עליות או ירידות עוצמת הגירוי אור. בעתיד, נבדוק כדי לראות אם שינוי עוצמת גירוי אור מחקה תופעות ריכוז של odorants. שיטות גנטיות פשוטות לעוף ניתן לבטא CsChrimson או כל 21 זוגות של ORNs (באמצעות Orco-Gal4) או בכל זוג יחיד של ORNs (באמצעות בודדים או-Gal4s). עם זאת, גנטיקה מורכבות יידרשו אקספרס CsChrimson ב ' 1 < n < 21' נוירונים. בגלל זה, זה יהיה קשה לשכפל את ההשפעות נצפתה עם ריח תערובות איפה רכיבים בודדים של התערובת להפיק תגובות ולהתמכר אחד או יותר. אף-על-פי התנהגות ניווט זחל נחשבת התנהגות מימדי נמוכה, אנו להכיר כי תוכנית מעקב זחל שלנו יכולים עוד יותר להשתפר בעתיד על ידי בהתחשב נוספים מתארי התנהגותי מבוסס על בעלי חיים יציבה (למשל הסתברות של הראש הופך, גוף עיקולים וכו)8,17. המחקר שלנו הוגבל הסדר הראשון החישה הניריונים, הזחל. חקירה נוספת נדרשת לפני השיטה שלנו יכול להיות מיושם השני הזמנת הקרנה נוירונים, נוירונים המקומי המוטבעות באזור האונה במוח של המוח18.
לסיכום, שיטת שלנו מציע את היכולת לנתח את הפונקציה של כל ולהתמכר במעגל חוש הריח פשוט, צייתן של הזחל דרוזופילה . בעשותם כך, השיטה שלנו תאפשר פיתוח מודלים חישובית מדויקת יותר לתאר איך הריח אותות מתורגמות פלטי התנהגותיות שונות.

חוש הריח מידע בסביבה של זחל דרוזופילה הוא חש מאת רק 21 ORNs נפרדים פונקציונלית, הפעילויות אשר בסופו של דבר לקבוע את התנהגות זחל1,2,3,4. ובכל זאת, יחסית מעט מאוד ידוע על ההיגיון שלפיו מקודד מידע חושי בפעילויות של אלה ORNs 21. לכן יש צורך למדוד השפעול תרומות פונקציונלי של כל ולהתמכר זחל להתנהגות.
למרות הפרופיל תגובה חושית של רפרטואר שלם של ORNs הזחל דרוזופילה נחקרה פרט1,4,5, התרומות של בודדים ORNs המעגל חוש הריח, ובכך התנהגות ניווט נשאר ברובו לא ידוע. קשיים במחקרים התנהגות זחל, עולות עד כה, עקב חוסר יכולת להפעיל במרחב של חנותם ORNs יחיד. פאנל של odorants במיוחד להפעיל 19 של דרוזופילה 21 הזחל ORNs היה תיאר לאחרונה1. כל odorant בחלונית ', בריכוזים נמוכים, מעורר תגובה פיזיולוגית בלבד ולהתמכר cognate שלה. עם זאת, בריכוזים גבוהים המשמשים בדרך כלל עבור מבחני התנהגות המקובלת, כל odorant מעורר תגובות פיזיולוגיות מרובים ORNs1,5,6. עוד יותר, odorants בחלונית זו יש מגוון volatilities זה יסבך את הפרשנות של לימודי התנהגות תלויים היווצרות ריח יציב מעברי צבע7,8. לבסוף, באופן טבעי המתרחשים גירויים ריח יש רכיב טמפורלית שקשה לשחזר בתנאי מעבדה. לכן חשוב לפתח שיטה שיכול למדוד התנהגות זחל כאשר בו זמנית הפעלתי ORNs בודדים באופן מרחבי טמפורלית.
. הנה, נדגים שיטה בעלת יתרונות על פני מעקב זחל שתואר לעיל מבחני1,8. וזמינותו מעקב המתוארים Gershow. et al. משתמש שסתומים מבוקר אלקטרונית כדי לשמור על מעבר צבע יציב של ריח ארנה התנהגות8. עם זאת, בשל רמת מעורב לבנות הגדרת גירוי ריח מורכבים הנדסה, שיטה זו קשה לשכפל במעבדות אחרות. יתרה מזאת, הנושאים הקשורים לשימוש odorants להפעלת במיוחד ORNs יחיד נותרו בלתי פתורות. וזמינותו מעקב שמתואר מתיו. ואח משתמש במערכת המסירה ריח פשוט יותר, אך מעבר הצבע ריח וכתוצאה מכך תלויה התנודתיות של מבחן odorant יציב עבור משך זמן של assay1. לפיכך, על-ידי החלפת ריח גירויים גירויים קלים, השיטה שלנו יש את היתרונות של ירידה לפרטים, שליטה מדויקת הטמפורלי של הפעלת ולהתמכר ואינה תלויה היווצרות ריח מעברי צבע בעלי חוזק שונה.
השיטה שלנו היא קל להגדיר, והוא מתאים מהחוקרים המעוניינים מדידה היבטים של ניווט זחל דרוזופילה . טכניקה זו יכולה להתאים למערכות אחרות דגם ובלבד החוקר הוא מסוגל לנהוג הביטוי של CsChrimson ב neuron(s) של המערכת האהוב שלהם להתמקד. CsChrimson היא גרסה אדום-העביר של אופסין # רודופסין ערוץ. . זה הופעל באורכי גל כי הם בלתי נראים למערכת phototaxis של הזחל . אנחנו ולכן יכולים לתמרן את פעילות הנוירונים עם ירידה לפרטים, אמינות וצריכת הפארמצבטית9... על-ידי שינוי המנהג לכתוב תוכנה לקחת בחשבון שינויים בגודל של הנושאים, שיטה זו יכול בקלות להיות מותאם עבור הזחלים סריקה של מינים חרקים אחרים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:925px;" width="924">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Video camera to capture larval movement</td>
			<td style="width:296px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">CCD Camera&#160;</td>
			<td style="width:296px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:208px;">106215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">M52 to M55 Filter Thread Adapter</td>
			<td style="width:296px;">Edmund Optics</td>
			<td>59-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">2&#34; Square Threaded Filter Holder for Imaging Lenses&#160;</td>
			<td style="width:296px;">Edmund Optics</td>
			<td>59-445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">RG-715, 2&#34; Sq. Longpass Filter</td>
			<td style="width:296px;">Edmund Optics</td>
			<td>46-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Electronics for optogenetic setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Raspberry Pi 2B</td>
			<td>RASPBERRY-PI.org</td>
			<td>RPI2-MODB-V1.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">3 Channel programmable power supply</td>
			<td>newegg.com</td>
			<td>9SIA3C62037092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">8 Channel optocoupler relay</td>
			<td>amazon.com</td>
			<td>6454319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">630nm Quad-row LED strip lights</td>
			<td>environmentallights.com</td>
			<td>red3528-450-reel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:359px;">850nm LED strips</td>
			<td>environmentallights.com</td>
			<td>wp-4000K-CC5050-60x2-kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:359px;">Software&#160;</td>
			<td style="width:296px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:359px;">Matlab</td>
			<td>Mathworks Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:359px;">Ubuntu MATE v16.04</td>
			<td>Nubuntu</td>
			<td>https://github.com/yslo/nubuntu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Other items</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Plexiglass black acrylic</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td style="width:208px;">MC1184848bl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Fly food and other reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Nutrifly fly food</td>
			<td style="width:296px;">Genesee Scientific</td>
			<td>66-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Agarose powder</td>
			<td style="width:296px;">Genesee Scientific</td>
			<td>20-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">22cm X 22cm square petri-dish</td>
			<td style="width:296px;">VWR Inc.</td>
			<td>25382-327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">All trans-retinal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Flies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">UAS-IVS-CsChrimson&#160;</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>55134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:359px;">Orco-Gal4</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>26818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Or42a-Gal4</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>9970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Or7a-Gal4</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>23907</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking drosophila larval behavior in response to optogenetic stimulation of olfactory neurons

היכולת של חרקים כדי לנווט כלפי מקורות ריח מבוסס על הפעילות של הנוירונים שלהם קולטני ריח מסדר ראשון (ORNs). בעוד כמות ניכרת של מידע נוצרה בנוגע ולהתמכר התגובות odorants, תפקיד ספציפי ORNs נהיגה תגובות התנהגותיות נשאר ממעטים להבין. להתעורר סיבוכים בניתוח התנהגות עקב volatilities שונים של odorants להפעיל ORNs בודדים, ORNs מרובים מופעל על ידי יחיד odorants, ואת הקושי באופן טבעי שנצפה טמפורלית בווריאציות גירויים חוש הריח באמצעות שכפול שיטות קונבנציונאלי ריח-מסירה במעבדה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מנתח התנהגות זחל דרוזופילה בתגובה optogenetic בו זמנית גירוי של ORNs שלה. הטכנולוגיה optogenetic המשמש כאן מאפשר ירידה לפרטים של הפעלת ולהתמכר שליטה מדויקת של דפוסי הטמפורלי של הפעלת ולהתמכר. תנועת הזחל המתאימה מתבצע מעקב אחר רשמה דיגיטלית, נותחה באמצעות כתב תוכנה מותאמת אישית. על-ידי החלפת ריח גירויים גירויים קלים, שיטה זו מאפשרת שליטה מדויקת יותר של הפעלת ולהתמכר בודדים ללימוד השפעתה על התנהגות זחל. השיטה שלנו יכול ניתן להרחיב הלאה לחקור את ההשפעה של נוירונים מסדר שני הקרנה (מערכת העצבים ההיקפית) כמו גם המקומי נוירונים (ההגירה) על התנהגות זחל. שיטה זו ובכך יאפשר ניתוח מקיף של פונקציה מעגל חוש הריח, המשלים מחקרים על פעילויות נוירון איך הריח לתרגם להתנהגות תגובות.

כדי להדגים יחודיות של הפעלת ולהתמכר, השיטה שלנו הוחלה בהצלחה כדי לקבוע את ההשפעה של שני ולהתמכר שונים (ORN::7a & ORN::42a) הפעלה (ORNs או Or7a או Or42a) על התנהגות זחל (איור 3). בקנה אחד עם מחקרים שנעשו לאחרונה אדם הזה ORNs הזחל הם נפרדים פונקציונלית1,10,13, הנתונים הנציגה שלנו מדגים כאשר ORN::7a לבטא CsChrimson היה מגורה על ידי אור, שהיה שם ירידה משמעותית באורך ריצה ביחס לבעלי שליטה. לעומת זאת, כאשר ORN::42a לבטא CsChrimson היה מגורה על ידי אור, היה גידול משמעותי ריצה באורך בהשוואה לבעלי שליטה (איור 3). הנתונים קולקטיבית ניתח מ ~ 100-120 מסלולים זחל, התקבלו (n = 8) ניסויים שבוצעו עבור כל גנוטיפ. קווי השגיאה מייצגים ב- SEM. בעוד אנו מתארים רק פרמטר יחיד התנהגות (אורך הריצה) כאן, אנחנו מתבקשים לשים לב כי כל רצועה זחל ניתן לנתח נוספת לחישוב פרמטרים עבור מהירות, עקמומיות נתיב, הגוף מתכופף1,8,13, 14,15. פרמטרים נוספים הקשורים כיוון כגון כותרת זווית, להפעיל את אורך לפעול במהירות לכיוון, הרחק ריחות ניתן להשיג אם מקור ריח מסופק על צד אחד של ארנה1,8,13.
כדי להפגין היכולת של השיטה שלנו לשנות את דפוסי הטמפורלי של הפעלת ולהתמכר, אנחנו מגוונים שלנו גירוי למעבר בין ולכבות את האורות. אנחנו חשופים הזחלים לבטא UAS -CsChrimson ב ORN::42a כדי שלושה דפוסים שונים הטמפורלי של גירויים קלים במהלך התקופה על אורות (0.04 הרץ, 1 הרץ ו קבוע). ואז מדדנו שינויים ההתנהגותיים שקורים בשלב ON OFF ← אורות ובמהלך אורות על ← OFF שלב. מצאנו כי עבור ORN::42a, דפוסים שונים הטמפורלי של גירוי אור elicited תגובות התנהגותיות שונות (איור 4). שינויים כאלה לא נצפתה הזחלים שליטה המבטאים לא UAS-CsChrimson , כל ORNs. אלה תוצאות המדגישות החשיבות של הבנת דפוסי איך הטמפורלי של הפעלת ולהתמכר לתרום התנהגות בעלי חיים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57353/57353fig1.jpg"> איור 1 : התנהגות ארנה והמדיום הסריקה זחל. (א) מבט על הזירה קופסה שחורה התנהגות חזיתי. לפתוח את הדלת של הזירה מגלה מצלמת CCD תלויה מהתקרה של התיבה. (B) התצוגה התחתונה של פלטפורמה מתכת המכיל אדום LED אור רצועות משמש optogenetic stimulations נטענה מסביב למצלמה CCD. (ג) Top view של המדיום הסריקה זחל בשימוש וזמינותו. לפני תחילת הקלטה תנועת הזחל, ~ 20 הזחלים שטף הונחו לאורך מרכז 22 ס"מ x 22 ס"מ פטרי שכבתית עם 1.5% agarose. הפטרי המכיל הזחלים ממוקמת במרכז הזירה מתחת למצלמה CCD, בין שתי אינפרא אדום LED אור רצועות המשמשים כמקור אור למצלמה. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57353/57353fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57353/57353fig2.jpg"> איור 2 : הגדרת Optogenetics. אינפוגרפיקה מציג את סידור אלקטרוני עבור ההתקנה optogenetics. בקצרה, נורית אור (630 ננומטר) רצועות מחוברים בסדרת, חוטי החשמל היוצאים הרצועות ניזונים לתוך optocoupler מחובר מיקרו 2B מעבד פאי פטל. את רצועות אור LED והן את optocoupler מופעל על ידי ספק כוח. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57353/57353fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57353/57353fig3.jpg"> איור 3 : ההשפעה של הפעלת האור של ORNs בודדים על התנהגות זחל. ריצה אורך הזחלים לבטא CsChrimson ORN::7a, ORN::42a הושפעו באופן שונה לעומת שליטה הזחלים על הפעלת האור. כל עמודה מייצגת SEM ± RI ממוצע (n = 8). ריצה אורך הזחלים כאשר הופעל ORN::7a היה נמוך משמעותית מאשר שליטה. ריצה אורך הזחלים כאשר הופעל ORN::42a היה גבוה משמעותית מאשר שליטה. העמודות מייצגות SEM זאת אומרת ± (n = 8, מבחן t התלמיד; "*" הוא p < 0.05, "* *" הוא p < 0.001). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57353/57353fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57353/57353fig4.jpg"> איור 4 : ההשפעה של דפוסים שונים הטמפורלי של הפעלת ולהתמכר להתנהגות זחל. (א) שלושה דפוסי הטמפורלי של גירויים להשתמש לשם הפעלת ORNs. ת: גירוי קבוע 1 דקות אור במהלך, גירוי ב': 0.04 הרץ אור גירוי, גירוי c: 1 הרץ גירוי אור LED על תקופה בדקה 2. (B) הזחלים היו נתונים לתבניות שונות שלושה של גירויים קלים שמתואר א כל נקודה מייצגת את השינוי בהתנהגות זחל, תחת כל תבנית של גירויים קלים, בעת הפעלת האור הוא החליף מ ON OFF. שינוי 'הפעל אורך' (באב לרוץ אורך (OFF) - באב לרוץ אורך (על)) מותווה בציר ה-x. שינוי 'לפעול במהירות' (באב לפעול במהירות (OFF) - באב לפעול במהירות (ב)) מותווה בציר ה-y. הגרף השמאלי (נקודות אפור) מייצג את המידות של שליטה הזחלים ומייצג הגרף נכון (נקודות אדומות) מדידות של הזחלים לבטא CsChrimson ב ORN::42a. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57353/57353fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Final Code PDF" src="/files/ftp_upload/57353/57353code.jpg"> קובץ משלים של תחביר: מערכת פשוטה קודים Matlab ('Tracklarva') כי ניתן להתאים בקלות בהתאם תנאים נאותים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57353/Final_Code.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons at JoVE.com

מעקב אחר התנהגות זחל תסיסנית בתגובה לגירוי אופטוגנטי של נוירונים חוש ריח | מדעי המוח | וִידֵאוֹ

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

פרוטוקול זה מנתח התנהגות ניווט של זחל דרוזופילה בתגובה optogenetic בו זמנית גירוי של נוירונים חוש הריח שלו. אור של 630 ננומטר אורך גל משמש כדי להפעיל את חוש הריח נוירונים בודדים לבטא של אופסין # רודופסין אדום-העביר ערוץ. תנועת הזחל מתבצע בו זמנית, רשמה דיגיטלית, נותחה באמצעות תוכנה מותאמת אישית-נכתב.

מעקב אחר התנהגות זחל דרוזופילה בתגובה Optogenetic גירוי של חוש הריח נוירונים

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

tracking-drosophila-larval-behavior-response-to-optogenetic

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Neuroscience

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Ecology

Behavior

SCIENTISTS IN ACTION

7.2K Views.  University of Nevada. פרוטוקול זה מנתח התנהגות ניווט של זחל דרוזופילה בתגובה optogenetic בו זמנית גירוי של נוירונים חוש הריח שלו. אור של 630 ננומטר אורך גל משמש כדי להפעיל את חוש הריח נוירונים בודדים לבטא של אופסין # רודופסין אדום-העביר ערוץ. תנועת הזחל מתבצע בו זמנית, רשמה דיגיטלית, נות?...

Video: Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Sensillum הקלטות סינגל חרקים תסיסנית melanogaster ו אנופלס gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

ויזואליזציה של עצבים המגזרי הזחל ב 3 Rd Instar תסיסנית הכנות הזחל

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

התמרה ויראלי סלקטיבי של נוירונים בוגרים יליד חוש הריח של כרוני In vivo Optogenetic גירוי

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

שיטות Assay תסיסנית התנהגות

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

למידה אסוציאטיבית הרחה באפטטיבית<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the elucidation of the molecular mechanisms involved in cognitive diseases1-7. Learning and memory can be assayed in larvae to study the effect of neurodevelopmental genes8-10 and in flies to measure the contribution of adult plasticity genes1-7. Furthermore, the short lifespan of Drosophila facilitates the analysis of genes mediating age-related memory impairment5,11-13. The availability of many inducible promoters that subdivide the Drosophila nervous system makes it possible to determine when and where a gene of interest is required for normal memory as well as relay of different aspects of the reinforcement signal3,4,14,16.
Studying memory in adult Drosophila allows for a detailed analysis of the behavior and circuitry involved and a measurement of long-term memory15-17. The length of the adult stage accommodates longer-term genetic, behavioral, dietary and pharmacological manipulations of memory, in addition to determining the effect of aging and neurodegenerative disease on memory3-6,11-13,15-21.
Classical conditioning is induced by the simultaneous presentation of a neutral odor cue (conditioned stimulus, CS+) and a reinforcement stimulus, e.g., an electric shock or sucrose, (unconditioned stimulus, US), that become associated with one another by the animal1,16. A second conditioned stimulus (CS-) is subsequently presented without the US. During the testing phase, Drosophila are simultaneously presented with CS+ and CS- odors. After the Drosophila are provided time to choose between the odors, the distribution of the animals is recorded. This procedure allows associative aversive or appetitive conditioning to be reliably measured without a bias introduced by the innate preference for either of the conditioned stimuli. Various control experiments are also performed to test whether all genotypes respond normally to odor and reinforcement alone.

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

The method to measure adult Drosophila associative memory is described. The assay is based on the ability of the fly to associate an odor presented with a negative reinforcer (electric shock) and then recall this information at a later time, allowing memory to be measured.

דרוזופילה מבוגרים חוש הריח הלם למידה

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

גירוי Optogenetic של התנהגות בריחה ב<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אנטנה

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

בoptogenetic גירוי vivo של מערכת העצבים המרכזית מכרסם

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

גירוי optogenetic של עצב השמיעה

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...