Este trabalho foi financiado por fundos de inicialização da Universidade de Nevada, Reno e pelo NIGMS do Instituto Nacional de saúde, sob número de concessão GM103650 P20.

1. construção de uma Arena de comportamento e preparação de Hardware para habilitar Optogenetic estimulação na Arena de comportamento
<ol><li>Para construir uma arena de comportamento privado de luz, construir uma caixa com uma dimensão de 89 x 61 x 66 cm3 (L 35" x 24" W x 26" H) feito de chapas de acrílico de acrílico colorido preto (espessura de 3 mm) (ver Tabela de materiais). Materiais para construir uma caixa tão grande devem estar disponíveis em lojas de ferragem locais. Coloque esta caixa em uma mesa na sala de comportamento (Figura 1A).</li>
	<li>Monte uma câmera USB 3.0 CCD monocromática equipada com um filtro de nm passe longo-830 IR e uma lente de montagem C f 1.4 de 8 mm (ver Tabela de materiais) para o centro do teto da caixa preta. Lugar dois LED infravermelho tiras (ver Tabela de materiais) sobre a mesa a fim de iluminar as larvas na arena escura (Figura 1A).</li>
	<li>Para construir a plataforma de LED, obter uma placa de alumínio quadrada 22 cm x 22 cm (de preferência pulverizador pintado com um acabamento em preto fosco para eliminar qualquer reflexão). No centro da placa, usando um cortador de metal, corte um buraco suficientemente grande para caber em torno da câmera do CCD.</li>
	<li>Cobrir a placa de metal com luzes de tira de LED vermelhas (ver Tabela de materiais). Solda arames de faixa de luz LED em série e alimentar os fios de strip-tease em um relé acoplador controlado por um microprocessador de 2B Raspberry Pi (ver Tabela de materiais) (Figura 1B e 2).</li>
	<li>Instalar e configurar o sistema operacional Ubuntu companheiro/Raspian Jesse/Linux baseado no processador Raspberry Pi antes de ligar o relé acoplador para as tiras de LED. Anexar uma fonte de alimentação para abastecer as tiras de LED e o acoplador (Figura 2) (ver Tabela de materiais). Monte a plataforma de LED em torno da câmera do CCD (Figura 1B). Nota: O sistema de operacional Ubuntu companheiro v16.04 está disponível gratuitamente. Um conjunto de comandos Python com base simples pode ser facilmente adaptado para os padrões do programa de estímulos de luz LED (consulte o arquivo de sintaxe).</li>
	<li>Certifique-se de irradiância homogênea em vários pontos da arena de comportamento. Medir a absoluta irradiância na superfície da arena, com a ajuda de um espectrômetro e determinar que seja ~1.3 W/m2 em toda a superfície da arena. Nota: Com esta intensidade, não foram observadas alterações significativas na temperatura ao longo dos experimentos. Outro estudo10 usado uma maior irradiância de ~1.9 W/m2 e não observada nenhuma alteração na temperatura ao longo dos experimentos.</li>
</ol>2. preparação de larvas de Drosophila para análises de comportamento
<ol><li>Manter as moscas no padrão alimentar de voar (ver Tabela de materiais) a 25 ° C, 50-60% RH e um ciclo claro/escuro de 12 h/12 h.</li>
	<li>
Para expressar a CsChrimson em um único par de ORNs, cruzar fêmeas virgens de uma linha UAS-IVS-CsChrimson para machos de uma linha de OrX-Gal4 ('X' corresponde a um dos receptores de odor larval 21 (ou) os genes que são expressos com exclusividade em cada um de 21 pares de ORNs)9,11.
	<ol>
<li>Alternadamente, para expressar a CsChrimson em todos os 21 ORNs larvas, Cruz fêmeas virgens de um UAS-IVS-CsChrimson linha de machos de uma linha de Orco-Gal4 ('Orco' é o receptor co que é expresso em todos os 21 ORNs).</li>
		<li>Use linha UAS-IVS-CsChrimson por si só como um controle nesses experimentos. Nota: Os estoques voar listados aqui estão disponíveis no centro de estoque de Drosophila Bloomington (ver Tabela de materiais).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Assim moscas machos e fêmeas em uma cruz são permitidas para acasalar e botar ovos por 48 h, transferência de adultos para um frasco de doce.
	<ol>
<li>À superfície do frasco de alimentos que contenham ovos, adicione 400 µ l de uma mistura contendo 400 retinal todo-trans µM (ATR) dissolvido em dimetilsulfóxido (DMSO) e 89 mM de sacarose dissolvida em água destilada. Nota: A pequena quantidade de sacarose promove alimentação larval da solução ATR. ATR é um cofator necessário para estrogenos de CsChrimson expressão9,10. ATR é sensível à luz.</li>
		<li>Se adicionarmos ATR os frascos de alimentos que contêm ovos, incube os frascos no escuro para um adicional 72 h. Nota: Enquanto este estudo e os dois estudos acima não observaram efeitos no comportamento larval devido a alimentação de ATR, é recomendável controlar para os efeitos do ATR alimentação sujeitando linhas de teste para a mesma quantidade de mistura acima que não contenha ATR.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extrai larvas de terceiro instar (~ 120 h após a postura de ovos) da superfície do alimento voar por flutuante-los usando uma solução de sacarose (15%) de alta densidade. Usando um P1000 micropipeta separar as larvas flutuando na superfície da solução de sacarose para um copo de vidro de 1000 mL.</li>
	<li>Lave as larvas 3 – 4 vezes trocando 800 mL de água destilada fresca no copo de vidro de cada vez. Permitir que as larvas descansar por 10 min antes de submetê-los para o ensaio de comportamento.</li>
</ol>3. comportamento ensaio
<ol><li>Manter uma temperatura consistente (entre 22 e 25 ° C) e umidade (entre 50 e 60% RH) na sala de comportamento.</li>
	<li>
Prepare-se larvas rastejante médio derramando 150ml de agarose derretido (1,5%) em um quadrado de 22 cm x 22 cm placa de Petri. Uma placa de Petri é derramado para cada julgamento do ensaio, 8 – 10 ensaios por experiência. Permitir que a agarose solidificar e arrefecer durante 1 a 2 h nos pratos de Petri antes de usá-los no ensaio de comportamento.
	<ol>
<li>Transferência de não mais que 20 das larvas de terceiro instar preparadas para o centro do prato de Petri (Figura 1C). Cubra o prato de Petri com a tampa. Coloque o prato de Petri na arena de comportamento sob a câmera do CCD. Nota: Dependendo do experimento, ensaios de comportamento são normalmente efectuados por 3 – 5 min. Se um odorante é usado no ensaio para fornecer dicas de orientação, foi observado que o gradiente de odor resultante permanece estável por aproximadamente 5 min1. Tempos mais longos de ensaio não são recomendados. Não foram observados efeitos deletérios sobre as larvas, devido à desidratação ou de 630 nm luz vermelha a exposição prolongada a esses pontos de tempo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vire ON the 850 nm infravermelho fonte de luz LED para visualizar as larvas no vídeo. Inicie a câmera CCD para gravar movimento larval.</li>
	<li>Usando o software associado com o processador de Raspberry Pi, programa o procedimento para administrar adequados padrões de estimulação de luz vermelha. Nota: Um conjunto de comandos Python com base simples pode ser facilmente adaptado para os padrões do programa de estímulos de luz LED (consulte o arquivo de sintaxe).</li>
</ol>4. processamento de dados e análise
<ol><li>Importe o vídeo gravado de cada julgamento em qualquer software de programação disponível como Matlab.</li>
	<li>Obter coordenadas XY de cada larva em um filme como uma função do tempo. Com base em limites do software de rastreamento, larvas de terceiro instar 15 – 20 podem ser seguidas em um único filme1,8. Nota: Um conjunto de códigos simples Matlab ('Tracklarva') que podem ser facilmente adaptadas às condições apropriadas (veja arquivo de sintaxe) é fornecido. Este programa combina todos os testes em um experimento e saídas as coordenadas XY de cada larva para toda a duração do ensaio (consulte Sintaxe de código abaixo). Alternadamente, um pode usar vários programas de código aberto baseados livremente disponíveis para pesquisadores. Por exemplo JAABA (http://jaaba.sourceforge.net/)12.</li>
	<li>
Use as coordenadas XY geradas para traçar trajetórias larvas e analisar mais locomoção larval.
	<ol>
<li>Para análises de comportamento, use estatísticas de navegação como velocidade, curvatura de caminho, ângulo de posição, para segmentar individuais trajetórias larvas em alternando sequências de corridas e voltas.</li>
		<li>Execuções são definidas como períodos contínuos de movimento para a frente. Parece que separa execuções sucessivas. Curvas são sinalizadas quando mudanças de ângulos de orientação de trajetória foram > 45° (ver arquivo de sintaxe).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcule os valores médios para a velocidade de execução, executar comprimento, direção de execução e outros parâmetros conforme necessário. Nota: Um conjunto de sintaxe simples para extrair 'roda' e 'Para' de trajetórias larvas é fornecido (consulte o arquivo de sintaxe). Simples Matlab ou Excel baseado em funções podem ser aplicadas a dados extraídos para calcular valores para 'executar velocidade', 'executar comprimento' etc.</li>
	<li>Representar dados para cada métrica comportamental como média ± SEM.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mathew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+among+sensory+receptors+in+a+Drosophila+olfactory+circuit.">Functional diversity among sensory receptors in a Drosophila olfactory circuit.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2134-2143 (2013).</li><li>Ramaekers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+maps+without+cellular+redundancy+at+successive+levels+of+the+Drosophila+larval+olfactory+circuit.">Glomerular maps without cellular redundancy at successive levels of the Drosophila larval olfactory circuit.</a> Current biology : CB. 15, 982-992 (2005).</li><li>Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular,+anatomical,+and+functional+organization+of+the+Drosophila+olfactory+system.">Molecular, anatomical, and functional organization of the Drosophila olfactory system.</a> Current biology : CB. 15, 1535-1547 (2005).</li><li>Kreher, S. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+odor+coding+in+the+Drosophila+larva.">The molecular basis of odor coding in the Drosophila larva.</a> Neuron. 46, 445-456 (2005).</li><li>Kreher, S. A., Mathew, D., Kim, J., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+sensory+input+into+behavioral+output+via+an+olfactory+system.">Translation of sensory input into behavioral output via an olfactory system.</a> Neuron. 59, 110-124 (2008).</li><li>Hallem, E. A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+of+odors+by+a+receptor+repertoire.">Coding of odors by a receptor repertoire.</a> Cell. 125, 143-160 (2006).</li><li>Monte, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+larval+olfactory+response+in+Drosophila+and+its+genetic+basis.">Characterization of the larval olfactory response in Drosophila and its genetic basis.</a> Behav Genet. 19, 267-283 (1989).</li><li>Gershow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+airborne+cues+to+study+small+animal+navigation.">Controlling airborne cues to study small animal navigation.</a> Nature methods. 9, 290-296 (2012).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature methods. 11, 338-346 (2014).</li><li>Hernandez-Nunez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse-correlation+analysis+of+navigation+dynamics+in+Drosophila+larva+using+optogenetics.">Reverse-correlation analysis of navigation dynamics in Drosophila larva using optogenetics.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAABA:+interactive+machine+learning+for+automatic+annotation+of+animal+behavior.">JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior.</a> Nature methods. 10, 64-67 (2013).</li><li>Newquist, G., Novenschi, A., Kohler, D., Mathew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contributions+of+Olfactory+Receptor+Neurons+in+a+Drosophila+olfactory+circuit.">Differential contributions of Olfactory Receptor Neurons in a Drosophila olfactory circuit.</a> eNeuro. 3, (2016).</li><li>Schulze, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamical+feature+extraction+at+the+sensory+periphery+guides+chemotaxis.">Dynamical feature extraction at the sensory periphery guides chemotaxis.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Tastekin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+Subesophageal+Zone+in+Sensorimotor+Control+of+Orientation+in+Drosophila+Larva.">Role of the Subesophageal Zone in Sensorimotor Control of Orientation in Drosophila Larva.</a> Current Biology. 25, 1448-1460 (2015).</li><li>Famiglietti, E. V., Kolb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+ON-and+OFF-center+responses+in+retinal+ganglion+cells.">Structural basis for ON-and OFF-center responses in retinal ganglion cells.</a> Science. 194, 193-195 (1976).</li><li>Luo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+thermotaxis+in+Caenorhabditis+elegans+is+mediated+by+distinct+sensorimotor+strategies+driven+by+the+AFD+thermosensory+neurons.">Bidirectional thermotaxis in Caenorhabditis elegans is mediated by distinct sensorimotor strategies driven by the AFD thermosensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2776-2781 (2014).</li><li>Berck, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wiring+diagram+of+a+glomerular+olfactory+system.">The wiring diagram of a glomerular olfactory system.</a> eLife. 5, (2016).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui, descrevemos um método que permite a medição do comportamento larval de Drosophila em resposta à ativação simultânea optogenetic dos neurônios olfativos. Descrito anteriormente larval de rastreamento métodos1,8 usar tecnologia de entrega de odor diferente para ativar ORNs. No entanto, esses métodos não podem controlar para a especificidade ou padrões temporais de ativação ORN. Nosso método supera esses défices usando estímulos de luz em vez de estímulos de odor para um controle mais preciso da ativação de ORN.
Os materiais necessários para construir a arena de comportamento podem ser facilmente obtidos na loja de ferragem local e requer o mínimo de esforço na Assembleia. Os componentes eletrônicos necessários para preparar o módulo optogenetics também estão facilmente disponíveis e construído. O método descrito aqui usa luz vermelha para ativar uma rodopsina canal avermelhado (CsChrimson) expressos em neurônios específicos. O comportamento resultante larval em resposta à ativação ORN correspondente é gravado usando uma câmera CCD e medido usando software escrito personalizado que é fornecido aqui. Nosso método permite que os pesquisadores de respostas a várias perguntas que não eram possíveis antes de perguntar: 1) qual é o impacto de padrões diferentes de estímulo olfativo na capacidade do animal para navegar em direção a um odor? 2) semelhantes ao ON-centro e células ganglionares de OFF-centro na retina de mamíferos16, existem ORNs que respondem especificamente a uma diminuição de estímulos olfactory além ORNs que respondem ao aumento de estímulos olfativos? Finalmente, nosso método permite que uma variedade de aplicações futuras, incluindo a medição do impacto dos neurônios a jusante do circuito olfativo (PNs e LNs) para navegação larval.
Embora existam várias vantagens ao nosso método, reconhecemos certas limitações. Não está claro se os efeitos de concentração observados com odores podem ser facilmente replicados usando este sistema. Enquanto nossa configuração atual não permite isso, o módulo de optogenetics pode ser facilmente modificado para acomodar aumenta ou diminui a intensidade do estímulo luz. No futuro, vamos verificar para ver se mudando a intensidade do estímulo de luz imita os efeitos da concentração de odores. Técnicas genéticas moscas simples podem ser usadas para expressar a CsChrimson em qualquer todos os 21 pares de ORNs (usando o Orco-Gal4) ou em um único par de ORNs (usando individuais ou-Gal4s). No entanto, complicada genética seria necessário para expressar CsChrimson em 1 < n < 21' neurônios. Devido a isso, seria difícil replicar os efeitos observados com misturas de odor onde componentes individuais da mistura eliciam respostas de mais de um ORN. Mesmo que o comportamento de navegação larval é considerado um comportamento dimensional baixo, reconhecemos que nosso programa de rastreamento larval poderia ser melhorado no futuro pelo considerando adicionais descritores comportamentais baseados na postura animal (por exemplo, probabilidade de cabeça gira, corpo curvas etc)8,17. Nosso estudo limitou-se a neurônios sensoriais de primeira ordem a larva. Investigação adicional é necessária antes de nosso método pode ser aplicado a segunda sequência de neurônios de projeção e neurônios locais que são incorporados na região do lóbulo cerebral do cérebro18.
Em resumo, nosso método oferece a capacidade de dissecar a função de cada ORN no circuito simples, tractable olfativo da drosófila larva. Ao fazer isso, nosso método permitirá o desenvolvimento de modelos computacionais mais precisos que descrevem como sinais de odor são convertidos em saídas comportamentais diferentes.

Informação olfativa no ambiente da larva uma drosófila é detetada por apenas 21 ORNs funcionalmente distintos, as atividades de que, finalmente, determinar o comportamento larval1,2,3,4. No entanto, relativamente pouco é conhecido sobre a lógica pela qual informação sensorial é codificada nas atividades destas 21 ORNs. Assim, há uma necessidade de medir experimentalmente as contribuições funcionais de cada ORN larval de comportamento.
Embora o perfil de resposta sensorial do repertório inteiro de Drosophila ORNs larvas tem sido estudado em detalhe1,4,5, as contribuições de ORNs individuais para o circuito olfativo e, desse modo, para comportamento de navegação permanecem em grande parte desconhecidos. Em estudos de comportamento larval, até agora, dificuldades devido à incapacidade de espacial e temporalmente ativar ORNs único. Um painel de odores que ativam especificamente o 19. º as 21 ORNs larvas de Drosophila foi recentemente descrito1. Cada odorante no painel, em baixas concentrações, provoca uma resposta fisiológica apenas a partir de seu cognato ORN. No entanto, em altas concentrações que normalmente são usadas para os ensaios de comportamento convencional, cada odorant elicia respostas fisiológicas de múltiplos ORNs1,5,6. Além disso, odorantes neste painel têm variado volatilidades que complicam a interpretação dos estudos de comportamento que dependem de formação de odor estável gradientes7,8. Finalmente, naturalmente ocorrendo estímulos odor tem um componente temporal que é difícil de replicar em condições de laboratório. Portanto, é importante desenvolver um método que pode medir comportamento larval enquanto simultaneamente ativando ORNs individuais de uma forma espacial e temporal.
Aqui, vamos demonstrar um método que possui vantagens sobre rastreamento larval descrito anteriormente ensaios1,8. O ensaio de rastreamento descrito em Gershow et al usa válvulas eletronicamente controladas para manter um gradiente estável do odor no comportamento arena8. No entanto, devido ao nível de engenharia complexo envolvido para construir o odor estímulo de configuração, esse método é difícil de replicar em outros laboratórios. Além disso, os problemas relacionados ao uso de odorantes para ativar especificamente ORNs único continuam por resolver. O ensaio de rastreamento descrito na Mathew et al usa um sistema de entrega de odor mais simples, mas o gradiente de odor resultante depende da volatilidade do teste odorant e é instável para durações longas do ensaio1. Assim, substituindo a estímulos de odor com estímulos de luz, nosso método tem as vantagens da especificidade e um controle preciso da ativação de ORN temporal e não é dependente da formação de gradientes de odor de diferentes intensidades.
Nosso método é fácil de configurar e é apropriado para pesquisadores interessados em medir aspectos da navegação de larvas de Drosophila . Esta técnica poderia ser adaptada para outros sistemas modelo, desde que o pesquisador é capaz de dirigir a expressão de CsChrimson em neuron(s) seus favoritos do sistema de escolha. CsChrimson é uma versão avermelhado da rodopsina canal. Ele é ativado em comprimentos de onda que são invisíveis ao sistema de phototaxis da larva. Estamos, portanto, capazes de manipular a atividade de neurônios com especificidade, confiabilidade e reprodutibilidade9. Modificando o costume escrito software conta para alterações de tamanho dos indivíduos, esse método poderia ser facilmente adaptado para rastreamento larvas de outras espécies de insetos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:925px;" width="924">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Video camera to capture larval movement</td>
			<td style="width:296px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">CCD Camera&#160;</td>
			<td style="width:296px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:208px;">106215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">M52 to M55 Filter Thread Adapter</td>
			<td style="width:296px;">Edmund Optics</td>
			<td>59-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">2&#34; Square Threaded Filter Holder for Imaging Lenses&#160;</td>
			<td style="width:296px;">Edmund Optics</td>
			<td>59-445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">RG-715, 2&#34; Sq. Longpass Filter</td>
			<td style="width:296px;">Edmund Optics</td>
			<td>46-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Electronics for optogenetic setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Raspberry Pi 2B</td>
			<td>RASPBERRY-PI.org</td>
			<td>RPI2-MODB-V1.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">3 Channel programmable power supply</td>
			<td>newegg.com</td>
			<td>9SIA3C62037092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">8 Channel optocoupler relay</td>
			<td>amazon.com</td>
			<td>6454319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">630nm Quad-row LED strip lights</td>
			<td>environmentallights.com</td>
			<td>red3528-450-reel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:359px;">850nm LED strips</td>
			<td>environmentallights.com</td>
			<td>wp-4000K-CC5050-60x2-kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:359px;">Software&#160;</td>
			<td style="width:296px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:359px;">Matlab</td>
			<td>Mathworks Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:359px;">Ubuntu MATE v16.04</td>
			<td>Nubuntu</td>
			<td>https://github.com/yslo/nubuntu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Other items</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Plexiglass black acrylic</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td style="width:208px;">MC1184848bl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Fly food and other reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Nutrifly fly food</td>
			<td style="width:296px;">Genesee Scientific</td>
			<td>66-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Agarose powder</td>
			<td style="width:296px;">Genesee Scientific</td>
			<td>20-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">22cm X 22cm square petri-dish</td>
			<td style="width:296px;">VWR Inc.</td>
			<td>25382-327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">All trans-retinal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Flies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">UAS-IVS-CsChrimson&#160;</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>55134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:359px;">Orco-Gal4</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>26818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Or42a-Gal4</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>9970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Or7a-Gal4</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>23907</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking drosophila larval behavior in response to optogenetic stimulation of olfactory neurons

A capacidade de insetos para navegar em direção a fontes de odor baseia-se as atividades de seus neurônios olfactory do receptor de primeira ordem (ORNs). Gerou-se uma quantidade considerável de informações sobre ORN respostas a odorantes, o papel de ORNs específicas na condução de respostas comportamentais permanece mal compreendido. As complicações em análises de comportamento surgem devido a diferentes volatilidades dos odorantes que ativam ORNs individuais, vários ORNs ativados pelo único odorantes e da dificuldade em replicar naturalmente observadas variações temporais em estímulos olfactory usando métodos convencionais de odor-entrega no laboratório. Aqui, descrevemos um protocolo que analisa comportamento larval de Drosophila em resposta à estimulação optogenetic simultânea de suas ORNs. A tecnologia de optogenetic usada aqui permite a especificidade da ativação de ORN e controle preciso de padrões temporais de ativação ORN. Correspondente movimento larval é controlado digitalmente gravado e analisado usando personalizado escrito software. Substituindo a estímulos de odor com estímulos de luz, esse método permite que para um controle mais preciso da ativação de ORN individual a fim de estudar o seu impacto no comportamento larval. Nosso método para estudar o impacto de neurônios de projeção de segunda ordem (PNs) bem como neurônios locais (LNs) no comportamento larval poderia, ser novamente prorrogado. Este método permitirá, assim, uma dissecação completa da função olfativa circuito e complemento estudos sobre atividades de neurônio olfatório como traduzir em respostas de comportamento.

Para demonstrar a especificidade da ativação de ORN, nosso método foi aplicado com sucesso para determinar o impacto de duas diferentes ORN (ORN::7a & ORN::42a) ativação (ORNs expressando ou Or7a ou Or42a) sobre o comportamento de larva (Figura 3). Consistente com estudos recentes daquele indivíduo ORNs larvas são funcionalmente distintos1,10,13, nossos dados representativos demonstram que quando ORN::7a expressando CsChrimson foi estimulada pela luz, havia uma redução significativa no comprimento de execução em comparação com animais controle. Inversamente, quando ORN::42a expressando CsChrimson foi estimulada pela luz, houve um aumento significativo na execução comprimento comparado aos animais controle (Figura 3). Os coletivos dados analisados de ~ 100-120 faixas larvas foram obtidas (n = 8) ensaios realizados para cada genótipo. As barras de erro representam SEM. Enquanto aqui descrevemos apenas um parâmetro de comportamento único (comprimento de execução), notamos que cada faixa larval pode ser mais analisada para calcular parâmetros de velocidade, curvatura do caminho, e o corpo se dobra1,8,13, 14,15. Mais parâmetros relacionados a direcionalidade tais como ângulo de posição, comprimento e executar velocidade em direção e longe de odores podem ser obtidos se uma fonte de odor é fornecida em um lado da arena1,8,13.
Para demonstrar a capacidade do nosso método para alterar os padrões temporais de ativação de ORN, variamos o nosso estímulo para alternar entre as luzes e desligar. Estamos sujeitos as larvas expressando UAS -CsChrimson em ORN::42a de três diferentes padrões temporais de estímulos de luz durante o período de ON de luzes (0,04 Hz, 1Hz e constante). Em seguida medimos mudanças nos parâmetros comportamentais que ocorrem na fase luzes OFF → ON e durante as luzes na fase OFF →. Nós achamos que, para ORN::42a, diferentes padrões temporais de estimulação luminosa suscitou respostas comportamentais diferentes (Figura 4). Tais alterações não foram observadas em larvas de controle que não expressam UAS-CsChrimson em qualquer ORNs. Estes resultados de destaque a importância de compreender como temporais padrões de ativação ORN contribuem para o comportamento animal.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57353/57353fig1.jpg"> Figura 1 : Arena de comportamento e meio de rastreamento larval. (A) vista da arena caixa preta comportamento frontal. Porta aberta da arena revela uma câmera CCD suspendida do teto da caixa. (B) vista inferior de uma plataforma de metal contendo vermelhas tiras de LED de luz usadas para optogenetic estímulos é montada em torno da câmera do CCD. (C) vista superior do meio rastreamento larval usado no ensaio. Antes do início da gravação de movimento larval, ~ 20 larvas lavadas são dispostas ao longo do centro de um 22 cm x 22 cm placa de Petri com camadas de agarose 1,5%. A placa de Petri contendo larvas é colocado no centro da arena sob a câmera do CCD e entre as duas infravermelho LED luz tiras que são usadas como uma fonte de luz para a câmera. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57353/57353fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57353/57353fig2.jpg"> Figura 2 : Instalação de Optogenetics. Um infográfico mostrando o arranjo eletrônico para a instalação de optogenetics. Brevemente, diodo emissor de luz (630 nm) tiras são ligadas em série e fios das tiras são alimentados em um acoplador conectado a um microprocessador de 2B PI framboesa. Tanto as tiras de luz LED e o acoplador são alimentados por uma fonte de alimentação. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57353/57353fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57353/57353fig3.jpg"> Figura 3 : Impacto de acionamento do refletor de ORNs individuais no comportamento larval. Execute o comprimento de larvas expressando CsChrimson em ORN::7a e ORN::42a foram afetados de forma diferente em comparação para controlar as larvas após a ativação de luz. Cada barra representa a média do RI ± SEM (n = 8). Execução de larvas quando ORN::7a foi ativado era significativamente inferior ao controle. Execução de larvas quando ORN::42a foi ativado era significativamente maior do que o controle. Barras representam a média ± SEM (n = 8, teste-t de Student; "*" é p < 0.05, "* *" é p < 0,001). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57353/57353fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57353/57353fig4.jpg"> Figura 4 : Impacto de diferentes padrões temporais de ativação ORN no comportamento larval. (A) três padrões temporais de estímulos utilizados para ativar ORNs. R: estímulo constante de 1min luz durante, estímulo b: 0,04 Hz luz estimulação, estimulação luminosa de estímulo c: 1 Hz durante o período de LED ON no minuto 2. (B) as larvas foram submetidas a três diferentes padrões de estímulos de luz descritos na. Cada ponto representa a mudança no comportamento larval, sob cada padrão de estímulos de luz, quando o acionamento do refletor é alternado de ON para OFF. Mudar em 'executar comprimento' (AV. comprimento (OFF) - AV. executar o comprimento (em)) é plotado no eixo x. Mudar em 'executar velocidade' (AV. executar velocidade (OFF) - AV. executar velocidade (ON)) é plotada no eixo y. O gráfico à esquerda (pontos cinzas) representa medições de larvas de controle e o gráfico certo (pontos vermelhos) representa medições de larvas expressando CsChrimson em ORN::42a. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57353/57353fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Final Code PDF" src="/files/ftp_upload/57353/57353code.jpg"> Arquivo suplementar de sintaxe: um conjunto de códigos simples Matlab ('Tracklarva') que podem ser facilmente adaptadas às condições adequadas de. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57353/Final_Code.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

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Rastreando o comportamento larval de Drosophila em resposta à estimulação optogenética de neurônios olfativos | Neurociência | Vídeo

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Este protocolo analisa comportamento de navegação de larvas de Drosophila em resposta à estimulação optogenetic simultânea de seus neurônios olfativos. Luz de comprimento de onda de 630 nm é usada para ativar individuais neurônios olfativos expressando uma rodopsina canal avermelhado. Larval movimento simultaneamente é controlado digitalmente gravado e analisados utilizando o software personalizados.

Rastreamento do comportamento larval de Drosophila em resposta à estimulação optogenética de neurônios olfativos

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

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Nanyang Technological University

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Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

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7.2K visualizações.  University of Nevada. Este protocolo analisa comportamento de navegação de larvas de Drosophila em resposta à estimulação optogenetic simultânea de seus neurônios olfativos. Luz de comprimento de onda de 630 nm é usada para ativar individuais neurônios olfativos expressando uma rodopsina canal avermelhado. Larval movimento simultaneamente é controlado digitalmente gravado e analisados utilizando o software personalizados.

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Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Único Recordings Sensillum na Insetos Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Neurociência

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

Visualização de Larval Nervos segmentar em 3 Rd Instar Drosophila Preparações larval

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Transdução Viral seletiva de Adultos-nascido neurônios olfativos de crônica In vivo Estímulo Optogenetic

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Métodos de Ensaio para Drosophila Comportamento

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

Aprendizagem associativa apetitiva olfativa em<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the elucidation of the molecular mechanisms involved in cognitive diseases1-7. Learning and memory can be assayed in larvae to study the effect of neurodevelopmental genes8-10 and in flies to measure the contribution of adult plasticity genes1-7. Furthermore, the short lifespan of Drosophila facilitates the analysis of genes mediating age-related memory impairment5,11-13. The availability of many inducible promoters that subdivide the Drosophila nervous system makes it possible to determine when and where a gene of interest is required for normal memory as well as relay of different aspects of the reinforcement signal3,4,14,16.
Studying memory in adult Drosophila allows for a detailed analysis of the behavior and circuitry involved and a measurement of long-term memory15-17. The length of the adult stage accommodates longer-term genetic, behavioral, dietary and pharmacological manipulations of memory, in addition to determining the effect of aging and neurodegenerative disease on memory3-6,11-13,15-21.
Classical conditioning is induced by the simultaneous presentation of a neutral odor cue (conditioned stimulus, CS+) and a reinforcement stimulus, e.g., an electric shock or sucrose, (unconditioned stimulus, US), that become associated with one another by the animal1,16. A second conditioned stimulus (CS-) is subsequently presented without the US. During the testing phase, Drosophila are simultaneously presented with CS+ and CS- odors. After the Drosophila are provided time to choose between the odors, the distribution of the animals is recorded. This procedure allows associative aversive or appetitive conditioning to be reliably measured without a bias introduced by the innate preference for either of the conditioned stimuli. Various control experiments are also performed to test whether all genotypes respond normally to odor and reinforcement alone.

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

The method to measure adult Drosophila associative memory is described. The assay is based on the ability of the fly to associate an odor presented with a negative reinforcer (electric shock) and then recall this information at a later time, allowing memory to be measured.

Drosophila Adulto Olfativo Choque Aprendizagem

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Optogenética estimulação do comportamento de fuga em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Monte todo imunomarcação de Neurônios Receptores Olfatórios no<em&gt; Drosophila</em&gt; Antena

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo Optogenetic estimulação do sistema nervoso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

A estimulação optogenética do nervo auditivo

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...