Este trabajo fue financiado por fondos de puesta en marcha de la Universidad de Nevada, Reno y por NIGMS del Instituto Nacional de salud bajo la concesión número GM103650 P20.

1. construcción de un estadio de comportamiento y preparación de Hardware para permitir la estimulación Optogenetic en la Arena de comportamiento
<ol><li>Para construir una arena de comportamiento privado de luz, construir una caja con una dimensión de 89 x 61 x 66 cm3 (35" L x 24" W x 26" H) hecha de plexiglás color negra las hojas de acrílico (espesor 3 mm) (véase Tabla de materiales). Materiales para construir una caja de esa deben estar disponibles en las ferreterías locales. Colocar esta caja en una mesa en la sala de comportamiento (figura 1A).</li>
	<li>Monte una cámara monocromática USB 3.0 CCD equipado con un filtro IR largo-paso de 830 nm y una lente de 8 mm F1.4 C-mount (véase Tabla de materiales) al centro del techo de la caja negra. Lugar dos infrarrojos tiras de LED (véase Tabla de materiales) sobre la mesa para iluminar las larvas en el arena oscuro (figura 1A).</li>
	<li>Para construir la plataforma de LED, obtener una placa de aluminio cuadrada de 22 cm x 22 cm (preferentemente aerosol pintado con un acabado negro mate para eliminar cualquier reflexiones). En el centro de la placa, usando un cortador de metal, corte un agujero lo suficientemente grande como para caber alrededor de la cámara CCD.</li>
	<li>Cubrir la placa metálica con luces de tira de LED rojo (véase Tabla de materiales). Soldar cables de tira de luz LED en serie y pase los cables de la tira en un relé óptico controlado por un microprocesador de 2B de frambuesa Pi (véase Tabla de materiales) (figura 1B y 2).</li>
	<li>Instalar y configurar el sistema operativo Ubuntu Mate/Raspian Jesse/Linux basado en el procesador de frambuesa Pi antes de conectar el relé óptico a las tiras de LED. Adjuntar una fuente de alimentación para alimentar las tiras de LED y el optoacoplador (figura 2) (véase Tabla de materiales). Montaje de la plataforma de LED alrededor de la cámara de CCD (figura 1B). Nota: Sistema operativo de Ubuntu Mate v16.04 está disponible. Un conjunto de comandos de Python basado en simples puede ser fácilmente adaptado a los patrones del programa de estímulos de luz LED (véase archivo de sintaxis).</li>
	<li>Asegúrese de irradiación homogénea en varios puntos en el ámbito del comportamiento. Medir la irradiancia absoluta en la superficie de la arena con la ayuda de un espectrómetro y determinar que ~1.3 W/m2 a lo largo de la superficie de la arena. Nota: En esta intensidad, no se observaron cambios significativos de temperatura a lo largo de los experimentos. Otro estudio10 utiliza una mayor irradiancia de ~1.9 W/m2 y había observado sin cambios de temperatura a lo largo de los experimentos.</li>
</ol>2. preparación de las larvas de Drosophila para análisis de comportamiento
<ol><li>Mantener las moscas en la comida de mosca estándar (véase Tabla de materiales) a 25 ° C, 50-60% de humedad relativa y un ciclo de luz/oscuridad de 12 h/12 h.</li>
	<li>
Para expresar el CsChrimson en un solo par de ORNs, cruzar hembras vírgenes desde la línea de UAS-IVS-CsChrimson a los machos de una línea OrX-Gal4 ('X' corresponde a una de 21 receptores de olor larvas (o) genes que se expresan únicamente en cada uno de 21 pares de ORNs)9,11.
	<ol>
<li>Alternativamente, para expresar el CsChrimson en todas ORNs larvas 21, cruzar hembras vírgenes de un UAS-IVS-CsChrimson línea machos de una línea de Orco-Gal4 ('Orco' es el correceptor que se expresa en todas las 21 ORNs).</li>
		<li>Utilice línea de UAS-IVS-CsChrimson por sí mismo como un control en estos experimentos. Nota: Las poblaciones de mosca enumeradas aquí están disponibles en el Bloomington Drosophila Stock Center (véase Tabla de materiales).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Una vez que las moscas machos y hembras en una cruz se les permite aparearse y poner huevos durante 48 h, transferencia de adultos a un vial nuevo.
	<ol>
<li>A la superficie de la cubeta de alimentos que contengan huevos, añadir 400 μL de una mezcla que contiene retinal todo-trans-μm 400 (ATR) disuelto en dimetil sulfóxido (DMSO) y 89 mM sacarosa disuelta en agua destilada. Nota: La pequeña cantidad de sacarosa promueve la alimentación larval de la solución ATR. ATR es un cofactor requerido para regular de CsChrimson expresión9,10. ATR es sensible a la luz.</li>
		<li>Una vez que ATR se agrega a los frascos de alimentos que contengan huevos, incubar los frascos en la oscuridad por un adicional 72 h. Nota: Mientras que este estudio y los dos estudios anteriores no han observado efectos en la conducta larval por ATR de alimentación, se recomienda controlar los efectos de ATR alimentación sometiendo líneas de prueba a la misma cantidad de la mezcla anterior que no contenga ATR.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extracto de larvas de tercer estadio (~ 120 h después de la puesta de huevos) de la superficie del alimento mosca flotando a través de una solución de sacarosa de alta densidad (15%). Usando una P1000 micropipeta separar las larvas flotan en la superficie de la solución de sacarosa en un vaso de vidrio de 1000 mL.</li>
	<li>Lave las larvas 3 – 4 veces intercambiando agua destilada 800 mL en el vaso de vidrio cada vez. Permitir que las larvas a reposar 10 min antes de someterlos a la prueba de comportamiento.</li>
</ol>3. ensayo de comportamiento
<ol><li>Mantener una temperatura constante (entre 22 y 25 ° C) y humedad (entre 50 y 60% HR) en la habitación de comportamiento.</li>
	<li>
Preparar medio reptante larvas vertiendo 150 mL de agarosa fundida (1.5%) en un cuadrado de 22 cm x 22 cm plato de Petri. Una placa de Petri se vierte para cada ensayo de ensayo, ensayos de 8 a 10 por experimento. Permiten agarosa solidificar y enfriar durante 1 – 2 h en los platos de Petri antes de usarlos en el análisis del comportamiento.
	<ol>
<li>La transferencia de no más de 20 de las larvas de tercer estadio preparadas para el centro del plato de Petri (figura 1C). Cubrir la placa de Petri con su tapa. Coloque el plato Petri en la arena de comportamiento bajo la cámara CCD. Nota: Dependiendo de la experiencia, ensayos de comportamiento típicamente llevan a cabo 3-5 minutos. Si un olor se utiliza en el ensayo para proporcionar señales de orientación, se ha observado que el gradiente de olor resultante permanece estable durante aproximadamente 5 min1. Tiempos de ensayo más largos no son recomendables. No se han observado efectos deletéreos sobre las larvas debido a la deshidratación o de 630 nm rojo una exposición prolongada en estos momentos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gire en el 850 nm infrarrojo LED fuente de luz para visualizar las larvas en el video. Iniciar la cámara CCD para grabar movimiento de larvas.</li>
	<li>Utilizando el software asociado con el procesador del Raspberry Pi, programa el procedimiento para administrar patrones adecuados de estimulación de luz roja. Nota: Un conjunto de comandos de Python basado en simples puede ser fácilmente adaptado a los patrones del programa de estímulos de luz LED (véase archivo de sintaxis).</li>
</ol>4. procesamiento de datos y análisis
<ol><li>Importar el vídeo grabado de cada ensayo a cualquier software disponible de programación como Matlab.</li>
	<li>Obtener coordenadas XY de cada larva en una película como una función del tiempo. En límites de software de seguimiento de la base, 15-20 larvas de tercer estadio pueden ser rastreadas en la película solo1,8. Nota: Se proporciona un conjunto de simples códigos de Matlab ('Tracklarva') que puede ser fácilmente adaptado a las condiciones apropiadas (véase archivo de sintaxis). Este programa combina todos los ensayos en un experimento y salidas de las coordenadas XY de cada larva para toda la duración del ensayo (ver sintaxis de código a continuación). Alternativamente, uno puede utilizar varios programas basados en código abierto que están libremente disponibles para los investigadores. Por ejemplo JAABA (http://jaaba.sourceforge.net/)12.</li>
	<li>
Utilizar las coordenadas XY generadas para trazar trayectorias larvales y más análisis larval locomoción.
	<ol>
<li>Para análisis de comportamiento, usar estadísticas de navegación como la velocidad, la curvatura de la trayectoria, ángulo de partida, para segmentar trayectorias individuales de larvas en alterna secuencias de carreras y vueltas.</li>
		<li>Carreras se definen como períodos continuos de movimiento hacia adelante. Vueltas separan las ejecuciones. Vueltas se marcan cuando los cambios a los ángulos de orientación de la trayectoria fueron > 45° (véase archivo de sintaxis).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcular los valores promedio de velocidad de ejecución, ejecutar la longitud, dirección ejecución y otros parámetros como sea necesario. Nota: Se proporciona un conjunto de sintaxis simple para extraer larvas trayectorias 'funciona' y 'para' (véase archivo de sintaxis). Simple Matlab o Excel funciones base pueden aplicarse a los datos extraídos se calcular valores para 'speed run', ' longitud ' etcetera.</li>
	<li>Representar datos para cada métrica de comportamiento como media ± SEM.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mathew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+diversity+among+sensory+receptors+in+a+Drosophila+olfactory+circuit.">Functional diversity among sensory receptors in a Drosophila olfactory circuit.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2134-2143 (2013).</li><li>Ramaekers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+maps+without+cellular+redundancy+at+successive+levels+of+the+Drosophila+larval+olfactory+circuit.">Glomerular maps without cellular redundancy at successive levels of the Drosophila larval olfactory circuit.</a> Current biology : CB. 15, 982-992 (2005).</li><li>Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular,+anatomical,+and+functional+organization+of+the+Drosophila+olfactory+system.">Molecular, anatomical, and functional organization of the Drosophila olfactory system.</a> Current biology : CB. 15, 1535-1547 (2005).</li><li>Kreher, S. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+odor+coding+in+the+Drosophila+larva.">The molecular basis of odor coding in the Drosophila larva.</a> Neuron. 46, 445-456 (2005).</li><li>Kreher, S. A., Mathew, D., Kim, J., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+sensory+input+into+behavioral+output+via+an+olfactory+system.">Translation of sensory input into behavioral output via an olfactory system.</a> Neuron. 59, 110-124 (2008).</li><li>Hallem, E. A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coding+of+odors+by+a+receptor+repertoire.">Coding of odors by a receptor repertoire.</a> Cell. 125, 143-160 (2006).</li><li>Monte, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+larval+olfactory+response+in+Drosophila+and+its+genetic+basis.">Characterization of the larval olfactory response in Drosophila and its genetic basis.</a> Behav Genet. 19, 267-283 (1989).</li><li>Gershow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+airborne+cues+to+study+small+animal+navigation.">Controlling airborne cues to study small animal navigation.</a> Nature methods. 9, 290-296 (2012).</li><li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations.">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature methods. 11, 338-346 (2014).</li><li>Hernandez-Nunez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse-correlation+analysis+of+navigation+dynamics+in+Drosophila+larva+using+optogenetics.">Reverse-correlation analysis of navigation dynamics in Drosophila larva using optogenetics.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li><li>Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAABA:+interactive+machine+learning+for+automatic+annotation+of+animal+behavior.">JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior.</a> Nature methods. 10, 64-67 (2013).</li><li>Newquist, G., Novenschi, A., Kohler, D., Mathew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contributions+of+Olfactory+Receptor+Neurons+in+a+Drosophila+olfactory+circuit.">Differential contributions of Olfactory Receptor Neurons in a Drosophila olfactory circuit.</a> eNeuro. 3, (2016).</li><li>Schulze, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamical+feature+extraction+at+the+sensory+periphery+guides+chemotaxis.">Dynamical feature extraction at the sensory periphery guides chemotaxis.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Tastekin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+Subesophageal+Zone+in+Sensorimotor+Control+of+Orientation+in+Drosophila+Larva.">Role of the Subesophageal Zone in Sensorimotor Control of Orientation in Drosophila Larva.</a> Current Biology. 25, 1448-1460 (2015).</li><li>Famiglietti, E. V., Kolb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+ON-and+OFF-center+responses+in+retinal+ganglion+cells.">Structural basis for ON-and OFF-center responses in retinal ganglion cells.</a> Science. 194, 193-195 (1976).</li><li>Luo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+thermotaxis+in+Caenorhabditis+elegans+is+mediated+by+distinct+sensorimotor+strategies+driven+by+the+AFD+thermosensory+neurons.">Bidirectional thermotaxis in Caenorhabditis elegans is mediated by distinct sensorimotor strategies driven by the AFD thermosensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2776-2781 (2014).</li><li>Berck, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wiring+diagram+of+a+glomerular+olfactory+system.">The wiring diagram of a glomerular olfactory system.</a> eLife. 5, (2016).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, describimos un método que permite la medición de la conducta de larvas de Drosophila en respuesta a la activación de la optogenetic simultánea de neuronas olfativas. Descrito larvas seguimiento métodos1,8 utilizan la tecnología de entrega diferente olor para activar ORNs. Sin embargo, estos métodos no pueden controlar la especificidad o patrones temporales de la activación de la ORN. Nuestro método supera estos déficits mediante estímulos de luz en lugar de estímulos de olor para un control más exacto de la activación de la ORN.
Los materiales necesarios para construir la arena de comportamiento puede obtenerse fácilmente en la ferretería local y requiere un esfuerzo mínimo en Asamblea. La electrónica necesaria para preparar el módulo optogenetics es también fácilmente disponibles y construido. El método descrito aquí utiliza luz roja para activar una rodopsina canal rojo-cambiado de puesto (CsChrimson) expresado en neuronas específicas. El comportamiento larval resultante en respuesta a la correspondiente activación de ORN se registra con una cámara CCD y medido utilizando software escrito a medida que se proporciona aquí. Nuestro método permite a los investigadores a pedir respuestas a varias preguntas que no eran posibles antes de: 1) ¿Cuál es el impacto de patrones de diferentes estímulos olfativos en la habilidad del animal para navegar hacia un olor? ¿2) similares a en el centro y las células del ganglio de OFF-center en la retina mamíferos16, hay ORNs que respondan específicamente a una disminución de estímulos olfativos además de ORNs que responden a un aumento de estímulos olfativos? Por último, nuestro método permite una gran variedad de aplicaciones futuras, incluyendo la medición del impacto de neuronas descendentes en el circuito olfatorio (PNs y LNs) navegación larval.
Si bien hay varias ventajas a nuestro método, reconocemos ciertas limitaciones. No está claro si efectos de concentración observados con olores pueden ser replicados fácilmente usando este sistema. Mientras que nuestra configuración actual no permite esto, el módulo optogenetics podría modificarse fácilmente para dar cabida a los aumentos o disminuciones de la intensidad del estímulo luz. En el futuro, nosotros comprobará para ver si cambio intensidad del estímulo luz imita efectos de la concentración de olores. Técnicas genéticas mosca simple pueden utilizarse para expresar CsChrimson en ambos todos los 21 pares de ORNs (usando Gal4 Orco) o en un solo par de ORNs (mediante Gal4s o individuales). Sin embargo, se necesitarían genética complicada para expresar CsChrimson en 1 < n < 21' las neuronas. Debido a esto, sería difícil de replicar los efectos observados con mezclas de olores donde los componentes individuales de la mezcla de provocan respuestas de más de un acido. A pesar de comportamiento navegación larvas se considera un comportamiento dimensional bajo, reconocemos que nuestro programa de seguimiento de larvas puede mejorarse aún más en el futuro considerando adicionales descriptores de comportamiento basados en la postura animal (p. ej. probabilidad de cabeza gira, cuerpo curvas etc.)8,17. Nuestro estudio se limitó a neuronas sensoriales de primer orden en la larva. Más investigación se requiere antes de que nuestro método puede ser aplicado a las neuronas de proyección de segundo orden y de neuronas locales que están incrustadas en la región del cerebro lóbulo del cerebro18.
En Resumen, nuestro método ofrece la posibilidad de analizar la función de cada Acido en el circuito olfatorio simple y manejable de la larva de Drosophila . Al hacerlo, nuestro método le permitirá desarrollo de modelos computacionales más precisos que describen cómo las señales del olor se traducen en diferentes salidas conductuales.

Información olfativa en el entorno de una larva de Drosophila es detectada por solamente 21 ORNs funcionalmente diferentes, las actividades de las cuales en última instancia determinar comportamiento larval1,2,3,4. Sin embargo, relativamente poco se sabe acerca de la lógica por la que está codificada información sensorial en las actividades de estos 21 ORNs. Por lo tanto es necesario medir experimentalmente la contribución funcional de cada larva ORN a comportamiento.
Aunque el perfil de la respuesta sensorial del repertorio entero de ORNs larvas de Drosophila se ha estudiado en detalle1,4,5, las contribuciones de ORNs individuales al circuito olfatorio y de tal modo a comportamiento de navegación siguen siendo en gran parte desconocidos. En estudios de comportamiento larval, hasta el momento, dificultades debido a la incapacidad de espacial y temporal activar solo ORNs. Un panel de olores que se activan específicamente 19 de los 21 ORNs larvas de Drosophila fue descrito recientemente1. Cada olor en el panel, en bajas concentraciones, provoca una respuesta fisiológica de su cognado ORN. Sin embargo, en concentraciones más altas que se utilizan normalmente para los ensayos de comportamiento convencional, cada olor provoca respuestas fisiológicas de múltiples ORNs1,5,6. Además, los olores en este panel han variado volatilidades que complican la interpretación de los estudios de comportamiento que dependen de la formación de gradientes de olor estable7,8. Por último, naturalmente que ocurren estímulos de olor tienen un componente temporal que es difícil de reproducir en condiciones de laboratorio. Por lo tanto es importante desarrollar un método que puede medir el comportamiento larval mientras que simultáneamente activar ORNs individuales de una manera espacial y temporal.
Aquí, demostramos un método que tiene ventajas sobre el seguimiento de larvas previamente descrito ensayos1,8. El seguimiento se describe en Gershow et al. emplea válvulas controladas electrónicamente para mantener un gradiente estable de olor en la arena de comportamiento8. Sin embargo, debido a la compleja ingeniería para construir la configuración de estímulos de olor, este método es difícil de replicar en otros laboratorios. Además, siguen sin resolverse los problemas relacionados con el uso de aceites para activar específicamente solo ORNs. El seguimiento se describe en Mateo et al. emplea un sistema más simple de olor, pero el gradiente de olor resultante depende de la volatilidad de la prueba de olor y es inestable para las duraciones largas del ensayo1. Así, mediante la sustitución de estímulos de olor con estímulos de luz, nuestro método tiene las ventajas de especificidad y un control temporal de la activación ORN y no es dependiente en la formación de gradientes de olor de diferentes potencias.
Nuestro método es fácil de configurar y es apropiado para los investigadores interesados en la medición de aspectos de la navegación de larvas de Drosophila . Esta técnica podría adaptarse a otros sistemas de modelo siempre y cuando el investigador es capaz de conducir la expresión de CsChrimson en neuron(s) de su sistema favorito de la elección. CsChrimson es una versión rojo-cambiado de puesto de la rodopsina de la canal. Se activa en longitudes de onda que son invisibles al sistema de phototaxis de la larva. Por lo tanto somos capaces de manipular la actividad de las neuronas con especificidad, confiabilidad y reproducibilidad9. Modificando la costumbre escrita software para tener en cuenta para los cambios de tamaño de los sujetos, este método podría ser fácilmente adaptado para reptantes larvas de otras especies de insectos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:925px;" width="924">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:359px;">Video camera to capture larval movement</td>
			<td style="width:296px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">CCD Camera&#160;</td>
			<td style="width:296px;">Edmund Optics</td>
			<td style="width:208px;">106215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">M52 to M55 Filter Thread Adapter</td>
			<td style="width:296px;">Edmund Optics</td>
			<td>59-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">2&#34; Square Threaded Filter Holder for Imaging Lenses&#160;</td>
			<td style="width:296px;">Edmund Optics</td>
			<td>59-445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">RG-715, 2&#34; Sq. Longpass Filter</td>
			<td style="width:296px;">Edmund Optics</td>
			<td>46-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Electronics for optogenetic setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Raspberry Pi 2B</td>
			<td>RASPBERRY-PI.org</td>
			<td>RPI2-MODB-V1.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">3 Channel programmable power supply</td>
			<td>newegg.com</td>
			<td>9SIA3C62037092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">8 Channel optocoupler relay</td>
			<td>amazon.com</td>
			<td>6454319</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">630nm Quad-row LED strip lights</td>
			<td>environmentallights.com</td>
			<td>red3528-450-reel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:359px;">850nm LED strips</td>
			<td>environmentallights.com</td>
			<td>wp-4000K-CC5050-60x2-kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:359px;">Software&#160;</td>
			<td style="width:296px;"></td>
			<td style="width:208px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:359px;">Matlab</td>
			<td>Mathworks Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:359px;">Ubuntu MATE v16.04</td>
			<td>Nubuntu</td>
			<td>https://github.com/yslo/nubuntu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Other items</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Plexiglass black acrylic</td>
			<td>Home Depot</td>
			<td style="width:208px;">MC1184848bl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Fly food and other reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Nutrifly fly food</td>
			<td style="width:296px;">Genesee Scientific</td>
			<td>66-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Agarose powder</td>
			<td style="width:296px;">Genesee Scientific</td>
			<td>20-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">22cm X 22cm square petri-dish</td>
			<td style="width:296px;">VWR Inc.</td>
			<td>25382-327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>84097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">All trans-retinal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Flies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">UAS-IVS-CsChrimson&#160;</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>55134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:359px;">Orco-Gal4</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>26818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Or42a-Gal4</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>9970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Or7a-Gal4</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center</td>
			<td>23907</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking drosophila larval behavior in response to optogenetic stimulation of olfactory neurons

La capacidad de navegar hacia fuentes de olor de insectos se basa en la actividad de sus neuronas receptoras olfatorias de primer orden (ORNs). Mientras que se ha generado una cantidad considerable de información sobre respuestas ORN a los aceites, el papel de ORNs específicos en las respuestas del comportamiento de conducción sigue siendo mal entendido. Complicaciones en el análisis de comportamiento se presentan debido a diferentes volatilidades de odorantes que activan las ORNs individuales, múltiples ORNs activados solo olores, y la dificultad en reproducir naturalmente observadas variaciones temporales en estímulos olfativos utilizando métodos convencionales de olor-entrega en el laboratorio. Aquí, describimos un protocolo que analiza la conducta de larvas de Drosophila en respuesta a la estimulación simultánea de la optogenetic de sus ORNs. La tecnología optogenetic utilizada aquí permite la especificidad de la activación de la ORN y control preciso de los patrones temporales de la activación de la ORN. Correspondiente movimiento de larvas se realiza un seguimiento, grabados digitalmente y analizados usando custom software por escrito. Mediante la sustitución de estímulos de olor con estímulos de luz, este método permite un control más preciso de la activación individual de ORN para estudiar su impacto en el comportamiento larval. Nuestro método podría ampliarse aún más para estudiar el impacto de las neuronas de proyección de segundo orden (PNs) además de las neuronas locales (LNs) en comportamiento larval. Este método permitirá así a una disección completa de la función olfativa circuito y complemento de estudios sobre actividades de neurona olfativa cómo traducen en respuestas de comportamiento.

Para demostrar la especificidad de la activación de la ORN, nuestro método se aplicó con éxito para determinar el impacto de dos diferentes ORN (ORN::7a y ORN::42a) activación (ORNs manifieste su Or7a o Or42a) en el comportamiento larval (figura 3). Consistente con estudios recientes que individuales ORNs larvas son funcionalmente distintos1,10,13, nuestros datos representativos demuestran que cuando ORN::7a expresar CsChrimson fue estimulada por la luz, había un disminución significativa en el funcionamiento largo comparado con animales control. Por el contrario, cuando ORN::42a expresar CsChrimson fue estimulada por la luz, hubo un aumento significativo de largo funcionamiento en comparación con animales de control (figura 3). Los datos colectivos analizados de ~ 100-120 se obtuvieron pistas larvales (n = 8) ensayos realizados para cada genotipo. Las barras de error representan SEM. Mientras que se describe aquí sólo un parámetro de comportamiento individual (longitud de ejecución), observamos que cada pista larvas puede analizarse además para calcular los parámetros para la velocidad, la curvatura de la trayectoria, y cuerpo dobla1,8,13, 14,15. Más parámetros relacionados con direccionalidad como ángulo de dirección, longitud y velocidad hacia y lejos de los olores pueden obtenerse si se proporciona una fuente de olor en un lado de la arena1,8,13.
Para demostrar la capacidad de nuestro método para modificar los patrones temporales de la activación de la ORN, hemos variado nuestro estímulo para alternar entre encendido y apagado de luces. Sometimos las larvas expresando UAS -CsChrimson en ORN::42a a tres diferentes patrones temporales de los estímulos de luz durante el período de las luces ON (0,04 Hz, 1 Hz y constante). Luego medimos cambios en parámetros conductuales que ocurren durante la fase de luces OFF → ON y luces en fase → OFF. Encontramos que para ORN::42a, diferentes patrones temporales del estímulo luz produce diferentes respuestas conductuales (figura 4). Tales cambios no se observaron en las larvas de control que no expresan UAS-CsChrimson en cualquier ORNs. Estos resultados destaca la importancia de entender cómo temporales patrones de activación de ORN contribuyen al comportamiento animal.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57353/57353fig1.jpg"> Figura 1 : Comportamiento arena y medio reptante larvas. (A) vista de la arena de la caja negra de comportamiento frontal. La puerta de la arena revela una cámara CCD suspendida del techo de la caja. (B) vista inferior de una plataforma de metal que contiene rojo tiras de luz LED utilizadas para estímulos de optogenetic se monta alrededor de la cámara CCD. (C) vista superior del medio reptante larvas utilizado en el ensayo. Antes de registrar el movimiento de larvas, en capas de ~ 20 larvas lavadas se colocan en el centro de una 22 cm x 22 cm plato de Petri con agarosa al 1.5%. La placa de Petri que contienen larvas se coloca en el centro de la arena bajo la cámara y entre dos infrarrojos LED tiras de la luz que se utilizan como fuente de luz para la cámara. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57353/57353fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57353/57353fig2.jpg"> Figura 2 : Configuración Optogenetics. Una infografía que muestra el arreglo electrónico para la instalación de optogenetics. Brevemente, luz del LED (630 nm) tiras se conectan en serie y los cables de las tiras son alimentados en un optoacoplador conectado a un microprocesador de 2B frambueso PI. Las tiras de luz LED y el optoacoplador son alimentados por una fuente de alimentación. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57353/57353fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57353/57353fig3.jpg"> Figura 3 : Impacto de activación luz de ORNs individuales en comportamiento larval. Longitud carrera de larvas expresar CsChrimson en ORN::7a y ORN::42a fueron afectados diferentemente en comparación con el control de larvas en la activación de luz. Cada barra representa RI promedio ± SEM (n = 8). Las larvas cuando se activó la ORN::7a ejecución fue significativamente menor al control. Las larvas cuando se activó la ORN::42a ejecución fue significativamente superior de control. Las barras representan la media ± SEM (n = 8, prueba de t de Student; "*" es p < 0.05, "**" es p < 0.001). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57353/57353fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57353/57353fig4.jpg"> Figura 4 : Impacto de los diferentes patrones temporales de la activación de la ORN en comportamiento larval. (A) tres patrones temporales de los estímulos utilizados para activar ORNs. Estímulo a: constante de 1 min luz durante el estímulo de luz de estímulo b: de 0,04 Hz, estímulo c: 1 Hz luz la estimulación durante período de LED en minuto 2. (B) las larvas se sometieron a los tres patrones diferentes de estímulos de luz descritos en el A. Cada punto representa el cambio de comportamiento larval, debajo de cada patrón de estímulos de luz, luz de activación cambia de ON a OFF. Cambio en 'run longitud' (Av. longitud (OFF) - Av. corren largo (a)) se grafica en el eje x. Cambio en 'run speed' (velocidad (OFF) - Av. correr velocidad (ON) Av.) se grafica en el eje y. El gráfico de la izquierda (puntos grises) representa las mediciones de las larvas de control y el gráfico de la derecha (puntos rojos) representa medidas de larvas expresar CsChrimson en ORN::42a. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57353/57353fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Final Code PDF" src="/files/ftp_upload/57353/57353code.jpg"> Archivo suplementario de sintaxis: un conjunto de simples códigos de Matlab ('Tracklarva') que se puede fácilmente adaptar a las condiciones apropiadas. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57353/Final_Code.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Seguimiento del comportamiento de las larvas de Drosophila en respuesta a la estimulación optogenética de las neuronas olfativas | Neurociencia | Video

Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Este protocolo analiza comportamiento navegación de larva de Drosophila en respuesta a la estimulación simultánea de la optogenetic de sus neuronas olfativas. Luz de longitud de onda de 630 nm se usa para activar las neuronas olfativas individuales expresando una rodopsina canal rojo-cambiado de puesto. Movimiento de larvas al mismo tiempo se realiza un seguimiento grabado digitalmente y analizados utilizando el software de medida.

Seguimiento de comportamiento larvario de Drosophila en respuesta a la estimulación de la Optogenetic de las neuronas olfatorias

The ability of insects to navigate toward odor sources is based on the activities of their first-order olfactory receptor neurons (ORNs). While a ...

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Nanyang Technological University

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Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

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7.2K vistas.  University of Nevada. Este protocolo analiza comportamiento navegación de larva de Drosophila en respuesta a la estimulación simultánea de la optogenetic de sus neuronas olfativas. Luz de longitud de onda de 630 nm se usa para activar las neuronas olfativas individuales expresando una rodopsina canal rojo-cambiado de puesto. Movimiento de larvas al mismo tiempo se realiza un seguimiento grabado digitalmente y analizados utilizando el software de medida.

Video: Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Grabaciones solo Sensillum en los insectos Drosophila melanogaster Y Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Investigación

Neurociencias

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of its convenient genetics and fully sequenced genome. Additionally, the larval nervous system is an ideal model system to study mechanisms of axonal transport as the larval segmental nerves contain bundles of axons with their cell bodies located within the brain and their nerve terminals ending along the length of the body. Here we describe the procedure for visualization of synaptic vesicle proteins within larval segmental nerves. If done correctly, all components of the nervous system, along with associated tissues such as muscles and NMJs, remain intact, undamaged, and ready to be visualized. 3rd instar larvae carrying various mutations are dissected, fixed, incubated with synaptic vesicle antibodies, visualized and compared to wild type larvae. This procedure can be adapted for several different synaptic or neuronal antibodies and changes in the distribution of a variety of proteins can be easily observed within larval segmental nerves.

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Drosophila melanogaster larvae provide an ideal model system to investigate the mechanisms of axonal transport within larval segmental nerves. Using this procedure, 3rd instar larvae carrying various mutations can be compared to wild type larvae.

La visualización de larvas Nervios segmentarios en 3 Rd Instar Drosophila Preparación de larvas

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells in the walls of the lateral ventricle give rise to neuroblasts that migrate for several millimeters along the rostral migratory stream (RMS) to reach and incorporate into the olfactory bulb. To study the different steps and the impact of adult-born neuron integration into preexisting olfactory circuits, it is necessary to selectively label and manipulate the activity of this specific population of neurons. The recent development of optogenetic technologies offers the opportunity to use light to precisely activate this specific cohort of neurons without affecting surrounding neurons4,5. Here, we present a series of procedures to virally express Channelrhodopsin2(ChR2)-YFP in a temporally restricted cohort of neuroblasts in the RMS before they reach the olfactory bulb and become adult-born neurons. In addition, we show how to implant and calibrate a miniature LED for chronic in vivo stimulation of ChR2-expressing neurons.

Selective Viral Transduction of Adult-born Olfactory Neurons for Chronic in vivo Optogenetic Stimulation

Adult-born neurons of the olfactory bulb can be optogenetically controlled using Channelrhodopsin2-expressing lentiviral injection in the rostral migratory stream and chronic photostimulation with an implanted miniature LED.

Transducción viral selectiva de adultos nacidos en las neuronas olfativas de las enfermedades crónicas En vivo Estimulación Optogenetic

Local interneurons are continuously regenerated in the olfactory bulb of adult rodents1-3. In this process, called adult neurogenesis, neural stem cells ...

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular disease and various neurological diseases1. We have optimized simple and robust behavioral assays for determining larval locomotion, adult climbing ability (RING assay), and courtship behaviors of Drosophila. These behavioral assays are widely applicable for studying the role of genetic and environmental factors on fly behavior. Larval crawling ability can be reliably used for determining early stage changes in the crawling abilities of Drosophila larvae and also for examining effect of drugs or human disease genes (in transgenic flies) on their locomotion. The larval crawling assay becomes more applicable if expression or abolition of a gene causes lethality in pupal or adult stages, as these flies do not survive to adulthood where they otherwise could be assessed. This basic assay can also be used in conjunction with bright light or stress to examine additional behavioral responses in Drosophila larvae. Courtship behavior has been widely used to investigate genetic basis of sexual behavior, and can also be used to examine activity and coordination, as well as learning and memory. Drosophila courtship behavior involves the exchange of various sensory stimuli including visual, auditory, and chemosensory signals between males and females that lead to a complex series of well characterized motor behaviors culminating in successful copulation. Traditional adult climbing assays (negative geotaxis) are tedious, labor intensive, and time consuming, with significant variation between different trials2-4. The rapid iterative negative geotaxis (RING) assay5 has many advantages over more widely employed protocols, providing a reproducible, sensitive, and high throughput approach to quantify adult locomotor and negative geotaxis behaviors. In the RING assay, several genotypes or drug treatments can be tested simultaneously using large number of animals, with the high-throughput approach making it more amenable for screening experiments.

Methods to Assay Drosophila Behavior

Drosophila melanogaster is a genetically and behaviorally tractable model system that has been used to understand the molecular and cellular basis of many important biological processes for over a century 1. Drosophila has been well exploited to gain insights into the genetic basis of fly behavior.

Métodos de ensayo a Drosophila Comportamiento

Drosophila melanogaster, the fruit fly, has been used to study molecular mechanisms of a wide range of human diseases such as cancer, cardiovascular ...

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

Apetitivo aprendizaje asociativo olfativa en<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the elucidation of the molecular mechanisms involved in cognitive diseases1-7. Learning and memory can be assayed in larvae to study the effect of neurodevelopmental genes8-10 and in flies to measure the contribution of adult plasticity genes1-7. Furthermore, the short lifespan of Drosophila facilitates the analysis of genes mediating age-related memory impairment5,11-13. The availability of many inducible promoters that subdivide the Drosophila nervous system makes it possible to determine when and where a gene of interest is required for normal memory as well as relay of different aspects of the reinforcement signal3,4,14,16.
Studying memory in adult Drosophila allows for a detailed analysis of the behavior and circuitry involved and a measurement of long-term memory15-17. The length of the adult stage accommodates longer-term genetic, behavioral, dietary and pharmacological manipulations of memory, in addition to determining the effect of aging and neurodegenerative disease on memory3-6,11-13,15-21.
Classical conditioning is induced by the simultaneous presentation of a neutral odor cue (conditioned stimulus, CS+) and a reinforcement stimulus, e.g., an electric shock or sucrose, (unconditioned stimulus, US), that become associated with one another by the animal1,16. A second conditioned stimulus (CS-) is subsequently presented without the US. During the testing phase, Drosophila are simultaneously presented with CS+ and CS- odors. After the Drosophila are provided time to choose between the odors, the distribution of the animals is recorded. This procedure allows associative aversive or appetitive conditioning to be reliably measured without a bias introduced by the innate preference for either of the conditioned stimuli. Various control experiments are also performed to test whether all genotypes respond normally to odor and reinforcement alone.

Drosophila Adult Olfactory Shock Learning

The method to measure adult Drosophila associative memory is described. The assay is based on the ability of the fly to associate an odor presented with a negative reinforcer (electric shock) and then recall this information at a later time, allowing memory to be measured.

Drosophila Adulto olfativa Choque Aprendizaje

Drosophila have been used in classical conditioning experiments for over 40 years, thus greatly facilitating our understanding of memory, including the ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Optogenético estimulación de comportamiento de escape en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Todo el montaje de Immunolabeling olfativa del receptor de las neuronas en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Antena

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenético la estimulación del sistema nervioso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted deaf subjects1-6. Nonetheless, sound coding with current CIs has poor frequency and intensity resolution due to broad current spread from each electrode contact activating a large number of SGNs along the tonotopic axis of the cochlea7-9. Optical stimulation is proposed as an alternative to electrical stimulation that promises spatially more confined activation of SGNs and, hence, higher frequency resolution of coding. In recent years, direct infrared illumination of&#160;the cochlea has been used to evoke responses in the auditory nerve10. Nevertheless it requires higher energies than electrical stimulation10,11 and uncertainty remains as to the underlying mechanism12. Here we describe a method based on optogenetics to stimulate SGNs with low intensity blue light, using transgenic mice with neuronal expression of channelrhodopsin 2 (ChR2)13 or virus-mediated expression of the ChR2-variant CatCh14. We used micro-light emitting diodes (&#181;LEDs) and fiber-coupled lasers to stimulate ChR2-expressing SGNs through a small artificial opening (cochleostomy) or the round window. We assayed the responses by scalp recordings of light-evoked potentials (optogenetic auditory brainstem response: oABR) or by microelectrode recordings from the auditory pathway and compared them with acoustic and electrical stimulation.

Cochlear implants (CIs) enable hearing by direct electrical stimulation of the auditory nerve. However, poor frequency and intensity resolution limits the quality of hearing with CIs. Here we describe optogenetic stimulation of the auditory nerve in mice as an alternative strategy for auditory research and developing future CIs.

Estimulación Optogenética del nervio auditivo

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...