המחקר נתמך על ידי מענק של מכוני הבריאות הלאומיים, הלאומית המכון של שיניים ומחקר ואסטתיים (DE025030).

הפרוטוקול המתואר להלן אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה ועוקבת אחרי ההנחיות מוסרית נוסדה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים. כל הנתונים שהובאו בדו ח זה נוצר על ידי שימוש בעכברים הנשי שהיו בגיל 10-12 שבועות. זני עכברים הבאים שימשו: C57BL/6, BALB/ג, DBA1, 129S ו- F1 (B6XA/J). כל העכברים היו שוכנו בכלובים מכשול (5 חיות לכל כלוב) בתנאים מסוימים ללא הפתוגן וסיפק מזון ומים ad libitum.
1. הכנה
<ol><li>כדי להכין פתרון מניות של פילוקרפין הידרוכלוריד, שוקלת 10 מ ג של המתחם, להמיס ב 1.776 מ ל תמיסת סטרילית מול מאת vortexing, בכדי לתת מענה מניות של 5.63 מ"ג/מ"ל. יש צורך לעקר את הפתרון הזה. אבל, אם תסנן את זה דרך מסנן 0.2 µM. לאחסן פתרון מניות זה aliquots מרובים במקפיא-80 oC עד 3 חודשים. כל מניה קפוא הוא לשימוש יחיד. ברגע הקרת, לא להקפיא את הפתרון פילוקרפין מחדש..</li>
	<li>קח 0.6 מ"ל microfuge צינורות, בזהירות אגרוף חור קטן בתחתית של כל שפופרת עם מחט אל תדאגי מחוממת. הגדר הצינורות האלה לתוך צינורות 2 מ"ל. הצינורות לא צריך להיות סטרילי.</li>
	<li>בעזרת סכין גילוח חד, סטרילי, לחתוך גליל מטליות סופג לחתיכות בערך 2 ס מ אורך. חותכים כל חלק 2 ס מ באלכסון כדי לתת 2 מטליות בצורת חרוט. הצב ספוגית אחת בכל אחד הצינורות microfuge 0.6 מ"ל.</li>
	<li>שוקלים את הצינור microfuge 0.6 מ"ל המכיל הקיסם יבש.</li>
	<li>העברת העכברים שילמדו לתוך כלוב נקי חדש עם בקבוקי מים. לשמור על העכברים ללא מזון במשך לפחות שעתיים לפני תחילת אוסף רוק כדי למנוע חלקיקי מזון שמזהם את הרוק שנאספו. הערה: אין צורך לשמור על העכבר 1 לכל כלוב עבור הליך זה. עם זאת, מספר עכברים להציב בכלוב כל תלוי של המוסד הספציפי החוקים והתקנות לשימוש בבעלי חיים.</li>
	<li>קצת לפני סוף 2 h, הכן הפתרון פילוקרפין לעבוד (0.0563 mg/mL) על ידי דילול מניות פתרון x 100 בתוך תמיסת מלח סטרילית. זה לא הכרחי כדי מסנן נוסף לעקר את הפתרון הזה. שמור תמיד את הפתרון פילוקרפין עובד על קרח. הערה: טבלה 1 נותן כמות פילוקרפין כדי להיות מוזרק למגוון רחב של משקולות גוף העכבר כדי לתת מנה הסופי של 0.375 מ"ג/ק"ג משקל גוף.</li>
</ol>2. הליך
<ol><li>שוקל כל עכבר, לקבוע את המינון של המיקס הרדמה עבור כל העכבר באמצעות טבלה 1. להזריק את העכבר הראשון עם נפח מתאים של המיקס הרדמה על ידי תוואי בקרום הבטן. לכוון את הטיימר למשך 2 דקות (רוב זני העכבר במקצועות פרוטוקול זה ללכת לישון על ידי 2 דקות). ודא כי העכבר הוא כראוי ומורדמת באמצעות חוסר הליכה כאשר מניחים על משטח שטוח. אם העכבר עדיין ללכת, לחכות 2 דקות נוספות לפני שתמשיך לשלב הבא. טיפה של משחה אופטלמולוגיות סיכה חלות על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות. הערה: טבלה 1, המינון של המיקס הרדמה היא 0.007 mL/גרם משקל. הטווח האופטימלי עבור הליך זה הוא במשקל הגוף כדי 0.006 0.008 מ ל/g. עם זאת, לאחר 4 דקות, אם העכבר עדיין הליכה או מציג תנועות קופצניות, התייעץ עם הוטרינר מוסדי עבור כראוי להגדיל את המינון של ההרדמה.</li>
	<li>לקבוע את המינון של פילוקרפין אחר העכבר באמצעות טבלה 1 ולהזריק את הכמות המתאימה דרך בקרום הבטן. את הטיימר למשך 2 דקות ולהוסיף את העכבר לתוך הצינור restrainer 50 מ ל עד בראש ובאוזניים להישאר מחוץ הסוף לחתוך. הניחו את השפופרת בזווית של 45 מעלות, עם הראש למטה, ואת (גחוני) פונה כלפי מעלה. קלטת את הצינור ללוח הליך כדי למנוע את העברת. הערה: טבלה 1 מספק המינון עבור עכברים יותר מ- 17 גרם, כמו בהליך זה ניסה לא על עכברים שקילה מתחת 17 גרם.</li>
	<li>בסוף 2 דקות, בעדינות להוסיף זוג מיקרו לנתח מלקחיים לתוך הפה סגור והרם את הלסת התחתונה כלפי מעלה כדי לפתוח את הפה. לדחוף את המלקחיים 1-2 מ מ נוספים לתוך הפה, מוודא כי הלשון נתפסת נח על הזרוע העליונה של המלקחיים. עם עוד זוג מלקחיים בסדר, להחזיק הקיסם יבש מראש שנשקל קרוב את קצהו חרוט.</li>
	<li>החלק בעדינות את קצה הדגימה חרוט לתוך הפה. תיסוג המלקחיים ולהשאיר את קצה הדגימה בחלל הפה.</li>
	<li>לאחוז בקצה רחב יותר של הדגימה הארכת מחוץ הפה וסובב אותו כדי לאפשר מקסימום שטח המגע עם הפה. שמור את הספוגית בתנוחה זו למשך 15 דקות. הערה: פעולה זו מבטיחה כי הדגימה נשאר בפה למשך כל האוסף. שימו לב כי קצה הדגימה חרוט משמש הפתיל, החלק הרחב של הדגימה, נותר מחוץ לפה.</li>
	<li>בסוף 15 דקות, בעדינות לסובב הדגימה כדי לאסוף את כל רוק זה לא נספג ולמקם את הספוגית לחה בצינור microfuge 0.6 מ"ל. לסגור את הצינור ולהגדיר אותו בצינור 2 מ"ל על קרח. הערה: בשלב זה, הרירית האוראלית יופיעו יבש לחלוטין. העכבר עכשיו ניתן להעביר בחזרה לכלוב שלו ההתאוששות מן ההרדמה.</li>
	<li>להעביר את העכבר בתוך הכלוב. המקום לחלח באוכל שלהן בכלוב אחרי אוסף רוק כדי לסייע מהיר התייבשות. הערה: העכברים להתעורר בתוך 10 דקות לאחר הסיום של האוסף. הזרקה תת עורית של 0.2 מ"ל תמיסת מלח מול ומחוממת מראש יכול להינתן גם כדי להאיץ את ההחלמה.</li>
	<li>להמשיך העכבר הבאה. כל העכברים צריכים להיות במעקב עד הם התאוששו לגמרי, הן פעולות כירורגיות.</li>
</ol>3. מדידות
<ol><li>בסוף כל האוספים, לשקול את צינורות 0.6 מ"ל עם הדגימה רטוב. חישוב ההפרש בין משקל רטוב משקל יבש כדי לקבל את המשקל של הרוק מיוצר. מקם את הצינור 0.6 מ"ל עם הרוק בחזרה לתוך הצינור 2-mL.</li>
	<li>חתוך את הפקקים של הצינורות 2 מ"ל. לאחר מכן, centrifuge את צינורות 2 מ"ל למשך 2 דקות ב g 7500 x, ב 4oC ומפרידה מיקרו לשחזר את הרוק. למדוד את עוצמת הקול של הרוק תוך שימוש micropipette.</li>
	<li>לבטא את התוצאות כמו רוק משקל (מ ג)10 מעל 15 דקות או כיחס של רוק משקל (מ ג) / עכבר משקל הגוף (g). הערה: אם יש כבר למדוד הנפח של רוק חולצו מתוך הדגימה, לבטא את התוצאות כמות הרוק התאושש (mL) או היחס בין נפח רוק (mL) / עכבר משקל הגוף (g).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Proctor, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+salivary+secretion.">The physiology of salivary secretion.</a> Periodontol 2000. 70 (1), 11-25 (2016).</li><li>Fox, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sj&#246;gren's+syndrome.">Sj&#246;gren's syndrome.</a> Lancet. 366 (9482), 321-331 (2005).</li><li>Eisbruch, A., Kim, H. M., Terrell, J. E., Marsh, L. H., Dawson, L. A., Ship, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xerostomia+and+its+predictors+following+parotid-sparing+irradiation+of+head-and-neck+cancer.">Xerostomia and its predictors following parotid-sparing irradiation of head-and-neck cancer.</a> Int J Radiat Oncol Biol Phys. 50 (3), 695-704 (2001).</li><li>Marmary, Y., Fox, P. C., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+secretion+rates+from+mouse+and+rat+parotid+glands+are+markedly+different+following+pilocarpine+stimulation.">Fluid secretion rates from mouse and rat parotid glands are markedly different following pilocarpine stimulation.</a> Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 88 (2), 307-310 (1987).</li><li>Lin, A. L., Johnson, D. A., Wu, Y., Wong, G., Ebersole, J. L., Yeh, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+short-term+gamma-irradiation+effects+on+mouse+salivary+gland+function+using+a+new+saliva+collection+device.">Measuring short-term gamma-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device.</a> Arch Oral Biol. 46 (11), 1085-1089 (2001).</li><li>Scofield, R. H., Asfa, S., Obeso, D., Jonsson, R., Kurien, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+short+peptides+from+the+60-kDa+Ro+antigen+recapitulates+the+serological+and+pathological+findings+as+well+as+the+salivary+gland+dysfunction+of+Sjogren's+syndrome.">Immunization with short peptides from the 60-kDa Ro antigen recapitulates the serological and pathological findings as well as the salivary gland dysfunction of Sjogren's syndrome.</a> J Immunol. 175 (12), 8409-8414 (2005).</li><li>Deshmukh, U. S., Nandula, S. R., Thimmalapura, P. R., Scindia, Y. M., Bagavant, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+innate+immune+responses+through+Toll-like+receptor+3+causes+a+rapid+loss+of+salivary+gland+function.">Activation of innate immune responses through Toll-like receptor 3 causes a rapid loss of salivary gland function.</a> J Oral Pathol Med. 38 (1), 42-47 (2009).</li><li>Deshmukh, U. S., Ohyama, Y., Bagavant, H., Guo, X., Gaskin, F., Fu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+stimuli+accelerate+Sj&#246;gren's+syndrome-like+disease+in+(NZB+x+NZW)F1+mice.">Inflammatory stimuli accelerate Sj&#246;gren's syndrome-like disease in (NZB x NZW)F1 mice.</a> Arthritis Rheum. 58 (5), 1318-1323 (2008).</li><li>Szczerba, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+innate+immunity+and+Ro52-induced+antibody+causes+Sj&#246;gren's+syndrome-like+disorder+in+mice.">Interaction between innate immunity and Ro52-induced antibody causes Sj&#246;gren's syndrome-like disorder in mice.</a> Ann Rheum Dis. 75 (3), 617-622 (2016).</li><li>Takakura, A., Moreira, T., Laitano, S., De Luca J&#250;nior, L., Renzi, A., Menani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+muscarinic+receptors+signal+pilocarpine-induced+salivation.">Central muscarinic receptors signal pilocarpine-induced salivation.</a> J Dent Res. 82 (12), 993-997 (2003).</li><li>Yao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-induced+elevation+and+secretion+of+interleukin-1beta+in+the+submandibular+gland+of+male+mice.">Lipopolysaccharide-induced elevation and secretion of interleukin-1beta in the submandibular gland of male mice.</a> Immunology. 116 (2), 213-222 (2005).</li><li>Knudsen, J., Nauntofte, B., Josipovic, M., Engelholm, S. A., Hyldegaard, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+isoflurane+anesthesia+and+pilocarpine+on+rat+parotid+saliva+flow.">Effects of isoflurane anesthesia and pilocarpine on rat parotid saliva flow.</a> Radiat Res. 176 (1), 84-88 (2011).</li><li>Kohrs, R., Durieux, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ketamine:+teaching+an+old+drug+new+tricks.">Ketamine: teaching an old drug new tricks.</a> Anesth Analg. 87 (5), 1186-1193 (1998).</li><li>Kozaki, T., Hashiguchi, N., Kaji, Y., Yasukouchi, A., Tochihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+saliva+collection+using+cotton+swab+on+cortisol+enzyme+immunoassay.">Effects of saliva collection using cotton swab on cortisol enzyme immunoassay.</a> Eur J Appl Physiol. 107 (6), 743-746 (2009).</li></ol>

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

ייצור רוק הוא תהליך מורכב, מושפע מגורמים רבים. לכן, מדידת תפקוד בלוטת הרוק בחיות מעבדה עשויה להיות אתגר. אתגר נוסף הוא כי מדידות חוזרות של תפקוד בלוטת הרוק אצל אותה חיה נדרשים להקים תחילתה של מחלה או להפגין התאוששות לאחר הטיפול.
השיטה ספוגית שתוארו בדו ח זה פשוטה מבחינה טכנית לבצע עם אפשרויות מרובות כדי לייצג את הנתונים. התוצאות המתקבלות הן לשחזור, עם הבין-מפעיל גרסא חדשה. השיטה יכול לזהות ירידה בייצור הרוק מודלים שונים של תפקוד לקוי של בלוטת הרוק. יתרון משמעותי הוא השימוש של פולימרים אינרטי, סופג מאוד שחזור יעיל של רוק שנאספו, המאפשר מדידה של מולקולות הרוק. יתרון נוסף של שיטה זו הוא שניתן לבצע את הליך בו זמנית בעכברים עד 2 בכל פעם על-ידי מפעיל יחיד. זה באופן משמעותי יעיל יותר חלק מהשיטות האחרות, איפה זה מתבצע בעכבר אחת בכל פעם.
ההשתנות במדידות ייצור רוק היה שונא את כל טכניקות מדידה של הרוק. כדי למזער את השתנות, חשוב לדבוק בקפדנות הפרוטוקול. שלבים קריטיים כוללים: בחירה זמנית של היום צום העכברים ואיסוף רוק, המתאים מינון תרופות להרדמה פילוקרפין (טבלה 1), ואת משקל מדויק הרשומות של דגימות רטובה ויבשה. ניהול זמן זהירות נדרשת כדי להגדיר עד שני עברים בכל פעם עבור אוסף רוק.
כפי שמוצג באיור3, הסכום של הרוק מיוצר על ידי עכברים הוא זן התלויים. לכן, מתאים למתח, גיל ומין עכברים תואמים אמור לשמש כפקדי. טיטור של המינון פילוקרפין, המתח ספציפיים, התנאי ניסיוני בחקירה, מומלץ בחום. למרות מינון גבוה יותר של פילוקרפין מעבר 0.5 מ"ג/ק"ג גורם ייצור מוגבר של רוק, כדי להעריך את הבלוטות hypofunction, מומלץ להשתמש במינון נמוך. דבר זה מאפשר זיהוי הבדלים משניים אפילו בייצור רוק בין חולה ולשלוט עכברים. מינונים של 0.5 מ"ג/ק"ג משקל גוף, 0.375 מ"ג/ק"ג משקל גוף שימשו בהצלחה להפגין בלוטת הרוק hypofunction. עם זאת, יצוין כי מערכות דגם ניסיוני מסוימים עשויים לדרוש תקופות ארוכה או קצרה יותר של אוסף מזה המתואר פרוטוקול זה. זה צריך להיבדק על ידי כל מעבדה.
מגבלה של שיטה זו, רוב שיטות מדידה רוק הוא בצורך בהרדמה. הדו ח באמצעות שיטת ואקום אינו כולל את השימוש הרדמה5. עם זאת, היעדר הרדמה גורם רמות משתנות של חרדה בעכברים. הם נוטים המאבק ולנשוך את הצנרור, זה בתורו, יכול להשפיע על יעילות פלט ואוסף רוק. איזופלוריין הרדמה אצל חולדות גורם הייצור12רוק פילוקרפין המושרה פתע. לעומת זאת, קטמין מגביר הפרשות הסמפונות, הרוק באמצעות גירוי אוהד13. אנחנו ואחרים השתמשו בהצלחה של קטמין, חריגות השירותים הווטרינריים תערובת כחומר הרדמה למדידת פילוקרפין המושרה רוק ייצור4,7,8,9. הטווח המומלץ עבור ניתוח בהרדמה הוא 100-200 מ"ג/ק"ג של קטמין ו- 5-16 מ"ג/ק"ג של חריגות השירותים הווטרינריים14. המינון של 0.006-0.008 מ ל/גרם משקל בשימוש בשיטה זו (מקביל 60-80 מ"ג/ק"ג של קטמין ו- 6-8 מ"ג/ק"ג של חריגות השירותים הווטרינריים) נופל על הקצה התחתון של הטווח המומלץ, מספיקה למתן רמה אחידה של קיבעון ללא הרדמה עמוקה .
השיטה ספוגית הוקמה כחלופה לשיטה micropipet בשימוש שגרתי. החיסרון העיקרי של שיטת pipet היה ההשתנות הגבוהה בין המפעיל לבין הצורך לאסוף רוק עכבר אחד בכל פעם. השיטה ספוגית מטפל בשתי בעיות אלה. היתרונות כוללים הגבלה של מספר בעלי חיים הדרושים כדי להשיג כוח ניתוחים סטטיסטיים, התייעלות. ספוגיות כותנה בהחלפה עם פולימר אינרטי מטליות מציעים אפשרות טובה יותר מאז ספוגיות כותנה ידועים לפגיעה כימות של מולקולות פעילים ביולוגית-15.
לאור הפשטות של השיטה ספוגית, שלה הפארמצבטית גבוהה בין אנשים שונים, יש לקוות כי השיטה ספוגית יקל יותר השוואות של דגמי העכבר בין חוקרים במעבדות שונות ומוסדות.

בלוטות הרוק לייצר רוק בתגובה למגוון גירויים נוירולוגית ועל מכניים1. הגירויים מתבצעות דרך מערכת העצבים הסימפתטית, הפארא-סימפתטי לקולטנים adrenergic, שימוש ב בלוטת. פילוקרפין הוא סוכן שימוש, פארא-sympathomimetic, אשר פועלת בעיקר על קולטנים מוסקריניים. בבלוטת הרוק, זה גורם הייצור של רוק על ידי משחק על קולטן מוסקריני M31. ייצור רוק בעקבות פילוקרפין המינהל הוא מחוון ליכולת של בלוטות הרוק להגיב לגירוי, הוא נפוץ כאמצעי של תפקוד בלוטת הרוק.
מדידה מדויקת של ייצור רוק הוא קריטי במחקר של מחלות בלוטת הרוק כולל תסמונת סיוגרן2 ופציעה קרינה בעקבות הראש והצוואר סרטן טיפול3. פותחו מספר שיטות שונות למדידת ייצור רוק בחולדות. אלה כוללות תעלות ישירה של צינור הרוק excretory4, אוסף של רוק בין חלל הפה תחת ואקום5, וכן אוסף באמצעות נימי זכוכית6 או7,micropipette8, 9. ישיר תעלות התעלה הרוק מספק ביותר רוק טהור ומדויקים. עם זאת, זהו תהליך מאתגר מבחינה טכנית, פוטנציאל גרימת חבלה ductal מונע אוספים רוק חוזרות של אותה חיה. איסוף הרוק תחת ואקום יכול להוביל לתוצאות משתנה עקב ייבוש של רוק מהצינור. אובדן זה היא מוגזמת נוספת אצל עכברים עם ריור מופחת. נימים זכוכית לאפשר את האוסף של רוק עבור ניתוחים שלאחר מכן, אולם, שינויי צמיגות של רוק מופרש במדינה נגועים מונע מילוי יעיל נים. יתרה מזאת, הניסיונות לטאטא את חלל הפה כדי לאסוף שאריות הרוק יכול להוביל לפציעה. שיטת pipet מאפשר איסוף מלאה, המפעיל אותו, זה עקביות במידה ניכרת בין ניסויים. עם זאת, מסיבות לא ידועות, שיטה זו מציגה וריאציה משמעותי בין מפעילי שונים. לכן, כדי לאפשר השוואות המתאים, הוא הופך להיות הכרחי שבו המפעיל אותו מבצע את כל הניסויים הקשורים לפרוייקט ספציפי. ברור, זה מייצג חיסרון מרכזי עבור מעבדה.
כדי להתגבר על בעיות אלה, הליך פותחה כי משלב רוק אוסף שיטות להשתמש עבור בני אדם ומכרסמים. שיטת ספוגית, המתוארים להלן למדידת נפח פילוקרפין-induced רוק פשוטה, לשחזור, לא השפיעו על ידי המפעיל, ניתן לבצע שוב ושוב על אותה חיה. בנוסף, היא מאפשרת איסוף הרוק עבור ניתוחים עוקבות של חלבונים, immunoglobulins או מולקולות אחרות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals for saliva collection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pilocarpine hydrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA</td>
			<td>B21410</td>
			<td>Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Mix solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetamine (Ketamine hydrochloride)</td>
			<td>Vet One, Boise, Idaho, USA</td>
			<td>C3N VT1</td>
			<td>Stock is 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anased (Xylazine)</td>
			<td>Med-Vet International, Mettawa, IL, USA</td>
			<td>RXANASED-20</td>
			<td>Stock is 20 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotonic sterile saline</td>
			<td>Vet One, Boise, Idaho, USA</td>
			<td>501032</td>
			<td>Used as diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment)</td>
			<td>Henry Schien, Dublin, OH, USA</td>
			<td>48272</td>
			<td>Used to prevent eyes from drying during the procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for saliva collection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SalivaBio Children&#39;s swab</td>
			<td>Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Individually wrapped swabs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene tubes</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>89004-364</td>
			<td>Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 0.6 mL</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>87003-290</td>
			<td>Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 2 mL</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>87003-298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes with permanently attached needles</td>
			<td>Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>324702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 gauge regular bevel needles</td>
			<td>Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scalpel blade #11</td>
			<td>Integra York Inc PA, USA</td>
			<td>4-311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting forceps</td>
			<td>Roboz, Gaithersburg, MD, USA</td>
			<td>RS-5139</td>
			<td>Serrated angular 0.8 mm tip, 4&#34; length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Label tape</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA</td>
			<td>sc-224487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 channel timer</td>
			<td>Amazon.com, Seattle, WA, USA</td>
			<td>B06W2KCYVN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Mettler Toledo, Columbus OH, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS</td>
			<td>Invivogen, San Deigo, CA, USA</td>
			<td>tlrl-b5lps</td>
			<td>Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL - inject 100 uL/ moue ip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imject Alum adjuvant</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>77161</td>
			<td>Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Ro52 antiserum</td>
			<td>Generated in lab</td>
			<td></td>
			<td>Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals/ Kits for saliva analyses</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salivary lysozyme estimation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnzChek Lysozyme Assay Kit</td>
			<td>Molecular Probes, Eugene, OR, USA</td>
			<td>E-22013</td>
			<td>Used as per manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salivary IgA estimation by sandwich ELISA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgA</td>
			<td>Southern Biotech, Birmingham, AL, USA</td>
			<td>0106-01</td>
			<td>Standards for sandwich ELISA - range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti- mouse IgA unlabeled</td>
			<td>Southern Biotech, Birmingham, AL, USA</td>
			<td>1040-01</td>
			<td>Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti- mouse IgA HRP</td>
			<td>Southern Biotech, Birmingham, AL, USA</td>
			<td>1040-05</td>
			<td>Detection antibody used at 1:4000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB substrate</td>
			<td>Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>555214</td>
			<td>Used as per manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates</td>
			<td>Thermo Scientific, Rochester, NY, USA</td>
			<td>3855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salivary protein estimation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td>BioRad, Hercules, CA, USA</td>
			<td>5000006</td>
			<td>For protein estimation as per manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for the measurement of salivary gland function in mice

חולים עם תסמונת סיוגרן, מחלה אוטואימונית משפיע על בלוטות אקסוקרינית, לפתח דלקת בלוטת הרוק, הפחיתו ייצור רוק. באופן דומה, ייצור רוק נפגעו קשות בחולים שקיבלו טיפול קרינה עבור סרטן הראש והצוואר. מודלים מכרסמים, שפותחה כדי לחקות תנאים קליניים אלה, להקל על הבנת הפתוגנזה המחלה ולאפשר הפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות חדשות. לכן, היכולת למדוד באופן מדויק, reproducibly ו שוב ושוב תפקוד בלוטת הרוק במודלים של בעלי חיים הוא קריטי. בונים על הליכים שתואר קודם לכן בספרות, שיטה פותחה עונה על קריטריונים אלה, שימש להערכת תפקוד בלוטת הרוק בעכברים. יתרון נוסף של שיטה חדשה היא כי זה הוא שולט בקלות, יש גרסא חדשה בין המפעיל. תפקוד בלוטת הרוק מוערך את הסכום (משקל או נפח) או קצב (mL/min) של הרוק מיוצר בתגובה לגירוי פילוקרפין. הרוק שנאספו הוא מקור טוב עבור הניתוחים של תכולת החלבון, ריכוזים בנוגדנים מולקולות אחרות.

במערכות דגם ניסיוני העכבר, היכולת לייצר רוק בתגובה לגירוי פילוקרפין משמש כמחוון של תפקוד בלוטת הרוק. ייצור רוק נמדדה בעכברים נקבה בת 11 בשבוע C57BL/6 בשיטת ספוגית. ב- איור 1A, התוצאות מבוטא את כמות הרוק (מ ג) שנאספו בעקבות הגדלת מינון של פילוקרפין. במינון של 1 מ"ג/ק"ג משקל גוף, חלק העכברים התחיל מפגין מצוקה (באופן לא רצוני רועד רועד). ומכאן מינונים גבוהים יותר של פילוקרפין, מעבר 1 מ"ג/ק"ג משקל גוף לא נבדקו במחקר זה. ב- איור 1B, התוצאות מיוצגים כיחס בין רוק משקל (מ ג) למשקל הגוף העכבר (g). באופן קולקטיבי, נתונים אלה מראים קשר תגובה מינון גבוה בין ייצור כמות ורוק פילוקרפין. הנפח של רוק התאוששה הדגימה נמדדה גם. כפי שמוצג באיור 1C, יש הקונקורדנציה משמעותי בין רוק ונפח איפה 1 מ ג של רוק שווה ל- 0.001 mL.
התוצאות המתקבלות באמצעות שיטת ספוגית דומים לאלו שהושגו באמצעות שיטת איסוף פיפטה. איור 2A מראה כמות הרוק שנאספו על ידי שיטת ספוגית ושיטת pipet רשע דומה מאוד ההבדלים אינם סטטיסטית משמעותית. איור 2B 2 ג ו- 2D מראים כי השיטה ספוגית לא משפיעים שערוך של מולקולות ברוק. למעשה, לעומת שיטת pipet, השיטה ספוגית הראה על המגמה הכללית גבוהה יותר של רמות אכזרי של חלבון הרוק הכולל (איור 2C), פעילות ליזוזים הרוק (איור דו-ממדי) איגה הרוק (איור 2E). עם זאת, הבדלים אלה מבחינה סטטיסטית לא היו משמעותיים.
אוסף רוק השיטה המתוארת כאן הוא יכול לזהות את ההבדלים בין הרוק מיוצר על ידי העכבר שונים זנים (איור 3), בלוטת הרוק hypofunction המושרה על ידי תנאים מחלות שונות (איור 4). איור 3A מציג תוצאות של ייצור רוק פילוקרפין המושרה עכברים C57BL/6, BALB/ג, DBA1/J ו- 129S6 נשים 10-12-בת שבוע. העכברים 129S6 המיוצר הסכום הנמוך ביותר של הרוק לעומת זנים אחרים. יצוין, כי ההבדלים משקלי גוף אלו עכברים היו לא שונה באופן משמעותי (איור 3B). בשלב הבא, השיטה ספוגית שימש כדי לזהות בלוטת הרוק hypofunction, שתי דוגמאות מוצגות באיור4. איור 4A מראה תוצאה נציג של בלוטת הרוק hypofunction המושרה על ידי הפעלת מולדת חסינות לאחר ההזרקה של ליפופוליסכריד (LPS) (µg 10/עכבר, intraperitoneally). בקרת עכברים הוזרקו מלוחים11. עכברים שטופלו LPS מראים ירידה משמעותית רוק לעומת שולט. העברה פסיבית של נוגדנים תגובתי עם תסמונת אנטיגן סיוגרן A/Ro52 גורם בלוטת הרוק hypofunction, מודל זה מחקה היבטים מסוימים של תסמונת סיוגרן9. כפי שמוצג באיור 4B, עכברים הזריק אדג'וונט אלום פלוס נוגדנים anti-Ro52 ביחד היה ייצור רוק נמוך באופן משמעותי בהשוואה לעכברים שלא טופלו או עכברים שטופלו רק אלום.
השיטה ספוגית היא פשוט ליישם מפעיל עצמאי. איור 5 מציג ייצור הרוק הנשי 10-13-בת שבוע עכברים C57BL/6, בנסויים שנערכו בנקודות זמן שונות 6 באמצעות אופרטורים שונים 2. אופרטור התחלתי עם רק 2 חודשים של העכבר טיפול ניסיון בעוד המפעיל השני היה 6 חודשים של העכבר מוקדמת טיפול ניסיון, אבל הוצג רק לשיטת אוסף רוק למשך שבוע. נתונים אלה נוצרו בניסויים ביצעו כמעט שנה בנפרד, שימוש במינון פילוקרפין 0.375 מ"ג/ק"ג. היחס רוק מתקבל על ידי שני אופרטורים להציג טווח של קריאות (1.84 כדי 5.87). אופרטור של הניסויים המורחב תקופה של 10 שבועות בזמן הניסויים של המפעיל השני בוצעו מעל 3 ימים רצופים כמעט שנה לאחר מכן (איור 5A). ראוי לציין, היחס רוק שהושג לאורך זמן לא היו שונים באופן משמעותי (p = 0.064; מבחן Kruskal-Wallis). כדי עוד יותר להשוות בין המפעיל הספציפיים, היחס של רוק משקל לכל גרם משקל של ניסויים 3 עבור כל אופרטור היו איחדו, מוצגות באיור איור 5B. רוק יחסי שהושג על-ידי המפעיל (ממוצע + SEM; 4.45 + 0.152, n = 38) אינם שונים באופן משמעותי מפעיל 2 (ממוצע + SEM; 4.21 + 0.169; n = 25; p = 0.296 על ידי מבחן מאן ויטני).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57203/57203fig1.jpg"> איור 1: ייצור רוק תלויה במינון פילוקרפין. C57BL6/J עכברים (נקבות בת 11 בשבוע, 5 לכל קבוצה) הוזרקו מינונים שונים של פילוקרפין (משקל 0.25 מ"ג/ק"ג, 0.5 מ"ג/ק"ג, 1.0 מ"ג/ק"ג גוף), ייצור רוק נמדדה במשך 15 דקות (א) תוצאות מיוצגים כסכום רוק מ ג (זאת אומרת ± SEM). (B) הנתונים מיוצגים כמו רוק רשע יחס (רוק מ"ג לכל גרם משקל העכבר). (ג) רוק של עכברים C57BL/6 נקבה בת 11 בשבוע (n = 5) נאסף ע י שיטת ספוגית. פילוקרפין נעשה שימוש במינון של 0.375 מ"ג/ק"ג משקל גוף. הושארו רטוב נשקלו כדי למדוד את כמות הרוק מיוצר מ ג. הרוק בהושארו נמצאה לאחר מכן על ידי צנטריפוגה ולאחר הכרכים של הרוק התאושש נמדדו. ההסכם משמעותי נתפסת בין המשקל רוק בכרך מ"ג ו רוק µL. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57203/57203fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57203/57203fig2.jpg"> איור 2: שיטת ספוגית לא משפיע על הניתוח של מולקולות ברוק. רוק של 2 קבוצות של עכברים C57BL/6 נקבה בת 11 בשבוע, (n = 5 עכברים לכל קבוצה), נאספה בשיטת ספוגית או באמצעות פעולת השירות micropipet. ההבדלים רשע כרכים של רוק (א), כלומר בכמות החלבון (B), מתכוון כמויות של פעילות ליזוזים (C), ואני מתכוון כמויות האיגה בין 2 הקבוצות אינן סטטיסטית משמעותית. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57203/57203fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57203/57203fig3.jpg"> איור 3: שיטת ספוגית של אוסף רוק מזהה הבדלים בייצור הרוק קו הבסיס על ידי זנים שונים של עכברים. (א) רוק של עכברים (10-12-בת שבוע) נקבה שנאספו במשך 15 דקות באמצעות מנה פילוקרפין של 0.375 מ"ג/ק"ג משקל גוף. (B) משקולות הגוף אומר בין הקבוצות של עכברים לא היו שונים באופן משמעותי. מובהקות סטטיסטית נותחו על ידי Kruskal-איי ווליס מבחן, ואחריו דאן של מבחן השוואות מרובות. P < 0.05 נחשב משמעותי. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57203/57203fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57203/57203fig4.jpg"> איור 4: שיטת ספוגית מזהה בלוטת הרוק hypofunction. (א) (B6 X A / J) עכברים הנשי F1 הוזרק גם פתרון LPS (0.1 mg/mL, mL 0.1 לכל עכבר, intraperitoneally) או תמיסת מלח, ורוק נמדדה 26 h מאוחר יותר. ניסוי נציג מראה משמעותי (p = 0.0079) ירידה (60%) בייצור הרוק עכברים שטופלו LPS. (B) בלוטת הרוק hypofunction נמדדה במערכת מודל ניסיוני העכבר לתסמונת סיוגרן. המודל העברה פסיבית שפורסמו קודם לכן עבור אינדוקציה של תפקוד הבלוטות היה בשימוש4 עם כמה שינויים. C57BL/6 נקבות עכברים (בן 10-12 שבועות) הוזרקו אדג'וונט אלום. בימים 14 ו- 20 עכברים הוזרקו 0.05 מ של הארנב סרום אנטי-Ro52, ייצור רוק נמדדה אחרי ה 24 הערה משמעותי (p = 0.0003) טיפה (50%) בייצור הרוק עכברים שטופלו סרום אלום ו anti-Ro52. מובהקות סטטיסטית נותחו על ידי Kruskal-איי ווליס מבחן, ואחריו דאן של מבחן השוואות מרובות. P < 0.05 נחשב משמעותי. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57203/57203fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57203/57203fig5.jpg"> איור 5: השיטה ספוגית מניבה תוצאות לשחזור לאורך זמן (א) ובין מפעילי (B). השיטה ספוגית מראה תוצאות דומות בין שני אופרטורים בעלי אורכים שונים של העכבר טיפול ניסיון בניסויים שבוצעו על שנה אחת. ייצור רוק בסיסית בעכברים הנשי C57BL/6 (מגיל 10-13 שבועות) נמדדה על ידי כל אופרטור. תוצאות מבוטא משקל של הרוק מיוצר (מ ג/גרם משקל). תאריכים של אוסף רוק בציר ה-x, מוצגות התוצאות של הנתונים שנאספו לאורך זמן (א). כל נקודת נתונים מייצג עכבר אחד, מספר עכברים ניתח כל הזמן מוצג בסוגריים. בסיסית רוק יחסי (ממוצע + SEM) איחדו בין 3 ניסויים מוצגים (B), והם אינם שונים באופן משמעותי בין מפעילי. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57203/57203fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice at JoVE.com

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

בלוטת הרוק hypofunction הוא תוצאה תכופים של מחלות אוטואימוניות והקרנות. לשחזור הערכה של תפקוד בלוטת הרוק במודלים של העכבר המחלות האלה היא אתגר טכני. . הנה, מתוארת שיטה פשוטה למדידה מדויקת, לשחזור של ייצור רוק בעכברים.

שיטת המדידה של תפקוד בלוטת הרוק בעכברים

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...

a-method-for-the-measurement-of-salivary-gland-function-in-mice

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.3K Views.  Oklahoma Medical Research Foundation. בלוטת הרוק hypofunction הוא תוצאה תכופים של מחלות אוטואימוניות והקרנות. לשחזור הערכה של תפקוד בלוטת הרוק במודלים של העכבר המחלות האלה היא אתגר טכני. . הנה, מתוארת שיטה פשוטה למדידה מדויקת, לשחזור של ייצור רוק בעכברים.

Video: A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse models allow us to study how diseases unfold, often providing a good replica of the same processes occurring in humans. For some autoimmune diseases, like type 1A diabetes, there are models (the NOD mouse) that spontaneously develop a disease similar to the human counterpart. For many other autoimmune diseases, however, the model needs to be induced experimentally. A common approach in this regard is to inject the mouse with a dominant antigen derived from the organ being studied. For example, investigators interested in autoimmune thyroiditis inject mice with thyroglobulin2, and those interested in myasthenia gravis inject them with the acetylcholine receptor3. If the autoantigen for a particular autoimmune disease is not known, investigators inject a crude protein extract from the organ targeted by the autoimmune reaction. For autoimmune hypophysitis, the pathogenic autoantigen(s) remain to be identified4, and thus a crude pituitary protein preparation is used. In this video article we demonstrate how to induce experimental autoimmune hypophysitis in SJL mice.

This video shows how to induce autoimmune hypophysitis in SJL mice and how to assess its severity by histopathology.

אינדוקציה של Hypophysitis אוטואימוניות הניסויי עכברים SJL

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

באמצעות הדמיה Bioluminescent לחקור סינרגיזם בין Streptococcus pneumoniae ו שפעת וירוס עכברים תינוקות

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in the thymus proper vasculature formation and patterning is essential for thymocyte entry into the organ and mature T-cell exit to the periphery. The spatial arrangement of blood vessels in the thymus is dependent upon signals from the local microenvironment, namely thymic epithelial cells (TEC). Several recent reports suggest that disruption of these signals results in thymus blood vessel defects 1,2. Previous studies have described techniques used to label the neonatal and adult thymus vasculature 1,2. We demonstrate here a technique for labeling blood vessels in the embryonic thymus. This method combines the use of FITC-dextran or Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I (GSL 1 - isolectin B4) facial vein injections and CD31 antibody staining to identify thymus vascular structures and PDGFR-&beta; to label thymic perivascular mesenchyme 3-5. The option of using cryosections or vibratome sections is also provided. This protocol can be used to identify thymus vascular defects, which is critical for defining the roles of TEC-derived molecules in thymus blood vessel formation. As the method labels the entire vasculature, it can also be used to analyze the vascular networks in multiple organs and tissues throughout the embryo including skin and heart 6-10.

This article describes a method for labeling embryonic skin and thymus blood vessels.

שיטה תיוג vasculature ב עכברים עובריים

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human &gamma;-HVs, such as EBV and KSHV, has severely hindered detailed pathogenic studies. Murine &gamma;-herpesvirus 68 (&gamma;HV68) shares extensive genetic and biological similarities with human &gamma;-HVs and is a natural pathogen of murid rodents2. As such, evaluation of &gamma;HV68 infection of mice inbred strains at different stages of viral infection provides an important model for understanding viral lifecycle and pathogenesis during &gamma;-HVs infection.
Upon intranasal inoculation, &gamma;HV68 infection results in acute viremia in the lung that is later resolved into a latent infection of splenocytes and other cells, which may be reactivated throughout the life of the host3,4. In this protocol, we will describe how to use the plaque assay to assess infectious virus titer in the lung homogenates on Vero cell monolayers at the early stage (5 - 7 days) of post-intranasal infection (dpi). While acute infection is largely cleared 2 - 3 weeks postinfection, a latent infection of &gamma;HV68 is established around 14 dpi and maintained later on in the spleen of the mice. Latent infection usually affects a very small population of cells in the infected tissues, whereby the virus stays dormant and shuts off most of its gene expression. Latently-infected splenocytes spontaneously reactivate virus upon explanting into tissue culture, which can be recapitulated by an infectious center (IC) assay to determine the viral latent load. To further estimate the amount of viral genome copies in the acutely and/or latently infected tissues, quantitative real-time PCR (qPCR) is used for its maximal sensitivity and accuracy. The combined analyses of the results of qPCR and plaque assay, and/or IC assay will reveal the spatiotemporal profiles of viral replication and infectivity in vivo.

&#947;-Herpesviruses (&#947;-HVs) establish life-long persistency in their host. Infection of mice with &#947;-HV68 provides a genetically tractable in vivo model for the characterization of the lifecycle/pathogenesis of &#947;HVs. This protocol describes the detection and quantitation of &#947;HV68 infection at acute and latent stages following infection by plaque-forming, infectious center, and qPCR assays.

מדידה של זיהום γHV68 ב עכברים

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

הכלאה<em&gt; באתרו</em&gt; של בלוטות הרוק, השחלות, ועוברים של וקטור יתושים

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

רוק, בלוטות הרוק, וכן אוסף Hemolymph מ קרציות קרצית Scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

מדידת כמותית של התגובה החיסונית ובשינה<em&gt; דרוזופילה</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, including cell biology, oncology, dentistry, and immunology. The SMG is an exocrine gland comprised of secretory epithelial cells, myofibroblasts, endothelial cells, nerves, and extracellular matrix. Dynamic cellular processes in the rat and mouse SMG have previously been imaged, mostly using inverted multi-photon microscope systems. Here, we describe a straightforward protocol for the surgical preparation and stabilization of the murine SMG in anesthetized mice for in vivo imaging with upright multi-photon microscope systems. We present representative intravital image sets of endogenous and adoptively transferred fluorescent cells, including the labeling of blood vessels or salivary ducts and second harmonic generation to visualize fibrillar collagen. In sum, our protocol allows for surgical preparation of mouse salivary glands in upright microscopy systems, which are commonly used for intravital imaging in the field of immunology.

We describe a protocol to surgically expose and stabilize the murine submandibular salivary gland for intravital imaging using upright intravital microscopy. This protocol is easily adaptable to other exocrine glands of the head and neck region of mice and other small rodents.

הכנה של בלוטת הרוק Submandibular מאתר מיקרוסקופ Intravital זקופה

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

A Silver Nanoparticle Method for Ameliorating Biliary Atresia Syndrome in Mice

Biliary atresia (BA) is a severe type of cholangitis with high mortality in children of which the etiology is still not fully understood. Viral infections may be one possible cause. The typical animal model used for studying BA is established by inoculating a neonatal mouse with a rhesus rotavirus. Silver nanoparticles have been shown to exert antibacterial and antiviral effects; their function in the BA mouse model is evaluated in this study. Currently, in BA animal experiments, the methods used to improve the symptoms of BA mice are generally symptomatic treatments given via food or other drugs. The aim of this study is to demonstrate a new method for ameliorating BA syndrome in mice by the intraperitoneal injection of silver nanoparticles and to provide detailed methods for preparing the silver nanoparticle gel formulation. This method is simple and widely applicable and can be used to research the mechanism of BA, as well as in clinical treatments. Based on the BA mouse model, when the mice exhibit jaundice, the prepared silver nanoparticle gel is injected intraperitoneally to the surface of the lower liver. The survival status is observed, and biochemical indicators and liver histopathology are examined. This method allows a more intuitive understanding of both the establishment of the BA model and novel BA treatments.

This article describes in detail a method based on silver nanoparticles for ameliorating biliary atresia syndrome in an experimental biliary atresia mouse model. A solid understanding of the reagent preparation process and the neonatal mouse injection technique will help familiarize researchers with the method used in neonatal mouse model studies.

שיטת ננו-חלקיק כסף Ameliorating בהכנת בכיס המרה תסמונת בעכברים

Biliary atresia (BA) is a severe type of cholangitis with high mortality in children of which the etiology is still not fully understood. Viral infections ...

Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 per codon, the actual error rates vary widely, depending on the species, environment, and codons being studied. We have previously shown that mycobacteria use a two-step pathway for the generation of aminoacylated glutamine and asparagine tRNAs and that this is specifically associated with relatively high error rates due to the modulation of mistranslation rates by an essential component of the pathway, the amidotransferase GatCAB. We modified a previously employed Renilla-Firefly dual-luciferase system that had been used to measure mistranslation rates in Escherichia coli for use in mycobacteria to measure specific mistranslation rates of glutamate at glutamine codons and aspartate for asparagine codons. Although this reporter system was suitable for the accurate estimation of specific error rates, lack of sensitivity and requirements for excessive manipulation steps made it unsuitable for high-throughput applications. Therefore, we developed a second gain-of-function reporter system, using Nluc luciferase and green fluorescent protein (GFP), which is more amenable to medium/high-throughput settings. We used this system to identify kasugamycin as a small molecule that can decrease mycobacterial mistranslation. Although the reporters that we describe here have been used to measure specific types of mycobacterial mistranslation, they may be modified to measure other types of mistranslation in a number of model systems.

In this article, we present two complementary methods to measure specific rates of translational error and mistranslation in the model mycobacterium, Mycobacterium smegmatis, using gain-of-function reporter systems. The methods can be employed to measure accurate error rates in low throughput or relative error rates in a more high-throughput setting.

מדידה של שיעורי הטעויות הספציפיים של פטרת מערכות כתבת

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 ...