עבודה זו מומן על ידי הקרן הלאומית השוויצרית (SNF) פרויקט גרנט 31003A_135649, 31003A_153457, 31003A_172994 (ל JVS), מלגת Leopoldina LPDS 2011-16 (כדי BS). עבודה זו כמיותרים setups אופטי של "מיקרוסקופ הדמיה מרכז" (MIC) באוניברסיטת ברן.

כל העבודה בעלי חיים אושרה על ידי הוועדה הקנטונים לניסויים בבעלי חיים וניהלת בהתאם להנחיות הפדרלי.
1. עזים ומתנגד העכבר
<ol><li>ללבוש ציוד מגן אישי, כולל חלוק וכפפות.</li>
	<li>מערבבים קטמין חריגות השירותים הווטרינריים, תמיסת מלח כדי ריכוז העבודה של 20 מ"ג/מ"ל, 1 מ"ג/מ"ל, בהתאמה. להזריק את מלאי עבודה intraperitoneally (i.p.) ב 8-10 µL/g העכבר. הנח את העכבר בחזרה לתוך הכלוב. הערה: פרוטוקול זה נבדקו עבור עכברים זכר ונקבה 6 - ל שבוע בן 40 עם רקע C57BL/6.</li>
	<li>להכין את הפתרון איזופרומאזין ב- 2.5 מ"ג/מ"ל, להזריק 30 µL i.p., 15 דקות אחרי הזריקה קטמין-חריגות השירותים הווטרינריים (µg 75/עכבר).</li>
	<li>לאחר 5-15 דקות, בדוק אם שיכוך כאבים והרדמה נאותה על ידי שליטה רפלקסים, למשל, רפלקס הנסיגה של כף הרגל או רפלקס המצמוץ.</li>
	<li>לשלוט על רפלקסים כ 30 דקות במהלך לכל אורך הניסוי. Subcutaneously להזריק קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים רפלקסים µL 1.5/g העכבר, כל 60 דקות או מוקדם יותר אם הם חיוביים. הערה: אין אפשרות להשתמש באינהלציה הרדמה כגון איזופלוריין עם פרוטוקול זה, בשל הקיבעון של העכבר.</li>
</ol>2. להסיר את הפרווה של אזור ההפעלה
<ol><li>השתמש מכונת גילוח חשמלית לגלח אזור שמרחיבה בערך של 5 מ מ סימטרית של הפה כלפי כאשר רגליו הקדמיות, המשתרע על פני הלסתות כלפי בשתי האוזניים.</li>
	<li>להחיל קרם להסרת שיער באזור מגולח באמצעות מקלון צמר גפן. בזהירות וביסודיות להסיר לאחר 3 דקות, למשלעל ידי ניגוב עם במטלית לחה.</li>
</ol>3. לתקן את העכבר על הבמה
הערה: פרוטוקול זה משתמשת במה אישית (איור 1) מצויד שני בעלי מתכוונן באופן חופשי עבור שער גולשת (אחד מחובר את הבמה עם בורג, והשני קבוע לצמיתות על זה); ברים האוזן סטיאוטטי מתכווננת; מחרוזת, אשר ניתן לתגבר את בורג; מתכת מתכוונן באופן חופשי חימום הטבעת; אזור מוגבה הייעודיים כדי למקם את הגוף של העכבר. בשלב זה הוא שונה מן הבמה popliteal הלימפה בבית השחי הצומת, ועם של מחזיק סטיאוטטי נוספה תמיכה עבור תגית המכסה התחתון מחזיק את SMG יהיו exteriorized. תוכניות מפורטות או ציטוטים של הבמה הינם זמינים על פי בקשה.
<ol><li>להכין את הבמה על-ידי הסרת את מחזיקי הטבעת חימום, המחזיק slip כיסוי נשלף. שחרר את הברגים של בעלי אוזן בר, בעל קבוע כיסוי slip. סרט חתיכת גזה לאזור מרכז הבמה, הגשה מצעים על העכבר.</li>
	<li>להשתמש בדבק (ראה טבלה של חומרים) כדי לצרף זכוכית מכסה בקוטר 20 מ מ העליון של בעל מתכת גלילי (זה יהיה הזכוכית המכסה התחתון). דבק זכוכית מכסה 25 מ מ לחלק התחתון של המחזיק המתכת השטוחים (זה יהיה הזכוכית המכסה העליון). ודא כי המשקפיים כיסוי חופפים כ 2-3 מ מ עם מחזיקי מתכת כי שאר הזכוכית נשאר ללא גריז ודבק.</li>
	<li>הנח את העכבר על גבו אל הגזה, בניצב החוט נמתח, עם הראש בין הסורגים האוזן.</li>
	<li>לתקן את הגפיים העליונות של העכבר לבמה עם הדבקה.</li>
	<li>בשלב הבא, לחבר את החוט אל החותכות הקדמי העליון והדק עד הלסת מגיע במיקום אופקי. להשתמש מלקחיים מעוקל בזווית למשוך מעט את הלשון מהפה, אשר מקל על הנשימה.</li>
	<li>בחוזקה, אך לא בכוח, משוך את הזנב, להקליט אותה על הבמה.</li>
	<li>יישר את הסורגים האוזן כדי להשיג זווית של 30 מעלות בין שורת לבין קצה הבמה. כדי להבטיח את הזווית, להשתמש סרגל משולש לצייר זווית 30 מעלות ימינה ושמאלה על גיליון נייר, ולמקם על הבמה שקוף על הנייר כדי ליישר את מחזיקי בהתאם.</li>
	<li>לתקן את הלסת בין הסורגים אוזן על-ידי בו זמנית הזזת הסרגל ימינה ושמאלה פנימה עד הלסת הוא immotile, ולהדק את הברגים. להתבונן תנועת החזה לפני, במהלך, ואחרי תיקון הלסת. מופחת או נעדר נשימה מציין כי הסורגים קבועות על הצוואר, לא עצם הלסת; במקרה זה, חזור על הליך תיקון מיידי.</li>
	<li>מספקים חימום העכבר, למשל, על ידי הצבת מנורה חימום בקרבת מקום ו/או כרית חימום מתחת לבמה.</li>
</ol>4. ניתוח החשיפה של בלוטת הרוק באמצעות Stereomicroscope
הערה: השלבים הבאים מחייבים השימוש של stereomicroscope, מלקחיים בסדר ומספריים כירורגיים. מאז ההליך הוא מסוף, זה לא הכרחי לשמור על הפעלה בתנאים סטריליים. אתנול-ניקיתי כלי נגינה מספיק.
<ol><li>אתר את המיקום המשוער של האונה הימנית SMG מאת מחפש בליטה קלה של העור כ 15 מ מ סימטרית של הפה, 5 מ מ המדיאלי של קו הלסת. הרם קיפול העור קטנה במרכז הבליטה, לחתוך אותה כדי ליצור פתיחה של 5 מ מ אורך.</li>
	<li>מיד החל טבעת 4 מ מגבוהה של ואקום גריז על העור שמסביב החתך. (השתמש מזרק ואקום מלא גריז עם מחט תת-עורית קהות של 25 גרם).</li>
	<li>למלא את הטבעת גריז עם תמיסת מלח כדי להבטיח שהרקמה יישאר לח במהלך המבצע.</li>
	<li>תחת stereomicroscope, לשבש את רקמת החיבור באמצעות ההליך הבא: להשתמש מלקחיים בסדר אחד לאחוז בחוזקה חתיכה של רקמת חיבור מחובר ישירות SMG ולהשתמש עם מלקחיים השנייה למשוך רקמת חיבור דיסטלי עד זה ציסטות נקרעות. להבטיח כי כמה רקמת נשאר קשור SMG; זה רצוי שכן הוא מאפשר טיפול. אל תגעו בלוטת עצמה עם המלקחיים, מאז זה לגרום לדימום.</li>
	<li>התהליך של שיבוש רקמת חיבור קודם על גבי בלוטת ולאחר מכן בצד המדיאלי (בין האונה מימין ומשמאל של SMG). אל תפריד את sublingual מבלוטת נקראות.</li>
	<li>להמשיך להסיר את רקמת חיבור לרוחב נגד כיוון השעון מסביב SMG (המדיאלי כדי סימטרית, כדי הדיסטלי, כדי rostral).</li>
	<li>ודא כי אספקת הדם efferent lymphatics, צינור הרוק, אשר ממוקמים בצרור באתר הגולגולת של בלוטת, הם לא נקרע.</li>
	<li>לאחר רקמת חיבור לרוחב מופרת, להשתמש מלקחיים למשוך מצורף לסוף סימטרית SMG כלפי מעלה כדי להרים את הסוף סימטרית של SMG רקמת החיבור. לשבש את רקמת החיבור שמתחת האונה SMG, החל סימטרית ונעה לקראת הסוף rostral.</li>
	<li>המשך עד רקמת החיבור לכל האתרים של SMG מוסר (למעט אתר rostral עם כלי הדם האכלה/ניקוז, של WD).</li>
</ol>5. תיקון בלוטת
<ol><li>לאשר הטבעת גריז מחזיק את תמיסת המלח הוא לפחות 4 מ מ גבוה ולא דולף (ראה שלב 4.2).</li>
	<li>התקנת השער התחתון זכוכית (ראה שלב 3.2) על-ידי הצמדת סרגל מתכת ומתכתי גובהו. ודא בעל מכסה מותאם למיקום upmost אינו נוגע את הטבעת גריז כאשר מצורף אל הבמה. הצב בעל מהכיוון סימטרית בזווית של 60° העכבר, עם כיסוי בתגית מכסה בערך שני שליש (חלקים סימטרית ו דיסטלי) של האונה חשוף. הורידו את הזכוכית המכסה עד שהוא יוצר קשר עם בלוטת.</li>
	<li>השלם את המעגל גריז על גבי הזכוכית המכסה כדי ליצור מאגר מלוחים חדש</li>
	<li>משוך בזהירות את האונה SMG מעל תגית כיסוי עם מלקחיים, רק לגעת רקמת החיבור מצורף (איבר המין יכול להיות הפוך עם האתר התחתון כלפי מעלה).</li>
	<li>ודא הטבעת גריז יש גובה ואפילו לפחות 4 מ מ אינה דולפת. במידת הצורך, מילוי המאגר מלוחים באמצעות 30 G מזרק מלא מי מלח.</li>
	<li>ודא כי בעל כיסוי זכוכית עבור הזכוכית המכסה העליון במקומו upmost. השתמש את הבורג כדי לחבר המחזיק מתכת עם הזכוכית המכסה העליון של 25 מ מ עם בעלי. השתמש את הברגים מתכוונן של בעל כדי למקם את מכסה הזכוכית כך SMG ממורכזת באמצע.</li>
	<li>השתמש את הברגים של מאחז מתכוונן להנמיך את הזכוכית המכסה העליון עד זה קשר ישירות את SMG. לבחון את הצורה ואת צביעה של בלוטת במהלך שלב זה. אם בלוטת שטח מופיע גדולים יותר, או צביעה משתנה (למשל מורוד-לבן), מיד לשים את מכסה הזכוכית למיקום גבוה יותר כדי להקל על הלחץ SMG.</li>
	<li>בדוק את האגם מלוחים לאיתור נזילות על ידי מחפש בועות אוויר, או טיפות של תמיסת מלח מחוץ המאגר. אם זוהתה בועה דליפה או באוויר, הסרת שער גולשת וכל משמנים והפעל מ שלב 2.</li>
	<li>בורג סגור כל הברגים קיבעון.</li>
</ol>6. תיקון כביש הטבעת חימום של רגש טמפרטורה
<ol><li>להוסיף בדיקה טמפרטורה לתוך המאגר, מקם אותה קרוב בלוטת, לאחר מכן להקליט את החוט בדיקה על הבמה.</li>
	<li>חלות טבעת גריז הרכב המכסה העליון, עם SMG במרכז (הקוטר של גריז. הטבעת צריכה להתאים את קוטר טבעת חימום). מקם את טבעת חימום מעל תגית כיסוי, חותם עם גריז. להקליט את הצנרת של טבעת חימום על הבמה.</li>
</ol>7. הדמיה
הערה: אנו משתמשים מערכת מיקרוסקופ שני הפוטונים זקוף מצוידים לייזר Ti:Sa tunable, מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מים-טבילה 20 X או 25 X יעדים. ניתן ליישם תיקון בזמן אמת של רקמות להיסחף במהלך הרכישה באמצעות על הבמה אוטומטיות ו- VivoFollow19. זה משפר את היציבות של ייבוא תמונות, אך אינו נדרש.
<ol><li>הפעל את המערכת מיקרוסקופ זקוף באמצעות תוכנה מתאימה המסופקים על ידי היצרן מיקרוסקופ. מנגינה הלייזר Ti:Sa עירור 780-900 ננומטר אורך גל.</li>
	<li>להתחבר לאורך צינור חימום הטבעת חימום. משאבה סחרור מים מסחררת מים חמים (מחומם על ידי השוקע חלק הצנרת באמבט מים 80° C) דרך טבעת כדי לחמם את SMG.</li>
	<li>לחבר את המכשיר טמפרטורה מד חום דיגיטלי. כוון את מהירות משאבת סחרור, אם הטמפרטורה היא לא בין 35-39 מעלות צלזיוס. מהר יותר המשאבה עובדת, חם מקבל האובייקט, ולהיפך.</li>
	<li>לפני תחילת ייבוא תמונות, לבצע פקד ויזואלי בין המהירויות זרימת דם. בדוק ליקוציט המעבר דרך הנימים דק או בזריקה לתוספי פלורסנט. הערה: לתוספי פלורסנט מוזרק לווריד מיד ימלאו את להערכת SMG כולו כאשר זרימת הדם הוא פיזיולוגי. . זה כמעט תמיד במקרה של הליך זה.</li>
	<li>כדי לעקוב אחר תאים חיסוניים, עומק הדמיה הוא בדרך כלל בין 20-150 מיקרומטר מתחת לפני השטח של SMG המזוהה על-ידי האות הרמונית דור 2nd . אוספי תמונות שיא של 150-300 מיקרומטר שדה ראייה עם פיקסל ברזולוציה של 512 x 512 ומעלה, z-בעומק של 20-60 מיקרומטר עם מרווח של 2-4 מיקרומטר בין תמונות. חזור על רכישת המחסנית s כל 20-30 עבור משך סך של 20-60 דקות.</li>
	<li>השתמש את המדחום הדיגיטלי כדי לשלוט רמות מינימום ומקסימום טמפרטורה לאחר רכישה של רצף תמונות אחד. לבטל את רצף תמונות אם מינימום או מקסימום אינם בטווח של 37 ± 2 ° C. למלא מים כדי ליהנות מחוויה חושית המטרה בין רצפי תמונות.</li>
	<li>בסוף המפגש הדמיה, המתת חסד העכברים בעזרת2 CO תחת הרדמה. שימו לב: זאת בהתאם להנחיות הפדרלי השוויצרי של ניסויים בבעלי חיים; הנחיות המתת חסד אחרים עשויים לחול במקום אחר.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Pakurar, A. S., Bigbee, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digestive+System.">Digestive System.</a> Digital Histology. , 101-121 (2005).</li><li>Carpenter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Saliva+in+the+Oral+Processing+of+Food.">Role of Saliva in the Oral Processing of Food.</a> Food Oral Processing. , 45-60 (2012).</li><li>Masedunskas, A., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+two-photon+microscopy+for+studying+the+uptake+and+trafficking+of+fluorescently+conjugated+molecules+in+live+rodents.">Intravital two-photon microscopy for studying the uptake and trafficking of fluorescently conjugated molecules in live rodents.</a> Traffic. 9 (10), 1801-1810 (2008).</li><li>Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+histology+of+rodent+and+human+major+salivary+glands.">Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands.</a> Acta Histochem Cytochem. 45 (5), 241-250 (2012).</li><li>Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+and+growth+factors+in+salivary+gland+development.">Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development.</a> Front Oral Biol. 14, 48-77 (2010).</li><li>Takeyama, A., Yoshikawa, Y., Ikeo, T., Morita, S., Hieda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+patterns+of+CD66a+and+CD117+in+the+mouse+submandibular+gland.">Expression patterns of CD66a and CD117 in the mouse submandibular gland.</a> Acta Histochem. 117 (1), 76-82 (2015).</li><li>Hata, M., Ueki, T., Sato, A., Kojima, H., Sawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+podoplanin+in+the+mouse+salivary+glands.">Expression of podoplanin in the mouse salivary glands.</a> Arch Oral Biol. 53 (9), 835-841 (2008).</li><li>Proctor, G. B., Carpenter, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+salivary+gland+function+by+autonomic+nerves.">Regulation of salivary gland function by autonomic nerves.</a> Auton Neurosci. 133 (1), 3-18 (2007).</li><li>Le, A., Saverin, M., Hand, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+Dendritic+Cells+in+Normal+Human+Salivary+Glands.">Distribution of Dendritic Cells in Normal Human Salivary Glands.</a> Acta Histochem Cytochem. 44 (4), 165-173 (2011).</li><li>Hofmann, M., Pircher, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-cadherin+promotes+accumulation+of+a+unique+memory+CD8+T-cell+population+in+murine+salivary+glands.">E-cadherin promotes accumulation of a unique memory CD8 T-cell population in murine salivary glands.</a> Proc Natl Acad Sci. 108 (40), 16741-16746 (2011).</li><li>Bombardieri, M., Barone, F., Lucchesi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+tertiary+lymphoid+structures,+autoimmunity,+and+exocrine+dysfunction+in+a+novel+model+of+salivary+gland+inflammation+in+C57BL/6+mice.">Inducible tertiary lymphoid structures, autoimmunity, and exocrine dysfunction in a novel model of salivary gland inflammation in C57BL/6 mice.</a> J Immunol. 189 (7), 3767-3776 (2012).</li><li>Szwarc, M. M., Kommagani, R., Jacob, A. P., Dougall, W. C., Ittmann, M. M., Lydon, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrant+activation+of+the+RANK+signaling+receptor+induces+murine+salivary+gland+tumors.">Aberrant activation of the RANK signaling receptor induces murine salivary gland tumors.</a> PLoS One. 10 (6), e0128467 (2015).</li><li>Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+A+novel+tool+to+study+cell+biology+in+living+animals.">Intravital microscopy: A novel tool to study cell biology in living animals.</a> Histochem Cell Biol. 133 (5), 481-491 (2010).</li><li>Masedunskas, A., Milberg, O., Porat-Shliom, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy.">Intravital microscopy.</a> Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).</li><li>Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+magic:+Multiphoton+microscopy+in+the+biosciences.">Nonlinear magic: Multiphoton microscopy in the biosciences.</a> Nat Biotechnol. 21 (11), 1369-1377 (2003).</li><li>Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+to+a+depth+of+1000+&#181;m+in+living+brains+by+use+of+a+Ti:Al_2O_3+regenerative+amplifier.">Two-photon imaging to a depth of 1000 &#181;m in living brains by use of a Ti:Al_2O_3 regenerative amplifier.</a> Opt Lett. 28 (12), 1022 (2003).</li><li>Gomez-Conde, I., Caetano, S. S., Tadokoro, C. E., Olivieri, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+3D+in+vivo+intravital+microscopy+images+with+an+iteratively+refined+soft-tissue+model+for+immunology+experiments.">Stabilizing 3D in vivo intravital microscopy images with an iteratively refined soft-tissue model for immunology experiments.</a> Comput Biol Med. 64, 246-260 (2015).</li><li>Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+drift+correction+following+4D+confocal+time-lapse+imaging.">Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li><li>Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+tissue+offset+correction+system+for+intravital+multiphoton+microscopy.">Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy.</a> J Immunol Methods. 438, 35-41 (2016).</li><li>Haghayegh Jahromi, N., Tardent, H., Enzmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+cervical+spinal+cord+window+preparation+allows+for+two-photon+imaging+of+T-Cell+interactions+with+the+cervical+spinal+cord+microvasculature+during+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">A novel cervical spinal cord window preparation allows for two-photon imaging of T-Cell interactions with the cervical spinal cord microvasculature during experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Front Immunol. 8, 406 (2017).</li><li>Heymann, F., Niemietz, P. M., Peusquens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+intravital+multiphoton+microscopy+imaging+of+immune+cells+in+healthy+and+diseased+liver+using+CXCR6.Gfp+reporter+mice.">Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice.</a> J Vis Exp. (97), e52607 (2015).</li><li>Gaylo, A., Overstreet, M. G., Fowell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+CD4+T+cell+interstitial+migration+in+the+inflamed+dermis.">Imaging CD4 T cell interstitial migration in the inflamed dermis.</a> J Vis Exp. (109), e53585 (2016).</li><li>Looney, M. R., Thornton, E. E., Sen, D., Lamm, W. J., Glenny, R. W., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung.">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nat Methods. 8 (8), 91-96 (2011).</li><li>Liou, H. L. R., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+the+mouse+popliteal+lymph+node.">Intravital imaging of the mouse popliteal lymph node.</a> J Vis Exp. (60), e3720 (2012).</li><li>Sramkova, M., Masedunskas, A., Parente, L., Molinolo, A., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+plasmid+DNA+in+the+salivary+gland+epithelium:+novel+approaches+to+study+dynamic+cellular+processes+in+live+animals.">Expression of plasmid DNA in the salivary gland epithelium: novel approaches to study dynamic cellular processes in live animals.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 297 (6), C1347-C1357 (2009).</li><li>Masedunskas, A., Porat-shliom, N., Tora, M., Milberg, O., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy+for+imaging+subcellular+structures+in+live+mice+expressing+fluorescent+proteins.">Intravital microscopy for imaging subcellular structures in live mice expressing fluorescent proteins.</a> J Vis Exp. (79), e50558 (2013).</li><li>Masedunskas, A., Sramkova, M., Parente, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+the+actomyosin+complex+in+regulated+exocytosis+revealed+by+intravital+microscopy.">Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci. 108 (33), 13552-13557 (2011).</li><li>Milberg, O., Shitara, A., Ebrahim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concerted+actions+of+distinct+nonmuscle+myosin+II+isoforms+drive+intracellular+membrane+remodeling+in+live+animals.">Concerted actions of distinct nonmuscle myosin II isoforms drive intracellular membrane remodeling in live animals.</a> J Cell Biol. 216 (7), 1925-1936 (2017).</li><li>Kuriki, Y., Liu, Y., Xia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannulation+of+the+mouse+submandibular+salivary+gland+via+the+Wharton's+duct.">Cannulation of the mouse submandibular salivary gland via the Wharton's duct.</a> J Vis Exp. (51), e3074 (2011).</li><li>Chen, G. Y., Nu&#241;ez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sterile+inflammation:+Sensing+and+reacting+to+damage.">Sterile inflammation: Sensing and reacting to damage.</a> Nat Rev Immunol. 10 (12), 826-837 (2010).</li><li>McLaren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+causes+of+variation+of+body+temperature+in+mice.">Some causes of variation of body temperature in mice.</a> Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 46 (1), 38-45 (1961).</li><li>Baumgart, K., Wagner, F., Gr&#246;ger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+and+metabolic+effects+of+hypothermia+and+inhaled+hydrogen+sulfide+in+anesthetized+and+ventilated+mice.">Cardiac and metabolic effects of hypothermia and inhaled hydrogen sulfide in anesthetized and ventilated mice.</a> Crit Care Med. 38 (2), 588-595 (2010).</li><li>Crouch, A. C., Manders, A. B., Cao, A. A., Scheven, U. M., Greve, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-sectional+area+of+the+murine+aorta+linearly+increases+with+increasing+core+body+temperature.">Cross-sectional area of the murine aorta linearly increases with increasing core body temperature.</a> Int J Hyperth. , 1-13 (2017).</li><li>Smith, C. J., Caldeira-Dantas, S., Turula, H., Snyder, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+CMV+infection+induces+the+continuous+production+of+mucosal+resident+T+cells.">Murine CMV infection induces the continuous production of mucosal resident T cells.</a> Cell Rep. 13 (6), 1137-1148 (2015).</li><li>Lindquist, R. L., Shakhar, G., Dudziak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+dendritic+cell+networks+in+vivo.">Visualizing dendritic cell networks in vivo.</a> Nat Immunol. 5 (12), 1243-1250 (2004).</li><li>Riedl, J., Flynn, K. C., Raducanu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact+mice+for+studying+F-actin+dynamics.">Lifeact mice for studying F-actin dynamics.</a> Nat Methods. 7 (3), 168-169 (2010).</li><li>Chtanova, T., Hampton, H. R., Waterhouse, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+interactive+two-photon+photoconversion+of+recirculating+lymphocytes+for+discontinuous+cell+tracking+in+live+adult+mice.">Real-time interactive two-photon photoconversion of recirculating lymphocytes for discontinuous cell tracking in live adult mice.</a> J Biophotonics. 7 (6), 425-433 (2014).</li><li>Kyratsous, N. I., Bauer, I. J., Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+context-dependent+calcium+signaling+in+encephalitogenic+T+cells+in+vivo+by+two-photon+microscopy.">Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (31), E6381-E6389 (2017).</li><li>Mank, M., Reiff, D. F., Heim, N., Friedrich, M. W., Borst, A., Griesbeck, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change.">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophys J. 90 (5), 1790-1796 (2006).</li><li>Tsyboulski, D., Orlova, N., Saggau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplitude+modulation+of+femtosecond+laser+pulses+in+the+megahertz+range+for+frequency-multiplexed+two-photon+imaging.">Amplitude modulation of femtosecond laser pulses in the megahertz range for frequency-multiplexed two-photon imaging.</a> Opt Express. 25 (8), 9435 (2017).</li><li>Potma, E. O., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+single+lipid+bilayers+with+coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+(CARS)+microscopy.">Detection of single lipid bilayers with coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy.</a> J Raman Spectrosc. 34 (9), 642-650 (2003).</li></ol>

שאין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקול זה מציעה גישה ישירה עבור ויוו הדמיה של מאתר בלוטות הרוק submandibular, sublingual באמצעות מיקרוסקופ ליניארי זקוף משמש לעתים קרובות בתחום אימונולוגיה. השיטה ניתן להתאים עבור ההדמיה בלוטות אקסוקרינית אחרות באזור הראש והצוואר. למשל, המעבדה שלנו ביצע הדמיה של בלוטת הדמעות באופן מקביל (לא מוצג).
הסרת רקמת החיבור מסביב SMG הוא השלב הקריטי ביותר של פרוטוקול זה, שכן נזק לרקמות מקרי יכול להתרחש. נזק אספקת הדם הראשי SMG מחייבת פיטורים מידיים של הניסוי, מאז הרקמה SMG יהפוך ובשפתיים. אם הרקמה SMG עצמו פגום, הדימום בדרך כלל עוצר באופן טבעי על ידי קרישת הדם. עם זאת, זה צריך לקחת בחשבון כי הפגיעה מפעיל דלקת סטרילית ושחרור ציטוקינים proinflammatory30, אשר עשויה להשפיע על מדידה ניסיוני. סיבוך נפוץ יותר, אבל פחות קריטי במהלך תיאום הן נזילות במאגר המים מלוחים. כדי למזער את המופע של דליפות, תמיד למרוח משחה לעור יבש, שיער. תיקון נזילה היא בדרך כלל חסרת טעם: במקום, להסיר את כל השומן, לנקות את העור עם ספוגית כותנה יבשה, ולהחיל מחדש מאפס.
במהלך דימות, טמפרטורה קרוב טמפרטורת הגוף פיזיולוגיים חייבת להישמר (כ 37 מעלות צלזיוס על זכר ונקבה C567BL/6 עכברים31). מאז גם היפו - וגם היפרתרמיה תשנה את הדם לזרום32,33, תפקיד פיזיולוגי של SMG לא יכולה להניח, בתנאים כאלה. עם זאת, הבחנו אין הבדל זרימת הדם או תא T תנועתיות במהלך קטן (± 2 ° C), ארעי (< 5 דקות) לחריגות טמפרטורה אופטימלית.
צמצום התנועה רקמה חיונית עבור איכות הדמיה טובה. סוגים שונים של רקמות לא רצויות תנועה יכול להתרחש, אומרת כי ניתן לעבור לפתרון בעיות. ראשית, רציפה xyz-להיסחף נגרמת בדרך כלל SMG נסחף לאט בחזרה למיקומו המקורי דרך רקמת חיבור המצורפת. זה קורה אם הזכוכית המכסה התחתון הותקן גבוה מדי, או רקמת החיבור מסביב SMG לא הופרעו ביסודיות. שנית, z-להיסחף איטי ומתמשך עלולה להתרחש אם הטמפרטורה יציב. במקרה זה בקפידה להתאים את החימום ולחכות הטמפרטורה יציב, כ- 15 דקות לפני הדמיה. לבסוף, רקמה פועמת תנועה מתרחשת כאשר תא מלוחים לא אטומה בחוזקה. הלחץ מצטבר ומשחרר בבית הבליעה מלוחים עם כל מחזור הנשימה. בשילוב עם דליפות או בועות אוויר זה מוביל פועמת זורם נוזל, אשר תרגם ישירות אל הרקמה SMG. במקרה זה, ההרכבה מחדש של משקפיים הכיסוי והן מלוחים קאמרית היא הפתרון הכי אמין.
מהמקסימום הדמיה עומק תלוי אורך הגל עירור המשמש את fluorophores מועסק. כמו כמעט כל הכיוונונים הדמיה intravital, צבעי אדום-העביר או פלורסנט חלבונים יכולים להתרגש עם אורכי גל ארוכים (900-1100 ננומטר) מאפשרים רקמות עמוק הדמיה מאשר צבעי ירוק, עירור קצר אורכי גל.
SMG שימש מודל איברים עבור אנדו - אקסוציטוזה ואת קרום שיפוץ27,3,28, זיהום34, מחלת חיסון עצמי11, הגידול ביולוגיה12. היא מתירה עוד צורות רבות של מניפולציה: צבעי, תרכובות תרופתי ו נוגדנים יכול להיות מועברת בלוטת דרך זרם הדם. לחלופין, ניתן לפלח את SMG ישירות באמצעות תעלות של WD, אשר שימש להעברת וירוסים11, dextrans3, דנ א25, צבעי29או סוכנים תרופתי3.
השדה הדמיה intravital ממשיכה להרוויח מארגז ההולכת וגוברת של פלורסנט גנטי וביוכימי תיוג טכניקות. ההתקדמות בהנדסה גנטית לספק קווים העכבר שורות תאים עם סמנים פלורסנט מתוחכמים. הדוגמאות האחרונות כוללות תיוג של קבוצות תאים מסוים משנה (CD11c+ תאים35) או חלבונים cytoskeletal דינמי (Lifeact36), photoconvertible סמנים עבור מעקב אחר 37, כתבים בזמן אמת של גרעיני תא טרנסלוקציה (NFAT38) או סידן איתות39. יישומים אחרים עשויים להשתמש פלורסנט הגששים הביוכימי, המבליטים תאים subcellular ספציפיים (כגון ה-DNA מחייב 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) או צבעי ממברנה lipophilic). מיקרוסקופ NLO מודרני מציע פתרונות אפשריים רבים לענות בצורה הטובה ביותר את השאלות ניסיוני. למשל, מרובבת שני הפוטונים הדמיה פותחה חריפה להגביר מהירות הרכישה המרבי40. טכניקות אחרות מציעות הדמיה ללא תווית multiphoton, על-ידי ייצור השני או השלישי הרמונית אותות15, או על ידי מדידת רטט תהודה אופייני של מולקולות (ראמאן נגד סטוקס קוהרנטי פיזור)41. לכן, כאשר מעשית נהלי רקמות חשיפה וייצוב זמינים, הגבולות של הנבחנים בעיקר נקבעים על-ידי משאבים ויצירתיות של הנסיין.

הרוק הוא מופרש על ידי בלוטות אקסוקרינית לשמן מזון, להגן על משטחים הרירית של מערכת אוראלי, וכדי לספק אנזימי העיכול, כמו גם חומרים מיקרוביאלית1,2. בנוסף בלוטות הרוק קטין וביניהם ב submucosa דרך הפה, ישנם שלוש קבוצות דו צדדיים של בלוטות הגדולות מזוהות הפרוטיד, sublingual, submandibular, לפי המיקום שלהם,1,2. תאים אפיתל בצורת פירמידה, המסודרות בצורת הבקבוק שקי (acini) או demilunes זה מוקף קרום המרתף, והתאים myoepithelial מפרישים הצפק, ריריות מרכיבי הרוק1. ברווח luminal הצר acini מתנקז לתוך צינוריות intercalated, אשר התאחדו לתוך צינוריות תילומית עד שהם סוף סוף להצטרף לתוך צינור excretory1. ההדבקה excretory הראשי של SMG נקרא צינור וורטון (WD) ופותח לתוך3,sublingual caruncle4. תא אפיתל SMG מייצג ולכן מבנה מאוד arborized עם הקצה מסוף סעפת, הדומה צרור של ענבים-1,-5,-6. Interstitium SMG מורכב של כלי הדם, הלימפה בתוך רקמת חיבור7 המכיל העצבים הפאראסימפתטית8 ו מטריצה חוץ-תאית5. בלוטות הרוק רגיל של האדם ושל מכרסמים מכילות גם T תאים מקרופאגים, תאים דנדריטים9, כמו גם תאים פלזמה להפריש אימונוגלובולינים (איגה) לתוך רוק9,10. בשל תפקידיה הגיוון הרב של מחלה ובריאות, SMG הוא נושא מעניין עבור שדות רבים של המחקר הביולוגי, כולל רפואת שיניים4, אימונולוגיה11, אונקולוגיה12, פיזיולוגיה8וביולוגיה של התא 3.
הדמיה של תהליכים תאיים דינאמית ואינטראקציה הוא כלי רב עוצמה המחקר הביולוגי13,14. הפיתוח של רקמות עמוק הדמיה וחידושים inmicroscopes מבוסס על אופטיקה לא לינארית (NLO), אשר מסתמך על פיזור או קליטת פוטונים מרובים על-ידי המדגם, אפשרה לבדוק ישירות תהליכים תאיים ברקמות מורכבות13 ,15. קליטת פוטונים מרובים כרוכה משלוח של עירור סה כ האנרגיה על ידי אנרגיה נמוכה פוטונים, איזה עירור fluorophore וביתנו למישור מוקד, ובכך מאפשר חדירה רקמות עמוק ועם צמצום נזקי רעש מחוץ המוקד עירור13,15. עיקרון זה הוא מועסק על ידי מיקרוסקופ שני הפוטונים (מהשעה 2) ומאפשר הדמיה של דגימות פלורסנט בעומקים של עד 1 מ מ15,16. תוך זמינים מסחרית-2 בצהריים setups הפכו להיות ידידותי, אמין, האתגר העיקרי עבור הדמיה intravital היא בקפידה לחשוף ולייצב את איבר היעד ומורדמת עכברים, במיוחד עבור הדמיה של זמן לשגות סדרות. מספר שיטות לתיקון דיגיטלי הסחף לאחר קירור והקפאה כבר פורסם17,18 , לאחרונה פיתחנו "VivoFollow", מערכת תיקון אוטומטי, אשר מנטרל את רקמת איטי להיסחף בזמן אמת באמצעות הבמה הממוחשבת19. עם זאת, עדיין במצב קריטי לאיכות גבוהה הדמיה כדי למזער את רקמת תנועה, במיוחד מהר תנועות הנגרמת על ידי נשימה או פעימת לב19. הליכי הכנה וייצוב פורסמו עבור איברים מרובות, כולל חוט השדרה20, הכבד21, העור22, ריאות23, ו הלימפה24. יתר על כן, מודלים עבור עכברים בלוטת הרוק הדמיה יש כבר פיתח3,25 ומעודן יותר עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה intravital של מאתר ש-SMG למידותיו מיקרוסקופ הפוכה ההתקנה26, 27 , 28.
כאן, אנו מציגים מעשי וישימה עבור הדמיה intravital של SMG מאתר פרוטוקול באמצעות מיקרוסקופ לא לינארית זקוף, המשמש בדרך כלל עבור הדמיה intravital בתחום של אימונולוגיה. לשם כך, שינינו שלב הנייח מועסקים נרחב המשמש ההכנות popliteal הלימפה בבית השחי הצומת.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Narketan 10 %&#160; (Ketamine) 20ml (100 mg/ml)</td>
			<td>Vetoquinol</td>
			<td>3605877535982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun 2% (Xylazine) 25 ml (20 mg/ml)</td>
			<td>Bayer</td>
			<td>680538150144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline NaCl 0.9%</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>3535789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prequillan 1% (Acepromazine) 10 ml (10 mg/ml)</td>
			<td>Fatro</td>
			<td>6805671900029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric shaver</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>9818L</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hair removal cream</td>
			<td>Veet</td>
			<td>4002448090656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m)</td>
			<td>Durapore (3M)</td>
			<td>1538-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durapore Surgical tape (2.5 cm x 9.1 m and 1.25 cm x 9.1 m)</td>
			<td>Durapore (3M)</td>
			<td>1538-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue Ultra gel, instantaneous glue</td>
			<td>Pattex, Henkel</td>
			<td>4015000415040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass slides 20 mm and 22 mm</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;ser</td>
			<td>631-1343/ 631-1344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grease for laboratories 60 g glisseal N</td>
			<td>Borer (VWR supplier)</td>
			<td>DECO514215.00-CA15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T )</td>
			<td>14090-09</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools (F.S.T )</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swab</td>
			<td>Migros</td>
			<td>617027988254</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze Gazin 5 x 5 cm</td>
			<td>Lohmann and Rauscher</td>
			<td>18500</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red dextran 70kDa</td>
			<td>&#160;Molecular Probes</td>
			<td>D1864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cascade Blue dextran 10kDa</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>D1976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon system</td>
			<td>LaVision Biotec</td>
			<td>TrimScope I and II</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XLUMPLANFL 20x/0.95 W objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>n/a</td>
			<td>or other water immersion objective&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital thermometer</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>95969077651</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of murine submandibular salivary gland for upright intravital microscopy

בלוטת הרוק submandibular (SMG) הוא אחד של בלוטות הרוק הגדולות שלוש, הוא עניין בתחומים רבים ומגוונים של המחקר הביולוגי, כולל ביולוגיה של התא, אונקולוגיה, רפואת שיניים, אימונולוגיה. SMG היא בלוטה אקסוקרינית מורכב של תאים אפיתל הפרשה, myofibroblasts, תאי אנדותל, עצבים, מטריצה חוץ-תאית. בעבר יש כבר תמונה דינמית תהליכים תאיים החולדה, העכבר SMG, בעיקר באמצעות הפוכה מיקרוסקופים פוטונים ריבוי מערכות. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול פשוטה עבור הכנה כירורגית ו ייצוב SMG מאתר בעכברים ומורדמת עבור ויוו הדמיה עם מערכות מיקרוסקופים פוטונים מרובה זקוף. אנו מציגים תמונה intravital נציג סטים של אנדוגני, הועבר adoptively פלואורסצנט תאים, כולל תיוג של כלי הדם או צינוריות הרוק ואת הדור השני הרמונית להמחיש קולגן fibrillar. לסיכום, פרוטוקול שלנו מאפשר הכנה כירורגי של בלוטות הרוק העכבר במערכות מיקרוסקופ זקוף, אשר משמשים בדרך כלל עבור הדמיה intravital בתחום של אימונולוגיה.

פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של כמעט כל הגבי או הגחון הצד של SMG. שדה הראייה בדרך כלל כולל גם את בלוטת הרוק sublingual, שונה במקצת SMG קומפוזיציה הסלולר4. שתי בלוטות כמוס על ידי קולגן fibrillar, מחולק אונות. רוב השעות 14:00 מערכות יכול לייצר תמונה ללא תווית של קולגן fibrillar על ידי מדידת האות הרמונית 2nd , אך בדרך כלל מולקולות פלורסנט נחוצות עבור ויזואליזציה של מבנים הסלולר subcellular. למשל, הביטוי הטרנסגניים בכל מקום של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) בשילוב עם האות הרמונית 2nd מספיקה לזהות acini צינוריות, במערכת SMG הדם על-ידי תכונות מורפולוגיות שלהם. תוכנית התקנה זו ניתן להתבונן הטרנסגניים סמני פלורסנט עם תא סוג ביטוי ספציפי כדי לזהות תאים מסוים קבוצות משנה. איור 2 מציג את רשת ofCOL1A1-GFP לבטא כתב פיברובלסט כמו תאים של רקמת חיבור. גם מוצגות כלי דם, תווית באמצעות ורידיות הפלורסנט מצמידים לתוספי משקל מולקולרי גבוה. תא luminal של הצינורות יכול גם להיקרא (איור 3) כאשר לצבוע מוזרק retrogradually WD29.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57283/57283fig1.jpg"> איור 1 : אישית שלב. (ו- a *) שני מחזיקי מתכוונן באופן חופשי שער גולשת; ברים האוזן סטיאוטטי מתכווננת (b ו b *); (ג) של מחרוזת, אשר ניתן לתגבר את בורג; (ד) מתכת מתכוונן באופן חופשי חימום הטבעת; (ה) העלה המיועדים למקם את הגוף של העכבר. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57283/57283fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57283/57283fig2.jpg"> איור 2 : להערכת סמן (אדום) ורשת של COL1A1-GFP לביטוי תאים (ירוק). להערכת המתויגים באמצעות ורידיות טקסס אדום-לתוספי המספר המשלים (MW 70 kDa). קולגן fibrillar בין שתי האונות הוא מדמיין כמו האות הרמונית 2nd (כחול). המוצג הוא z יחיד-תחזית של 15 תמונות מוערמות עם 47 עומק מיקרומטר. סרגל קנה מידה = 40 µm. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57283/57283fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57283/57283fig3.jpg"> איור 3 : Luminal צינור הנקרא לאחר ההזרקה WD- כלי הדם עם 70 kDa-MW טקסס אדום-לתוספי (אדום), צינור לומן תוויות בתווית עם מפל כחול-לתוספי (לבן; 10 kDa MW) באמצעות הזרקת רטרוגרדית דרך WD GFP הועבר adoptively+ CD8+ T תאים (ירוק) SMG. מוצג. זאת יחידה z-ההקרנה של 27 תמונות מוערמות עם 50 עומק מיקרומטר. סרגל קנה מידה = 40 µm. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57283/57283fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy at JoVE.com

Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

הכנה של בלוטת הרוק Submandibular מאתר מיקרוסקופ Intravital זקופה

אנו מתארים פרוטוקול בניתוח לחשוף ולייצב את בלוטת הרוק submandibular מאתר עבור הדמיה intravital באמצעות מיקרוסקופ intravital זקוף. פרוטוקול זה ניתנת להתאמה בקלות אחרים בלוטות אקסוקרינית של הראש, באזור הצוואר של עכברים ומכרסמים קטנים אחרים.

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

preparation-murine-submandibular-salivary-gland-for-upright

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.0K Views.  University of Bern. אנו מתארים פרוטוקול בניתוח לחשוף ולייצב את בלוטת הרוק submandibular מאתר עבור הדמיה intravital באמצעות מיקרוסקופ intravital זקוף. פרוטוקול זה ניתנת להתאמה בקלות אחרים בלוטות אקסוקרינית של הראש, באזור הצוואר של עכברים ומכרסמים קטנים אחרים.

Video: Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

Intravital Microscopy of the Inguinal Lymph Node

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune response and therefore, the development of effector cells. As such, LNs are key to fighting invading pathogens and maintaining health. The choice of LN to study is dictated by accessibility and the desired model; the inguinal lymph node is well situated and easily supports studies of biologically relevant models of skin and genital mucosal infection.
The inguinal LN, like all LNs, has an extensive microvascular network supplying it with blood. In general, this microvascular network includes the main feed arteriole of the LN that subsequently branches and feeds high endothelial venules (HEVs). HEVs are specialized for facilitating the trafficking of immune cells into the LN during both homeostasis and infection. How HEVs regulate trafficking into the LN under both of these circumstances is an area of intense exploration. The LN feed arteriole, has direct upstream influence on the HEVs and is the main supply of nutrients and cell rich blood into the LN. Furthermore, changes in the feed arteriole are implicated in facilitating induction of adaptive immune response. The LN microvasculature has obvious importance in maintaining an optimal blood supply to the LN and regulating immune cell influx into the LN, which are crucial elements in proper LN function and subsequently immune response. 
The ability to study the LN microvasculature in vivo is key to elucidating how the immune system and the microvasculature interact and influence one another within the LN. Here, we present a method for in vivo imaging of the inguinal lymph node. We focus on imaging of the microvasculature of the LN, paying particular attention to methods that ensure the study of healthy vessels, the ability to maintain imaging of viable vessels over a number of hours, and quantification of vessel magnitude. Methods for perfusion of the microvasculature with vasoactive drugs as well as the potential to trace and quantify cellular traffic are also presented. 
Intravital microscopy of the inguinal LN allows direct evaluation of microvascular functionality and real-time interface of the direct interface between immune cells, the LN, and the microcirculation. This technique potential to be combined with many immunological techniques and fluorescent cell labelling as well as manipulated to study vasculature of other LNs.

A technique for performing intravital microscopy of the inguinal lymph node (LN) is outlined. Such technique allows for real-time, in vivo study of the lymph node microvasculature and structure both during homeostasis and infection. This technique can be adapted to cell trafficking studies and to other lymph node sites.

מיקרוסקופית Intravital של הצומת לימפה מפשעתי

Lymph nodes (LN's), located throughout the body, are an integral component of the immune system. They serve as a site for induction of adaptive immune ...

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the postcapillary venules of inflamed tissue, leukocytes initially tether and roll on the luminal surface of venular wall. Rolling leukocytes arrest on endothelium and undergo firm adhesion in response to chemokine or other chemoattractants on the venular surface. Many adherent leukocytes relocate from the initial site of adhesion to the junctional extravasation site in endothelium, a process termed intraluminal crawling3. Following crawling, leukocytes move across endothelium (transmigration) and migrate in extravascular tissue toward the source of chemoattractant (chemotaxis)4. Intravital microscopy is a powerful tool for visualizing leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and revealing cellular and molecular mechanisms of leukocyte recruitment2,5. In this report, we provide a comprehensive description of using brightfield intravital microscopy to visualize and determine the detailed processes of neutrophil recruitment in mouse cremaster muscle in response to the gradient of a neutrophil chemoattractant. To induce neutrophil recruitment, a small piece of agarose gel (~1-mm3 size) containing neutrophil chemoattractant MIP-2 (CXCL2, a CXC chemokine) or WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, a synthetic analog of bacterial peptide) is placed on the muscle tissue adjacent to the observed postcapillary venule. With time-lapsed video photography and computer software ImageJ, neutrophil intraluminal crawling on endothelium, neutrophil transendothelial migration and the migration and chemotaxis in tissue are visualized and tracked. This protocol allows reliable and quantitative analysis of many neutrophil recruitment parameters such as intraluminal crawling velocity, transmigration time, detachment time, migration velocity, chemotaxis velocity and chemotaxis index in tissue. We demonstrate that using this protocol, these neutrophil recruitment parameters can be stably determined and the single cell locomotion conveniently tracked in vivo.

We describe a protocol of brightfield intravital microscopy for measuring dynamic neutrophil-endothelial cell interactions during neutrophil recruitment in response to the source of a neutrophil chemoattractant in vivo. Neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in mouse cremaster muscle tissue are visualized with time-lapsed video photography and tracked with ImageJ.

מעקב זחילה Intraluminal נויטרופילים, הגירה Chemotaxis Transendothelial ועל רקמות על ידי מיקרוסקופית וידאו Intravital

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic tools and surgical procedures, TPM becomes a powerful technique to identify "niches" inside organs and to document cellular "behaviors" in live animals. While intravital imaging provides information that best resembles the real cellular behavior inside the organ, it is both more laborious and technically demanding in terms of required equipment/procedures than alternative ex vivo imaging acquisition. Thus, we describe a surgical procedure and novel "stereotactic" organ holder that allows us to follow the movements of Foxp3+ cells within the thymus.
Foxp3 is the master regulator for the generation of regulatory T cells (Tregs). Moreover, these cells can be classified according to their origin: ie. thymus-differentiated Tregs are called "naturally-occurring Tregs" (nTregs), as opposed to peripherally-converted Tregs (pTregs). Although significant amount of research has been reported in the literature concerning the phenotype and physiology of these T cells, very little is known about their in vivo interactions with other cells. This deficiency may be due to the absence of techniques that would permit such observations. The protocol described in this paper provides a remedy for this situation.
Our protocol consists of using nude mice that lack an endogenous thymus since they have a punctual mutation in the DNA sequence that compromises the differentiation of some epithelial cells, including thymic epithelial cells. Nude mice were gamma-irradiated and reconstituted with bone marrows (BM) from Foxp3-KIgfp/gfp mice. After BM recovery (6 weeks), each animal received embryonic thymus transplantation inside the kidney capsule. After thymus acceptance (6 weeks), the animals were anesthetized; the kidney containing the transplanted thymus was exposed, fixed in our organ holder, and kept under physiological conditions for in vivo imaging by TPM. We have been using this approach to study the influence of drugs in the generation of regulatory T cells.

We have developed novel laboratory tools and protocols for intravital imaging acquisition of the thymus. Our technique should help in the identification of &#x201C;niches&#x201D; within the thymus where T cell development occurs.

הדמיה Intravital של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. Thus, in vivo imaging of malaria parasites during pre-erythrocytic stages have revealed the active entrance of parasites into skin lymph nodes 3, the complete development of the parasite in the skin 4, and the formation of a hepatocyte-derived merosome to assure migration and release of merozoites into the blood stream 5. Moreover, the development of individual parasites in erythrocytes has been recently documented using 4D imaging and challenged our current view on protein export in malaria 6. Thus, intravital imaging has radically changed our view on key events in Plasmodium development. Unfortunately, studies of the dynamic passage of malaria parasites through the spleen, a major lymphoid organ exquisitely adapted to clear infected red blood cells are lacking due to technical constraints.
Using the murine model of malaria Plasmodium yoelii in Balb/c mice, we have implemented intravital imaging of the spleen and reported a differential remodeling of it and adherence of parasitized red blood cells (pRBCs) to barrier cells of fibroblastic origin in the red pulp during infection with the non-lethal parasite line P.yoelii 17X as opposed to infections with the P.yoelii 17XL lethal parasite line 7. To reach these conclusions, a specific methodology using ImageJ free software was developed to enable characterization of the fast three-dimensional movement of single-pRBCs. Results obtained with this protocol allow determining velocity, directionality and residence time of parasites in the spleen, all parameters addressing adherence in vivo. In addition, we report the methodology for blood flow quantification using intravital microscopy and the use of different colouring agents to gain insight into the complex microcirculatory structure of the spleen. 
Ethics statement
All the animal studies were performed at the animal facilities of University of Barcelona in accordance with guidelines and protocols approved by the Ethics Committee for Animal Experimentation of the University of Barcelona CEEA-UB (Protocol No DMAH: 5429). Female Balb/c mice of 6-8 weeks of age were obtained from Charles River Laboratories.

We show the method for performing intravital microscopy of the spleen using GFP transgenic malaria parasites and the quantification of parasite mobility and blood flow within this organ.

מיקרוסקופית Intravital של הטחול: ניתוח כמותי של ניידות טפיל ואת זרימת הדם

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

רוק, בלוטות הרוק, וכן אוסף Hemolymph מ קרציות קרצית Scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

מיקרוסקופית Intravital הפסים תאורה נפתר מאוד של מרכזי ז&#39;רמינל

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various biological events in real time and in live animals. This technology has greatly advanced our understanding of physiological processes and pathogen-mediated phenomena in specific organs.
In this study, IVM is applied to the mouse liver and protocols are designed to image in vivo the circulatory system of the liver and measure red blood cell (RBC) velocity in individual hepatic vessels. To visualize the different vessel subtypes that characterize the hepatic organ and perform blood flow speed measurements, C57Bl/6 mice are intravenously injected with a fluorescent plasma reagent that labels the liver-associated vasculature. IVM enables in vivo, real time, measurement of RBC velocity in a specific vessel of interest. Establishing this methodology will make it possible to investigate liver hemodynamics under physiological and pathological conditions. Ultimately, this imaging-based methodology will be important for studying the influence of L. donovani infection&#160;on hepatic hemodynamics.
This method can be applied to other infectious models and mouse organs and might be further extended to pre-clinical testing of a drug&#8217;s effect on inflammation by quantifying its effect on blood flow.

Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics

This article reports on a detailed method for the dynamic measurement and quantification of blood flow velocity within individual blood vessels of the mouse liver vasculature using intravital microscopy imaging in combination with a specific methodology for image acquisition and analysis.

מיקרוסקופית Intravital הדמיה של הכבד הבא<em&gt; שושנת יריחו</em&gt; זיהום: הערכה של פרמטרים המודינמיים בדיה

Intravital microscopy (IVM) is a powerful optical imaging technique that has made possible the visualization, monitoring and quantification of various ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

לטווח ארוך Intravital multiphoton מיקרוסקופית הדמיה של תאים חיסוני בבריאים וחולה כבד באמצעות עכברים CXCR6.Gfp Reporter

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

אינטראקציות מיקרוסקופית Intravital של יקוציט-האנדותל וטסיות דם-יקוציט בMesenterial ורידים בעכברים

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced saliva production. Similarly, saliva production is severely compromised in patients receiving radiation treatment for head and neck cancers. Rodent models, developed to mimic these clinical conditions, facilitate an understanding of the disease pathogenesis and allow for the development of new therapeutic strategies. Therefore, the ability to accurately, reproducibly, and repeatedly measure salivary gland function in animal models is critical. Building on procedures previously described in the literature, a method was developed that meets these criteria and was used to evaluate salivary gland function in mice. An additional advantage of this new method is that it is easily mastered, and has little inter-operator variation. Salivary gland function is evaluated as the amount (weight or volume) or rate (mL/min) of saliva produced in response to pilocarpine stimulation. The collected saliva is a good source for the analyses of protein content, immunoglobulin concentrations, and other biomolecules.

Salivary gland hypofunction is a frequent consequence of autoimmune disease and radiation therapy. Reproducible evaluation of salivary gland function in mouse models of these diseases is a technical challenge. Here, a simple method for accurate and reproducible measurement of saliva production in mice is described.

שיטת המדידה של תפקוד בלוטת הרוק בעכברים

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...