El estudio fue apoyado por una subvención de los institutos nacionales de salud, Instituto Nacional de Dental e investigación craneofacial (DE025030).

El protocolo que se describe a continuación fue aprobado por el cuidado institucional de Animal y uso y sigue las normas éticas establecidas por los institutos nacionales de salud. Todos los datos presentados en este informe se generaron mediante el uso de ratones femeninos que fueron 10-12 semanas de edad. Se utilizaron las siguientes cepas de ratones: C57BL/6, BALB/c, DBA1, 129S y F1 (B6XA/J). Todos los ratones fueron alojados en jaulas de barrera (a 5 animales por jaula) en condiciones libres de patógenos específicas y proporciona alimento y agua ad libitum.
1. preparación
<ol><li>Para preparar una solución de clorhidrato de pilocarpina, pesan 10 mg de compuesto y disolver en 1,776 mL de solución salina isotónica estéril con un vórtex, para dar una solución stock de 5,63 mg/mL. No hay necesidad de esterilizar esta solución. Pero si lo desea, filtrarla por un filtro de 0.2 μm. Almacenar esta solución en múltiples alícuotas en un congelador de-80 oC hasta por 3 meses. Cada helado es de un solo uso. Una vez descongelado, no vuelva a congelar la solución de pilocarpina.</li>
	<li>Tomar 0,6 mL de los tubos del microfuge y cuidadosamente perforar un pequeño agujero en la parte inferior de cada tubo con una aguja de calibre 18 climatizada. Coloque estos tubos en tubos de 2 mL. Los tubos no necesitan ser estériles.</li>
	<li>Usando una hoja de afeitar afilada, estéril, cortar esponjas absorbentes cilíndricos en trozos de unos 2 cm de longitud. Cortar cada 2 cm diagonal para dar 2 torundas de forma cónicas. Coloque una torunda en cada uno de los tubos de microcentrífuga de 0.6 mL.</li>
	<li>Pesar el tubo de microcentrífuga de 0.6 mL que contiene el hisopo seco.</li>
	<li>La transferencia de los ratones que se estudiarán en una nueva jaula limpia con botellas de agua. Mantener los ratones sin alimentos durante al menos 2 h antes del inicio de la colección de saliva para evitar que las partículas de alimentos contaminen la saliva recogida. Nota: No es necesario tener 1 ratón por jaula para este procedimiento. Sin embargo, el número de ratones en cada jaula depende de reglas específicas de la institución y de uso animal.</li>
	<li>Justo antes del final de 2 h, preparar la solución de pilocarpina de trabajo (0,0563 mg/mL) diluyendo la solución madre 100 x en solución salina estéril. No es necesario más filtro esterilizar esta solución. Mantenga siempre la solución de trabajo de la pilocarpina en el hielo. Nota: La tabla 1 muestra la cantidad de pilocarpina que se inyecta para un rango de peso corporal de ratón para darle una última dosis de 0,375 mg/kg peso corporal.</li>
</ol>2. procedimiento
<ol><li>Peso de cada ratón y determinar la dosis de la mezcla anestésica para cada ratón utilizando la tabla 1. Inyectar el primer ratón con el volumen adecuado de la mezcla anestésica por vía intraperitoneal. Ajuste el temporizador durante 2 min (mayoría de las cepas de ratón en este protocolo de ir a dormir por 2 min). Asegúrese de que el ratón correctamente está anestesiado por la falta de caminar cuando se coloca sobre una superficie plana. Si el ratón está caminando todavía, espere 2 minutos adicionales antes de proceder al siguiente paso. Aplique una gota de lubricante pomada oftálmica en ambos ojos para evitar que se sequen. Nota: En la tabla 1, la dosis de la mezcla anestésica es 0,007 mL/g de peso corporal. El rango óptimo para este procedimiento es 0.006 a 0.008 mL/g de peso corporal. Sin embargo, después de 4 minutos, si el ratón está todavía caminando o exhibir movimientos espasmódicos, consultar con el veterinario institucional para aumentar adecuadamente la dosis del anestésico.</li>
	<li>Determinar la dosis de pilocarpina para el ratón utilizando la tabla 1 e inyecte la cantidad apropiada por vía intraperitoneal. Ajustar el temporizador de 2 minutos y colocar el ratón en el tubo de limitador de 50 mL hasta que la cabeza y las orejas sobresalen el extremo cortado. Coloque el tubo en un ángulo de 45 grados, con la cabeza hacia abajo y la superficie ventral hacia arriba. Con cinta adhesiva el tubo a la Junta Directiva de procedimiento para guardarlo de la mudanza. Nota: Tabla 1 proporciona dosis de ratones más de 17 g, como este procedimiento no se ha intentado en ratones debajo de 17 g de peso.</li>
	<li>Al final de 2 minutos, suavemente inserte un par cerrado de micro fórceps de disección en la boca y levante la mandíbula inferior hacia arriba para abrir la boca. Empujar la pinza 1-2 mm más en la boca, asegurándose de que la lengua se ve apoyada en el brazo superior de las pinzas. Con otro par de Pinzas finas, mantener el hisopo seco previamente pesado cerca de su extremo cónico.</li>
	<li>Deslice suavemente el extremo cónico de la esponja en la boca. Retirar las pinzas dejando la punta de la torunda en la cavidad bucal.</li>
	<li>Sujete el extremo más ancho de la torunda que se extiende fuera de la boca y girar para permitir que la superficie máxima de contacto con la boca. Mantener el hisopo en esta posición durante 15 minutos. Nota: Esto asegura que el hisopo permanezca en la boca para la duración de la colección. Tenga en cuenta que el extremo cónico de la torunda actúa como una mecha y la parte más ancha de la esponja permanece fuera de la boca.</li>
	<li>Al final de 15 minutos, suavemente gire el hisopo para recoger cualquier saliva que no ha sido absorbida y colocar el hisopo mojado en el tubo de microcentrífuga de 0.6 mL. Cierre el tubo y colóquelo en el tubo de 2 mL a hielo. Nota: En este momento, la mucosa oral aparece completamente seca. El ratón puede ahora mover hacia atrás en su jaula para la recuperación de la anestesia.</li>
	<li>Transferir el ratón en la jaula. Coloque bolitas de alimento húmedo en la jaula después de la recolección de saliva para ayudar a la rehidratación más rápida. Nota: Los ratones se despiertan dentro de 10 minutos después del final de la colección. Inyección subcutánea de solución salina isotónica con 0.2 mL se puede administrar también para acelerar la recuperación.</li>
	<li>Proceder al próximo ratón. Todos los ratones deben ser vigilados hasta que han recuperado completamente y son ambulatorios.</li>
</ol>3. las mediciones
<ol><li>Al final de todas las colecciones, pesar los tubos 0.6 mL con el hisopo mojado. Calcular la diferencia entre el peso húmedo y peso seco para obtener el peso de saliva producida. Coloque el tubo de 0.6 mL con saliva en el tubo de 2 mL.</li>
	<li>Cortar las tapas de los tubos de 2 ml. Luego, centrifugar los tubos de 2 mL por 2 min a x 7500 g, a 4oC en una micro centrífuga para recuperar la saliva. Medir el volumen de saliva obtenido usando una micropipeta.</li>
	<li>Los resultados se expresarán como saliva peso (mg)10 sobre 15 minutos o como una relación de peso de saliva (mg) / peso (g) del ratón. Nota: Si se ha medido el volumen de saliva extraída de la torunda, expresar los resultados como el volumen de saliva recuperado (mL) o el cociente del volumen de saliva (mL) peso (g) de ratón.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Proctor, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+salivary+secretion.">The physiology of salivary secretion.</a> Periodontol 2000. 70 (1), 11-25 (2016).</li><li>Fox, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sj&#246;gren's+syndrome.">Sj&#246;gren's syndrome.</a> Lancet. 366 (9482), 321-331 (2005).</li><li>Eisbruch, A., Kim, H. M., Terrell, J. E., Marsh, L. H., Dawson, L. A., Ship, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xerostomia+and+its+predictors+following+parotid-sparing+irradiation+of+head-and-neck+cancer.">Xerostomia and its predictors following parotid-sparing irradiation of head-and-neck cancer.</a> Int J Radiat Oncol Biol Phys. 50 (3), 695-704 (2001).</li><li>Marmary, Y., Fox, P. C., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+secretion+rates+from+mouse+and+rat+parotid+glands+are+markedly+different+following+pilocarpine+stimulation.">Fluid secretion rates from mouse and rat parotid glands are markedly different following pilocarpine stimulation.</a> Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 88 (2), 307-310 (1987).</li><li>Lin, A. L., Johnson, D. A., Wu, Y., Wong, G., Ebersole, J. L., Yeh, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+short-term+gamma-irradiation+effects+on+mouse+salivary+gland+function+using+a+new+saliva+collection+device.">Measuring short-term gamma-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device.</a> Arch Oral Biol. 46 (11), 1085-1089 (2001).</li><li>Scofield, R. H., Asfa, S., Obeso, D., Jonsson, R., Kurien, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+short+peptides+from+the+60-kDa+Ro+antigen+recapitulates+the+serological+and+pathological+findings+as+well+as+the+salivary+gland+dysfunction+of+Sjogren's+syndrome.">Immunization with short peptides from the 60-kDa Ro antigen recapitulates the serological and pathological findings as well as the salivary gland dysfunction of Sjogren's syndrome.</a> J Immunol. 175 (12), 8409-8414 (2005).</li><li>Deshmukh, U. S., Nandula, S. R., Thimmalapura, P. R., Scindia, Y. M., Bagavant, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+innate+immune+responses+through+Toll-like+receptor+3+causes+a+rapid+loss+of+salivary+gland+function.">Activation of innate immune responses through Toll-like receptor 3 causes a rapid loss of salivary gland function.</a> J Oral Pathol Med. 38 (1), 42-47 (2009).</li><li>Deshmukh, U. S., Ohyama, Y., Bagavant, H., Guo, X., Gaskin, F., Fu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+stimuli+accelerate+Sj&#246;gren's+syndrome-like+disease+in+(NZB+x+NZW)F1+mice.">Inflammatory stimuli accelerate Sj&#246;gren's syndrome-like disease in (NZB x NZW)F1 mice.</a> Arthritis Rheum. 58 (5), 1318-1323 (2008).</li><li>Szczerba, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+innate+immunity+and+Ro52-induced+antibody+causes+Sj&#246;gren's+syndrome-like+disorder+in+mice.">Interaction between innate immunity and Ro52-induced antibody causes Sj&#246;gren's syndrome-like disorder in mice.</a> Ann Rheum Dis. 75 (3), 617-622 (2016).</li><li>Takakura, A., Moreira, T., Laitano, S., De Luca J&#250;nior, L., Renzi, A., Menani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+muscarinic+receptors+signal+pilocarpine-induced+salivation.">Central muscarinic receptors signal pilocarpine-induced salivation.</a> J Dent Res. 82 (12), 993-997 (2003).</li><li>Yao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-induced+elevation+and+secretion+of+interleukin-1beta+in+the+submandibular+gland+of+male+mice.">Lipopolysaccharide-induced elevation and secretion of interleukin-1beta in the submandibular gland of male mice.</a> Immunology. 116 (2), 213-222 (2005).</li><li>Knudsen, J., Nauntofte, B., Josipovic, M., Engelholm, S. A., Hyldegaard, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+isoflurane+anesthesia+and+pilocarpine+on+rat+parotid+saliva+flow.">Effects of isoflurane anesthesia and pilocarpine on rat parotid saliva flow.</a> Radiat Res. 176 (1), 84-88 (2011).</li><li>Kohrs, R., Durieux, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ketamine:+teaching+an+old+drug+new+tricks.">Ketamine: teaching an old drug new tricks.</a> Anesth Analg. 87 (5), 1186-1193 (1998).</li><li>Kozaki, T., Hashiguchi, N., Kaji, Y., Yasukouchi, A., Tochihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+saliva+collection+using+cotton+swab+on+cortisol+enzyme+immunoassay.">Effects of saliva collection using cotton swab on cortisol enzyme immunoassay.</a> Eur J Appl Physiol. 107 (6), 743-746 (2009).</li></ol>

Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.

La producción de saliva es un proceso complejo y está influenciada por muchos factores. Por lo tanto, la función de la glándula salival en animales de laboratorio de medición puede ser un desafío. Un desafío adicional es que mediciones repetidas de la función de la glándula salival en el mismo animal son necesarias para establecer el inicio de la enfermedad o para demostrar la recuperación después del tratamiento.
El método de hisopo que se describe en este informe es técnicamente fácil de realizar con múltiples opciones para representar los datos. Los resultados son reproducibles, con poca variación inter-operador. El método puede detectar una reducción en la producción de saliva en diferentes modelos de disfunción de las glándulas salivales. Una ventaja importante es el uso de polímeros altamente absorbentes, inertes y recuperación eficiente de la saliva recogida, permitiendo medir de biomoléculas salival. Otra ventaja de este método es que es posible llevar a cabo este procedimiento simultáneamente en hasta 2 ratones a la vez por un solo operador. Esto es significativamente más eficiente que algunos de los otros métodos, donde se realiza en un solo ratón a la vez.
La variabilidad en las mediciones de producción de saliva ha sido la pesadilla de todas las técnicas de medición saliva. Para minimizar la variabilidad, es importante seguir estrictamente el protocolo. Pasos críticos incluyen: seleccionar el mismo tiempo del día para los ratones de ayuno y la recogida de saliva, apropiada dosificación de anestésico, pilocarpina (tabla 1) y registros de peso exacto de torundas secas y húmedas. Gestión del cuidado del tiempo es necesaria para establecer hasta 2 ratones a la vez para la colección de saliva.
Como se muestra en la figura 3, la cantidad de saliva producida por los ratones es dependiente de la cepa. Apropiado así, cepa, edad y sexo ratones emparejados deben usarse como controles. Titulación de la dosis de pilocarpina, para la cepa específica y la condición experimental investigado, es muy recomendable. Aunque una dosis mayor de pilocarpina más allá de 0.5 mg/kg induce aumento de la producción de saliva, para evaluar la hipofunción glandular, se recomienda utilizar una dosis más baja. Esto permite la identificación de aún pequeñas diferencias en la producción de saliva entre el enfermo y el control de ratones. Dosis de 0.5 mg/kg de peso corporal y 0,375 mg/kg de peso corporal han sido utilizados exitosamente para demostrar la hipofunción de la glándula salival. Sin embargo, debe señalarse que ciertos sistemas de modelo experimental pueden requerir períodos más cortos o más largos de la colección que se describe en este protocolo. Esto debe ser probado por cada laboratorio.
Una limitación de este método y más técnicas de medición de la saliva es la necesidad de anestesia. El informe con el método vacío no incluye el uso de anestésico5. Sin embargo, la ausencia de anestesia induce niveles variables de ansiedad en los ratones. Tienden a luchar y morder el tubo, y que a su vez, puede influir en eficiencia de producción y colección de saliva. Anestesia isoflurano en ratas induce una gota pilocarpina inducida por saliva producción12. En contraste, la ketamina aumenta las secreciones bronquiales y salivales a través de la estimulación simpática13. Nosotros y otros han utilizado con éxito la ketamina y xilacina mezcla como un anestésico para la medición de pilocarpina indujo saliva producción4,7,8,9. El intervalo recomendado para la anestesia quirúrgica es 100-200 mg/kg de ketamina y 5-16 mg/kg de xilacina14. La dosis de 0.008 0.006 mL/g de peso utilizado en este método (corresponde a 60-80 mg/kg de ketamina y de 6-8 mg/kg de xilacina) cae en el extremo inferior de la gama recomendada y es suficiente para proporcionar un nivel consistente de inmovilización sin anestesia profunda .
El método del hisopo se estableció como una alternativa al método habitualmente utilizado micropipeta. La desventaja principal del método de la pipeta fue la alta variabilidad entre operador y la necesidad de recoger saliva de un ratón a la vez. El método del hisopo aborda ambos problemas. Los beneficios incluyen limitar el número de animales necesario para alcanzar el poder en los análisis estadísticos y aumento de la eficiencia. Reemplazando los bastoncillos de algodón con hisopos de polímero inerte ofrecen una mejor opción puesto que hisopos de algodón son conocidos por afectar la cuantificación de moléculas biológicamente activas15.
Dada la sencillez del método de hisopo y su alta reproducibilidad entre diferentes individuos, es de esperar que el método del hisopo facilitará mejores comparaciones de los modelos de ratón entre investigadores en diversos laboratorios e instituciones.

Las glándulas salivales producen la saliva en respuesta a una variedad de estímulos neurológicos y mecánicos1. Los estímulos son llevados a través del sistema nervioso simpático y parasimpático a los receptores adrenérgicos y colinérgicos en la glándula. La pilocarpina es un agente colinérgico, párr simpaticomimético que actúa predominantemente sobre los receptores muscarínicos. En las glándulas salivales, induce la producción de saliva actuando sobre el receptor muscarínico M31. La producción de saliva tras la administración de pilocarpina es un indicador de la capacidad de responder a la estimulación de las glándulas salivales y es comúnmente usada como una medida de la función de la glándula salival.
Medición precisa de la producción de saliva es importante en el estudio de enfermedades de las glándulas salivales como síndrome de Sjögren2 y lesión por radiación después de tratamiento de cáncer de cabeza y cuello3. Varios métodos se han desarrollado para medir la producción de saliva de roedores. Estos incluyen directa canulación del conducto excretor salival4, colección de saliva desde la cavidad bucal bajo vacío5y colección mediante tubos capilares de cristal6 o una micropipeta7,8, 9. dirigir la canulación del conducto salival proporciona la más precisa y pura saliva. Sin embargo, este es un procedimiento técnicamente difícil, y el potencial para causar lesión ductal excluye colecciones repetitivas saliva del mismo animal. Recogida de saliva bajo vacío puede llevar a resultados variables debido a la sequedad de la saliva del tubo. Esta pérdida es aún más exagerada en ratones con disminución de la salivación. Capillares de vidrio permiten la recogida de saliva para análisis posteriores, sin embargo, cambios en la viscosidad de la saliva secretada en el estado enfermo impide eficiente llenado del tubo capilar. Además, intenta barrer la cavidad bucal para recoger saliva residual puede provocar lesiones. El método de pipeta permite la colección completa, y para el mismo operador, es notablemente consistente entre experimentos. Sin embargo, por razones desconocidas, este método muestra una variación significativa entre los diferentes operadores. Por lo tanto, para permitir comparaciones apropiadas, resulta imprescindible que el operador mismo realiza todos los experimentos relacionados con un proyecto específico. Claramente, esto representa una gran desventaja para un laboratorio.
Para superar estos problemas, se desarrolló un procedimiento que combina métodos de recolección de saliva se utilizan para los seres humanos y roedores. El método del hisopo, que se describe a continuación para medir el volumen de saliva inducida por la pilocarpina es simple, reproducible, no influenciado por el operador y puede realizarse varias veces en el mismo animal. Además, permite recoger la saliva para el posterior análisis de las proteínas, inmunoglobulinas o de otras biomoléculas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals for saliva collection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pilocarpine hydrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar, Tewksbury, MA, USA</td>
			<td>B21410</td>
			<td>Dilute in sterile isotonic saline. Store single use aliquots of 100X stock at -80oC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia Mix solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mix 1 mL ketamine hydrochloride + 0.5 mL xylazine + 8.5 mL sterile isotonic saline in a sterile vial. Can be used for 3 months.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetamine (Ketamine hydrochloride)</td>
			<td>Vet One, Boise, Idaho, USA</td>
			<td>C3N VT1</td>
			<td>Stock is 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anased (Xylazine)</td>
			<td>Med-Vet International, Mettawa, IL, USA</td>
			<td>RXANASED-20</td>
			<td>Stock is 20 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotonic sterile saline</td>
			<td>Vet One, Boise, Idaho, USA</td>
			<td>501032</td>
			<td>Used as diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial tears (lubricant ophthalmic ointment)</td>
			<td>Henry Schien, Dublin, OH, USA</td>
			<td>48272</td>
			<td>Used to prevent eyes from drying during the procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials for saliva collection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SalivaBio Children&#39;s swab</td>
			<td>Salimetrics, LLC Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Individually wrapped swabs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL polypropylene tubes</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>89004-364</td>
			<td>Cut off the bottom 1 cm of the tube. Make sure that the cut edge is smooth.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 0.6 mL</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>87003-290</td>
			<td>Make holes in the bottom of tube with heated 18 gauge needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 2 mL</td>
			<td>VWR, Radnor, PA, USA</td>
			<td>87003-298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Syringes with permanently attached needles</td>
			<td>Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>324702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 gauge regular bevel needles</td>
			<td>Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile scalpel blade #11</td>
			<td>Integra York Inc PA, USA</td>
			<td>4-311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microdissecting forceps</td>
			<td>Roboz, Gaithersburg, MD, USA</td>
			<td>RS-5139</td>
			<td>Serrated angular 0.8 mm tip, 4&#34; length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Label tape</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA</td>
			<td>sc-224487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 channel timer</td>
			<td>Amazon.com, Seattle, WA, USA</td>
			<td>B06W2KCYVN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>Mettler Toledo, Columbus OH, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals/ reagents for inducing salivary dysfunction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS</td>
			<td>Invivogen, San Deigo, CA, USA</td>
			<td>tlrl-b5lps</td>
			<td>Dissolve in endotoxin free water, and store stock solution at 5 mg/mL . dilute in sterile HBSS 100 ug/mL - inject 100 uL/ moue ip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imject Alum adjuvant</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>77161</td>
			<td>Dilute 1:1 in sterile saline. Inject intraperitoneally 0.1 mL/mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Ro52 antiserum</td>
			<td>Generated in lab</td>
			<td></td>
			<td>Immunization of rabbits with recombinant mouse Ro52</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals/ Kits for saliva analyses</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salivary lysozyme estimation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EnzChek Lysozyme Assay Kit</td>
			<td>Molecular Probes, Eugene, OR, USA</td>
			<td>E-22013</td>
			<td>Used as per manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salivary IgA estimation by sandwich ELISA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgA</td>
			<td>Southern Biotech, Birmingham, AL, USA</td>
			<td>0106-01</td>
			<td>Standards for sandwich ELISA - range 30 ng/mL to 0.5 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti- mouse IgA unlabeled</td>
			<td>Southern Biotech, Birmingham, AL, USA</td>
			<td>1040-01</td>
			<td>Coat at 1 ug/mL in bicarbonate buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti- mouse IgA HRP</td>
			<td>Southern Biotech, Birmingham, AL, USA</td>
			<td>1040-05</td>
			<td>Detection antibody used at 1:4000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB substrate</td>
			<td>Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>555214</td>
			<td>Used as per manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immulon 4HBX Microtiter 96 well plates</td>
			<td>Thermo Scientific, Rochester, NY, USA</td>
			<td>3855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salivary protein estimation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td>BioRad, Hercules, CA, USA</td>
			<td>5000006</td>
			<td>For protein estimation as per manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for the measurement of salivary gland function in mice

Pacientes con síndrome de Sjögren, una enfermedad autoinmune que afecta las glándulas exocrinas, desarrollan inflamación de la glándula salival y han reducido la producción de saliva. Del mismo modo, la producción de saliva está comprometida seriamente en pacientes que reciben radioterapia para cánceres de cabeza y cuello. Modelos de roedores, desarrollados para imitar estas condiciones clínicas, facilitan la comprensión de la patogénesis de la enfermedad y permitan el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas. Por lo tanto, la capacidad precisa, reproducible y varias ocasiones medir la función de la glándula salival en modelos animales es fundamental. Basándose en procedimientos previamente descritos en la literatura, que cumple estos criterios y se utilizó para evaluar la función de la glándula salival en ratones se desarrolló un método. Una ventaja adicional de este nuevo método es que se domina fácilmente y tiene poca variación inter-operador. Función de la glándula salival se evalúa como la cantidad (peso o volumen) o (mL/min) de la saliva producida en respuesta a la estimulación de la pilocarpina. La recogida de la saliva es una buena fuente para el análisis de contenido de proteína, las concentraciones de inmunoglobulinas y otras biomoléculas.

En los sistemas de modelo experimental de ratón, la capacidad de producir saliva en respuesta a la estimulación de la pilocarpina se utiliza como un indicador de la función de la glándula salival. La producción de saliva se midió en ratones hembra de 11 semanas de edad C57BL/6 por el método de esponja. En la figura 1A, los resultados se expresan como la cantidad de saliva (mg) recogido después de cada vez mayor dosis de pilocarpina. A la dosis de 1 mg/kg de peso corporal, algunos de los ratones comenzaron exponiendo la angustia (temblores involuntarios y temblando). Por lo tanto, dosis más altas de pilocarpina, más allá de 1 mg/kg de peso corporal no fueron probadas en este estudio. En la figura 1B, los resultados se representan como el cociente del peso de la saliva (mg) para el peso del ratón (g). Colectivamente, estos datos muestran una relación de buena dosis respuesta entre la producción de saliva y la cantidad de pilocarpina. También se midió el volumen de saliva que se recuperó de la torunda. Como se muestra en la figura 1, existe una concordancia significativa entre saliva peso y volumen que 1 mg de saliva es igual a 0,001 mL.
Los resultados obtenidos con el método del hisopo son similares a los obtenidos con el método de recogida de pipetas. Figura 2A muestra que la cantidad media de saliva recogida por el método de la esponja y el método de la pipeta es muy similar y las diferencias son estadísticamente no significativas. Figura 2B 2C y 2D muestran que el método del hisopo no afectan el cálculo de biomoléculas en la saliva. De hecho, en comparación con el método de la pipeta, el método del hisopo mostró una tendencia general mayor en los niveles medios de proteína salival total (figura 2), actividad de la lisozima salivar (Figura 2D) y IgA salival (Figura 2E). Sin embargo, estas diferencias fueron estadísticamente no significativas.
El método de colección de saliva descrito aquí es capaz de detectar diferencias en la cantidad de saliva producida por las cepas de ratón diferente (figura 3) y la hipofunción de la glándula salival inducida por condiciones de enfermedad diferentes (figura 4). Figura 3A muestra resultados de pilocarpina inducida por la producción de saliva de ratones femeninos C57BL/6 y BALB/c, DBA1/J, 129S6 de 10-12 semanas de edad. Los ratones de 129S6 produjeron la menor cantidad de saliva frente a las otras cepas. Cabe señalar que las diferencias en el peso corporal de estos ratones no fueron significativamente diferentes (figura 3B). A continuación, se utilizó el método de esponja para detectar hipofunción de la glándula salival, y se muestran dos ejemplos en la figura 4. Figura 4A muestra un resultado representativo de hipofunción de glándulas salivales inducido por la activación de la inmunidad innata, después de la inyección de lipopolisacáridos (LPS) (10 μg/ratón, intraperitoneal). Control de ratones fueron inyectados con solución salina11. Los ratones tratados con LPS muestran una caída significativa en la saliva, en comparación con controles. Transferencia pasiva de anticuerpos reactivos con el antígeno del síndrome de Sjögren A Ro52 induce la hipofunción de la glándula salival y este modelo imita ciertos aspectos del síndrome de Sjögren9. Como se muestra en la Figura 4B, ratones inyectaron con alumbre adyuvante más anticuerpos anti Ro52 juntos tuvieron menor producción de saliva, en comparación con los ratones no tratados o ratones trataron sólo con alumbre.
El método de esponja es fácil de implementar y operador independiente. La figura 5 muestra la producción de saliva de ratones femeninos C57BL/6 10-13 semanas de edad, en experimentos llevados a cabo en 6 momentos diferentes por 2 operadores diferentes. Operador empecé con sólo 2 meses de ratón manejo experiencia operador II tenía 6 meses de ratón previo manejo de experiencia, pero fue introducido solamente en el método de recogida de saliva para una semana. Estos datos fueron generados en experimentos que llevó a cabo casi un año, utilizando dosis de pilocarpina de 0,375 mg/kg. Las proporciones de saliva obtenidas por ambos operadores muestran una gama de lecturas (1.84 a 5.87). Operador experimentos abarcó un período de 10 semanas mientras que los experimentos de operador II se llevaron a cabo durante 3 días consecutivos, casi un año más tarde (figura 5A). En particular, las proporciones de saliva obtenidas con el tiempo no fueron significativamente diferentes (p = 0,064; Prueba de Kruskal-Wallis). Además comparar las variaciones inter-operador, los cocientes del peso de saliva por g de peso corporal de 3 experimentos para cada operador se agruparon y se muestran en la figura 5B. Proporciones de saliva obtenida por operador I (media + SEM; 4,45 + 0.152, n = 38) no son significativamente diferentes del operador 2 (media + SEM; 4.21 + 0.169; n = 25; p = 0.296 por prueba de Mann Whitney).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57203/57203fig1.jpg"> Figura 1: producción de Saliva es dependiente de la dosis de pilocarpina. Se inyectaron ratones C57BL6/J (hembras de 11 semanas de edad, 5 por grupo) con diferentes dosis de pilocarpina (0,25 mg/kg, 0.5 mg/kg y 1.0 mg/kg de peso corporal) y se midió la producción de saliva durante 15 minutos (A) resultados se representan como la cantidad de saliva de mg (media ± SEM). (B) los datos son representados como cociente medio de la saliva (saliva mg por peso corporal del ratón g). (C) Saliva de ratones C57BL/6 femeninos 11 semanas de edad (n = 5) fue recogida por el método de esponja. Pilocarpina se utiliza en una dosis de 0,375 mg/kg de peso corporal. Los hisopos húmedos se pesaron para medir la cantidad de saliva producida en mg. La saliva en los hisopos de entonces se recuperó por centrifugación y se midieron los volúmenes de la saliva recuperado. El acuerdo es visto entre el peso de la saliva en mg y saliva volumen en μl. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57203/57203fig1large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57203/57203fig2.jpg"> Figura 2: el método del hisopo no afecta el análisis de biomoléculas en saliva. Saliva de 2 grupos de ratones C57BL/6 mujeres 11 semanas de edad (n = 5 ratones por grupo), fue colectado por el método de esponja o por el método de la micropipeta. Las diferencias en los volúmenes promedios de saliva (A), significa las cantidades de proteína (B), significan la cantidad de actividad de la lisozima (C) y significan cantidades de IgA entre los 2 grupos son estadísticamente no significativos. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57203/57203fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57203/57203fig3.jpg"> Figura 3: el método de hisopo de colección de saliva detecta diferencias en la producción de saliva de línea de base por diferentes cepas de ratones. (A) se recolectaron Saliva de ratones femeninos (10-12 semana de edad) durante 15 min mediante el uso de una dosis de pilocarpina de 0,375 mg/kg de peso corporal. (B) el peso corporal promedio entre los grupos de ratones no fueron significativamente diferente. Se analizó la significación estadística de Kruskal-Wallis test, seguido de Dunn del test de comparaciones múltiples. P < 0.05 se consideró significativo. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57203/57203fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57203/57203fig4.jpg"> Figura 4: método del hisopo detecta la hipofunción salival. (A) (B6 X A / J) F1 hembra ratones fueron inyectados con cualquier solución de LPS (0,1 mg/mL, 0.1 mL por ratón, intraperitoneal) o solución salina y la saliva se midió 26 h más tarde. Un experimento representativo muestra un significativo (p = 0.0079) baja (60%) en la producción de saliva en los ratones tratados con LPS. (B) hipofunción de la glándula salival se midió en un sistema de modelo experimental de ratón de síndrome de Sjögren. El modelo de transferencia pasiva previamente publicados para la inducción de disfunción glandular fue usado4 con pocas modificaciones. Mujer ratones C57BL/6 (10-12 semanas) se inyectaron con coadyuvante de alumbre. En los días 14 y 20 ratones fueron inyectados con 0,05 mL de suero de conejo anti Ro52 y la producción de saliva se midió después de 24 h. nota un significativo (p = 0,0003) baja (50%) en la producción de saliva en los ratones tratados con alumbre y anti Ro52 suero. Se analizó la significación estadística de Kruskal-Wallis test, seguido de Dunn del test de comparaciones múltiples. P < 0.05 se consideró significativo. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57203/57203fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57203/57203fig5.jpg"> Figura 5: el método del hisopo obtienen resultados reproducibles en el tiempo (A) y entre operadores (B). El método de esponja muestra resultados comparables entre dos operadores con diferentes longitudes de ratón manejo experiencia en experimentos realizados durante un año. La producción de saliva basal en ratones hembra C57BL/6 (10-13 semanas de edad) fue medida por cada operador. Resultados se expresan como peso de saliva producido (mg/g de peso corporal). Las fechas de colección de la saliva están en el eje x y se muestran los resultados de los datos recogidos con el tiempo (A). Cada punto de datos representa un ratón, y el número de ratones analizados en cada momento se muestra entre paréntesis. Referencia saliva ratios (media + SEM) de 3 experimentos aparecen (B)y no son significativamente diferentes entre los operadores. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57203/57203fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Hipofunción de la glándula salival es una consecuencia frecuente de la terapia de radiación y enfermedad autoinmune. Evaluación reproducible de la función de la glándula salival en modelos de ratón de estas enfermedades es un desafío técnico. Aquí, se describe un método simple de medida preciso y reproducible de la producción de saliva de ratones.

Un método para la medición de la función de la glándula salival en ratones

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.3K vistas.  Oklahoma Medical Research Foundation. Hipofunción de la glándula salival es una consecuencia frecuente de la terapia de radiación y enfermedad autoinmune. Evaluación reproducible de la función de la glándula salival en modelos de ratón de estas enfermedades es un desafío técnico. Aquí, se describe un método simple de medida preciso y reproducible de la producción de saliva de ratones.

Video: A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Induction of Experimental Autoimmune Hypophysitis in SJL Mice

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse models allow us to study how diseases unfold, often providing a good replica of the same processes occurring in humans. For some autoimmune diseases, like type 1A diabetes, there are models (the NOD mouse) that spontaneously develop a disease similar to the human counterpart. For many other autoimmune diseases, however, the model needs to be induced experimentally. A common approach in this regard is to inject the mouse with a dominant antigen derived from the organ being studied. For example, investigators interested in autoimmune thyroiditis inject mice with thyroglobulin2, and those interested in myasthenia gravis inject them with the acetylcholine receptor3. If the autoantigen for a particular autoimmune disease is not known, investigators inject a crude protein extract from the organ targeted by the autoimmune reaction. For autoimmune hypophysitis, the pathogenic autoantigen(s) remain to be identified4, and thus a crude pituitary protein preparation is used. In this video article we demonstrate how to induce experimental autoimmune hypophysitis in SJL mice.

This video shows how to induce autoimmune hypophysitis in SJL mice and how to assess its severity by histopathology.

La inducción de la hipofisitis autoinmune experimental en ratones SJL

Autoimmune hypophysitis can be reproduced experimentally by the injection of pituitary proteins mixed with an adjuvant into susceptible mice1. Mouse ...

Investigación

Inmunología e Infección

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Utilizando imágenes bioluminiscentes encargado de investigar la sinergia entre Streptococcus pneumoniae Y el Virus de la Influenza en ratones lactantes

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in the thymus proper vasculature formation and patterning is essential for thymocyte entry into the organ and mature T-cell exit to the periphery. The spatial arrangement of blood vessels in the thymus is dependent upon signals from the local microenvironment, namely thymic epithelial cells (TEC). Several recent reports suggest that disruption of these signals results in thymus blood vessel defects 1,2. Previous studies have described techniques used to label the neonatal and adult thymus vasculature 1,2. We demonstrate here a technique for labeling blood vessels in the embryonic thymus. This method combines the use of FITC-dextran or Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I (GSL 1 - isolectin B4) facial vein injections and CD31 antibody staining to identify thymus vascular structures and PDGFR-&beta; to label thymic perivascular mesenchyme 3-5. The option of using cryosections or vibratome sections is also provided. This protocol can be used to identify thymus vascular defects, which is critical for defining the roles of TEC-derived molecules in thymus blood vessel formation. As the method labels the entire vasculature, it can also be used to analyze the vascular networks in multiple organs and tissues throughout the embryo including skin and heart 6-10.

This article describes a method for labeling embryonic skin and thymus blood vessels.

Un método para etiquetar los Vasos sanguíneos en embriones de ratones

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human &gamma;-HVs, such as EBV and KSHV, has severely hindered detailed pathogenic studies. Murine &gamma;-herpesvirus 68 (&gamma;HV68) shares extensive genetic and biological similarities with human &gamma;-HVs and is a natural pathogen of murid rodents2. As such, evaluation of &gamma;HV68 infection of mice inbred strains at different stages of viral infection provides an important model for understanding viral lifecycle and pathogenesis during &gamma;-HVs infection.
Upon intranasal inoculation, &gamma;HV68 infection results in acute viremia in the lung that is later resolved into a latent infection of splenocytes and other cells, which may be reactivated throughout the life of the host3,4. In this protocol, we will describe how to use the plaque assay to assess infectious virus titer in the lung homogenates on Vero cell monolayers at the early stage (5 - 7 days) of post-intranasal infection (dpi). While acute infection is largely cleared 2 - 3 weeks postinfection, a latent infection of &gamma;HV68 is established around 14 dpi and maintained later on in the spleen of the mice. Latent infection usually affects a very small population of cells in the infected tissues, whereby the virus stays dormant and shuts off most of its gene expression. Latently-infected splenocytes spontaneously reactivate virus upon explanting into tissue culture, which can be recapitulated by an infectious center (IC) assay to determine the viral latent load. To further estimate the amount of viral genome copies in the acutely and/or latently infected tissues, quantitative real-time PCR (qPCR) is used for its maximal sensitivity and accuracy. The combined analyses of the results of qPCR and plaque assay, and/or IC assay will reveal the spatiotemporal profiles of viral replication and infectivity in vivo.

&#947;-Herpesviruses (&#947;-HVs) establish life-long persistency in their host. Infection of mice with &#947;-HV68 provides a genetically tractable in vivo model for the characterization of the lifecycle/pathogenesis of &#947;HVs. This protocol describes the detection and quantitation of &#947;HV68 infection at acute and latent stages following infection by plaque-forming, infectious center, and qPCR assays.

La medición de γHV68 infección en los ratones

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes. Investigation of transcripts and gene regulators that are expressed in tissues in which the mosquito host and pathogen interact, and in organs involved in reproduction are of great interest for strategies to reduce mosquito-borne disease transmission and disrupt egg development. A number of tools have been employed to study and validate the temporal and tissue-specific regulation of gene expression. Here, we describe protocols that have been developed to obtain spatial information, which enhances our understanding of where specific genes are expressed and their products accumulate. The protocol described has been used to validate expression and determine accumulation patterns of transcripts in tissues related to mosquito-borne pathogen transmission, such as female salivary glands, as well as subcellular compartments of ovaries and embryos, which relate to mosquito reproduction and development. 
 The following procedures represent an optimized methodology that improves the efficiency of various steps in the protocol without loss of target-specific hybridization signals. Guidelines for RNA probe preparation, dissection of soft tissues and the general procedure for fixation and hybridization are described in Part A, while steps specific for the collection, fixation, pre-hybridization and hybridization of mosquito embryos are detailed in Part B.

Hybridization in situ of Salivary Glands, Ovaries, and Embryos of Vector Mosquitoes

Temporal and spatial gene expression analyses have a crucial role in functional genomics. Whole-mount hybridization in situ is useful for determining the localization of transcripts within tissues and subcellular compartments. Here we outline a hybridization in situ protocol with modifications for specific target tissues in mosquitoes.

Hibridación<em&gt; In situ</em&gt; De las glándulas salivales, los ovarios y embriones de los mosquitos vectores

Mosquitoes are vectors for a diverse set of pathogens including arboviruses, protozoan parasites and nematodes.  Investigation of transcripts and gene ...

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne relapsing fever (Borrelia spp.), Rocky Mountain Spotted fever (Rickettsia rickettsii), ehrlichiosis (Ehrlichia chaffeensis and E. equi), anaplasmosis (Anaplasma phagocytophilum), encephalitis (tick-borne encephalitis virus), babesiosis (Babesia spp.), Colorado tick fever (Coltivirus), and tularemia (Francisella tularensis) 1-8. To be properly transmitted into the host these infectious agents differentially regulate gene expression, interact with tick proteins, and migrate through the tick 3,9-13. For example, the Lyme disease agent, Borrelia burgdorferi, adapts through differential gene expression to the feast and famine stages of the tick's enzootic cycle 14,15. Furthermore, as an Ixodes tick consumes a bloodmeal Borrelia replicate and migrate from the midgut into the hemocoel, where they travel to the salivary glands and are transmitted into the host with the expelled saliva 9,16-19.
As a tick feeds the host typically responds with a strong hemostatic and innate immune response 11,13,20-22. Despite these host responses, I. scapularis can feed for several days because tick saliva contains proteins that are immunomodulatory, lytic agents, anticoagulants, and fibrinolysins to aid the tick feeding 3,11,20,21,23. The immunomodulatory activities possessed by tick saliva or salivary gland extract (SGE) facilitate transmission, proliferation, and dissemination of numerous tick-borne pathogens 3,20,24-27. To further understand how tick-borne infectious agents cause disease it is essential to dissect actively feeding ticks and collect tick saliva. This video protocol demonstrates dissection techniques for the collection of hemolymph and the removal of salivary glands from actively feeding I. scapularis nymphs after 48 and 72 hours post mouse placement. We also demonstrate saliva collection from an adult female I. scapularis tick.

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

The collection of infected tick hemolymph, salivary glands, and saliva is important to study how tick-borne pathogens cause disease. In this protocol we demonstrate how to collect hemolymph and salivary glands from feeding Ixodes scapularis nymphs. We also demonstrate saliva collection from female I. scapularis adults.

La saliva, la glándula salival, y la Colección hemolinfa de las garrapatas Ixodes scapularis

Ticks are found worldwide and afflict humans with many tick-borne illnesses. Ticks are vectors for pathogens that cause Lyme disease and tick-borne ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

Medición cuantitativa de la respuesta inmune y del sueño en<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, including cell biology, oncology, dentistry, and immunology. The SMG is an exocrine gland comprised of secretory epithelial cells, myofibroblasts, endothelial cells, nerves, and extracellular matrix. Dynamic cellular processes in the rat and mouse SMG have previously been imaged, mostly using inverted multi-photon microscope systems. Here, we describe a straightforward protocol for the surgical preparation and stabilization of the murine SMG in anesthetized mice for in vivo imaging with upright multi-photon microscope systems. We present representative intravital image sets of endogenous and adoptively transferred fluorescent cells, including the labeling of blood vessels or salivary ducts and second harmonic generation to visualize fibrillar collagen. In sum, our protocol allows for surgical preparation of mouse salivary glands in upright microscopy systems, which are commonly used for intravital imaging in the field of immunology.

We describe a protocol to surgically expose and stabilize the murine submandibular salivary gland for intravital imaging using upright intravital microscopy. This protocol is easily adaptable to other exocrine glands of the head and neck region of mice and other small rodents.

Preparación de glándula salival submaxilar murino para la microscopia Intravital vertical

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

A Silver Nanoparticle Method for Ameliorating Biliary Atresia Syndrome in Mice

Biliary atresia (BA) is a severe type of cholangitis with high mortality in children of which the etiology is still not fully understood. Viral infections may be one possible cause. The typical animal model used for studying BA is established by inoculating a neonatal mouse with a rhesus rotavirus. Silver nanoparticles have been shown to exert antibacterial and antiviral effects; their function in the BA mouse model is evaluated in this study. Currently, in BA animal experiments, the methods used to improve the symptoms of BA mice are generally symptomatic treatments given via food or other drugs. The aim of this study is to demonstrate a new method for ameliorating BA syndrome in mice by the intraperitoneal injection of silver nanoparticles and to provide detailed methods for preparing the silver nanoparticle gel formulation. This method is simple and widely applicable and can be used to research the mechanism of BA, as well as in clinical treatments. Based on the BA mouse model, when the mice exhibit jaundice, the prepared silver nanoparticle gel is injected intraperitoneally to the surface of the lower liver. The survival status is observed, and biochemical indicators and liver histopathology are examined. This method allows a more intuitive understanding of both the establishment of the BA model and novel BA treatments.

This article describes in detail a method based on silver nanoparticles for ameliorating biliary atresia syndrome in an experimental biliary atresia mouse model. A solid understanding of the reagent preparation process and the neonatal mouse injection technique will help familiarize researchers with the method used in neonatal mouse model studies.

Forma de nanopartículas de plata para paliar el síndrome de Atresia biliar en ratones

Biliary atresia (BA) is a severe type of cholangitis with high mortality in children of which the etiology is still not fully understood. Viral infections ...

Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 per codon, the actual error rates vary widely, depending on the species, environment, and codons being studied. We have previously shown that mycobacteria use a two-step pathway for the generation of aminoacylated glutamine and asparagine tRNAs and that this is specifically associated with relatively high error rates due to the modulation of mistranslation rates by an essential component of the pathway, the amidotransferase GatCAB. We modified a previously employed Renilla-Firefly dual-luciferase system that had been used to measure mistranslation rates in Escherichia coli for use in mycobacteria to measure specific mistranslation rates of glutamate at glutamine codons and aspartate for asparagine codons. Although this reporter system was suitable for the accurate estimation of specific error rates, lack of sensitivity and requirements for excessive manipulation steps made it unsuitable for high-throughput applications. Therefore, we developed a second gain-of-function reporter system, using Nluc luciferase and green fluorescent protein (GFP), which is more amenable to medium/high-throughput settings. We used this system to identify kasugamycin as a small molecule that can decrease mycobacterial mistranslation. Although the reporters that we describe here have been used to measure specific types of mycobacterial mistranslation, they may be modified to measure other types of mistranslation in a number of model systems.

In this article, we present two complementary methods to measure specific rates of translational error and mistranslation in the model mycobacterium, Mycobacterium smegmatis, using gain-of-function reporter systems. The methods can be employed to measure accurate error rates in low throughput or relative error rates in a more high-throughput setting.

Medición de tasas de desconfianza micobacterianas específicas con sistemas de reportera de ganancia de función

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 ...