עבודה זו נתמכה על ידי משרד גרמני לחינוך ולמחקר (BMBF 01EO1003, BMBF 01EO1503).

הניסויים נערכו על עכברים זכר גיל 8 עד 12 שבועות תחת האישור של ועדת האתיקה על ניסויים בבעלי חיים של ריינלנד-פאלץ (אישור מספר 23 177-07/G12-1-002 ו 23 177-07/G15-1-051).
1. עכבר הכנה ניתוח והרדמה
<ol>
	<li>לפני הניתוח, לוודא את בריאות טובה ואת מצבם של בעלי החיים. לפני הניתוח, לפקח על בעלי חיים פעם אחת ביום למשך 2-3 ימים על מצבם הכללי (מראה, תנוחות, התנהגות ספונטנית) כמו גם משקל הגוף, המזון וצריכת מים.</li>
	<li>להכין את תערובת הבסיס עבור הרדמה עם midazolam (5 מ"ג/ק"ג משקל גוף), medetomidine (0.5 מ"ג/ק"ג משקל גוף) של פנטניל (0.05 מ"ג/ק"ג משקל גוף) intraperitoneally (i.p.) להזריק 200 העכבר µL/30 גרם ב 1 מ"ל מזרק עם מחט 26 גרם.</li>
	<li>משאבת osmotic השרשה והכנת בעלי חיים לניסויים IVM מבוצעות על שדה הפעולה ב- C ° 39 ההתחממות פלטפורמה. לחטא את כל הכלים באמבט חיטוי ולחטא את הפלטפורמה התחממות כדור הארץ.</li>
	<li>במהלך ההליכים, להגן על העיניים בעלי חיים עם משחה העין. הסר את הפרווה עם סכיני גילוח לפני המשאבה osmotic השרשה. השתמש להסרת שיער קרם ספוגיות כותנה עבור בידוד של לעורק הראש, צוואר קטטר השרשה בניסויים IVM. לחיטוי עור החיה באמצעות שני אמצעי חיטוי העור: אחד מחטא וקוטל המכיל povidone יוד ואחד העור מחטא המכיל octenidine בפתרון מבוסס-אלכוהול.</li>
	<li>להכין את תערובת הבסיס להרגיז את ההרדמה ("מיקס antisedan") עם atipamezol (0.05 מ"ג/ק"ג משקל גוף), פלומאזניל (0.01 מ"ג/kgbody משקל), ולהכין µL 200/עכבר במזרק 1 מ"ל עם מחט 26 גרם להיות subcutaneously (ש) מוזרק.</li>
</ol>
2. osmotic משאבת והכנה השרשה
הערה: עירוי תת-עורי AngII באמצעות משאבות osmotic תוארה בפירוט על ידי Lu. et al. 17
<ol>
	<li>להכין את AngII על-ידי לשחזר את האבקה lyophilized עם סליין סטרילי ולהתאים את הריכוז עם המשקל בעלי חיים ואת קצב משלוח של המשאבה. שמור את AngII משוקם צינורות פלסטיק (אל תשתמש צינורות זכוכית).</li>
	<li>למלא את המשאבות הפתרון AngII כדי לספק 1 mg/(kg·d) במשך 7 ימים. לאחר ההכנה, לשמור את המשאבות מלח סטרילית עבור 4-6 שעות מינימום ב 37 º C.</li>
	<li>הבדיקה בהרדמה מלאה של העכבר לאחר הזרקה של המיקס הרדמה עם אחורי רגל רפלקסים ומניחים אותו על המגרש מבצע חם. הרדמה אינדוקציה לוקח 10-15 דקות, עובד טוב יותר אם חיות ממוקמים בסביבה חשוכה.</li>
	<li>לגלח את הגב התחתון העכבר ולחטא אותו עם חיטוי אלכוהולי העור.</li>
	<li>עושים חתך 1 ס מ בניצב לעמוד השדרה באמצעות מספריים. ליצור כיס עבור המשאבה באמצעות עוצר דימום מצר ולהוסיף את המשאבה (זרימה מנחה קודם). הכיס לאפשר תנועה חופשית של המשאבה עם אין לחץ על הפצע.</li>
	<li>לסגור את הפצע עם התפרים, לא קליפים, על מנת להגביל את דלקת; לאחר מכן לחטא עם חיטוי העור.</li>
	<li>הקטנטנים של ההרדמה בזריקה ספורטינג של 200 µL של המיקס antisedan וחוזרים העכבר בכלוב.</li>
	<li>לבצע נגד כאבים לאחר הניתוח עם הבופרנורפין (0.075 ק מ"ג/ק"ג ספורטינג) פעם אחת לאחר הניתוח, על פי דרישה בהתאם להתנהגות בעלי חיים.</li>
</ol>
3. צוואר קטטר השרשה והכנות לעורק הראש
<ol>
	<li>הבדיקה בהרדמה מלאה של העכבר לאחר הזרקה של ההרדמה לערבב עם מזון אחורי רפלקסים, למקם את החיה anesthetized recumbence הגבי בצלחת כירורגי 39 ° C עם מכשיר בדיקה רקטלית על מנת לשמור על הטמפרטורה, לשים את המשחה על העיניים כדי להגן עליהם במהלך ההליך.</li>
	<li>להסיר שערות הצוואר השימוש בקרם להסרת שיער. השתמש ספוגית כותנה כדי להפיץ ומרח את הקרם למשך 2 דקות עד שהשערות מתחיל לנשור. לאחר 2 דקות נוספות, להסיר את קרם ואת שערות עם מרית, לחטא את העור עם העור אלכוהוליים חיטוי.</li>
	<li>לבצע את הניתוח תחת stereomicroscope. עושים חתך ארוך 1 – 1.5 ס"מ בעור longitudinally בצוואר, 1 ס מ ליד קנה הנשימה. ואז להפוך אחרים שני חתכים בניצב כדי בשני הגפיים החתכים הראשונים.</li>
	<li>בזהירות להסיר רקמות לצד העור ולהסיר את פיסת העור כיסוי ומוחלף השמאלי על קנה הנשימה.</li>
	<li>בזהירות לבודד את בלוטת הפרוטיד; בלוטות sublingual, submaxillary מאזור עניין עם מלקחיים מעוקל 2. לא לחתוך או נזק הבלוטות, למקם אותם כדי לאפשר את הגישה הטובה ביותר ומוחלף על וכדי לעורק הראש.</li>
	<li>כדי לבודד את ומוחלף, להשתמש מלקחיים דק לאט ולפתוח ולסגור אותו לשחרר בעדינות את הכלי מן הרקמה שמסביב. פעם אחת הווריד נקייה לגמרי, מקם את המלקחיים תחת הכלי ומניחים התפרים 7-0 שני של 10 ס מ כל אחד מתחת.</li>
	<li>סגור את התפר מקורב לראש עם שני קשרים. התפר אחרים, להכין קשר אחד אך אינו סגור.</li>
	<li>. תחזיק את הקטטר (0.28 מ מ בתוך הקוטר החיצוני 0.61 מ מ, קוטר) מלא מלח סטרילית 37 ° C עם מלקחיים עם יד אחת; בזמן עם היד השנייה, עושים חתך קטן לתוך הכלי עם מספריים דק או מחט 26 גרם מעוקל. לאחר מכן להכניס את הצנתר ומוחלף על, וסגרי את הקשר פעמיים. סגור את התפר מקורב לראש על הצנתר על מנת להבטיח הנייח מלאה.</li>
	<li>כדי לבודד ולהכין בעורקים, לנתח המשתרע על קנה הנשימה באמצעות מלקחיים מעוקל דק.</li>
	<li>לאחר לעורק הראש חינם מן הרקמות הסובבות, להסיר את העצב התועה (זה נראה כמו פס לבן צמוד בעורק) מכלי הקיבול (אבל זה לא מספיק). המלקחיים דק יכול להיות סגור ופתח לאט לגייס בעדינות את העצב.</li>
	<li>לאחר שני העורקים נקיים לגמרי, מקום המלקחיים תחת העורק הראשי הראשון ולמקם קטן שחור 3 מ מ רוחב x 2.5 ס מ אורך פלסטיק חתיכה תחת הכלי. חשוב מאוד לא overstretch את הכלי, כדי לבדוק זרימת הדם נוכחת ברגע בעל כלי השיט ממוקם. מקם את העורק השני מעל בעל כלי השיט. אם העכבר אינם ממוקמים ישירות מתחת למיקרוסקופ, תחזיר את הבלוטות מעל קנה הנשימה ולהחיל מלח סטרילית 37 ° C כדי למנוע ייבוש של האזור.</li>
</ol>
4. הערכה של גלגול והקפדה לויקוציטים / LysM + תאים עם IVM
<ol>
	<li>להכין acridine כתום פתרון מניות 2 מ"ג/מ"ל המאוחסנים ב-20 ° C, למהול אותו 1:4 במלח סטרילית (ריכוז סופי 0.5 מ"ג/מ"ל) במזרק 1 מ"ל.</li></ol>להגן על המזרק מפני האור ושימוש µL 200 לכל עכבר אחד.<ol>
		<li>בדיקת מצבים שונים: (1) הזרקה של acridine כתום עם הצנתר צוואר; (2) הזרקה של acridine כתום ישירות לתוך הווריד לרוחב של הזנב (עם מצב זה שהושתל צנתר צוואר אין); (3) מדידה מבלי acridine כתום באמצעות קרינה פלואורסצנטית את LysMCre+IRG+ עכברים (כאן שוב קטטר צוואר לא הושתל).</li>
	</ol>
	
	<li>ברגע הקטטר נמצא במקום שני לעורק הראש מבודדים, מיקום העכבר מתחת למיקרוסקופ. לבצע מדידות עם מיקרוסקופ פלורסצנטיות שדה רחב במהירות גבוהה תוך שימוש הקבל למרחקים של 10 X (NA 0.3) המטרה טבילה במים עם monochromator, מפצל קרן מצלמה תשלום מצמידים מכשיר. בצע ייבוא תמונות וניתוח מערכת הדמיה בזמן אמת.</li>
	<li>פוקוס המטרה מיקרוסקופ באמצע העורק הראשי על פני אנדותל. לאט לאט להחדיר 50 µL של acridine כתום (0.5 mg/mL) (קח בחשבון נפח מת של הצנתר על הזריקה הראשונה). להגדיר את התוכנה כדי להקליט תמונות 100 עם זמן חשיפה בלתי המילישניות 120 לכל תמונה.</li>
	<li>להפוך ארבעה קטעי וידאו לפי העורק הראשי (ימין ושמאל) במקומות שונים על העורק עבור כל קליפ. אם האות פלורסצנטיות יורדת, להזריק עוד 50 µL של acridine כתום.</li>
	<li>לאחר הקלטת כל קטעי וידאו להרדימו על ידי נקע בצוואר הרחם.</li>
	<li>להגדיר את מהירות וידאו-10 תמונות בשנייה, לכמת את התאים מתגלגל, חסיד בתצוגה מיקרומטר 200 x 250 מיקרומטר מלבן במרכזו את הכלי עבור כל קליפ. ספירת תאים מתגלגל, חסיד; תאים חסיד מוגדרים תאים לא לזוז או להתנתק מהתכונה אנדותל בתוך הוידאו s 10. כדי לפשט כמת, להסיר את הערוץ עם פלואורסצנטי אדום ולהשתמש רק את הירוק פלורסצנטיות לספור תאים מתגלגל, והקפדה.</li>
	<li>לניסויים באמצעות acridine כתום, להפוך את הסף ידנית של זריחה כדי להסיר את הרקע שנעשו על ידי תאי אנדותל.</li>

<ol>
	<li>Lewington, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-specific+relevance+of+usual+blood+pressure+to+vascular+mortality:+a+meta-analysis+of+individual+data+for+one+million+adults+in+61+prospective+studies.">Age-specific relevance of usual blood pressure to vascular mortality: a meta-analysis of individual data for one million adults in 61 prospective studies.</a> Lancet. 360, 1903-1913 (2002).</li><li>Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mosaic+theory+revisited:+common+molecular+mechanisms+coordinating+diverse+organ+and+cellular+events+in+hypertension.">The mosaic theory revisited: common molecular mechanisms coordinating diverse organ and cellular events in hypertension.</a> J Am Soc Hypertens. 7, 68-74 (2013).</li><li>Guzik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+T+cell+in+the+genesis+of+angiotensin+II+induced+hypertension+and+vascular+dysfunction.">Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction.</a> J Exp Med. 204, 2449-2460 (2007).</li><li>De Ciuceis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+vascular+remodeling,+endothelial+dysfunction,+and+oxidative+stress+in+resistance+arteries+of+angiotensin+II-infused+macrophage+colony-stimulating+factor-deficient+mice:+evidence+for+a+role+in+inflammation+in+angiotensin-induced+vascular+injury.">Reduced vascular remodeling, endothelial dysfunction, and oxidative stress in resistance arteries of angiotensin II-infused macrophage colony-stimulating factor-deficient mice: evidence for a role in inflammation in angiotensin-induced vascular injury.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25, 2106-2113 (2005).</li><li>Wenzel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme+M-positive+monocytes+mediate+angiotensin+II-induced+arterial+hypertension+and+vascular+dysfunction.">Lysozyme M-positive monocytes mediate angiotensin II-induced arterial hypertension and vascular dysfunction.</a> Circulation. 124, 1370-1381 (2011).</li><li>Kossmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-localized+FXI+promotes+a+vascular+coagulation-inflammatory+circuit+in+arterial+hypertension.">Platelet-localized FXI promotes a vascular coagulation-inflammatory circuit in arterial hypertension.</a> Sci Transl Med. 9, (2017).</li><li>Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Johnson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+Immune+System+in+Hypertension.">Role of the Immune System in Hypertension.</a> Physiol Rev. 97, 1127-1164 (2017).</li><li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+a+practical+guide+on+imaging+intracellular+structures+in+live+animals.">Intravital microscopy: a practical guide on imaging intracellular structures in live animals.</a> Bioarchitecture. 2, 143-157 (2012).</li><li>Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+a+novel+tool+to+study+cell+biology+in+living+animals.">Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals.</a> Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).</li><li>Wenzel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heme+oxygenase-1+suppresses+a+pro-inflammatory+phenotype+in+monocytes+and+determines+endothelial+function+and+arterial+hypertension+in+mice+and+humans.">Heme oxygenase-1 suppresses a pro-inflammatory phenotype in monocytes and determines endothelial function and arterial hypertension in mice and humans.</a> Eur Heart J. 36, 3437-3446 (2015).</li><li>Pawelski, H., Lang, D., Reuter, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+monocytes+and+platelets:+implication+for+life.">Interactions of monocytes and platelets: implication for life.</a> Front Biosci (Schol Ed). 6, 75-91 (2014).</li><li>Hinsbergh, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium--role+in+regulation+of+coagulation+and+inflammation.">Endothelium--role in regulation of coagulation and inflammation.</a> Semin Immunopathol. 34, 93-106 (2012).</li><li>Njock, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+suppress+monocyte+activation+through+secretion+of+extracellular+vesicles+containing+antiinflammatory+microRNAs.">Endothelial cells suppress monocyte activation through secretion of extracellular vesicles containing antiinflammatory microRNAs.</a> Blood. 125, 3202-3212 (2015).</li><li>Colognato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+and+regulation+of+protease-activated+receptors+in+human+peripheral+monocytes+and+monocyte-derived+antigen-presenting+cells.">Differential expression and regulation of protease-activated receptors in human peripheral monocytes and monocyte-derived antigen-presenting cells.</a> Blood. 102, 2645-2652 (2003).</li><li>Schaffner, A., Rhyn, P., Schoedon, G., Schaer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+expression+of+platelet+factor+4+in+human+monocytes--role+of+PARs+as+a+quantitatively+important+monocyte+activation+pathway.">Regulated expression of platelet factor 4 in human monocytes--role of PARs as a quantitatively important monocyte activation pathway.</a> J Leukoc Biol. 78, 202-209 (2005).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li><li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+Angiotensin+II+Infusion+using+Osmotic+Pumps+Induces+Aortic+Aneurysms+in+Mice.">Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice.</a> J Vis Exp. , (2015).</li><li>Koh, T. J., DiPietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+wound+healing:+the+role+of+the+macrophage.">Inflammation and wound healing: the role of the macrophage.</a> Expert Rev Mol Med. 13, e23 (2011).</li><li>Dargaud, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proposal+for+standardized+preanalytical+and+analytical+conditions+for+measuring+thrombin+generation+in+hemophilia:+communication+from+the+SSC+of+the+ISTH.">Proposal for standardized preanalytical and analytical conditions for measuring thrombin generation in hemophilia: communication from the SSC of the ISTH.</a> J Thromb Haemost. , (2017).</li></ol>

המחברים אין לחשוף

LysM+ ומונוציטים הוצגו בעבר כדי להיות מעורב בפיתוח של יתר לחץ דם5. הנה אנחנו מראים כי תאים חיסוניים LysM+ רול, לדבוק שכבת אנדותל בתגובה AngII אינפוזיה. ממצא זה הושג באמצעות LysMCre+IRG+ עכברים ממחקרים קודמים שלנו לחקור את התפקיד של תאים חיסוניים יתר לחץ דם ויוו דמיין לויקוציטים עם הזרקה של6,acridine כתום10. לפיכך, אפליה של סוגי תאים והקפדה אנדותל איננה אפשרית.
IVM הוא כלי מאוד שימושי עבור כלי הדם מחקרים ותצפיות ויוו של תאים ישירות להערכת, אבל ההשפעה של הזרקת צבע בעזרת קטטר בניתוח שנוסף על רקע דלקתי של יתר לחץ דם אינו ידוע. כדי להעריך את השפעת פוטנציאל קטטר, acridine כתום הזרקת אנחנו ניצל LysMCre+עכברים IRG+ . AngII אינפוזיה גדל המספר לגלגל LysM+ תאים אנדותל. החדרת צנתר לווריד הצוואר הגביר את האפקט, לויקוציטים יותר מתגלגל והקפדה אותרו בעכברים חדורים AngII שעברו אינסטרומנטציה עם קטטר לעומת עכברים ללא קטטר שתלים. אפשרות זו מציינת את השרשת צנתר לעורק הצוואר גורם לתגובה דלקתית מערכתית בהקשר של פצע ריפוי המהווה שכבת-על התגובה החיסונית אצל יתר לחץ דם18. בנוסף, מהקרבה של ומוחלף על העורק הראשי ייתכן שאירעה הפעלה חיסוניים נוספים מאת המשפיעים ומוחלף. מאז את האפקט הזה לא היה נוכח בעת זריקות נעשו ישירות לווריד הזנב, אנחנו יכולים להניח שזה היעד לא לצבוע אלא הליך החדרת הקטטר. אנחנו כאן הפגין את החשיבות של העכברים הטרנסגניים כתב המבטאים חלבונים פלורסנט לא להתערב בתהליכים ויוו במהלך ניסויים. יתר על כן, הזרקה וריד הזנב של המשדרים פלורסנט עשויה להיות אלטרנטיבה אפשרית זריקות צוואר קטטר.
צעד קריטי של ההליך הוא החדרת AngII. הזנב הערכה השרוול של לחץ הדם יכולה להיעשות כדי לקבוע את היעילות של AngII משלוח באמצעות המשאבה. לחץ הדם צריך להגדיל לאחר 2−3 ימי אינפוזיה. כדי להגביל את דלקת יכולה להשפיע על הפעלת תאי LysM+ , סגירת החתך שבו המשאבה הוא מושתל צריכה להיעשות עם התפרים במקום קליפים. מגבלה אחת יש לציין לגבי הזרקת וריד הזנב: כדי להפוך את רכישת המידע האפשרי הטוב ביותר, 4 סרטונים נלקחים בדרך כלל עבור כל עורק הצוואר. אם האות פלורסנט יורדת, µL 50 acridine כתום מוזרקים אך עם הזרקת הזנב זה יותר קשה לבצע מספר זריקות וכדי לשמור לעורק הראש יציב תחת המטרה מיקרוסקופ. משך הזמן של הנוכחות של צנתר בווריד הצוואר אולי גם לווסת את ההפעלה תאים חיסוניים מאז. זה משפיע על הפעלת קרישה בפלסמה טסיות דם עשיר מוכן 4 שעות לאחר ההשתלה קטטר19. היבט זה של קטטר השרשה זקוק בהמשך החקירה.
בסופו של דבר, גם אם אנחנו מעריכים את ההשפעה של קטטר צוואר השרשה על ההפעלה תא LysM+ לאחר AngII אינפוזיה, אנחנו לא יכול באופן מלא להעריך את התפקיד של הכנה, הסרת העור, בידוד העורק על פוטנציאל תא LysM+ הפעלה. אנו מסיקים כי השימוש של קרינה פלואורסצנטית כתב עכברים אוהבים LysMCre+IRG+ עכבר מומלץ כדי למנוע הפרעה של כלי תקינות במהלך הכנת בעלי חיים עבור הדמיה ויוו .

יתר לחץ דם מגביר את הסיכון למחלות לב וכלי דם ומוות ומקדמת ההתפתחות של טרשת עורקים, מחלת לב כלילית, עורקי או ורידי thromboembolisms1. התפתחות יתר לחץ דם תלוי האינטראקציה של גורמים סביבתיים, גנטי, האנדוקרינית ו בגרימת. כיום, חסינות ודלקת הקשורים יתקבלו בברכה לשחק תפקיד חשוב האטיולוגיה של יתר לחץ דם2.
בין תאים חיסוניים, נמצאו לימפוציטים מסוג T, כמו גם ומונוציטים ו מקרופאגים להיות מעורב סיבתי AngII-induced דלקת כלי דם, יתר לחץ דם, הקשורים באופן חלקי ביכולתם לעורר מינים חמצן תגובתי3. מקרופאג המושבה-מגרה גורם לקוי עכברים הראה מופחתת בתגובה AngII בנוגע עלייה בלחץ הדם, דלקת כלי דם4. בעבודה קודמת, נוכל להראות כי LysM + ומונוציטים לנהוג בתפקוד כלי דם ודלקת AngII-induced יתר לחץ דם5. לאחרונה, אנחנו תיאר את מסלול הרומן ב אילו קרישה פקטור XI משתפת פעולה עם טסיות ועל הקיר כלי כדי לגרום דלקת כלי הדם תרומבין תלוית6. לאחרונה, הידע הנוכחי על תפקידה של מערכת החיסון אצל יתר לחץ דם היה מסוכם, נבדקו על ידי רודריגז-Iturbe ואח. 7
מאז המעורבות של תאים חיסוניים להתפתחות יתר לחץ דם התברר, מודלים וטכניקות את האינטראקציה בין הכלי לבין תאים חיסוניים הפך הכרחי. IVM Epifluorescence של כלי דם הוא כלי שימושי כדי להתבונן ויוו האינטראקציות בין במחזור הדם והתאים אנדותל8,9,10. בטכניקה זו, הזרקה של צבעי intercalating עם ה-DNA (כגון כתום acridine) יכולה לדמיין תאים nucleated (מחזורי וכן מ של אנדותל). טסיות הדם מבודדים צבעונית שמחוץ עם rhodamin - 6 G או dichlorofluorescein (DCF) יכול להיות מוזרק להמחיש טסיות דם עשיר כגון פגיעה בעורקים. או מודלים.
בדרך כלל, קטטר ומוחלף להזרקת המשדרים או מסומן טסיות. שינוי אנדותל והפעלה עוקבות של המפל קרישה שניהם ידועים להיות השפעות על מונוציט הפעלה. פציעה אנדותל מיד מוביל טסיות הפעלה באמצעות מטריקס subendothelial מולקולות לאטום את הרקמה, שהתפתח מונוציט המשיכה והפעלה11. להפך, אנדותל שלם הוא ידוע כבעל מאפיינים קרישה (למשל, באמצעות רקמות גורם מסלול מעכב או thrombomodulin)12 ו ישיר מעכבות ההשפעות על מונוציט, למשל, באמצעות הפרשת חוץ-תאית שלפוחית המכילה מיקרו Rna13. ומונוציטים ידועים כדי לייצר גורם רקמות, activator החיצוניים של קרישת הדם בהתאם להירארכיית הקשרים, אקספרס מופעל פרוטאז קולטנים (PARs) יכול להיות מופעל על ידי תרומבין ולהשתתף מונוציט הפעלה14,15 . לכן, כל הפעלה של טסיות או של המפל קרישה עקב פגיעה בכלי הדם יכול להיות תופעות בלתי צפויות על ההפעלה מונוציט ומשבשים את התופעה נצפתה. עם העזרה של IRG הטרנסגניים LysM Cre העכברים הטרנסגניים, עכבר כתב Cre כפול-פלורסנט (LysMCre+IRG+), אנו מציעים ללמוד בפירוט את השפעת זריקות עם קטטר ושיטות אלטרנטיבית על LysM+ תאים myelomonocytic במודל של עכברים של יתר לחץ דם16.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Ratiopharm GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Pfizer Deutschland GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl</td>
			<td>Janssen-Cilag GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alzane</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>Antisedan mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flumazenil</td>
			<td>Hikma pharma</td>
			<td></td>
			<td>Antisedan mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braunol</td>
			<td>B Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octeniderm</td>
			<td>Sch&#252;lke</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmotic pumps</td>
			<td>Alzet</td>
			<td>1007D</td>
			<td>Osmotic pump implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiotensin II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Osmotic pump implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-0 prolene suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td></td>
			<td>Osmotic pump implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acridine orange</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catheter</td>
			<td>Smiths Medical Deutschland GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Inside diameter, 0.28 mm; outer diameter, 0.61 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI fluorescence microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam Splitter</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>CMR-DV2-SYS - DualView2 MicroImager</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UMPLFLN10X</td>
			<td>Water immersion objective with a monochromator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>ORCA-R2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition and analysis software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Realtime Imaging System eXcellence RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Jax 008705</td>
			<td>B6.Cg-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Jax 004781</td>
			<td>LysM Cre (B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J )</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing leukocyte rolling and adhesion in angiotensin ii-infused mice: techniques and pitfalls

Epifluorescence intravital וידאו מיקרוסקופ (IVM) של כלי הדם היא שיטה הוקמה כדי להעריך את ההפעלה של תאים חיסוניים והיכולת שלהם תפקיד וציות על שכבת אנדותל. ויזואליזציה של מחזורי תאים על ידי זריקה של צבעי פלורסנט או נוגדנים מצמידים fluorophore נמצא בשימוש נפוץ. לחלופין, ניתן להשתמש כתב פלורסנט עכברים. אינטראקציות של לויקוציטים, ב מסוים ליזוזים M+ (LysM+) ומונוציטים, עם הקיר כלי משחק תפקיד מרכזי בקידום בתפקוד כלי הדם, יתר לחץ דם. אנו מציגים כאן את הטכניקה כדי להמחיש ולכמת ליקוציט מתגלגל והצמדות בעורקים באנגיוטנסין II (AngII)-induced יתר לחץ דם אצל עכברים מאת IVM.
ההשתלה של קטטר נזקים לקיר כלי הדם ומוביל אל תאי הדם שינו תגובות. השווינו הזרקה שונים וטכניקות ניהול נתיבים להמחיש לויקוציטים ב LysMCre+IRG+ עכבר עם ביטוי נרחב של חלבון פלואורסצנטי אדום, ביטוי מותנה של חלבון פלואורסצנטי ירוק ב- LysM + תאים. ללמוד הפעלת תא LysM+ , השתמשנו AngII חדורים עכברים מתגלגל, הידבקות של לויקוציטים כדי אנדותל גדל. אנחנו גם מוזרק acridine כתום של וריד הצוואר באמצעות קטטר או ישירות למרות הזנב הווריד לעומת הכמות מתגלגל והקפדה תאים. מצאנו כי הצנתר צוואר השרשה כשלעצמה גדל המספר של גלגול, הקפדה LysM+ בתאים המזויפים חדורים LysMCre+עכברים IRG+ לעומת שולט. הפעלה זה היה מרובדת בעכברים חדורים AngII. מעניין, הזרקת acridine כתום ישירות דרך הזנב וריד לא גדלה LysM+ תא אדהזיה או מגלגלים בעכברים חלוטים המזויפים. אנחנו ובכך הראו את החשיבות של העכברים הטרנסגניים כתב המבטאים חלבונים פלורסנט לא להתערב בתהליכים ויוו במהלך ניסויים. יתר על כן, הזרקה וריד הזנב של המשדרים פלורסנט עשויה להיות אלטרנטיבה אפשרית זריקות צוואר קטטר.

לעורק הראש של LysMCre+IRG+ נצפו עכברים רווי AngII באמצעות IVM. Acridine תפוז היה מוזרק באמצעות צנתר צוואר. כיוונו להסתכל על היחס של תאים LysM+ בקשר עם הקיר וסקולרית לעומת כל התאים במחזור nucleated (אשר יכול גם לקיים אינטראקציה עם כלי הקיבול מאז אפליה של סוג התא אינטראקציה עם הכלי נשאר פתוח שאלה מן העבודות הקודמות שלנו). בנקודת ההתחלה, הנוכחות של קטטר צוואר גורמת הידבקות של תאים LysM+ (איור 2 א, יח). לאחר ההזרקה acridine כתום, אותם התאים היו פלורסנט, אבל גם תאי אנדותל היו פלורסנט (איור 2B, E). לאחר ההפחתה של הרקע כדי להגביל אנדותל הקשורים פלורסצנטיות, הנתונים מצביעים על כי כל התאים adhering nucleated הם LysM+ (איור 2C, F); תוצאות אלו נכונה לאחר אינפוזיה AngII המאשרת את התוצאות הקודמות שלנו, הממחיש LysMCre+IRG+ הוא מודל טוב כדי לבחון את השפעת AngII על LysM+ תא ההפעלה.
הערכנו את התפקיד של נתיבי ממשל של תפוז על ההפעלה תא LysM+ לאחר אינפוזיה AngII ב LysMCre+IRG+acridine. אחרי שבוע אחד AngII אינפוזיה, ליקוציט אנדותל אינטראקציות בתוך עורק של LysMCre+IRG+ היו עכברים עם תמונה, דמיינו ידי IVM עם או בלי הזרקת acridine כתום דרך קטטר צוואר או דרך הווריד של הזנב. ללא קטטר או הזרקה, מתגלגל של תאים LysM+ היה משמעותי מוגברת לאחר אינפוזיה AngII לעומת עכברים שלא טופלו, והצמדות הראו עלייה (איור 3). הזרקה של acridine כתום ועם אדהזיה קטטר צוואר מוגברת של גילגולים AngII מטופלים עכברים במידה רבה יותר בהשוואה עכברים ללא קטטר (איור 3). הזרקה של תפוז את תקחי את הזנב acridine מוביל המסוכן דומה, מתגלגל לעומת עכברים זה לא קיבלה זריקה של acridine כתום (איור 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig1.jpg"> 
איור 1. ערכת אינפוזיה אנגיוטנסין II, הערכה של LysM+ תאים מתגלגל והצמדות בעכברים. LysMCre+IRG+ עכברים היו חדורים 7 ימים עם AngII, הקפדה, כמו גם מתגלגל LysM+ תאים מעל לעורק הראש היו לכמת עם או בלי הזרקת acridine כתום דרך קטטר צוואר או על-ידי וריד הזנב זריקה. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56948/56948fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig2.jpg"> 
באיור 2. הערכה של LysM+ תא אדהזיה מתגלגל בעורקים של LysMCre+עכברים IRG+ . אדהזיה LysM+ תאי LysMCre+עכברים IRG+ (A, D) לפני ואחרי הזרקת acridine (B, E) באמצעות צנתר צוואר. קרינה פלואורסצנטית אדום וירוק נרשמו, תאים LysM+ (בירוק) ותאי שריר חלק (באדום) היו גלויים. לאחר ההזרקה של תפוז acridine, תאי אנדותל גלויים גם בירוק אבל הסרת רקע זריחה מאפשר רק במחזור nucleated תא ויזואליזציה (C, F). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56948/56948fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig3.jpg"> 
איור 3. הערכה של נתיבי ממשל של צבעי פלורסנט באנגיוטנסין II חדורים LysMCre+עכברים IRG+ . כימות של גלגול (A) והקפדה (B) LysM+ תאים המזויפים המופעל או חלוטים AngII חיות, עם או בלי זריקה של תפוז acridine באמצעות צנתר צוואר או בזריקה וריד הזנב. תמונות נציג של התנאים שונים (C). התוצאות הן זאת אומרת ± שגיאת התקן של הממוצע. 2-way ANOVA בוצעה ובדיקה של Bonferroni פוסט הוק , n = 3-12/קבוצות; p &#60; 0.05. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56948/56948fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls at JoVE.com

Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

כתב יד זה מתאר את השימוש העכברים הטרנסגניים הכתב ואת נתיבי ממשל שונים של צבעי פלורסנט באנגיוטנסין II-induced יתר לחץ דם באמצעות מיקרוסקופ וידאו intravital של כלי הדם כדי להעריך את ההפעלה של תאים חיסוניים שלהם היכולת לגלגל, לדבוק אנדותל.

להמחיש ליקוציט מתגלגל והצמדות אנגיוטנסין II חדורים עכברים: טכניקות ואת החסרונות

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...

visualizing-leukocyte-rolling-adhesion-angiotensin-ii-infused-mice

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.6K Views.  University Medical Center Mainz. כתב יד זה מתאר את השימוש העכברים הטרנסגניים הכתב ואת נתיבי ממשל שונים של צבעי פלורסנט באנגיוטנסין II-induced יתר לחץ דם באמצעות מיקרוסקופ וידאו intravital של כלי הדם כדי להעריך את ההפעלה של תאים חיסוניים שלהם היכולת לגלגל, לדבוק אנדותל.

Video: Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

לא פולשני הדמיה של ביות ליקוציט והגירה In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection. ATSs are derived from cDNA clones of mosquito-borne RNA viruses (genus Alphavirus; family Togaviridae). The Alphavirus genus contains about 30 different mosquito-borne virus species. Alphaviruses are enveloped viruses and contain single-stranded RNA genomes (~11.7 Kb). Alphaviruses transcribe a subgenomic mRNA that encodes the structural proteins of the virus required for encapsidation of the genome and maturation of the virus. Alphaviruses are usually highly lytic in vertebrate cells, but persistently infect susceptible mosquito cells with minimal cytopathology. These attributes make them excellent tools for gene expression in mosquito vectors. The most common ATSs in use are derived from Sindbis virus (SINV). The broad species tropism of SINV allows for infection of insect, avian, and mammalian cells8. However, ATSs have been derived from other alphaviruses as well9,10,20. Foreign gene expression is made possible by the insertion of an additional viral subgenomic RNA initiation site or promoter. ATSs in which an exogenous gene sequence is positioned 5' to the viral structural genes is used for stable protein expression in insects. ATSs, in which a gene sequence is positioned 3' to the structural genes, is used to trigger RNAi and silence expression of that gene in the insect.
ATSs have proven to be valuable tools for understanding vector-pathogen interactions, molecular details of viral replication and maintenance infectious cycles3,4,11,19,21. In particular, the expression of fluorescent and bioluminescent reporters has been instrumental tracking the viral infection in the vector and virus transmission5,14-16,18. Additionally, the vector immune response has been described using two strains of SINV engineered to express GFP2,9.
Here, we present a method for the production of SINV containing a fluorescent reporter (GFP) from the cDNA infectious clone. Infectious, full-length RNA is transcribed from the linearized cDNA clone. Infectious RNA is introduced into permissive target cells by electroporation. Transfected cells generate infectious virus particles expressing the GOI. Harvested virus is used to infect mosquitoes, as described here, or other host species (not shown herein). Vector competence is assessed by detecting fluorescence outside the midgut or by monitoring virus transmission7. Use of a fluorescent reporter as the GOI allows for convenient estimation of virus spread throughout a cell culture, for determination of rate of infection, dissemination in exposed mosquitoes, virus transmission from the mosquito and provides a rapid gauge of vector competence.

Methods for using alphavirus transducing systems to express fluorescent reporters in vitro and in adult mosquitoes are described. This technique may be adapted to express any protein of interest in lieu of or in addition to a reporter.

מערכת Alphavirus Transducing: כלי המאפשר הדמיה זיהום ווקטורים יתוש

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

ב Assay חוץ גופית של הידבקות חיידקים על תאים אפיתל היונקים

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

לדמיין וירוס דנגה דרך אלקסה פלואוריד תיוג

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. In the vasculature hypertension is associated with endothelial dysfunction and increased inflammation leading to atherosclerosis and various disease states such as chronic kidney disease2, stroke3 and heart failure4. An initial step in vascular inflammation leading to atherogenesis is the adhesion cascade which involves the rolling, tethering, adherence and subsequent transmigration of leukocytes through the endothelium. Recruitment and accumulation of leukocytes to the endothelium is mediated by an upregulation of adhesion molecules such as vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intracellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) and E-selectin as well as increases in cytokine and chemokine release and an upregulation of reactive oxygen species5. In vitro methods such as static adhesion assays help to determine mechanisms involved in cell-to-cell adhesion as well as the analysis of cell adhesion molecules. Methods employed in previous in vitro studies have demonstrated that acute increases in pressure on the endothelium can lead to monocyte adhesion, an upregulation of adhesion molecules and inflammatory markers6 however, similar to many in vitro assays, these findings have not been performed in real time under physiological flow conditions, nor with whole blood. Therefore, in vivo assays are increasingly utilised in animal models to demonstrate vascular inflammation and plaque development. Intravital microscopy is now widely used to assess leukocyte adhesion, rolling, migration and transmigration7-9. When combining the effects of pressure on leukocyte to endothelial adhesion the in vivo studies are less extensive. One such study examines the real time effects of flow and shear on arterial growth and remodelling but inflammatory markers were only assessed via immunohistochemistry10. Here we present a model for recording leukocyte adhesion in real time in intact pressurised blood vessels using whole blood perfusion. The methodology is a modification of an ex vivo vessel chamber perfusion model9 which enables real-time analysis of leukocyte -endothelial adhesive interactions in intact vessels. Our modification enables the manipulation of the intraluminal pressure up to 200 mmHg allowing for study not only under physiological flow conditions but also pressure conditions. While pressure myography systems have been previously demonstrated to observe vessel wall and lumen diameter11 as well as vessel contraction this is the first time demonstrating leukocyte-endothelial interactions in real time. Here we demonstrate the technique using carotid arteries harvested from rats and cannulated to a custom-made flow chamber coupled to a fluorescent microscope. The vessel chamber is equipped with a large bottom coverglass allowing a large diameter objective lens with short working distance to image the vessel. Furthermore, selected agonist and/or antagonists can be utilized to further investigate the mechanisms controlling cell adhesion. Advantages of this method over intravital microscopy include no involvement of invasive surgery and therefore a higher throughput can be obtained. This method also enables the use of localised inhibitor treatment to the desired vessel whereas intravital only enables systemic inhibitor treatment.

This is a method to visualise leukocyte adhesion to the endothelium in harvested pressurised vessels. The technique enables studying vascular adhesion under shear flow with differing intraluminal pressures up to 200 mmHg thus mimic-ing the pathophysiological conditions of high blood pressure.

הדמיה הדבקה ליקוציט כדי האנדותל דם בלחץ גבוה Intraluminal

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

כמותי<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

אינטראקציות מיקרוסקופית Intravital של יקוציט-האנדותל וטסיות דם-יקוציט בMesenterial ורידים בעכברים

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Assay הדבקה תחת מאמץ גזירה לחקר T לימפוציטים-הדבקה אינטראקציות מולקולה

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on the hypotonic lysis of erythrocytes and can be applied to human samples as well as to blood of non-human origin. The small initial sample volume of about 50 to 100 &#181;l makes this method applicable to recurrent blood sampling from small laboratory animals. Moreover, leukocyte enrichment is achieved within minutes and with low material efforts regarding chemicals and instrumentation, making this method applicable in multiple laboratory environments.
Standardized purification of leukocytes is combined with a highly selective staining method to evaluate halogenating peroxidase activity of the heme peroxidases, myeloperoxidase (MPO) and eosinophil peroxidase (EPO), i.e., the formation of hypochlorous and hypobromous acid (HOCl and HOBr). While MPO is strongly expressed in neutrophils, the most abundant immune cell type in human blood as well as in monocytes, the related enzyme EPO is exclusively expressed in eosinophils. The halogenating activity of these enzymes is addressed by using the almost HOCl- and HOBr-specific dye aminophenyl fluorescein (APF) and the primary peroxidase substrate hydrogen peroxide. Upon subsequent flow cytometry analysis all peroxidase-positive cells (neutrophils, monocytes, eosinophils) are distinguishable and their halogenating peroxidase activity can be quantified. Since APF staining may be combined with the application of cell surface markers, this protocol can be extended to specifically address leukocyte sub-fractions. The method is applicable to detect HOCl and HOBr production both in human and in rodent leukocytes.
Given the widely and diversely discussed immunological role of these enzymatic products in chronic inflammatory diseases, this protocol may contribute to a better understanding of the immunological relevance of leukocyte-derived heme peroxidases.

This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.

הערכה מהירה וספציפית של פעילות Halogenating Peroxidase בדגימות דם ליקוציט מועשר

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...