이 작품은 교육과 연구 (BMBF 01EO1003 및 BMBF 01EO1503)에 대 한 독일 정부에 의해 지원 되었다.

실험은 남성 쥐 나이에 라인 지방 팔 라틴 (승인 번호 23 177-07/G12-1-002 및 23 177-07/G15-1-051)에서 동물 실험 윤리 위원회의 승인 아래 오래 된 8 ~ 12 주에 실시 했다.
1. 마우스 마 취 및 수술 준비
<ol>
	<li>수술 전에 좋은 건강 및 동물의 상태를 확인 합니다. 수술 전에 체중, 음식, 및 물 소비 (모양, 자세, 자연 스러운 행동) 그들의 일반적인 조건에 대 한 2-3 일 동안 하루에 한 번씩 동물을 모니터링 합니다.</li>
	<li>준비 마스터 믹스 midazolam (5 mg/kg 체중), medetomidine (0.5 mg/kg 체중), 펜타닐 (0.05 mg/kg 몸 무게)와 마 취에 대 한 intraperitoneally (i.p.) 26 G 바늘 200 µ L/30 g 마우스 1 mL 주사기에 주입.</li>
	<li>삼 투 펌프 주입 및 IVM 실험 동물 준비 플랫폼 온난화 39 ° c는 작업 필드에 수행 됩니다. 소독 목욕에 모든 도구를 소독 하 고 소독 온난화 플랫폼.</li>
	<li>절차 동안 눈 연 고와 동물 눈을 보호 합니다. 삼 투 펌프 주입 전에 면도기와 모피를 제거 합니다. 제 모 크림, 면봉을 사용 하 여 년 및 jugular 카 테 테 르 주입 IVM 실험에서의 격리에 대 한. 2 피부 소독 제를 사용 하 여 동물의 피부를 소독: 한 살 균 및 살 균 제 povidone 요오드와 한을 포함 하 피부 살 균 포함 octenidine 알코올 기반 솔루션.</li>
	<li>반대 flumazenil (0.01 mg/kgbody 중량), atipamezol (0.05 mg/kg 체중)와 마 취 ("antisedan") 믹스 마스터 믹스를 준비 하 고 피하 것 26 G 바늘 200 µ L/마우스 1 mL 주사기에 준비 (사우스 캐롤라이나) 주입.</li>
</ol>
2. 삼 투 펌프 준비 및 이식
참고: 삼 투 펌프를 사용 하 여 피하 AngII 주입 Lu 그 외 여러분 에 의해 상세히에서 기술 되었다 17
<ol>
	<li>멸 균 식 염 수와 동결 건조 된 분말을 재구성 하 여는 AngII를 준비 하 고 농도 동물 무게와 펌프의 배달 속도 조정. 플라스틱 튜브 (유리 튜브를 사용 하지 마십시오.)에서 재구성 된 AngII를 유지.</li>
	<li>7 일 동안 1 mg/(kg·d)를 제공 하는 AngII 솔루션으로 펌프를 채우십시오. 준비 후에, 펌프에서에서 계속 4-6 h에 대 한 살 균 염 분 최소 37 ° c.</li>
	<li>후면 마 취 혼합의 사출 반사 발 고 따뜻한 작업 필드에는 마우스의 완벽 한 마 취를 테스트 합니다. 마 취 유도 10-15 분 소요 하 고 동물 어두운 환경에서 배치 하는 경우 더 잘 작동 합니다.</li>
	<li>마우스 뒷면 하단을 면도 하 고 알콜 피부 살 균 소독.</li>
	<li>가 위를 사용 하 여 척추에 수직인 1 cm 절 개를 확인 합니다. 해협 hemostat를 사용 하 여 펌프에 대 한 주머니를 만들고 펌프를 삽입 (먼저 사회자 흐름). 주머니 없는 압력 상처에 펌프의 자유 운동을 허용 해야 합니다.</li>
	<li>염증; 제한 하기 위하여 하지 클립, 봉합와 상처를 닫습니다 그런 다음 피부 살 균 소독.</li>
	<li>Antisedan 믹스의 200 µ L의 사우스 캐롤라이나 주사로 마 취를 반대 하 고 그것의 감 금 소를 마우스를 반환 합니다.</li>
	<li>수술 후 진통 buprenorphine와 수행 (0.075 m g/k g 사우스 캐롤라이나) 한 번 수술 후 및 동물의 행동에 따라 수요에.</li>
</ol>
3. jugular 카 테 테 르 주입 및 년 준비
<ol>
	<li>마우스의 완벽 한 마 취 주입 마 취의 후면 음식 반사와 혼합 하 고 온도 유지 하 고 연 고를 두고 직장 프로브와 39 ° C에 수술 등 recumbence에서 마 취 동물을 배치 후 테스트 절차 동안 그들을 보호 하기 위해 눈입니다.</li>
	<li>제 모 크림을 사용 하 여 목 머리카락을 제거 합니다. 면봉을 사용 하 여 확산 하 고 머리카락 밖으로을 시작 될 때까지 2 분 동안 크림을 문 지 르 세요. 추가 2 분 후 주걱으로 크림과 머리카락을 제거 하 고 알콜 피부 살 균으로 피부를 소독 합니다.</li>
	<li>아래는 stereomicroscope 수술을 수행 합니다. 경도 목, 기관지 옆 1 cm에서 피부에 1-1.5 cm 긴 절 개를 확인 합니다. 첫 번째 절 두 사지에 수직으로 다른 두 절을 확인 합니다.</li>
	<li>신중 하 게 피부 옆 조직 제거 하 고 피부 왼쪽된 경 정 맥 및 기도의 조각을 제거.</li>
	<li>조심 스럽게 분리 귀 밑 샘; 2 곡선된 겸 자에 대 한 관심의 영역에서 설 하 고 submaxillary 땀 샘. 하지 절단 또는 동맥 손상, 경 정 맥에는 년 최고의 액세스할 수 있도록 그들 장소.</li>
	<li>경 정 맥을, 얇은 집게를 사용 하 고 천천히 열고 주변 조직에서 혈관을 부드럽게 닫습니다. 일단 정 맥이 완전히 깨끗 한는 겸 그릇 아래 놓고 아래 각 10 cm의 2 개의 7-0 봉합을 배치.</li>
	<li>두 개의 매듭을 가진 머리에 인접 봉합을 닫습니다. 다른 봉합에 한 매듭을 준비 하지만 그것을 닫지 마십시오.</li>
	<li>잡고 한 손으로 집게와 37 ° C 살 균 염 분 가득한 테 (안쪽 직경, 0.61 m m 외부 직경 0.28 m m) 다른 한편으로는, 함께 하는 동안 얇은 위 또는 곡선된 26 G 바늘 그릇에 작은 절 개를 확인 합니다. 그런 다음 경 정 맥에 카 테 터를 삽입 하 고 두 번 매듭을 닫습니다. 완전 한 동원 정지를 위해 카 테 터를 통해 머리에 인접 봉합을 닫습니다.</li>
	<li>격리 하 고 경 동맥을 준비, 얇은 곡선된 겸 자 사용 하 여 기관지를 덮고 영역 해 부.</li>
	<li>일단 고 년 조직 주변에서 자유롭다, 선박에서 미주 신경 (흰색 라인은 경 동맥에 인접 한 모양)를 제거 (하지만 그것을 잘라 하지 않습니다). 얇은 포 셉 폐쇄 하 고 천천히 부드럽게 신경을 동원을 열 수 있습니다.</li>
	<li>두 동맥은 완전히 깨끗 한, 일단 아래 첫 번째 경 동맥 겸 자 놓고 작은 블랙 3 m m x 폭 2.5 c m 길이 플라스틱 조각 그릇 아래에 배치 합니다. 그것은 매우 중요 한 선박을 overstretch 하지 고 혈액의 흐름은 선박 소유자 배치 되 면 존재 확인. 두 번째 동맥 선박 소유자를 놓습니다. 마우스는 현미경의 밑에 직접 배치 되지 않습니다, 기도에 땀 샘을 다시 넣어 고 37 ° C 살 균 염 분 지 대의 건조 방지를 적용.</li>
</ol>
4. 압 연 및 백혈구 준수 평가 / LysM + IVM와 세포
<ol>
	<li>-20 ° C에 저장 하는 2 mg/mL 재고 솔루션에서 오렌지 acridine 준비 하 고 그것에 게 1:4 1 mL 주사기에 멸 균 식 염 수 (최종 농도 0.5 mg/mL)에 희석.</li></ol>빛에서 주사기를 보호 하 고 하나의 마우스 당 200 µ L를 사용 하 여.<ol>
		<li>다른 조건을 테스트: acridine jugular 테;와 오렌지의 (1) 주입 (2) 주입 acridine 오렌지 직접 꼬리 옆 정 맥 (이 조건으로 아무 jugular 테 이식 했다); (3) 측정 acridine 오렌지 형광 LysMCre+IRG+ 를 사용 하 여 마우스 (여기 다시 아무 jugular 테 이식 했다) 없이.</li>
	</ol>
	
	<li>일단 테 장소 이며 2 년은, 현미경 마우스를 놓습니다. 장거리 콘덴서와 X 10을 사용 하 여 고속 넓은 필드 형광 현미경으로 측정을 수행 (NA 0.3)는 단색, 빔 스플리터와 전 하 결합 소자 카메라 물 침수 목표. 이미지 수집 및 실시간 이미징 시스템 분석을 수행 합니다.</li>
	<li>경 동맥 내 피 표면에 중간 현미경 목표 초점. 천천히 주사 50 µ L의 acridine 오렌지 (0.5 mg/mL) (고려 첫 번째 주입을 위해 카 테 터의 죽은 볼륨). 이미지 당 120 밀리초의 노출 시간 100 이미지 기록 소프트웨어를 설정 합니다.</li>
	<li>각 비디오에 대 한 동맥에 다른 위치에서 경 동맥 (왼쪽 및 오른쪽) 당 4 개의 동영상을 확인 합니다. 형광 신호 감소, acridine 오렌지의 또 다른 50 µ L을 주입.</li>
	<li>모든 동영상을 녹화 후 자 궁 경부 전위에 의해 동물을 안락사.</li>
	<li>초당 10 이미지 비디오 속도 설정 하 고 각 비디오에 대 한 선박 중앙 배치 200 µ m x 250 µ m 사각형 보기에서 롤링 및 부착 세포 계량. 롤링 및 부착 셀; 부착 세포 이동 하지 않거나 10 s 비디오 내 피에서 분리 된 셀으로 정의 됩니다. 정량화를 단순화 하기 위해 빨간 형광으로 채널을 제거 하 고 롤링 및 접착 셀만 녹색 형광을 사용 합니다.</li>
	<li>실험 acridine 오렌지를 사용 하 여, 내 피 세포에 의해 만들어진 배경을 제거 하기 위해 형광의 수동 임계값을 확인 합니다.</li>

<ol>
	<li>Lewington, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-specific+relevance+of+usual+blood+pressure+to+vascular+mortality:+a+meta-analysis+of+individual+data+for+one+million+adults+in+61+prospective+studies.">Age-specific relevance of usual blood pressure to vascular mortality: a meta-analysis of individual data for one million adults in 61 prospective studies.</a> Lancet. 360, 1903-1913 (2002).</li><li>Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mosaic+theory+revisited:+common+molecular+mechanisms+coordinating+diverse+organ+and+cellular+events+in+hypertension.">The mosaic theory revisited: common molecular mechanisms coordinating diverse organ and cellular events in hypertension.</a> J Am Soc Hypertens. 7, 68-74 (2013).</li><li>Guzik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+T+cell+in+the+genesis+of+angiotensin+II+induced+hypertension+and+vascular+dysfunction.">Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction.</a> J Exp Med. 204, 2449-2460 (2007).</li><li>De Ciuceis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+vascular+remodeling,+endothelial+dysfunction,+and+oxidative+stress+in+resistance+arteries+of+angiotensin+II-infused+macrophage+colony-stimulating+factor-deficient+mice:+evidence+for+a+role+in+inflammation+in+angiotensin-induced+vascular+injury.">Reduced vascular remodeling, endothelial dysfunction, and oxidative stress in resistance arteries of angiotensin II-infused macrophage colony-stimulating factor-deficient mice: evidence for a role in inflammation in angiotensin-induced vascular injury.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25, 2106-2113 (2005).</li><li>Wenzel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme+M-positive+monocytes+mediate+angiotensin+II-induced+arterial+hypertension+and+vascular+dysfunction.">Lysozyme M-positive monocytes mediate angiotensin II-induced arterial hypertension and vascular dysfunction.</a> Circulation. 124, 1370-1381 (2011).</li><li>Kossmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-localized+FXI+promotes+a+vascular+coagulation-inflammatory+circuit+in+arterial+hypertension.">Platelet-localized FXI promotes a vascular coagulation-inflammatory circuit in arterial hypertension.</a> Sci Transl Med. 9, (2017).</li><li>Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Johnson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+Immune+System+in+Hypertension.">Role of the Immune System in Hypertension.</a> Physiol Rev. 97, 1127-1164 (2017).</li><li>Masedunskas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+a+practical+guide+on+imaging+intracellular+structures+in+live+animals.">Intravital microscopy: a practical guide on imaging intracellular structures in live animals.</a> Bioarchitecture. 2, 143-157 (2012).</li><li>Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+microscopy:+a+novel+tool+to+study+cell+biology+in+living+animals.">Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals.</a> Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).</li><li>Wenzel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heme+oxygenase-1+suppresses+a+pro-inflammatory+phenotype+in+monocytes+and+determines+endothelial+function+and+arterial+hypertension+in+mice+and+humans.">Heme oxygenase-1 suppresses a pro-inflammatory phenotype in monocytes and determines endothelial function and arterial hypertension in mice and humans.</a> Eur Heart J. 36, 3437-3446 (2015).</li><li>Pawelski, H., Lang, D., Reuter, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+monocytes+and+platelets:+implication+for+life.">Interactions of monocytes and platelets: implication for life.</a> Front Biosci (Schol Ed). 6, 75-91 (2014).</li><li>Hinsbergh, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelium--role+in+regulation+of+coagulation+and+inflammation.">Endothelium--role in regulation of coagulation and inflammation.</a> Semin Immunopathol. 34, 93-106 (2012).</li><li>Njock, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+suppress+monocyte+activation+through+secretion+of+extracellular+vesicles+containing+antiinflammatory+microRNAs.">Endothelial cells suppress monocyte activation through secretion of extracellular vesicles containing antiinflammatory microRNAs.</a> Blood. 125, 3202-3212 (2015).</li><li>Colognato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+and+regulation+of+protease-activated+receptors+in+human+peripheral+monocytes+and+monocyte-derived+antigen-presenting+cells.">Differential expression and regulation of protease-activated receptors in human peripheral monocytes and monocyte-derived antigen-presenting cells.</a> Blood. 102, 2645-2652 (2003).</li><li>Schaffner, A., Rhyn, P., Schoedon, G., Schaer, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+expression+of+platelet+factor+4+in+human+monocytes--role+of+PARs+as+a+quantitatively+important+monocyte+activation+pathway.">Regulated expression of platelet factor 4 in human monocytes--role of PARs as a quantitatively important monocyte activation pathway.</a> J Leukoc Biol. 78, 202-209 (2005).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li><li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+Angiotensin+II+Infusion+using+Osmotic+Pumps+Induces+Aortic+Aneurysms+in+Mice.">Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice.</a> J Vis Exp. , (2015).</li><li>Koh, T. J., DiPietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+wound+healing:+the+role+of+the+macrophage.">Inflammation and wound healing: the role of the macrophage.</a> Expert Rev Mol Med. 13, e23 (2011).</li><li>Dargaud, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proposal+for+standardized+preanalytical+and+analytical+conditions+for+measuring+thrombin+generation+in+hemophilia:+communication+from+the+SSC+of+the+ISTH.">Proposal for standardized preanalytical and analytical conditions for measuring thrombin generation in hemophilia: communication from the SSC of the ISTH.</a> J Thromb Haemost. , (2017).</li></ol>

저자 공개할 게 없다

LysM+ monocytes 이전 고혈압5의 개발에 연루를 표시 했다. 여기 우리가 LysM+ 면역 세포 롤 및 내 피 레이어 AngII 주입에 대 한 응답에서을 보여줍니다. 이 LysMCre+IRG+ 를 사용 하 여 얻은 acridine 오렌지6,10의 주입으로 백혈구를 시각화 하 여 비보에 고혈압에 면역 세포의 역할을 탐구 하는 우리의 이전 연구에서 생쥐. 따라서, 준수 하는 내 피 세포 유형의 차별 수 없었습니다.
IVM 혈관 연구 그리고 vivo에서 , 맥 관 구조에 직접 셀의 관찰에 대 한 매우 유용한 도구입니다 하지만 고혈압의 염증 성 맥락에서 수술로 삽입 된 카 테 터의 도움으로 염료를 주입의 영향 알 수 없는 남아 있습니다. 카 테 터와 acridine 오렌지의 잠재적 효과 평가 하기 위해 주입 우리 이용 했다 LysMCre++ IRG 쥐. AngII 주입 증가 수 있는 피에 LysM+ 세포의. 경 정 맥에 카 테 터의 삽입 효과 증폭 하 고 더 롤링 하 고 붙는 백혈구 테 임 플 란 트 없이 마우스에 비해 카 테 터와 기구 AngII-주입 마우스에서 발견 되었습니다. 이 이식 조직의 염증 반응의 맥락에서 상처 고혈압18에서 면역 반응으로 오버레이 치유 경 카 테 터 원인의 나타냅니다. 또한, 경 동맥을 경 정 맥의 근접 때문 추가 면역 활성화 수 생겼다 경 정 맥에 영향을 미치는 여. 이 효과 없는 꼬리 정 맥에 직접 주사 되었다 때, 이후 우리 효과 예정 이었습니다 추측할 수 있는 염료에 아닙니다 그러나 카 테 터를 삽입 하는 절차. 우리 여기 실험 동안 vivo에서 프로세스와 방해 하지에 형광 단백질을 표현 하는 유전자 변형 기자 마우스의 중요성을 설명 했다. 또한, 형광 추적기의 꼬리 정 맥 주입 jugular 테 주사 가능한 대안을 수 있습니다.
절차의 하나의 중요 한 단계는 AngII 주입 이다. 혈압의 꼬리 팔목 평가 펌프 AngII 전달의 효과 제어 하기 위해 만들 수 있습니다. 주입의 2−3 일 후 혈압 증가 한다. 제한 하려면 LysM+ 세포 활성화에 영향을 미칠 수 있는 염증, 펌프는 이식 절 개의 폐쇄 클립 대신 봉합 여야 한다. 꼬리 정 맥 주입에 대 한 한 가지 한계를 지적 한다: 각 경 최고의 가능한 데이터 수집을 하려면 4 동영상 촬영 일반적으로. 형광 신호 감소, acridine 오렌지의 50 µ L 주입 하지만 꼬리 주사로 더 어렵습니다 여러 주사는 년 현미경 목표 아래 안정적으로 유지 하 고. 경 정 맥에 카 테 터의 존재의 기간 때문에 혈소판이 풍부한 혈장 카 테 테 르 주입19후 4 h 준비에 응고 활성화에 영향을 미치는 면역 세포 활성화를 조절 또한 수도 있습니다. 카 테 테 르 주입의이 부분 추가 조사가 필요합니다.
마지막으로, 우리가 감사 jugular 카 테 테 르 주입 AngII 주입 후 LysM+ 세포 활성화에 미치는 영향, 경우에 우리 수 없습니다 완전히 견적 준비, 피부 제거, 및 잠재적인 LysM+ 셀에 경 격리의 역할 활성화입니다. 우리는 그 형광 기자 마우스를 사용 하 여 같은 결론 LysMCre++ IRG 마우스 vivo에서 화상 진 찰에 대 한 동물 준비 중 선박 무결성의 혼란을 피하기 위해 좋습니다.

동맥 고혈압 심혈 관 질환과 죽음의 위험을 증가 하 고 동맥 경화 증, 관상 동맥 심장 병 및 동맥 또는 정 맥 thromboembolisms1의 개발을 촉진. 고혈압의 개발 환경, 유전, 내 분 비과 hemodynamic 요인의 상호 작용에 따라 달라 집니다. 현재, 면역과 관련 된 염증 고혈압2의 병 인에 중요 한 역할을 감사 합니다.
면역 세포 중 T 림프 톨, monocytes 그리고 대 식 세포는 AngII 유도 혈관 염증과 고혈압, 반응성 산소 종3하 그들의 능력에 관련 부분에 원인이 되 관련 된 것을 발견 했다. 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 결핍 마우스 혈압 증가 및 혈관 염증4AngII 감소 반응을 보였다. 이전 작품에서 우리는 LysM + monocytes 드라이브 AngII 유발 고혈압5에 염증과 혈관 장애는 표시할 수 있습니다. 더 최근에, 우리는 새로운 통로 응고에 요소 사이 협력 혈소판 및 트 롬 빈-종속 혈관 염증6유도 하 혈관 벽 설명. 고혈압에 면역 시스템의 역할에 대 한 현재의 지식은 요약 최근 되었고 로드 리 게 스-Iturbe 외의 검토. 7
때문에 고혈압의 개발에 면역 세포의 관련 되었다 분명, 모델 및 선박 및 면역 세포 간의 상호 작용을 공부 하는 기술을 필요한 되었다. 혈관의 Epifluorescence IVM vivo에서 순환 하는 혈액 세포와 내 피8,,910간의 상호작용을 관찰 하는 유용한 도구입니다. 이 기술로 염료 (acridine orange) 같은 dna intercalating의 주입 nucleated 세포 순환 뿐만 아니라 (endothelium에서)을 시각화할 수 있습니다. Ex vivo rhodamin-6 G와 격리 된 혈소판 스테인드 또는 dichlorofluorescein (DCF) 동맥 또는 정 맥 손상 모델에서 혈소판이 풍부한 혈전을 시각화를 주입 할 수 있습니다.
경 정 맥 카 테 터를 추적기를 삽입 하는 데 사용 하 또는 표시 하는 일반적으로, 혈소판. Endothelium의 변경 및 응고 캐스케이드의 후속 활성화 모두 monocyte 활성화에 효과를 알려져 있습니다. 내 피 부상 즉시 이끌어 낸다 혈소판 활성화 subendothelial 매트릭스 분자를 통해 이어지는 monocyte 매력 및 활성화11조직 인감. 그와 반대로, 그대로 피는 항 응 혈 약 속성 (예를 들어, 직물 요인 통로 억제 물 또는 thrombomodulin)12 과 직접 금지 monocyte, 예를 들면,의 분 비를 통해에 알려져 microRNAs13를 포함 하는 extracellular 소포. Monocytes 조직 요인, 특급 프로 테아 제-활성화 수용 체 (동위) 트 롬 빈에 의해 활성화 될 수 있다 monocyte 활성화14,15에에서 참여 하 고 응고 캐스케이드의 외부 활성 제를 생산 알려져 있습니다. . 따라서, 어떤 활성화 혈소판 또는 응고 캐스케이드 혈관 부상으로 인해 있을 수 있습니다 monocyte 활성화에 대 한 예기치 않은 효과 관찰된 현상 방해. IRG 유전자 변형 LysM Cre 유전자 변형 생쥐, 더블-형광 Cre 기자 마우스 (LysMCre+IRG+)의 도움으로, 우리는 LysM+ 에 카 테 터와 대안 방법으로 주사의 효과 자세히 연구 제안 동맥 고혈압16의 마우스 모델에서 myelomonocytic 셀.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td>Ratiopharm GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidine</td>
			<td>Pfizer Deutschland GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl</td>
			<td>Janssen-Cilag GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Anesthesia mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alzane</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>Antisedan mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flumazenil</td>
			<td>Hikma pharma</td>
			<td></td>
			<td>Antisedan mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Braunol</td>
			<td>B Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octeniderm</td>
			<td>Sch&#252;lke</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmotic pumps</td>
			<td>Alzet</td>
			<td>1007D</td>
			<td>Osmotic pump implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angiotensin II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Osmotic pump implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-0 prolene suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td></td>
			<td>Osmotic pump implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acridine orange</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catheter</td>
			<td>Smiths Medical Deutschland GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Inside diameter, 0.28 mm; outer diameter, 0.61 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX51WI fluorescence microscope</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beam Splitter</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>CMR-DV2-SYS - DualView2 MicroImager</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UMPLFLN10X</td>
			<td>Water immersion objective with a monochromator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td>ORCA-R2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition and analysis software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Realtime Imaging System eXcellence RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Jax 008705</td>
			<td>B6.Cg-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>Jax 004781</td>
			<td>LysM Cre (B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J )</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing leukocyte rolling and adhesion in angiotensin ii-infused mice: techniques and pitfalls

혈관의 Epifluorescence intravital 비디오 현미경 (IVM) 면역 세포의 활성화 및 역할에 그들의 능력을 평가 하 고 내 피 층에 고착 하는 설정된 방법입니다. 형광 염료의 fluorophore 결합 항 체를 주입 하 여 세포를 순환의 일반적으로 사용 됩니다. 또는, 형광 기자 마우스 사용할 수 있습니다. + (LysM+) 특정 lysozyme M에서에서 백혈구의 상호작용 monocytes, 혈관 벽과 혈관 장애 및 동맥 고혈압에 중추적인 역할. 우리는 여기 시각화 하 고 압 연 하는 백혈구 및 접착 angiotensin II (AngII)에 있는 경 동맥에서 계량 기법 제시-IVM에 의해 쥐에서 고혈압을 유발.
카 테 터의 이식 혈관 벽을 손상 하 고 바꾸 인된 혈액 세포 응답에 연결 됩니다. 우리 다른 주입 기술 및 LysMCre++ IRG에서에서 백혈구를 시각화 하기 위해 관리 경로 비교 붉은 형광 단백질의 광범위 한 표현 및 LysM에 있는 녹색 형광 단백질의 조건식 마우스 + 세포. LysM+ 세포 활성화, 연구를 사용 하는 AngII 마우스 주입 압 연 및 접착 endothelium에 백혈구의 증가. 우리 역시 acridine 오렌지는 경을 사용 하 여 카 테 터를 주입 또는 직접 꼬리 정 맥 하 고 비교의 양을 압 연 및 준수 세포. 우리는 jugular 카 테 테 르 주입 당 회전의 수를 증가에 붙는 LysM+ 세포 가짜 주입 LysMCre++ IRG 마우스 컨트롤에 비해 발견. 이 활성화는 AngII 주입 마우스에서 증강 되었다. 흥미롭게도, acridine 오렌지 직접 꼬리를 통해 정 맥 증가 하지 않았다 LysM+ 세포 접착을 주입 또는 가짜 주입 마우스에서 압 연. 우리는 그로 인하여 실험 동안 vivo에서 프로세스와 방해 하지에 형광 단백질을 표현 하는 유전자 변형 기자 마우스의 중요성을 설명 했다. 또한, 형광 추적기의 꼬리 정 맥 주입 jugular 테 주사 가능한 대안을 수 있습니다.

년 LysMCre++ IRG의 쥐 AngII 주입 IVM를 사용 하 여 관찰 했다. Acridine 오렌지 jugular 카 테 터를 사용 하 여 주입 했다. 우리가 모든 nucleated 순환 세포 (배와 상호 작용 하는 셀 형식의 차별 남아 오픈 이후 선박 상호 작용 또한 수에 비해 혈관 벽 접촉 LysM+ 세포의 비율을 보면 목적 우리의 이전 작품에서 질문)입니다. 기준선에 jugular 카 테 터의 존재는 LysM+ 세포 (그림 2A, D)의 접착을 발생합니다. 오렌지 acridine 주입 후 동일한 세포 형광, 되었지만 또한 내 피 세포 형광 (그림 2B, E). 내 피를 제한 하려면 배경 감소 관련 형광, 후 데이터 나타냅니다 모든 nucleated 고집 셀 LysM+ (그림 2C, F); 이러한 결과 우리의 이전 결과 확인 하 고 LysMCre++ IRG는 LysM+ 세포 활성화에 AngII의 효과 관찰 하기 좋은 모델을 보여주는 AngII 주입 후 사실 만요.
우리 평가 acridine LysM+ AngII LysMCre++IRG에에서 주입 후 세포 활성화에 오렌지의 관리 노선의 역할. AngII 주입, 백혈구 endothelium 상호 작용의 1 주 후 LysMCre++ IRG의 경 동맥에 마우스 몇 군데 있었고 jugular 카 테 터를 통해 또는 꼬리 정 맥을 통해 오렌지 acridine 주입 없이 IVM에 의해 시각. 카 테 터 나 주입, 없이 LysM+ 세포의 롤링 크게 증가 되었다 AngII 주입 치료 쥐 및 접착에 비해 증가 (그림 3)를 보여준 후. Acridine jugular 테 증가 접착 및 AngII에서 오렌지의 주사 카 테 터 (그림 3) 없이 쥐와 비교 된 더 큰 정도로 쥐 취급. 과 비슷한 접착 acridine 꼬리 정 맥에 주황색의 사출 리드 acridine 오렌지 (그림 3)의 주입에는 영향을 받지 않은 쥐에 비해 압 연.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig1.jpg"> 
그림 1입니다. Angiotensin II 주입 및 LysM+ 의 평가 제도 압 연 및 쥐에 접착 세포. LysMCre++ IRG 마우스 AngII 7 일 주입 했다 하 고는 년 동안 셀 acridine jugular 카 테 터를 통해 또는 꼬리 정 맥에 의해 오렌지의 주입 없이 계량 했다 준수로 LysM+ 압 연 사출입니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56948/56948fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig2.jpg"> 
그림 2입니다. LysM+ 세포 접착 및 IRG+ 마우스 LysMCre+의 경 동맥에서 압 연의 평가. 접착의 LysM+ LysMCre+(A, D) 전에 IRG+ 마우스 세포 (B, E) acridine 주입 jugular 카 테 터를 통해 후. 빨간색과 녹색 형광 기록 했다, (녹색)에서 LysM+ 세포 및 평활 근 세포 (빨간색)으로 표시 했다. Acridine 오렌지의 주입, 후 내 피 세포도 그린에서 볼 수 있지만 셀 시각화 (C, F) nucleated만 순환 수 배경 형광을 제거. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56948/56948fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig3.jpg"> 
그림 3입니다. Angiotensin II에에서 형광 염료의 관리 노선 평가 LysMCre+IRG+ 쥐를 주입. 압 연 (A)와 (B) LysM+ 준수의 정량화 세포 가짜 운영 또는 AngII 생긴 동물 및 또는 없이 acridine 오렌지 jugular 카 테 터를 사용 하 여 또는 꼬리 정 맥 주입 하 여 주입. 다른 조건 (C)의 대표 사진. 결과 평균 ± 표준 오차의 의미. 2-방법은 ANOVA 수행한 Bonferroni의 임시 게시물 테스트, n = 3-12/그룹; p &#60; 0.05. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56948/56948fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

이 원고 설명 기자 유전자 변형 마우스의 사용 및 다른 관리 경로 angiotensin II 유발 고혈압 면역 세포의 활성화를 평가 하기 위해 혈관의 intravital 비디오 현미경을 사용 하 여 형광 염료의 그들의 롤 및 endothelium에 고착 하는 능력.

백혈구 롤링 Angiotensin II-주입 마우스에서 접착 시각화: 기술 및 함정

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...

visualizing-leukocyte-rolling-adhesion-angiotensin-ii-infused-mice

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.6K 조회수.  University Medical Center Mainz. 이 원고 설명 기자 유전자 변형 마우스의 사용 및 다른 관리 경로 angiotensin II 유발 고혈압 면역 세포의 활성화를 평가 하기 위해 혈관의 intravital 비디오 현미경을 사용 하 여 형광 염료의 그들의 롤 및 endothelium에 고착 하는 능력.

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Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

백혈구 호밍 및 마이 그 레이션의 비침습 영상 생체내에</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

연구

면역학 및 감염병학

Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection. ATSs are derived from cDNA clones of mosquito-borne RNA viruses (genus Alphavirus; family Togaviridae). The Alphavirus genus contains about 30 different mosquito-borne virus species. Alphaviruses are enveloped viruses and contain single-stranded RNA genomes (~11.7 Kb). Alphaviruses transcribe a subgenomic mRNA that encodes the structural proteins of the virus required for encapsidation of the genome and maturation of the virus. Alphaviruses are usually highly lytic in vertebrate cells, but persistently infect susceptible mosquito cells with minimal cytopathology. These attributes make them excellent tools for gene expression in mosquito vectors. The most common ATSs in use are derived from Sindbis virus (SINV). The broad species tropism of SINV allows for infection of insect, avian, and mammalian cells8. However, ATSs have been derived from other alphaviruses as well9,10,20. Foreign gene expression is made possible by the insertion of an additional viral subgenomic RNA initiation site or promoter. ATSs in which an exogenous gene sequence is positioned 5' to the viral structural genes is used for stable protein expression in insects. ATSs, in which a gene sequence is positioned 3' to the structural genes, is used to trigger RNAi and silence expression of that gene in the insect.
ATSs have proven to be valuable tools for understanding vector-pathogen interactions, molecular details of viral replication and maintenance infectious cycles3,4,11,19,21. In particular, the expression of fluorescent and bioluminescent reporters has been instrumental tracking the viral infection in the vector and virus transmission5,14-16,18. Additionally, the vector immune response has been described using two strains of SINV engineered to express GFP2,9.
Here, we present a method for the production of SINV containing a fluorescent reporter (GFP) from the cDNA infectious clone. Infectious, full-length RNA is transcribed from the linearized cDNA clone. Infectious RNA is introduced into permissive target cells by electroporation. Transfected cells generate infectious virus particles expressing the GOI. Harvested virus is used to infect mosquitoes, as described here, or other host species (not shown herein). Vector competence is assessed by detecting fluorescence outside the midgut or by monitoring virus transmission7. Use of a fluorescent reporter as the GOI allows for convenient estimation of virus spread throughout a cell culture, for determination of rate of infection, dissemination in exposed mosquitoes, virus transmission from the mosquito and provides a rapid gauge of vector competence.

Methods for using alphavirus transducing systems to express fluorescent reporters in vitro and in adult mosquitoes are described. This technique may be adapted to express any protein of interest in lieu of or in addition to a reporter.

Alphavirus Transducing 시스템 : 모기 벡터의 감염을 떠올리을위한 도구

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection.  ATSs are derived from cDNA clones of ...

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

포유류의 상피 세포에 박테리아의 접착 시험 관내 분석

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that influence this interaction could lead to improved understanding of disease pathogenesis and thus influence vaccine or therapeutic design. Hence, the development 
of methods to probe this interaction would be useful. Recent advancements in fluorophores development1-3 and imaging technology4 can be exploited to 
improve our current knowledge on dengue pathogenesis and thus pave the way to reduce the millions of dengue infections occurring annually.

The enveloped dengue virus has an external scaffold consisting of 90 envelope glycoprotein (E) dimers protecting the nucleocapsid shell, 
which contains a single positive strand RNA genome5. The identical protein subunits on the virus surface can thus be labeled with an amine reactive dye and visualized 
through immunofluorescent microscopy. Here, we present a simple method of labeling of dengue virus with Alexa Fluor succinimidyl ester dye dissolved directly in a sodium 
bicarbonate buffer that yielded highly viable virus after labeling. There is no standardized procedure for the labeling of live virus and existing manufacturer&#x2019;s protocol 
for protein labeling usually requires the reconstitution of dye in dimethyl sulfoxide. The presence of dimethyl sulfoxide, even in minute quantities, can block 
productive infection of virus and also induce cell cytotoxicity6. The exclusion of the use of dimethyl sulfoxide in this protocol thus reduced this possibility. 
Alexa Fluor dyes have superior photostability and are less pH-sensitive than the common dyes, such as fluorescein and rhodamine2, making them ideal for 
studies on cellular uptake and endosomal transport of the virus. The conjugation of Alexa Fluor dye did not affect the recognition of labeled dengue 
virus by virus-specific antibody and its putative receptors in host cells7. This method could have useful applications in virological studies.

Taking advantage of the advancements in fluorophore development and imaging technology, a simple method of Alexa Fluor labeling of dengue virus was devised to visualize the early interactions between virus and cell.

알렉사 플루어 라벨링을 통해 뎅그열 바이러스를 떠올리

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. In the vasculature hypertension is associated with endothelial dysfunction and increased inflammation leading to atherosclerosis and various disease states such as chronic kidney disease2, stroke3 and heart failure4. An initial step in vascular inflammation leading to atherogenesis is the adhesion cascade which involves the rolling, tethering, adherence and subsequent transmigration of leukocytes through the endothelium. Recruitment and accumulation of leukocytes to the endothelium is mediated by an upregulation of adhesion molecules such as vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intracellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) and E-selectin as well as increases in cytokine and chemokine release and an upregulation of reactive oxygen species5. In vitro methods such as static adhesion assays help to determine mechanisms involved in cell-to-cell adhesion as well as the analysis of cell adhesion molecules. Methods employed in previous in vitro studies have demonstrated that acute increases in pressure on the endothelium can lead to monocyte adhesion, an upregulation of adhesion molecules and inflammatory markers6 however, similar to many in vitro assays, these findings have not been performed in real time under physiological flow conditions, nor with whole blood. Therefore, in vivo assays are increasingly utilised in animal models to demonstrate vascular inflammation and plaque development. Intravital microscopy is now widely used to assess leukocyte adhesion, rolling, migration and transmigration7-9. When combining the effects of pressure on leukocyte to endothelial adhesion the in vivo studies are less extensive. One such study examines the real time effects of flow and shear on arterial growth and remodelling but inflammatory markers were only assessed via immunohistochemistry10. Here we present a model for recording leukocyte adhesion in real time in intact pressurised blood vessels using whole blood perfusion. The methodology is a modification of an ex vivo vessel chamber perfusion model9 which enables real-time analysis of leukocyte -endothelial adhesive interactions in intact vessels. Our modification enables the manipulation of the intraluminal pressure up to 200 mmHg allowing for study not only under physiological flow conditions but also pressure conditions. While pressure myography systems have been previously demonstrated to observe vessel wall and lumen diameter11 as well as vessel contraction this is the first time demonstrating leukocyte-endothelial interactions in real time. Here we demonstrate the technique using carotid arteries harvested from rats and cannulated to a custom-made flow chamber coupled to a fluorescent microscope. The vessel chamber is equipped with a large bottom coverglass allowing a large diameter objective lens with short working distance to image the vessel. Furthermore, selected agonist and/or antagonists can be utilized to further investigate the mechanisms controlling cell adhesion. Advantages of this method over intravital microscopy include no involvement of invasive surgery and therefore a higher throughput can be obtained. This method also enables the use of localised inhibitor treatment to the desired vessel whereas intravital only enables systemic inhibitor treatment.

This is a method to visualise leukocyte adhesion to the endothelium in harvested pressurised vessels. The technique enables studying vascular adhesion under shear flow with differing intraluminal pressures up to 200 mmHg thus mimic-ing the pathophysiological conditions of high blood pressure.

하이 Intraluminal 압력에서 혈관 내피에 이미징 백혈구의 접착

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

정량<em&gt; 체외</em정적 조건에서 활성화 된 기본 인간의 미세 혈관 내피 세포에 호중구 부착을 측정하는&gt; 분석

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

마우스의 Mesenterial 혈관에서의 생체 내에 현미경 백혈구 - 내피 세포와 혈소판 - 백혈구 상호 작용

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

T 림프구 - 접착 분자 상호 작용의 연구에 대한 접착에서 전단 응력의 분석

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on the hypotonic lysis of erythrocytes and can be applied to human samples as well as to blood of non-human origin. The small initial sample volume of about 50 to 100 &#181;l makes this method applicable to recurrent blood sampling from small laboratory animals. Moreover, leukocyte enrichment is achieved within minutes and with low material efforts regarding chemicals and instrumentation, making this method applicable in multiple laboratory environments.
Standardized purification of leukocytes is combined with a highly selective staining method to evaluate halogenating peroxidase activity of the heme peroxidases, myeloperoxidase (MPO) and eosinophil peroxidase (EPO), i.e., the formation of hypochlorous and hypobromous acid (HOCl and HOBr). While MPO is strongly expressed in neutrophils, the most abundant immune cell type in human blood as well as in monocytes, the related enzyme EPO is exclusively expressed in eosinophils. The halogenating activity of these enzymes is addressed by using the almost HOCl- and HOBr-specific dye aminophenyl fluorescein (APF) and the primary peroxidase substrate hydrogen peroxide. Upon subsequent flow cytometry analysis all peroxidase-positive cells (neutrophils, monocytes, eosinophils) are distinguishable and their halogenating peroxidase activity can be quantified. Since APF staining may be combined with the application of cell surface markers, this protocol can be extended to specifically address leukocyte sub-fractions. The method is applicable to detect HOCl and HOBr production both in human and in rodent leukocytes.
Given the widely and diversely discussed immunological role of these enzymatic products in chronic inflammatory diseases, this protocol may contribute to a better understanding of the immunological relevance of leukocyte-derived heme peroxidases.

This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.

백혈구가 풍부한 혈액 샘플의 할로겐 퍼 옥시 다제 활동의 신속하고 구체적인 평가

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...