עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של ארנסט und ברטה Grimmke Stiftung ואת בווריה Ophthalmologische דויטשה (הכלב).

ההליכים ניסיוני של מחקר זה אושרו על ידי החיה טיפול הוועדה של ריינלנד-פאלץ, גרמניה. טיפול בבעלי חיים תאמו המוסדיים הנחיות ואת האגודה למחקר בהצהרת חזון, רפואת עיניים (ארוו) לשימוש בבעלי אופטלמולוגיות ומחקר חזון. חיות טופלו בהתאם להנחיית האיחוד האירופי 2010/63/האיחוד האירופי לניסויים בבעלי חיים. זכר C57BL/6J עכברים (מעבדה ג'קסון, בר הרבור, לי, ארה ב) בגילאי 3-4 חודשים שימשו את הניסויים. בעלי חיים שוכנו בתנאים סטנדרטיים (טמפרטורה 23 ± 2 ° C, לחות טווח 55 ± 10% ו- 12 h מחזורים/כהה), הייתה גישה העכבר הסטנדרטי צ'או ומים ad libitum.
1. בידוד של רשתית העכבר
<ol><li>למקם את לנתיחה על השולחן הכנה ולבדוק אם כל המכשירים הם להשלים כדי לאפשר הכנה מהירה.</li>
	<li>להקריב את העכבר באמצעות אינהלציה2 CO.</li>
	<li>לערוף את העכבר עם מספריים פלדה, לחתוך את הגולגולת sagitally לשני חצאים באמצעות אותו זוג מספריים ולהסיר את העור ואת המוח באמצעות העין מספריים (איור 1).</li>
	<li>לחתוך עצם הגולגולת להשאיר רק את העצם מסלולית באמצעות מספריים העין.</li>
	<li>להעביר את מסלולו לתוך תבשיל לנתיחה המכיל מאגר קרבס-Henseleit קר כקרח.</li>
	<li>לשמור את המנה לנתיחה על קרח או לשנות את מאגר כל 10 דקות.</li>
	<li>לחתוך את העצם מסלולית באמצעות מספריים העין ולהסיר בעדינות את הגלובוס עין יחד עם הרקמה מסלולית באמצעות סוג 4 דיוק פינצטה ומספריים האביב סטודנט Vannas (איור 2).</li>
	<li>הסר בעדינות את בלוטת Harderian, רקמת השרירים extraocular באמצעות סוג 5 דיוק פינצטה ומספריים capsulotomy Vannas, דואג שלא יגרמו נזק הסניף הראשי של העורק אופטלמולוגיות.</li>
	<li>מאתרים ומפסיקים מסלולית ענפי עורק אופטלמולוגיות ובסופו של דבר הסוף הפרוקסימלית של הסניף הראשי של העורק אופטלמולוגיות בעזרת תפרים ניילון 10-0 (איור 3).</li>
	<li>העברת הגלובוס העין לתוך צלחת פטרי המכיל אתנול 70% עבור שימוש s 10 מסוג 4 דיוק פינצטה. מקום העולם העין בחזרה לתוך המנה לנתיחה והחלף את המאגר פתרון קרבס טריים. הקרנית יופיעו לבנבן לאחר חשיפה אתנול.</li>
	<li>לנקב את הקרנית היקפי עם מחט מד 30 ומנתחים את הקרנית באמצעות מספריים capsulotomy Vannas. בעדינות לחתוך את רקמת הקשתית, מקום אחד בחוד של המספריים capsulotomy Vannas בין הרשתית דמית העין ולנתק את דמית העין ואת sclera. להשאיר קצת הרקמה scleral סביב עצב הראייה (איור 4).</li>
</ol>2. הרכבה הרשתית בבית הבליעה זלוף
הערה: תא זלוף המשמש עבור ניסויים arteriole ברשתית הוא תוצרת בית. זה מורכב של מאגר שקוף עם צינור-בו יצוא (איור 5). קצה אחד של צינור סיליקון מודבק לתחתית התא עם דבק histoacryl ואת הקצה השני מחובר של צימוד-כיוונית. התחבר המזרק המכיל מאגר קרבס טריים צימוד-כיוונית, ממלאים את הצינור עם מאגר.
<ol><li>קח micropipette זכוכית עם בעל מחט ודחף לתוך בסוף הצינור בתחתית תא זלוף. אז שבור את הקצה של micropipette במספריים type 4 כדי לקבל טיפ של 100 מיקרומטר קוטר.</li>
	<li>פוקוס על קצה micropipette, לשטוף את זה דרך המזרק מחובר הצינור. תשמרי נימי הוא לא occluded על ידי פסולת. במקרה של סגר, להסיר אותו, לשטוף את הצנרור ולהוסיף עוד micropipette.</li>
	<li>למלא את התא זלוף מאגר קרבס קר ולשים את התא תחת מיקרוסקופ סטריאו.</li>
	<li>המקום פלטפורמה פלסטיק שקוף אל החדר זלוף. פלטפורמה זו יש ההזחה של 1.8 מ"מ רוחב עצב הראייה, העורק אופטלמולוגית והיא מושם על שני חוטי פלדה של 1.6 מ"מ קוטר. אז, במקום טבעת מפלדת של 2.8 מ"מ קוטר פנימי ו- 4.0 מ"מ הקוטר החיצוני על הפלטפורמה.</li>
	<li>העברה הרשתית עם עצב הראייה, עורק אופטלמולוגיות המצורפת מן החדר ניתוח אל החדר זלוף בזהירות מרבית, באמצעות כף. השלב זה חשוב למנוע את הפוטנציאל מתיחה של הרקמות כפי שהוא יכול להיות מזיק הניסוי.</li>
	<li>לחתוך את החלק sutured של סוף הפרוקסימלית של העורק אופטלמולוגיות להציב שתי לולאות preformed של 10-0 תפר ניילון על גבי micropipette, נקרר את העורק אופטלמולוגיות עם micropipette. לקשור את העורק micropipette (איור 6) ומניחים על הרשתית על הפלטפורמה שקוף באמצעות פיין-נקודת-פינצטה.</li>
	<li>בעדינות כשהבנו את capsula עדשה קדמית עם שני הצבע בסדר פינצטה להוציא את העדשה, לחתוך את capsula העדשה כל שימוש microscissors.</li>
	<li>לאחר מכן, להכין ארבעה חתכים רדיאליים לתוך הרשתית חצי המרחק pars plana עצב הראייה ולמקם טבעת מפלדת על הרשתית כדי לתקן את זה לעומק. הרשתית עכשיו הוא מוכן לניסוי (איור 7).</li>
</ol>3. הכנה של רבים ברשתית לניסוי.
<ol><li>מקם את התא זלוף תחת מיקרוסקופ אור. המטרה היא עדשה המטרה 100 X טבילה במים.</li>
	<li>לחבר את שני tubings עבור - ו -out - flow משאבה pericyclic, הפיצו את התא באמצעות מאגר קרבס חמצן ב- 95% O2 ו מוגז עם 5% CO2 ב 37 º C. השתמש בקצב הזרימה בין 100 ל 120 מ לדקה.</li>
	<li>להתחבר ברכבת התחתית סיליקון, אשר מחובר של micropipette, מאגר סיליקון צינור דרך צימוד-כיוונית. לאחר מכן, מילוי המאגר עם מאגר קרבס לגובה המתאים ל-50 מ מ כספית אבל אל תפתח את צימוד-כיוונית עדיין.</li>
	<li>להסתכל דרך המטרות של מיקרוסקופ, להתמקד על פני הרשתית. לחפש כלי דם או כדוריות דם אדומות. זה אפשרי כי כלי הדם לחלוטין מכווצים, אז לפעמים רק שקצת כדוריות דם אדומות גלויים.</li>
	<li>כאשר כלי דם, להתמקד בו ופתח את צימוד-כיוונית. הקוטר של הכלי צריך להגדיל באופן מיידי, כדוריות דם אדומות לזוז גם centrifugally, אם זה arteriole, או centripetally במקרה של venule. רבים קטנים בקוטר בהשוואה venules באותו הסדר.</li>
	<li>ברגע נמצא כלי דם עם קיר גלוי. ובכן, זה יכול להיות מועסק לניסויים בעקבות תקופה equilibration של 30 דקות (איור 8). במהלך התקופה equilibration, רבים לפתח הטון מהותי החלשה היחידה וכתוצאה מכך פחות מ-10% של הפחתת קוטר luminal.</li>
</ol>4. ביצוע הניסוי
<ol><li>בדיקת הכדאיות של כלי עם thromboxane מימטי 9,11-dideoxy-9α, 11α-methanoepoxy פרוסטגלנדין F2α (U46619) על-ידי הוספת זה הפתרון אמבט. סוכן זה מכווץ רבים רשתית העכבר על ידי כ-50% מן נח קוטר בריכוזים של ≥ 10-6 מ'.</li>
	<li>פעם אחת כלי הקיבול הוא אישר קיימא, לשטוף אגוניסט מהאמבטיה מאת במחזור המשאבה והענק מאגר קרבס טריים לתוך האמבט.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Toda, N., Nakanishi-Toda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide:+ocular+blood+flow,+glaucoma,+and+diabetic+retinopathy.">Nitric oxide: ocular blood flow, glaucoma, and diabetic retinopathy.</a> Prog Retin Eye Res. 26 (3), 205-238 (2007).</li><li>Schuster, A. K., Fischer, J. E., Vossmerbaeumer, C., Vossmerbaeumer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+coherence+tomography-based+retinal+vessel+analysis+for+the+evaluation+of+hypertensive+vasculopathy.">Optical coherence tomography-based retinal vessel analysis for the evaluation of hypertensive vasculopathy.</a> Acta Ophthalmol. 93 (2), e148-e153 (2015).</li><li>Cherecheanu, A. P., Garhofer, G., Schmidl, D., Werkmeister, R., Schmetterer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocular+perfusion+pressure+and+ocular+blood+flow+in+glaucoma.">Ocular perfusion pressure and ocular blood flow in glaucoma.</a> Curr Opin Pharmacol. 13 (1), 36-42 (2013).</li><li>Faraci, F. M., Sigmund, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+biology+in+genetically+altered+mice+:+smaller+vessels,+bigger+insight.">Vascular biology in genetically altered mice : smaller vessels, bigger insight.</a> Circ Res. 85 (12), 1214-1225 (1999).</li><li>Kornfield, T. E., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Retinal+Blood+Flow+Using+Fluorescently+Labeled+Red+Blood+Cells.">Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells.</a> eNeuro. 2 (2), (2015).</li><li>Guevara-Torres, A., Joseph, A., Schallek, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label+free+measurement+of+retinal+blood+cell+flux,+velocity,+hematocrit+and+capillary+width+in+the+living+mouse+eye.">Label free measurement of retinal blood cell flux, velocity, hematocrit and capillary width in the living mouse eye.</a> Biomed Opt Express. 7 (10), 4229-4249 (2016).</li><li>Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+topography+of+retinal+pericytes+in+the+living+mouse+retina+using+in+vivo+adaptive+optics+imaging+and+ex+vivo+characterization.">Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8237-8250 (2013).</li><li>Gericke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+muscarinic+acetylcholine+receptor+subtype+mediating+cholinergic+vasodilation+in+murine+retinal+arterioles.">Identification of the muscarinic acetylcholine receptor subtype mediating cholinergic vasodilation in murine retinal arterioles.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7479-7484 (2011).</li><li>Gericke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+alpha1-adrenoceptor+subtypes+in+murine+ophthalmic+arteries.">Functional role of alpha1-adrenoceptor subtypes in murine ophthalmic arteries.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4795-4799 (2011).</li><li>Bohmer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha(1)B+-adrenoceptor+subtype+mediates+adrenergic+vasoconstriction+in+mouse+retinal+arterioles+with+damaged+endothelium.">The alpha(1)B -adrenoceptor subtype mediates adrenergic vasoconstriction in mouse retinal arterioles with damaged endothelium.</a> Br J Pharmacol. 171 (16), 3858-3867 (2014).</li></ol>

המחברים יש אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

המדד של תגובות כלי הדם ברשתית העכבר הוא מאתגר בשל גודלו הקטן של כלי הדם ברשתית. עם הטכניקה שהוצגו, רבים ברשתית הם דמיינו ידי מיקרוסקופ אור המשודרת. זה אפשרי, כי הרשתית מבודד הוא שקוף למחצה. היתרון של השיטה הוא אופטי ברזולוציה גבוהה. הרזולוציה המרחבית מחושב הוא px 11/מיקרומטר. אולם, הפתרון האמיתי למערכת אופטית זו, העושה שימוש באור לבן הוא בין 200 עד 300 ננומטר, כפי שמוסבר על ידי הגבול עקיפה אבה. מאז הסניף הראשון של רבים רשתית העכבר יש של קוטר פנימי של 20-30 מיקרומטר, השינויים בקוטר של כ-1% הם לזיהוי במערכת זו. יש צורך של מכשירים טכניים נוספים או צבעי פלורסנט כפי שדווח במחקרים אחרים כדי להמחיש קטנים רבים ברשתית5,6,7. חיסרון של הטכניקה הוא הזמן הכנה ארוכה, אשר בין 90 עד 120 דקות על ידי חוקרים מיומנים. אם הזמן עולה 180 דקות, הפונקציה אנדותל מתחיל להיות הקלוש.
ישנם מספר שלבים קריטיים עיקריים בטכניקה זו. ראשית, חשוב ביסודיות מאתרים ומפסיקים את כל הענפים עורקים retrobulbar. אם מצדו אינו שלם, רבים ברשתית לא להיות מווסתת עקב דליפה. שנית, טבילת אתנול 10 s לפני פתיחת העולם עין חשוב לנטרל את תגובתיות שריר חלק של העורק אופטלמולוגיות. אנחנו הפגינו בעבר את הטבעית 10 s ב- 70% אתנול מבטל לחלוטין את העורק אופטלמולוגיות שריר חלק8. לעומת זאת, רבים ברשתית סביר להניח להיות מושפעים ישירות אתנול, מאז הם מוגנים ע י הקיר bulbar. אם שלב זה מושמט, קוטר שינויים בעורק אופטלמולוגיות עשויים להשפיע על זלוף של הרשתית. ראוי לציין, תגובתיות של העורק אופטלמולוגיות עשויות להשתנות במידה ניכרת מזו של רבים ברשתית בתגובה באותו אגוניסט9,10. שלישית, להימנע פיתול של העורק אופטלמולוגיות. במיוחד בזמן הרכבה ההכנה רשתית על הפלטפורמה, העורק אופטלמולוגיות ייתכן מתעוותים, וכתוצאה מכך סגר של לומן. בנוסף, בדקו בקפידה קצה נימי זכוכית הוא occluded לא להפעיל לחץ רבים ברשתית. אנו ממליצים שלא לבצע עיקולים ריכוז ברציפות-תגובה יותר משלוש בהכנת ברשתית אותו, כי ראינו כי התגובות אצטילכולין הפך חלשים כאשר חוזרים. את עקומות הריכוז-תגובה במשך יותר משלוש פעמים. עם זאת, ייתכנו הבדלים לגבי הדיר של עקומות הריכוז-תגובה בהתאם הסוכן חלה ו, לכן, צריך להיבדק באופן אינדיבידואלי.
והגשנו בקשה סוכנים תרופתי extraluminally במחקרים שלנו, למרות intraluminal זלוף באמצעות משאבה servo בקרה אפשרי גם. מאז הטכניקה מאפשר למדוד מנגנונים המקומי של תגובתיות כלי הדם ברשתית של חיות מעבדה קטנה כולל עכברים וחולדות, ניתן לגשת היתרונות של טכנולוגיית פילוח הגן באמצעות בעלי חיים מהונדסים בשיטה זו .

הפרעות ברשתית זלוף היו מעורבים בפתוגנזה של מחלות עינית שונות, כגון רטינופתיה סוכרתית, יתר לחץ דם רטינופתיה גלאוקומה1,2,3. לכן, מחקרים שמטרתם מדידה תגובתיות כלי הדם ברשתית חשוב להבין הפתופיזיולוגיה של מחלות אלו, לפתח טיפול חדש מתקרב.
בשל האפשרות של מניפולציה ג'ין הגנום מאתר, העכבר הפך מודל בעלי חיים בשימוש נרחב למחקרים של מערכת הלב וכלי דם4. עם זאת, בשל גודלו הקטן של כלי הדם ברשתית (≤ 30 מיקרומטר), מדידה של תגובתיות כלי הדם ברשתית העכבר הוא מאתגר. לדוגמה, טכניקות stereomicroscopic ויוו למדידה בו רזולוציה אופטית שלהם מוגבלים, לכן אפשר רק בדיוק לזהות שינויים בזרימת קוטר או דם בדם קטן של פחות מקוטר 30 מיקרומטר ≤ כאשר היא מצוידת נוספים התקנים מתוחכמים, כגון מיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות צבעי פלורסנט או אופטיקה אדפטיבית סריקה Ophthalmoscope אור5,6. יתר על כן, הפרשנות של ויוו מדידות שמטרתם זיהוי מקומי איתות מנגנונים בכלי הדם ברשתית יכולה להיות מבולבל על ידי הרדמה, משתנה לחץ דם סיסטמי, ההשפעה של כלי הדם retrobulbar.
לכן, פיתחנו שיטה למדידת תגובות של כלי הדם ברשתית עכבר עם רזולוציה אופטית גבוהה ex-vivo. הטכניקה שהוצגו במסמך זה מאפשר הדמיה של רבים ברשתית ויה ששודרו מיקרוסקופ אור. שיטה זו, אשר יכול לשמש גם בחולדות, מספקת גישה היתרונות של גן מיקוד הטכנולוגיה במחקר וסקולרית עינית.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Steel Scissors</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3576.1</td>
			<td>1x 140 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye Scissors</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-19390</td>
			<td>1x straight, 10.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers, straight with fine tips</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>LH68.1</td>
			<td>2x type 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers, straight with extra fine tips</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>LH53.1</td>
			<td>2x type 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas capsulotomy scissors</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>19760</td>
			<td>1x straight, 77 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91501-09</td>
			<td>1x curved,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barraquer Needle Holder</td>
			<td>Geuder</td>
			<td>G-17500</td>
			<td>1x curved, 120 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>305128</td>
			<td>1x 30 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillaries (for producing micropipettes)</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>9-000-1211</td>
			<td>1x (1.2 x 0.8 mm; outer/inner diameter)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Suture</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>198001</td>
			<td>1x 10-0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon cell culture dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>153066</td>
			<td>1x 35 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon cell culture dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>172931</td>
			<td>1x 100 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discofix C</td>
			<td>Braun</td>
			<td>16500C</td>
			<td>10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histoacryl adhesive</td>
			<td>B. Braun Surgical, S.A.</td>
			<td>1050052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pericyclic pump&#160; (CYCLO II)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>EP76.1</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical Pipette Puller Model 700C</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td></td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope (Vanox-T AH-2)</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water immersion objective LUMPlanFL, 1.0 NA</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital camera (TK-C1381)</td>
			<td>JVC</td>
			<td></td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion chamber</td>
			<td>self-made</td>
			<td></td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drugs and Solutions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>K928.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>5239.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kalium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>3904.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulphate (MgSO4)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>261.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>9265.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>0965.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-(D)-(+)- Glucose monohydrate</td>
			<td>Carl Roth GmbH</td>
			<td>6780.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9,11-dideoxy-9&#945;,11&#945;-methanoepoxy prostaglandin F2&#945; (U-46619)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>16450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylcholine chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6625-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation steps for measurement of reactivity in mouse retinal arterioles ex vivo

. אי ספיקת שינויים זלוף ברשתית נורמלי הם בין הגורמים העיקריים בפתוגנזה של סכנת הראייה עינית מחלות שונות, כגון רטינופתיה סוכרתית, רטינופתיה יתר לחץ דם, ואולי גלאוקומה. לכן, ההכנות microvascular ברשתית הם כלים מרכזי עבור מחקרים פיזיולוגיים תרופתי על המנגנונים הקשורים pathophysiological כבסיס לעיצוב טיפולים עבור המחלות. למרות השימוש בעכבר מודלים במחקר אופטלמולוגיות רחב, מחקרים על תגובתיות כלי הדם ברשתית נדירים של מין זה. הסיבה הראשית לסתירה הזו היא ההליכים בידוד מאתגר בשל גודלו הקטן של אלו כלי דם ברשתית, אשר ~ ≤ 30 מיקרומטר בקוטר luminal. כדי לעקוף את הבעיה של בידוד ישיר של אלה microvessels ברשתית ללימודי פונקציונלי, הקמנו שיטת בידוד והכנות המאפשרת שמחוץ מחקרים של vasoactivity רשתית העכבר בתנאים ליד-פיזיולוגיים . למרות ההכנות ניסיוני נוכח באופן ספציפי יפנה אל רבים רשתית העכבר, מתודולוגיה זו יכול בקלות להיות מועסק כדי microvessels של חולדות.

U-46619 מיוצר תגובות תלויי-ריכוז מצר את כלי הדם של הרשתית רבים עכברים פראי-סוג של רקע C57Bl/6J. ריכוז של 10-6 מ', ירידה בקוטר luminal היה ≈50% מ קוטר מנוחתו. איור 9 א מציג עקומת ריכוז נציג-תגובה של אחד arteriole ברשתית. ב רבים preconstricted עם U46619, ניהול המצטברת של אצטילכולין עורר מגביר ריכוז תלוית בקוטר luminal ל≈25% מ קוטר preconstricted ב- 10-5 מ', מעידה על (אנדותל כלי הדם ללא פגע איור 9B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56199/56199fig1.jpg"> איור 1: ניתוח של הגולגולת העכבר. העור על העכבר שראשו נערף ראשו מוסר כדי לחשוף את העיניים ואת חלל מסלולית. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56199/56199fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56199/56199fig2.jpg"> איור 2: בידוד של רקמת העין גלוב אנד אורביטל. העצם מסלולית נחתך עם מספריים העין ואת העולם עין יחד עם הרקמות retrobulbar, עצב הראייה היו מבודדים היטב. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56199/56199fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56199/56199fig3.jpg"> איור 3: עין גלוב אנד הכנה של העורק אופטלמולוגיות. ברגע מסלולית הרקמות הסובבות היו גזור עם microscissors בסדר, העורק אופטלמולוגיות נחשף בקפידה, ענפים קטנים שלהם מאתרים בתפרים monofilament ניילון 10-0. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56199/56199fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56199/56199fig4.jpg"> איור 4: ניתוח של מבנים עינית. כדי להמחיש את הרשתית, sclera ואת uvea היו גזור במספריים capsulotomy Vannas. טישו scleral סביב עצב הראייה נשאר כדי למנוע נזק של העורק אופטלמולוגיות. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56199/56199fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56199/56199fig5.jpg"> איור 5: איברים תא מיקרוסקופ וידאו בזמן אמת- החדר היה עשוי הביתה. היא כללה צלחת פטרי בקוטר 100 מ מ עם בו -out - flow שפופרת. הצינורות היו מודבקים עם דבק histoacryl. מאגר קרבס-Henseleit מבחוץ מחומצן תוססים הופצה על ידי משאבה סחרור דרך הצינורות האלה. קצה אחד של צינור סיליקון היה דבוק לחלק התחתון של החדר ואת הקצה השני מחובר של צימוד-כיוונית. בסוף הצינור, הוכנס micropipette זכוכית עם טיפ של 100 מיקרומטר, אשר שימשה תעלות של העורק אופטלמולוגיות. באמצעות הרכבת התחתית סיליקון, מחזור הדם אופטלמולוגיות היה מווסת על ידי מילוי צינור סיליקון עם מאגר קרבס לרמה המתאימה ל-50 מ מ כספית. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56199/56199fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56199/56199fig6.jpg"> איור 6: תעלות של העורק אופטלמולוגיות. העורק אופטלמולוגיות לצינוריות עם זכוכית micropipette, sutured בתפר ניילון 10-0. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56199/56199fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56199/56199fig7.jpg"> איור 7: תעלות של העורק אופטלמולוגיות. לאחר הצבת הרשתית על הפלטפורמה שקוף, העדשה עם שקית דרכים הוסר, בוצעו ארבעה חתכים רדיאליים לתוך הרשתית, נירוסטה טבעת של 2.8 מ"מ קוטר פנימי ו- 4.0 מ"מ הקוטר החיצוני הושם על הרשתית כדי לתקן את זה ל- b ottom. הרשתית היה מוכן לקבל הניסוי. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56199/56199fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56199/56199fig8.jpg"> איור 8: ויזואליזציה של כלי הדם ברשתית. Arteriole ברשתית למופת עם כדוריות דם אדומות בפנים.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56199/56199fig9.jpg"> איור 9: מחקרים פונקציונלי באמצעות מיקרוסקופ וידאו- ריכוז נציג עקומות תגובת מתוך יחיד arteriole ברשתית. (א) בריכוז-תגובת עקומת עבור מצר את כלי הדם, U46619 (10-9 עד 10-6 מ'), ו (ב) על אנדותל תלוית מרחיב כלי דם, אצטילכולין (10-8 עד 10-5 מ'). <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56199/56199fig9large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo at JoVE.com

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

מחלות רבות סכנת חזון עינית משויכות לקוי microvessels ברשתית. לכן, המדידה של תגובות arteriole ברשתית הוא חשוב לחקור את המנגנונים הקשורים pathophysiological המשמש כבסיס. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט עבור בידוד arteriole רשתית העכבר והכנות כדי להעריך את ההשפעות של חומרים vasoactive על קוטר כלי הדם.

שלבי הכנה מדידה של תגובתיות ב העכבר רבים ברשתית Vivo לשעבר

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...

preparation-steps-for-measurement-reactivity-mouse-retinal-arterioles

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

7.1K Views.  University Medical Center of the Johannes Gutenberg University Mainz. מחלות רבות סכנת חזון עינית משויכות לקוי microvessels ברשתית. לכן, המדידה של תגובות arteriole ברשתית הוא חשוב לחקור את המנגנונים הקשורים pathophysiological המשמש כבסיס. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט עבור בידוד arteriole רשתית העכבר והכנות כדי להעריך את ההשפעות של חומרים vasoactive על קוטר כלי ...

Video: Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness of a variety of oncolytic platforms including HSV, Reovirus, and Vaccinia OVs as treatment for cancer are currently underway2-5. One key characteristic of oncolytic viruses is that they can be genetically modified to express reporter transgenes which makes it possible to visualize the infection of tissues by microscopy or bio-luminescence imaging6,7. This offers a unique advantage since it is possible to infect tissues from patients ex vivo prior to therapy in order to ascertain the likelihood of successful oncolytic virotherapy8. To this end, it is critical to appropriately sample tissue to compensate for tissue heterogeneity and assess tissue viability, particularly prior to infection9. It is also important to follow viral replication using reporter transgenes if expressed by the oncolytic platform as well as by direct titration of tissues following homogenization in order to discriminate between abortive and productive infection. The object of this protocol is to address these issues and herein describes 1. The sampling and preparation of tumor tissue for cell culture 2. The assessment of tissue viability using the metabolic dye alamar blue 3. Ex vivo infection of cultured tissues with vaccinia virus expressing either GFP or firefly luciferase 4. Detection of transgene expression by fluorescence microscopy or using an In Vivo Imaging System (IVIS) 5. Quantification of virus by plaque assay. This comprehensive method presents several advantages including ease of tissue processing, compensation for tissue heterogeneity, control of tissue viability, and discrimination between abortive infection and bone fide viral replication.

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are promising for cancer therapeutics. The ability to ascertain the infectability of live tissue specimens obtained from patients prior to treatment is a unique advantage of this therapeutic approach. This protocol describes how to process tissues for ex vivo infection with oncolytic virus and subsequent viral quantification.

Ex Vivo זיהום של רקמה חיה עם וירוסים oncolytic

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly hydrated, forming a substantial endothelial surface layer (ESL) that contributes to the maintenance of endothelial function. As the endothelial glycocalyx is often aberrant in vitro and is lost during standard tissue fixation techniques, study of the ESL requires use of intravital microscopy. To best approximate the complex physiology of the alveolar microvasculature, pulmonary intravital imaging is ideally performed on a freely-moving lung. These preparations, however, typically suffer from extensive motion artifact. We demonstrate how closed-chest intravital microscopy of a freely-moving mouse lung can be used to measure glycocalyx integrity via ESL exclusion of fluorescently-labeled high molecular weight dextrans from the endothelial surface. This non-recovery surgical technique, which requires simultaneous brightfield and fluorescent imaging of the mouse lung, allows for longitudinal observation of the subpleural microvasculature without evidence of inducing confounding lung injury.

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

The endothelial glycocalyx/endothelial surface layer is ideally studied using intravital microscopy. Intravital microscopy is technically challenging in a moving organ such as the lung. We demonstrate how simultaneous brightfield and fluorescent microscopy may be used to estimate endothelial surface layer thickness in a freely-moving in vivo mouse lung.

במדידת vivo של שכבת פני שטח האנדותל ריאתי המאוסה

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

The use of ex vivo perfused models can mimic the physiological conditions of the liver for short periods, but to maintain normal homeostasis for an extended perfusion period is challenging. We have added the kidney to our previous ex vivo perfused liver experiment model to reproduce a more accurate physiological state for prolonged experiments without using live animals. Five intact livers and kidneys were retrieved post-mortem from sacrificed pigs on different days and perfused for a minimum of 6 hr. Hourly arterial blood gases were obtained to analyze pH, lactate, glucose and renal parameters. The primary endpoint was to investigate the effect of adding one kidney to the model on the acid base balance, glucose, and electrolyte levels. The result of this liver-kidney experiment was compared to the results of five previous liver only perfusion models. In summary, with the addition of one kidney to the ex vivo liver circuit, hyperglycemia and metabolic acidosis were improved. In addition this model reproduces the physiological and metabolic responses of the liver sufficiently accurately to obviate the need for the use of live animals. The ex vivo liver-kidney perfusion model can be used as an alternative method in organ specific studies. It provides a disconnection from numerous systemic influences and allows specific and accurate adjustments of arterial and venous pressures and flow.

Steps for the Autologous Ex vivo Perfused Porcine Liver-kidney Experiment

Study of the animal organ physiology can be achieved by performing an experimental ex vivo perfusion system. The addition of a porcine kidney, as a homeostatic organ to our previously developed ex vivo liver perfusion model can be a principal step to achieve a better physiological environment.

צעדים לעצמיים ב<em&gt; Ex vivo</emניסוי כבד וכליה&gt; perfused בשר חזירים

The use of ex vivo perfused models can mimic the physiological conditions of the liver for short periods, but to maintain normal homeostasis for an ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

בF-MRI 19 vivo למעקב סלולרי

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

<em&gt; Ex vivo</em&gt; דגם לחקר הורמוני פעולה בשד האדם

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with distinct functions and gene expression profiles. The roles of microglial activation in health, injury and disease remain incompletely understood due to their dynamic and complex regulation in response to changes in their microenvironment. Thus, it is critical to non-invasively monitor and analyze changes in microglial activation over time in the intact organism. In vivo studies of microglial activation have been delayed by technical limitations to tracking microglial behavior without altering the CNS environment. This has been particularly challenging during chronic neurodegeneration, where long-term changes must be tracked. The retina, a CNS organ amenable to non-invasive live imaging, offers a powerful system to visualize and characterize the dynamics of microglia activation during chronic disorders.
This protocol outlines methods for long-term, in vivo imaging of retinal microglia, using confocal ophthalmoscopy (cSLO) and CX3CR1GFP/+ reporter mice, to visualize microglia with cellular resolution. Also, we describe methods to quantify monthly changes in cell activation and density in large cell subsets (200-300 cells per retina). We confirm the use of somal area as a useful metric for live tracking of microglial activation in the retina by applying automated threshold-based morphometric analysis of in vivo images. We use these live image acquisition and analyses strategies to monitor the dynamic changes in microglial activation and microgliosis during early stages of retinal neurodegeneration in a mouse model of chronic glaucoma. This approach should be useful to investigate the contributions of microglia to neuronal and axonal decline in chronic CNS disorders that affect the retina and optic nerve.

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Microglia activation and microgliosis are key responses to chronic neurodegeneration. Here, we present methods for in vivo, long-term visualization of retinal CX3CR1-GFP+ microglial cells by confocal ophthalmoscopy, and for threshold and morphometric analyses to identify and quantify their activation. We monitor microglial changes during early stages of age-related glaucoma.

בVivo הדינמיקה של רשתית microglial הפעלה במהלך מוחיה: Confocal Ophthalmoscopic הדמיה וMorphometry הסלולרי בעכבר גלאוקומה

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

חסך בתאי עכבר מן xenografts גידול האנושי משפר משמעותי ניתוח במורד זרם של תאי יעד

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Echocardiographic Measurement of Right Ventricular Diastolic Parameters in Mouse

Diastolic dysfunction is a prominent feature of right ventricular (RV) remodeling associated with conditions of pressure overload. However, the RV diastolic function is rarely quantified in experimental studies. This might be due to technical difficulties in the visualization of the RV in the apical four-chamber view in rodents. Here we describe two positions facilitating the visualization of the apical four-chamber view in mice to assess the RV diastolic function.
The apical four-chamber view is enabled by tilting the mouse fixation platform to the left and caudally (LeCa) or to the right and cranially (RiCr). Both positions provide images of comparable quality. The results of the RV diastolic function obtained from two positions are not significantly different. Both positions are comparably easy to perform. This protocol can be incorporated into published protocols and enables detailed investigations of the RV function.

Here we describe and compare two positions for obtaining the apical four-chamber view in mice. These positions enable the quantification of the right ventricular function, provide comparable results, and can be used interchangeably.

המדידה האקוקרדיוגרפית של פרמטרים של הימני החדרית בעכבר

Diastolic dysfunction is a prominent feature of right ventricular (RV) remodeling associated with conditions of pressure overload. However, the RV ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No current animal models of diabetes and oxygen-induced retinopathy develop the full-range progressive changes manifested in human proliferative diabetic retinopathy (PDR). Therefore, understanding of the disease pathogenesis and pathophysiology has relied largely on the use of histological sections and vitreous samples in approaches that only provide steady-state information on the involved pathogenic factors. Increasing evidence indicates that dynamic cell-cell and cell-extracellular matrix (ECM) interactions in the context of three-dimensional (3D) microenvironments are essential for the mechanistic and functional studies towards the development of new treatment strategies. Therefore, we hypothesized that the pathological fibrovascular tissue surgically excised from eyes with PDR could be utilized to reliably unravel the cellular and molecular mechanisms of this devastating disease and to test the potential for novel clinical interventions. Towards this end, we developed a novel method for 3D ex vivo culture of surgically-excised patient-derived fibrovascular tissue (FT), which will serve as a relevant model of human PDR pathophysiology. The FTs are dissected into explants and embedded in fibrin matrix for ex vivo culture and 3D characterization. Whole-mount immunofluorescence of the native FTs and end-point cultures allows thorough investigation of tissue composition and multicellular processes, highlighting the importance of 3D tissue-level characterization for uncovering relevant features of PDR pathophysiology. This model will allow the simultaneous assessment of molecular mechanisms, cellular/tissue processes and treatment responses in the complex context of dynamic biochemical and physical interactions within the PDR tissue architecture and microenvironment. Since this model recapitulates PDR pathophysiology, it will also be amenable for testing or developing new treatments.

Here, we present a protocol to study the pathophysiology of proliferative diabetic retinopathy by using patient-derived, surgically-excised, fibrovascular tissues for three-dimensional native tissue characterization and ex vivo culture. This ex vivo culture model is also amenable for testing or developing new treatments.

מודל תרביות רקמה לשעבר Vivo עבור סיבוכים Fibrovascular Proliferative רטינופתיה סוכרתית

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

Preparation Of Gushukang (GSK) Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

Traditional Chinese herbal medicine plays a role as an alternative method in treating many diseases, such as postmenopausal osteoporosis (POP). Gushukang (GSK) granules, a marketed prescription in China, have bone-protective effects in treating POP. Before administration to the body, one standard preparation procedure is commonly required, which aims to promote the release of active constituents from raw herbs and enhance the pharmacological effects as well as therapeutic outcomes. This study proposes a detailed protocol for using GSK granules in in vivo and in vitro experimental assays. The authors first provide a detailed protocol to calculate the animal-appropriate dosages of granules for in vivo investigation: weighing, dissolving, storage, and administration. Second, this article describes protocols for micro-CT scanning and the measurement of bone parameters. Sample preparation, protocols for running the micro-CT machine and quantification of bone parameters were evaluated. Third, serum-containing GSK granules are prepared, and drug-containing serum is extracted for in vitro osteoclastogenesis and osteoblastogenesis. GSK granules were intragastrically administered twice per day to rats for three consecutive days. Blood was then collected, centrifuged, inactivated, and filtered. Finally, serum was diluted and used for performing osteoclastogenesis and osteoblastogenesis. The protocol described here can be considered a reference for pharmacological investigations of herbal prescription medicines, such as granules.

Preparation Of Gushukang GSK Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

This article provides a detailed protocol for preparing a working solution of Gushukang granules for animal studies and GSK granule containing serum for in vitro experiments. This protocol can be applied to pharmacological investigations of herbal medicines as well as prescriptions for both in vivo and in vitro experiments.

הכנת הגרגירים של גושוקאנג (GSK) בגרגרים בVivo ובניסויים חוץ-גופית

Traditional Chinese herbal medicine plays a role as an alternative method in treating many diseases, such as postmenopausal osteoporosis (POP). Gushukang ...