Diese Arbeit wurde von MRC, EU FP7, ARUK, Wellcome Trust und Parkinson UK unterstützt. Wir möchten auch Frau Johanna Buchler Danke für ihren Beitrag der konfokalen Bilder und den Mitgliedern des Labors für ihre konstruktiven Beiträge auf dem Manuskript und Methodik.

alle die Experimente mit Mäusen und Ratten wurden genehmigt und durchgeführt mit Anhang 1 Verfahren abgedeckt unter dem Innenministerium Tiere (wissenschaftliche Verfahren) Act 1986. Die künstliche Liquor cerebrospinalis (ACFS) Rezept finden Sie in Tabelle 1.
 1. akute Hippocampal Slice Vorbereitung <ol><li>das Gehirn der Maus so schnell wie möglich, mit einem Spatel entfernen und einer scharfen Schere schneiden den Schädel, und legen Sie sie in eiskalten, Sauerstoff (95 % O 2, 5 % CO 2), hoch-Saccharose ACFS (~ 100 mL).</li>
	<li>Das Gehirn der Maus auf eine Petrischale platzieren und entfernen das Kleinhirn und einen kleinen Abschnitt des frontalen Kortex mit einem Skalpell vor Hemisecting hinunter die Mittellinie des Gehirns.</li>
	<li>Bringen die beiden Hemisphären auf der Seite, die gerade geschnitten wurde und kleben Sie jede Hemisphäre auf die Bühne ein Vibratome.</li>
	<li>Cut 200-300 µm dicken Teil der gesamten Region von Interesse. Im Falle der Hippocampus, ca. 3-4 Scheiben pro Hemisphäre gesammelt werden.</li>
	<li>Mit einem Kunststoff Pasteurpipette übertragen die Scheiben zu einer Kammer in sauerstoffreichem (95 % O 2, 5 % CO 2) getaucht ACFS. Halten bei 34 ° C für 30 min. 
	Hinweis: Die Behandlung von Scheiben mit pharmakologischen Wirkstoffen wie rekombinante Dkk1 Proteine kann in diesem Stadium durch Zugabe von den Agenten der Slice-Kammer durchgeführt werden.</li>
	<li>Der Scheiben aus der Kammer mit einem Pinsel zu entfernen, legen Sie sie in einer 24-Well-Platte und fix für 20 min bis 1 h in 4 % Paraformaldehyd (PFA)/4% Saccharose bei Raumtemperatur (RT). 
	Achtung: PFA ist giftig, geeignete Verschleißschutz.</li>
	<li>Der Scheiben dreimal waschen mit 1 X PBS-Puffer (10 min). 
	Hinweis: Das Protokoll kann angehalten werden hier für 1-2 Tage, so lange die Scheiben bei 4 ° C mit 1 X PBS-Puffer gehalten werden.</li>
</ol> 2. Immunfluoreszenz für synaptischen Marker Hinweis: die Rezepte alle Puffer verwendet, finden Sie in Tabelle 2.
<ol><li>Ersetzen die PBS mit Blockierung/permeabilizing-Puffer (Tabelle 2) in den Slice-Brunnen und Inkubation bei RT für 4-6 h.</li>
	<li>Verdünnen den polyklonalen Meerschweinchen Antikörper gegen vGlut1 bei einem 1:2,000 Verdünnung im Puffer blockiert/Permeabilisierung. 
	Hinweis: vGlut1 ist ein Marker für die präsynaptischen exzitatorischen terminal Visualisierung. Zur Identifizierung der postsynaptischen erregenden Synapse, verwenden einen polyklonalen Antikörper gegen PSD-95 und verdünnter 1: 500 in der gleichen Projektmappe. Verwenden Sie ein Mindestvolumen von 300 µL in jede Vertiefung. Um die anatomische Lage des Hippocampus zu identifizieren, verwenden Sie einen Antikörper, der auch die neuronale Struktur, z. B. MAP2 oder Tubulin identifizieren kann. Trainieren Sie die korrekte Konzentrationen von allen primären Antikörper für die synaptischen Marker der Wahl (prä- und postsynaptischen) und im frischen blockieren/permeabilizing Puffer verdünnen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Scheiben in der primären Antikörper-Lösung über Nacht (oder für 1-2 Tage) bei 4 ° C. Verwendung einer schütteln Plattform mit kräftigen Bewegung.</li>
	<li>Waschen die Scheiben dreimal mit PBS-Puffer (10 min).</li>
	<li>Verdünnen der entsprechenden sekundären Antikörper 1: 500 in blocking-Puffer. Beispielsweise bei Verwendung den vGlut1-Meerschweinchen-Antikörper gelten Sie einen sekundäre Antikörper, der die Meerschweinchen-Komponente (z. B. Esel anti-guinea-Pig) konjugiert zu einem bestimmten Fluorophore erkennt. Bei Verwendung den PSD-95-Kaninchen-Antikörper gelten einen sekundären Antikörper, die die Kaninchen-Komponente (z. B. Esel Anti-Kaninchen) zu einer anderen spezifischen Fluorophor konjugiert erkennt.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Scheiben in dieser Lösung für 2-3 h bei RT. Stellen Sie sicher, dass die Scheiben vor dem Licht geschützt sind, wie Sekundärantikörper lichtempfindlich sind.</li>
	<li>Waschen die Scheiben dreimal mit PBS-Puffer (10 min).</li>
	<li>Entfernen Sie die Scheiben von der 24-Well-Platte mit einem Pinsel sorgfältig und legen Sie sie gleichmäßig auf vorher beschrifteten Objektträger. Geben Sie einen Tropfen Eindeckmittel auf jede Scheibe und dann legen Sie vorsichtig ein Glas Deckglas auf den Scheiben. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen. Achten Sie darauf, um genug Eindeckmedium (300-400 µL), zu verwenden, da eine unzureichende Menge Scheiben trocknen führen kann.</li>
	<li>Verlassen, um für ein Minimum von 1-2 Tage bei RT trocknen und halten die Folien vor Licht geschützt werden.</li>
	<li>Speichern die Folien bei 4 ° C, kurzfristig, aber für die langfristige Lagerung, halten sie bei-20 ° c</li>
</ol> 3. Konfokale Bildaufnahme und Analyse <ol><li>Imaging mit konfokale Laser-scanning-Mikroskopie.
	<ol><li>Identifizieren die Region des Hippocampus, abgebildet werden (z. B. die Cornu Ammonis 1 und 3 (CA1, CA3) oder dentate Gyrus (DG)) mittels eines 10 X oder 20 X Objektiv.</li>
		<li>Änderung auf einem 40 X oder 63 X Ölimmersion Ziel um sicherzustellen, dass die Slice-Anatomie ist intakt durch die kontinuierliche Neuriten Identifizierung und Struktur organisiert. Verwenden Sie einen neuronalen Marker, wie MAP2, als Referenz ( Abbildung 1A).</li>
		<li>Anschließend wechseln Sie in ein 60 x Ölimmersion Ziel (NA = ~1.3 - 1.4) und passen Sie die Einstellungen für jeden Kanal um optimales Signal und Kontrast zu erhalten. Stellen Sie die Intensität jeder Laser, die Sättigung der alle Pixel mit einem hohem / niedrigem Kontrast Option zu vermeiden. 
		Hinweis: Diese Einstellung wird auf das Mikroskop verwendet, sondern beziehen sich auf die Tabelle der Materialien für die Laser-Energie-Einstellungen verwendet, die in Abbildung 2, Abbildung 3, und Abbildung 4. Verwenden Sie um beste Ergebnisse zu erzielen eine Auflösung von 1024 x 1024 Pixeln. Die Einstellungen sollten über die unterschiedlichen Bedingungen des gleichen Experiments konstant bleiben. Zusätzliche Zoom kann bei Bedarf angewendet werden.</li>
		<li>Die Tiefe, wo die Färbung auch ist, zu bewerten und Bild Stapel von mindestens 8 äquidistant zu erwerben (250 nm) Flugzeuge. Dann nehmen Sie 3 angrenzenden repräsentative Bilder stapeln aus der gleichen Gegend pro Scheibe. 
		Hinweis: Die tiefe variieren von einem Stück zum anderen sollte aber immer ca. 2 bis 5 µm von der Oberfläche der Scheibe.</li>
		<li>Wiederholen, die Übernahme in mindestens 3 Scheiben pro Zustand und von 6-8 Tiere pro Behandlungsgruppe.</li>
	</ol></li> <li>Bildanalyse. 
	Hinweis: Verwenden Sie eine automatisierte Bildanalyse-Software (siehe die Tabelle der Materialien). Beachten Sie, dass einige Systeme eine Lizenz benötigen, während andere frei, wie ImageJ sind. Die verwendete Software muss die Bilder in 3D analysieren, indem Sie unter Berücksichtigung aller Ebenen des Stapels abgebildet. Beziehen sich auf die Tabelle der Materialien für die Details der Software in der Bildanalyse ( Abbildung 1).
	<ol><li>Verwendung eines Custom-basierte Intensität Schwelle Protokolls zur Identifizierung aller synaptischen Puncta und neuronale Marker, die manuell optimiert und in der Software ausgewählt [siehe Tabelle der Materialien für die spezifische Software verwendet in diesem Protokoll]. 
		Hinweis: Die Software identifiziert eine minimale und maximale Intensität für jeden Fluorophor und ordnet einen Prozentsatz der Intensität für jeden anerkannten Objekt. Beachten Sie, dass der Anteil der Intensität nach der Fluorophor verwendet wird und der Antikörper gegen die synaptischen Marker.</li>
		<li>Für synaptischen Marker, sicherzustellen, dass Größe filtert (&#62; 0.1µm 3 und &#60; 0.8µm 3) in der Software ausgewählt und auf das Bild angewendet. Passen Sie die Parameter um sicherzustellen, dass die ausgewählten Objekte nicht überlappen. Ausgeschlossen werden alle Objekte, die zu groß oder zu klein, um synaptische Puncta anzusehen sind (siehe Abb. 2 b). 
		Hinweis: Sobald optimiert, die gleichen Grenzwerte dann gelten für alle Bilder innerhalb einer gegebenen Experiment.</li>
		<li>Zu quantifizieren, die mittlere Zahl, Intensität und Umfang der einzelnen synaptischen Puncta (Pre- oder Post-synaptic) mit der optimierten Schwelle Protokollen innerhalb der Software ausgewählt. Normalisieren Sie die Puncta Zahl, um die Lautstärke über das Bildfeld (etwa 16.928 µm 3 im hier verwendeten System). Die synaptischen Puncta Intensität auf die Intensität der Referenz neuronalen Marker zu normalisieren. 
		Hinweis: Synapsen sind definiert als die Co Lokalisierung zwischen Prä- und postsynaptischen Marker. Einmal die Schwelle Protokolle für Prä- und postsynaptischen Puncta hAve wurde gegründet, sollte die Software die Co Lokalisierung der synaptischen Puncta als die Überlappung von 1 Pixel oder mehr in einer Ebene identifizieren. 
		Hinweis: Für statistische Analysen bestätigen Sie, dass alle Arten von Proben Normalität und Homogenität der Varianz, folgen bzw. Lilliefords und χ2-Test bestimmt. Zeigt eine Normalverteilung und Homogenität der Varianz Proben sollten mit parametrischen Tests analysiert werden, wie unten beschrieben. Beispielsweise sollte exzitatorische synaptische Puncta Analyse durchgeführt werden, eine einfache ANOVA mit Blockierung und Replikation. Jedes einzelne Experiment sollte als ein Block betrachtet werden; in der Regel gibt es drei unabhängige Experimenten, jeweils mit 1-3 Mäuse aus jede Bedingung.</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig1.jpg" /> Abbildung 1: Analyse der synaptischen Puncta mit der Bildanalyse Software (A) Screenshot der Intensität Schwelle Protokoll Anpassung. Das Beispiel ist für PSD-95, in dem die ausgewählten Puncta haben eine definierte Größe der &#62; 0,1 µm 3 und &#60; 0,8 µm 3 und gegenwärtigen minimiert sich überlappende Objekte. Beachten Sie, dass das dargestellte Bild einer konfokalen Ebene um die einfacher Visualisierung der synaptischen Puncta und genaue Parameter-Auswahl zu ermöglichen. (B) Screenshot der Analyse von der Software (nach der Auswahl des optimierten Protokolls) ausgegeben. Ein Beispiel für rohe synaptischen Puncta Anzahl Messungen basierend auf dem Volume. Diese Werte werden dann in einem Tabellenkalkulations-Software exportiert. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56153/56153fig1large.jpg" target="_blank"> Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
 <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig2.jpg" /> Abbildung 2: Qualitäts-Check von der Scheibe und Parameter-Einstellungen für synaptische Puncta. (A) repräsentative konfokale Bilder (40 X Objektiv) der Region von Interesse: CA1 Stratum Radiatum (sr) und Stratum Oriens (so) einer hippocampal Scheibe sind gekennzeichnet von MAP2 Färbung. Maßstabsleiste = 2 µm. (B) konfokale Bilder (60 x Ziel und eine zusätzliche 1,3 X Vergrößerung auf der Datenerfassungs-Software) von CA1 Stratum Radiatum, mit erregenden Marker-vGlut1 (grün) und PSD-95 (rot)-von hippocampal Scheiben. Beachten Sie die Kennung des klaren Prä- und postsynaptischen Puncta. Puncta größer als 0,8 µm 3 sind von der Quantifizierung (weisse Pfeile) ausgeschlossen. Maßstabsleiste = 2 µm (C) Confocal Bilder (60 x Ziel und eine zusätzliche 1,3 X Vergrößerung auf der Datenerfassungs-Software) von CA1 Stratum Radiatum, mit erregenden Marker-vGlut1 (grün)-von Kryostat-Schnitt hippocampal Abschnitte vom gesamten Gehirn in PFA behoben. Beachten Sie die Anwesenheit von großen Löchern und unregelmäßigen, aufgehäuften vGlut1 Färbung. Maßstabsleiste = 2 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56153/56153fig2large.jpg" target="_blank"> Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die genaue Auswertung der Synapse Anzahl gilt auf dem Gebiet der Neurowissenschaften. Hier zeigen wir, wie die Dichte der Synapsen im Großraum CA1 Stratum Radiatum der hippocampalen Scheiben als Modellsystem zu bewerten. Die Bedeutung in Bezug auf bestehende Methoden wird in unserem jüngsten Forschungsartikel über die Wirkung der Wnt-Mangel im Hippocampus und wo wir auch Synapse Zahl ausgewertet durch einteiligen EM10gezeigt. Das Ausmaß des Verlustes der Synapse sind ähnlich zwischen einteiligen EM und die Gehirn-Scheibe hier beschriebenen Methode10. So zeigt dieses Ergebnis, die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Technik.
Wichtig ist, ist eine Einschränkung des einteiligen EM und Immunostaining Synapsen, wie hier vorgestellt, die Unfähigkeit, genau zu schätzen, die absolute Synapse-Anzahl für eine bestimmte Gehirnregion. In der Tat ist es wichtig, jede globale morphologischen Veränderungen zu identifizieren, wie Veränderungen im Gesamtvolumen synaptischen Anzahl auswirken könnte. Eine weitere Einschränkung ist, dass bestimmte Antikörper bei Färbung intakt Hirnregionen, teilweise aufgrund der extremen Dichte von synaptischen Verbindungen weniger effizient sind. Wir haben erlebt, hochwertigere Färbung des vGlut1 und Gephyrin mit diesem Stück Vorbereitung und anschließende PFA Fixierung für maximal 1 h, im Vergleich zur sofortigen Fixierung des gesamten Gehirns in PFA (Abbildung 2). Letzteres führte zu aufgehäuften synaptischen Färbung, mit Löchern im Gewebe. Dennoch beschränkt sich die vGlut1 Antikörper Penetration noch bei beiden Methoden (ein paar zehntausend von Mikron). Wir diese Einschränkung nicht überwinden, sogar mit erhöhten Antikörper Inkubationszeit, sondern die die Antikörper-Penetration ist größer als die Gesamttiefe, die abgebildet ist, sollte keinen Einfluss auf das Endergebnis. Darüber hinaus sollte besondere Vorsicht geboten, um sicherzustellen, dass die Färbung auch während der gesamten erworbenen Stack ist.
In unserer Studie wollten wir unterscheiden exzitatorischen von hemmenden Synapsen. Daher wählten wir vGlut1/PSD-95 und vGAT/Gephyrin, bzw. wie diese Proteine im Hippocampus erwachsener Mäuse sehr ausgedrückt werden und sind spezifisch für jede Synapse Subtyp4,5. Weitere exzitatorischen und inhibitorischen synaptischen Marker könnte verwendet werden können, um jedes jeweiligen Synapse, wie Rezeptoren, die an jeder Synapse, einschließlich NMDA und AMPA-Rezeptoren für bereichert identifizieren exzitatorischen und GABAA-Rezeptoren für die hemmenden Synapsen. Andere Neurotransmitter und Neuromodulatoren können auch identifiziert werden, mit unserem Protokoll, um sicherzustellen, dass spezifische Antikörper verfügbar sind, da für dopaminerge Synapsen im Striatum22gezeigt. Darüber hinaus überwinden reduziert die Dicke der einzelnen Segmente bis 120 µm teilweise die geringe Menge an Proben mit akuten Scheiben, die unbedingt für Studien in kleinen Gehirnstrukturen wie der Amygdala.
Zukünftige Anwendungen unseres Protokolls konnte in der Studie der verschiedenen Gehirnregionen und Störungen umgesetzt werden. Zum Beispiel im Striatum (eine Region des Gehirns verbunden mit Parkinson-Erkrankung), eine Kombination von vGlut2/PSD-95 oder vGlut1/PSD-95 ließe sich der exzitatorischen Synapsen von Afferenzen aus dem Kortex oder Thalamus unterscheiden, bzw.22.
Zusammenfassend haben wir gezeigt, eine zuverlässige Methode, um die Anzahl der Synapsen im Gehirn Gewebe mit Prä- und postsynaptischen Marker definieren eine Synapse zu untersuchen. Wichtige Schritte sind die Vorbereitung gute hippocampal Scheiben einer Fixierzeit von bis zu 1 h in PFA, die Anwendung genügend Eindeckmedium, den Einsatz von zuverlässigen Antikörper, entsprechenden Bildeinstellungen Erwerb und strengen synaptischen Puncta Erkennung. Letztlich ist diese Methode ist relativ schnell und leicht reproduzierbar ist, indem alle Laboratorien, die Zugang zu einem confocal Mikroskop haben.

Das menschliche Gehirn besteht aus ca. 1014 Synapsen. Synapse ist eng in die Entwicklung und Reifung des zentralen Nervensystems (ZNS) geregelt. Während der gesamten Entwicklung Anzahl der Synapse moduliert von Synaptogenese und beschneiden, funktioneller neuronaler Netzwerke zu bilden. Lernen und Gedächtnis werden durch die Verordnung der Synapse Anzahl und Stärke, ein Prozeß bekannt als synaptische Potenzierung und Depression1unterstützt. Wichtig ist, ist die Stabilisierung der Reife Synapsen unerlässlich für die Aufrechterhaltung der neuronalen Netzwerk-Verbindungen. Darüber hinaus wurden Defizite in der Synapse Dichte in den frühen Stadien von neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit (AD)2gemeldet. Daher ist die Fähigkeit, genau zu identifizieren und zu bewerten Synapse Anzahl grundlegender Bedeutung für die Beurteilung der Gehirnphysiologie und Pathologie.
Die extreme Dichte und kompakte Art der Synapsen machen es schwierig, um ihre genaue Zahl in intakten Hirnareale zu schätzen. Chemische Synapsen im ZNS bestehen aus zwei Neuronen in enge Apposition, getrennt durch eine synaptic cleft3. Die präsynaptischen Terminal oder synaptische Bouton, ergibt sich aus einem Axon und besteht aus angesammelten Vesikel, die Neurotransmitter enthalten, die die Besonderheit einer Synapse zu definieren – nämlich, Glutamat und Gamma - Aminobuttersäure (GABA) für exzitatorische und hemmende Synapsen, beziehungsweise. Die Membranen der Vesikel enthalten vesikuläre Transporter spezifisch für jedes Neurotransmitter: vesikuläre Glutamat Transporter (vGlut) für Glutamat und vesikuläre GABA-Transporter (vGAT) für GABA. Die postsynaptischen Terminal ist eine sehr dichte Struktur, bestehend aus mehreren Proteinen, einschließlich Rezeptoren, Adhäsionsmoleküle und Gerüst Proteine. In exzitatorischen Synapsen ist postsynaptischen Dichte-95 Protein (PSD-95) das am häufigsten vorkommende Gerüst Protein4, modulierenden erregenden N-methyl-D-aspartate(NMDA-) und α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic Säure (AMPA)-Rezeptor funktionieren Sie, während Gephyrin inhibitorische Rezeptoren an der inhibitorischen postsynaptischen Klemme5verankert. Insgesamt, die Spezifität der Proteine zu prä- und postsynaptischen Fächer Beihilfen in der Differenzierung und Identifikation von Synapse-Subtypen.
Die Auswertung der Synapse Zahl kann mit verschiedenen Techniken durchgeführt werden. Am weitesten verbreitet ist der Einsatz der Elektronenmikroskopie (EM), die die Analyse der Synapse in kompakter und intakte Hirnareale mit hoher Vergrößerung und Auflösung ermöglicht. Aber diese Technik ist sehr teuer, erfordert komplizierte Probenvorbereitung und ist sehr zeitaufwendig. Andere Techniken umfassen die Verwendung von Array-Tomographie6, was einen großen Nachteil ist, dass es spezielle und teure Ausrüstung erfordert um die Analyse durchzuführen. Darüber hinaus transgene Linien mit dem Ausdruck spezifischer synaptischen Marker eignen sich Bewertung Synapse Nummer7, aber die Generation der neuen Linien kann restriktive und kostspielig sein, und die Überexpression von Proteinen kann zu unerwünschten Ziel führen Phänotypen.
Aufgrund dieser Einschränkungen und der Einfachheit halber bewerten viele Forscher Synapse Anzahl durch die Untersuchung insgesamt synaptischen Protein-Ebene. Synapse Verlust kann jedoch als strukturelle synaptischen Umbau Ergebnisse in die Zerstreuung der Pre- oder Post-synaptische Apposition, keine Verschlechterung der synaptischen Proteine vor erhebliche Änderungen im Protein, beobachtet werden. Darüber hinaus sind in AD, synaptischen Protein-Ebene reduzierten folgende Synapse Degeneration oder neuronalen Tod8,9. Die Quantifizierung der gesamten Ebenen ermöglicht es diese Unterscheidung nicht. So gibt es eine Notwendigkeit, eine zuverlässige, zugänglich und genaue Methode für die Bewertung der Anzahl der Synapsen im Gehirn zu entwickeln.
In diesem Artikel beschreiben wir wie Sie gründlich ermitteln und bestimmen Sie die Anzahl der Synapsen mit Immunfluoreszenz-Mikroskopie im Hippokampus Nagetier Gehirnscheiben. Die Synapsen sind durch die NS1 der Prä- und postsynaptischen Marker definiert, die in eine punktförmige Verteilung angezeigt. Wir zeigen die Gültigkeit dieser Technik durch das Studium der Wnt signalisieren in das Gehirn. Wnts sind wichtig für die Bildung, die Beseitigung und die Wartung von Synapsen sekretierten Proteine. Die in Vivo -Induktion des sekretierten Antagonisten der Wnt Kaskade, Dickkopf-1 (Dkk1), führt zu erregenden synaptischen Verlust unter Beibehaltung der hemmende Synapsen in der Hippocampus-10. Wir zeigen die Identifikation und Graf von erregenden und hemmenden Synapsen im Hippokampus Scheiben aus einer erwachsenen Maus mit dem Ausdruck Dkk1 und markieren Sie die Übertragbarkeit dieser Technik auf andere Arten von Gewebekultur/Vorbereitungen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5905</td>
			<td>vGlut1 (1:2000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MA1-046</td>
			<td>PSD-95 (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>131 004</td>
			<td>vGAT (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>147011</td>
			<td>Gephyrin (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5392</td>
			<td>MAP2 (1:10000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>706-545-148</td>
			<td>Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1:600)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175470</td>
			<td>Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td>Fluoromount-G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NA</td>
			<td>FV1000 confocal microscope using a 60x 1.35 numerical aperture (NA) oil objective. For vGlut1, use a 488 laser with a percentage power of 14%. For PSD-95 use a 559 laser with a percentage power of 20%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Volocity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>203</td>
			<td>No 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1446875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2, 5% CO2</td>
			<td>BOC</td>
			<td>NA</td>
			<td>Cylinder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>7107</td>
			<td>08-1.0mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iDkk1 mice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Mice were obtained by crossing tetO Dkk1 transgenic mice with CaMKII&#945; rtTA2 transgenic mice. TetO Dkk1 transgenic mice and CaMKII&#945; rtTA2 were crossed in a heterozygous state. Both mouse lines were bred in a C57BL/6J background. Single transgenic and WT littermate were used as controls.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for solutions:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V800372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>255793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S30-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of synapse density in hippocampal rodent brain slices

Im Gehirn sind Synapsen spezialisierte Verbindungen zwischen den Neuronen, Bestimmung der Stärke und Ausbreitung der neuronalen Signalisierung. Die Anzahl der Synapsen ist während der Entwicklung und neuronale Reifung streng reguliert. Wichtig ist, können Defizite in der Synapse Anzahl zu kognitiven Dysfunktion führen. Daher ist die Bewertung der Synapse Anzahl Bestandteil der Neurobiologie. Wie Synapsen im intakten Gehirn klein und sehr kompakt sind, ist die Beurteilung der absoluten Zahl jedoch anspruchsvoll. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um leicht erkennen und bewerten Sie Synapsen im Hippokampus Nagetier Scheiben mit Immunfluoreszenz-Mikroskopie. Freuen Sie sich auf eine drei-Schritt-Verfahren um Synapsen im konfokalen Mikroskopie qualitativ hochwertige Bilder zu bewerten, durch die Analyse der Co Lokalisierung der Prä- und postsynaptischen Proteine in hippocampal Scheiben. Es erklärt auch, wie die Analyse durchgeführt wird und repräsentative Beispiele von erregenden und hemmenden Synapsen. Dieses Protokoll stellt eine solide Grundlage für die Analyse von Synapsen und kann auf jede mögliche Forschung untersucht die Struktur und Funktion des Gehirns angewendet werden.

Synapse Verlust tritt früh bei neurodegenerativen Erkrankungen wie AD und der Parkinson-Krankheit2,11,12. Die molekularen Mechanismen, die diese Defizite bleiben jedoch schlecht verstanden. Mängel bei der Wnt Signalisierung wurden mit AD13,14,15,16,17. Wnts sind sekretierten Glykoproteine und spielen eine wesentliche Rolle bei der Bildung von Synapsen und die Modulation des synaptischen Übertragung18,19,20,21. Vor kurzem haben wir als wichtige Regulatoren der synaptischen Wartung in den Reifen Nervensystem10,22Wnts identifiziert. Um die Auswirkungen der Wnt signalisieren auf Synapsen im Hippocampus von genetisch veränderten Mäusen genau zu studieren, nutzten wir ein Gehirn Slice Vorbereitung und konfokalen Mikroskopie Veränderungen in Synapse zu bewerten. Wir identifizierten gesunde Scheiben, in denen die Struktur gut war, erhalten (Abbildung 2A). Darüber hinaus wurde die Auswahl der synaptischen Puncta sorgfältig definiert, mit Ausnahme von großen gefärbten Objekten, die wahrscheinlich die aggregierte Proteine (Abb. 2 b). Dieses Kriterium wurde auf alle Bilder mit den gleichen strengen Analyseparametern angewendet.
Wir verwendeten eine transgene Modellsystem, die den Ausdruck des sekretierten Wnt Antagonisten Dkk1 bei Erwachsenen induziert Mäuse (iDkk1) unter Tetracyclin kontrollieren (siehe die Tabelle der Materialien)10,22. Wir zeigten, dass die Blockade der Wnt signalisieren in den Erwachsenen Hippocampus exzitatorischen Synapse Verlust in der CA1 Stratum Radiatum Region (Abbildung 3) auslöst. Abbildung 3A zeigt repräsentative konfokale Bilder der exzitatorischen Prä- und postsynaptischen Marker (vGlut1 und PSD-95, beziehungsweise) gewonnenen hippocampal Scheiben iDkk1 Mäuse mit dem Ausdruck Dkk1 für zwei Wochen, sowie ihre jeweiligen Steuerelemente. Wir haben diese Bilder mit Volocity-Software analysiert und zeigte eine signifikante Verringerung der Zahl der exzitatorischen Synapsen, quantifiziert durch die Co Lokalisierung des vGlut1 - und PSD-95-Label Puncta in der CA1-Region des Hippocampus iDkk1 Mäusen nach der Induktion von Dkk1 für zwei Wochen (Abbildung 3 b, * p &#60; 0,05; Kruskal-Wallis-Test; 6 Mäuse pro Genotyp). In CA1 Stratum Radiatum reduzierte sich die erregenden Synapse Puncta Anzahl pro 1.000 µm3 von 500 im Kontroll-Mäusen bis 300 bei iDkk1 Mäusen. Im Gegensatz dazu induzierte Dkk1 Ausdruck hatte keinen Einfluss auf die Anzahl der hemmenden Synapsen (gekennzeichnet durch die Co Lokalisierung zwischen den Prä- und postsynaptischen Marker vGAT und Gephyrin, beziehungsweise), wie in Abbildung 4A-B gezeigt (p &#62; 0,05; Kruskal-Wallis-Test; 3 Mäuse pro Genotyp).
Wichtig ist, führten wir eine statistische Aussagekraft-Analyse, um die entsprechende Anzahl von Scheiben und Tieren benötigt, um diese robuste Ergebnisse generieren zu schätzen. Mit R, wir berechnet, dass etwa 35 Scheiben pro Zustand benötigt wurden (3 Bilder X 3 Scheiben X 6 Tiere = 36), eine große Effektgröße zu erkennen (f = 0,4) mit 80 % Vertrauen (Kraft = 0,8) in eine einfache ANOVA mit Blockierung und Replikation, wie in beschrieben Schritt 3.2.6.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig3.jpg"> 
Abbildung 3: Verlust von exzitatorischen Synapsen in hippocampal Scheiben aus iDkk1 Mäuse. (A) repräsentative konfokale Bilder der CA1 Stratum Radiatum Show exzitatorischen Synapsen, identifiziert durch Co Lokalisierung zwischen vGlut1 und PSD-95 (weisse Pfeile). Der untere Bereich repräsentiert eine höhere Vergrößerung des markierten Rechtecks. Skalieren von Balken = 2 µm. (B) der Anteil der exzitatorischen Synapsen zwischen Kontrolle und iDkk1 wurde quantifiziert mit Software, die in Tabelle Materialien erwähnt (* p &#60; 0,05; Kruskal-Wallis-Test; 6 Mäuse pro Genotyp). Die Daten sind vertreten ± SEM Diese Zahl wurde von Referenz10geändert. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56153/56153fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig4.jpg"> 
Abbildung 4: hemmende Synapsen sind unverändert im Hippokampus Scheiben aus iDkk1 Mäuse. (A) repräsentative konfokale Bilder von CA1 Stratum Radiatum hemmenden Synapsen durch die Co Lokalisierung zwischen vGAT und Gephyrin (weisse Pfeile) identifiziert. Der untere Bereich repräsentiert eine höhere Vergrößerung des markierten Rechtecks. Skalieren von Balken = 2 µm. (B) Prozentsatz der hemmenden Synapsen zwischen Kontrolle und iDkk1 Mäuse, wie quantifiziert mit Volocity Software (p &#62; 0,05; Kruskal-Wallis-Test; 3 Mäuse pro Genotyp). Die Daten sind vertreten ± SEM Diese Zahl wurde von Referenz10geändert. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56153/56153fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hohen Saccharose ACFS Komponenten</td>
			<td>Konzentration</td>
			<td>Notizen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>75 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nahco33</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4, 2 H2O</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic Säure</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brenztraubensäure Säure</td>
			<td>2 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>0,1 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>Nach Sauerstoffversorgung der Lösung hinzufügen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>4 mM</td>
			<td>Nach Sauerstoffversorgung der Lösung hinzufügen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharose</td>
			<td>100 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versunkene Kammer ACFS Komponenten</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>125 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nahco33</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4, 2 H2O</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>Nach Sauerstoffversorgung der Lösung hinzufügen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
</tr></tbody></table>			<td>1 mM</td>
			<td>Nach Sauerstoffversorgung der Lösung hinzufügen</td>
		
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
	

Tabelle 1: ACFS Zusammensetzung.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blockierung/permeabilizing Puffer</td>
			<td>Konzentration</td>
			<td>Notizen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Esel-serum</td>
			<td>10 %</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>0,50 %</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>1 x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 X PBS</td>
			<td></td>
			<td>pH auf 7,4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>1,37 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>27 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>100 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>18 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 % PFA/4% Saccharose</td>
			<td></td>
			<td>pH auf 7,4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>1 x</td>
			<td>Verdünnen von 10 x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>1,33 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharose</td>
			<td>117 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 2: Puffer für immunofluorescent Färbung verwendet.

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Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Ein Protokoll für die präzise Identifizierung und Analyse von Synapsen im Hippokampus Scheiben mit Immunfluoreszenz ist in diesem Artikel beschrieben.

Bewertung der Synapse Dichte im Hippokampus Nagetier Gehirnscheiben

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

evaluation-of-synapse-density-in-hippocampal-rodent-brain-slices

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.8K Aufrufe.  University College London. Ein Protokoll für die präzise Identifizierung und Analyse von Synapsen im Hippokampus Scheiben mit Immunfluoreszenz ist in diesem Artikel beschrieben.

Serie: Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

Herstellung von oligomeren β-Amyloid 1-42 Und Induktion der synaptischen Plastizität Impairment auf Schnitten des Hippocampus

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Forschung

Neurowissenschaften

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

DiOLISTIC Labeling von Neuronen aus Nager und nicht-menschlichen Primaten Hirnschnitten

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation von Neuronen aus Nager Hirnschnitten zu Study Synaptic Transmission and Image präsynaptischen

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Gepaart ganze Zelle Recordings in Organotypische Hippocampus

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

Low-Density Primäre Hippocampus Kultur

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Aufnahme synaptische Plastizität in akuten Hippocampal Scheiben gepflegt in einem kleinvolumigen Recycling - Perfusions- und untertauchen-Typ-Kammer-System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) is a promising approach when pharmacological treatment fails or neurosurgery is not recommended. Acute brain slices coupled to microelectrode arrays (MEAs) represent a valuable tool to study neuronal network interactions and their modulation by electrical stimulation. As compared to conventional extracellular recording techniques, they provide the added advantages of a greater number of observation points and a known inter-electrode distance, which allow studying the propagation path and speed of electrophysiological signals. However, tissue oxygenation may be greatly impaired during MEA recording, requiring a high perfusion rate, which comes at the cost of decreased signal-to-noise ratio and higher oscillations in the experimental temperature. Electrical stimulation further stresses the brain tissue, making it difficult to pursue prolonged recording/stimulation epochs. Moreover, electrical modulation of brain slice activity needs to target specific structures/pathways within the brain slice, requiring that electrode mapping be easily and quickly performed live during the experiment. Here, we illustrate how to perform the recording and electrical modulation of 4-aminopyridine (4AP)-induced epileptiform activity in rodent brain slices using planar MEAs. We show that the brain tissue obtained from mice outperforms rat brain tissue and is thus better suited for MEA experiments. This protocol guarantees the generation and maintenance of a stable epileptiform pattern that faithfully reproduces the electrophysiological features observed with conventional field potential recording, persists for several hours, and outlasts sustained electrical stimulation for prolonged epochs. Tissue viability throughout the experiment is achieved thanks to the use of a small-volume custom recording chamber allowing for laminar flow and quick solution exchange even at low (1 mL/min) perfusion rates. Quick MEA mapping for real-time monitoring and selection of stimulating electrodes is performed by a custom graphic user interface (GUI).

We illustrate how to perform recording and electrical modulation of 4-aminopyridine-induced epileptiform activity in rodent brain slices using microelectrode arrays. A custom recording chamber maintains tissue viability throughout prolonged experimental sessions. Live electrode mapping and selection of stimulating pairs are performed by a custom graphical user interface.

Aufnahme und Modulation der Epileptiformen Aktivität in Nagetier Gehirnscheiben gekoppelt mit Mikroelektrode Arrays

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the dendritic filopodia establish contact with a target axon, they begin maturing into spines, leading to the formation of a synapse. Telencephalin (TLCN) is abundantly localized in dendritic filopodia and is gradually excluded from spines. Overexpression of TLCN in cultured hippocampal neurons induces dendritic filopodia formation. We showed that telencephalin strongly binds to an extracellular matrix molecule, vitronectin. Vitronectin-coated microbeads induced phagocytic cup formation on neuronal dendrites. In the phagocytic cup, TLCN, TLCN-binding proteins such as phosphorylated Ezrin/Radixin/Moesin (phospho-ERM), and F-actin are accumulated, which suggests that components of the phagocytic cup are similar to those of dendritic filopodia. Thus, we developed a method for purifying the phagocytic cup instead of dendritic filopodia. Magnetic polystyrene beads were coated with vitronectin, which is abundantly present in the culture medium of hippocampal neurons and which induces phagocytic cup formation on neuronal dendrites. After 24 h of incubation, the phagocytic cups were mildly solubilized with detergent and collected using a magnet separator. After washing the beads, the binding proteins were eluted and analyzed by silver staining and Western blotting. In the binding fraction, TLCN and actin were abundantly present. In addition, many proteins identified from the fraction were localized to the dendritic filopodia; thus, we named the binding fraction as the dendritic filopodia-rich fraction. This article describes details regarding the purification method for the dendritic filopodia-rich fraction.

In this protocol, we introduce a method for purifying the dendritic filopodia-rich fraction from the phagocytic cup-like protrusion structure on cultured hippocampal neurons by taking advantage of the specific and strong affinity between a dendritic filopodial adhesion molecule, TLCN, and an extracellular matrix molecule, vitronectin.

Reinigung der dendritischen Filopodia-reichen Fraktion

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Bewertung der Langzeit-Depressionsinduktion bei erwachsenen Cerebellarscheiben

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...