Este trabajo fue apoyado por el MRC, UE FP7, ARUK, Wellcome Trust y Parkinson UK. También nos gustaría agradecer a la Sra. Johanna Buchler por su aportación de imágenes confocales y los miembros del laboratorio por su aportación constructiva en el manuscrito y la metodología de.

todos los experimentos con ratones y ratas fueron aprobados y llevó a cabo utilizando procedimientos Anexo 1 cubiertos bajo la ley de domicilio animales (procedimientos científicos) de 1986. La receta de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) se puede encontrar en la tabla 1.
 1. aguda Hippocampal rodaja preparación <ol><li>quitar el cerebro del ratón tan rápido como sea posible, con una espátula y afiladas tijeras para cortar el cráneo y se coloca en helada, oxigenada (95% O 2, 5% CO 2), alta sacarosa ACSF (~ 100 mL).</li>
	<li>Poner el cerebro de ratón en una caja Petri y quite el cerebelo y una pequeña sección de la corteza frontal con un bisturí antes de hemisecting hacia abajo de la línea media del cerebro.</li>
	<li>Colocar los dos hemisferios en la parte que era solo corte y pegue cada hemisferio en el escenario de un vibratome.</li>
	<li>Corte secciones de 200-300 μm de espesor de la región de información de interés. En el caso del hipocampo, se deben obtener aproximadamente 3 a 4 rebanadas por hemisferio.</li>
	<li>Con una pipeta Pasteur plástica, transferir las rebanadas a una cámara sumergida en oxigenada (95% O 2, 5% CO 2) ACSF. Mantener a 34 ° C durante 30 minutos 
	Nota: El tratamiento de las rebanadas con agentes farmacológicos activos, tales como proteínas recombinantes de Dkk1, puede realizarse en esta etapa mediante la adición de los agentes a la cámara slice.</li>
	<li>Retire las rebanadas de la cámara con un pincel, colocar en una placa de 24 pocillos y arreglar por 20 min a 1 h en paraformaldehído al 4% (sacarosa PFA)/4% a temperatura ambiente (RT). 
	PRECAUCIÓN: El PFA es tóxico, usar protección adecuada.</li>
	<li>Lavar las rodajas de tres veces en 1 X PBS (10 min). 
	Nota: El protocolo puede hacer una pausa aquí por 1-2 días, como las rodajas se mantienen a 4 ° C en 1 X PBS.</li>
</ol> 2. Inmunofluorescencia para marcadores sinápticos Nota: las recetas de todos los búferes utilizados pueden encontrarse en la tabla 2.
<ol><li>Reemplazar el PBS con tampón de bloqueo/permeabilizing (tabla 2) en los pozos de la rebanada e incube a TA por 4-6 h.</li>
	<li>Diluir el anticuerpo policlonal conejillo de Indias contra vGlut1 en una dilución de 1:2,000 en buffer de bloqueo/permeabilización. 
	Nota: vGlut1 es un marcador pre sináptica excitatoria visualización terminal. Para la identificación de sinapsis excitatoria postsináptica, utiliza un anticuerpo policlonal contra el PSD-95 y diluido 1: 500 en la misma solución. Utilizar un volumen mínimo de 300 μL en cada pocillo. Para identificar la localización anatómica del hipocampo, utilizan un anticuerpo que también puede identificar la estructura neuronal, como MAP2 o tubulina. Trabajar la correcta concentración de los anticuerpos primarios para los marcadores sinápticos de elección (pre y postsinápticos) y diluido en buffer de bloqueo/permeabilizing fresco.</li>
	<li>Incubar las rebanadas en la solución de anticuerpo primario durante la noche (o por 1-2 días) a 4 ° C. Utilice una plataforma de agitación con el vigoroso movimiento.</li>
	<li>Lavar las rodajas de tres veces en PBS (10 min).</li>
	<li>Diluir los correspondientes anticuerpos secundarios 1: 500 en solución amortiguadora de bloqueo. Por ejemplo, cuando se utiliza el anticuerpo de conejillo de Indias vGlut1, aplicar un anticuerpo secundario que reconoce el componente de conejillo de Indias (p. ej., burro anti-guinea-pig) conjugado con un fluoróforo específico. Cuando se utiliza el anticuerpo de conejo PSD-95, aplique un anticuerpo secundario que reconoce el componente de conejo (por ejemplo, burro anti-conejo) conjugado con un fluoróforo específico diferentes.</li>
	<li>Incubar las láminas en esta solución durante 2-3 h a RT. Asegúrese que las rebanadas están protegidas de la luz, como los anticuerpos secundarios son sensibles a la luz.</li>
	<li>Lavar las rodajas de tres veces en PBS (10 min).</li>
	<li>Cuidadosamente retire las rebanadas de la placa de 24 pozos con un pincel y colóquelos uniformemente en portaobjetos de vidrio etiquetadas. Añada una gota de medio de montaje encima de cada rebanada y luego colocar suavemente un cubreobjetos de vidrio encima de las rebanadas. Evitar la formación de burbujas de aire. Tenga cuidado de usar suficiente medio de montaje (300-400 μL), como una cantidad insuficiente puede llevar a secar rodajas de.</li>
	<li>Dejar secar por un mínimo de 1-2 días a temperatura ambiente y guardar las diapositivas de la luz.</li>
	<li>Guardar las diapositivas a 4 ° C en el corto plazo, pero para el almacenamiento a largo plazo, mantener a -20 ° C.</li>
</ol> 3. Análisis y adquisición de la imagen confocal <ol><li>proyección de imagen usando microscopía de láser confocal.
	<ol><li>Identificar la región del hipocampo al ser fotografiada (por ejemplo, el cornu ammonis 1 y 3 (CA1, CA3) o el giro dentado (DG)) por medio de un objetivo de 20 x o 10 x.</li>
		<li>Cambio a 40 x o x 63 objetivo de inmersión en aceite para asegurarse de que la anatomía de la rebanada intacta identificando neurites continuados y organizada estructura. Use un marcador neuronal, como la MAP2, como referencia ( figura 1A).</li>
		<li>Posteriormente, cambie una 60 x objetivo de inmersión en aceite (NA = ~1.3 - 1.4) y ajustar la configuración para cada canal para obtener óptima de la señal y el contraste. Ajustar la intensidad de cada láser para evitar la saturación de los píxeles mediante una opción de alto y bajo contraste. 
		Nota: Estos se dependen del microscopio utilizado, pero se refieren a la Tabla de materiales para la configuración de energía de láser utilizado en la figura 2, figura 3, y Figura 4. Para mejores resultados, utilice una resolución de 1024 x 1024 píxeles. La configuración debe permanecer constante a lo largo de las diferentes condiciones del experimento mismo. Puede aplicar zoom adicional si es necesario.</li>
		<li>Evaluar la profundidad donde la coloración es uniforme y adquirir pilas de imagen de por lo menos 8 equidistante (250 nm) planos. Luego tomar 3 pilas adyacentes imágenes representativas de la misma área de interés por rebanada. 
		Nota: La profundidad puede variar de un sector a otro, pero siempre debe ser aproximadamente 2-5 μm de la superficie de la rodaja.</li>
		<li>Repetir la adquisición de al menos 3 rebanadas por condición y de 6-8 animales por grupo de tratamiento.</li>
	</ol></li> <li>Análisis de imagen. 
	Nota: Utilice un software de análisis de imagen automatizado (véase la Tabla de materiales). Tenga en cuenta que algunos sistemas requieren una licencia, mientras que otros son gratis, como el ImageJ. El software utilizado debe analizar las imágenes en 3D, teniendo en cuenta todos los planos de la pila de imágenes. Consulte la Tabla de materiales para los detalles de los programas utilizados en el análisis de la imagen ( figura 1).
	<ol><li>Uso un protocolo de umbral de intensidad basado en el costumbre para identificar todos los puncta sináptica y marcadores neuronales, que son manualmente optimizados y seleccionados dentro del software [véase Tabla de materiales para el software específico utilizado en este Protocolo]. 
		Nota: El software identifica una intensidad mínima y máxima para cada fluoróforo y asocia un porcentaje de intensidad para cada objeto reconocido. Tenga en cuenta que el porcentaje de intensidad variará de acuerdo al fluoróforo que se utiliza y el anticuerpo contra el marcador sináptico.</li>
		<li>Para marcadores sinápticos, asegúrese de que tamaño filtros (&#62; 0.1µm 3 y &#60; 0.8µm 3) seleccionados dentro del software y aplicar a la imagen. Ajustar los parámetros para asegurar que los objetos seleccionados no se solapan. Para excluir cualquier objeto que es demasiado grande o demasiado pequeño para ser considerado puncta sináptica (ver figura 2B). 
		Nota: Una vez optimizado, los mismos valores de umbral luego son aplicados en todas las imágenes dentro de un experimento dado.</li>
		<li>Cuantificar el número, intensidad y volumen de puncta sináptica individual (pre- o postsináptica) utilizando los protocolos optimizados umbral seleccionados dentro del software. Normalizar el número de orificio para el volumen del campo imagen (más o menos 16.928 μm 3 en el sistema de aquí). Normalizar la intensidad sináptica puncta a la intensidad del marcador neuronal referencia. 
		Nota: Las sinapsis son definidas como la colocalización entre marcadores previos y postsinápticos. Una vez que los protocolos de umbral h orificio pre y postsinápticaAve sido establecido, el software debe identificar la co-localización de puncta sináptica como la superposición de 1 píxel o más en un solo plano. 
		Nota: Para el análisis estadístico, confirmar que todos los conjuntos de muestras de seguir la normalidad y homogeneidad de la varianza, según Lilliefords y pruebas de χ2, respectivamente. Mostrando una distribución normal y homogeneidad de la varianza de las muestras deben analizarse con pruebas paramétricas, como se describe a continuación. Por ejemplo, análisis de puncta sináptica excitatoria deben realizarse utilizando un ANOVA unidireccional con la replicación y el bloqueo. Cada experimento individual debe considerarse como un bloque; por lo general, existen tres experimentos independientes, cada uno con 1-3 ratones de cada Estado.</li>
	</ol></li></ol> <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig1.jpg" /> figura 1: Análisis de puncta sináptica mediante el análisis de imagen software (A) captura de pantalla de la personalización de protocolo de intensidad umbral. El ejemplo es para PSD-95, en el cual el orificio seleccionado tienen un tamaño definido de &#62; 0.1 μm 3 y &#60; 0,8 μm 3 y objetos superpuestos al mínimo actual. Tenga en cuenta que la imagen que se muestra es para que un plano confocal permitir la mejor visualización de puncta sináptica y selección de parámetro exacto. (B) captura de pantalla del análisis de la salida desde el software (después de la selección del protocolo optimizado). Un ejemplo de medidas número crudo puncta sináptica basado en el volumen. Estos valores luego son exportados a un software de hoja de cálculo. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56153/56153fig1large.jpg" target="_blank"> haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
 <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig2.jpg" /> figura 2: control de calidad de la rebanada y parámetro de configuración de puncta sináptica. (A) imágenes representativas de confocal (objetivo 40 x) de la región de interés: la CA1 estrato radiatum (sr) y estrato oriens (tan) de un segmento hippocampal se identifican por la coloración de la MAP2. Barra de escala = 2 μm. (B) las imágenes confocales (60 x objetivo y un 1.3 adicional X aumento en el software de adquisición) de la CA1 estrato radiatum, con los marcadores-vGlut1 (verde) y PSD-95 (rojo)-de rebanadas hippocampal. Tenga en cuenta la identificación de los puncta claro pre y postsinápticos. Orificio mayor a 0.8 μm 3 quedan excluidos de la cuantificación (flechas blancas). Barra de escala = 2 μm (C) Confocal imágenes (60 x objetivo y un 1.3 adicional X aumento en el software de adquisición) de la CA1 estrato radiatum, con los marcadores-vGlut1 (verde)-de criostato de corte secciones hipocampales del cerebro entero fija en PFA. Tenga en cuenta la presencia de orificios grandes y coloración irregular, agrupada vGlut1. Barra de escala = 2 μm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56153/56153fig2large.jpg" target="_blank"> haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Los autores no tienen nada que revelar.

La evaluación precisa del número de sinapsis es fundamental en el campo de la neurociencia. Aquí, mostramos cómo evaluar la densidad de sinapsis en la región CA1 estrato radiatum rebanadas hippocampal como sistema modelo. La importancia con respecto a los métodos existentes se demuestra en nuestro reciente artículo de investigación sobre el efecto de la deficiencia de Wnt en el hipocampo y donde también se evaluó el número de sinapsis por la solo-sección EM10. La magnitud de la pérdida de sinapsis son similares entre la solo-sección EM y la rebanada de cerebro método descrito aquí10. Por lo tanto, este hallazgo demuestra la exactitud y fiabilidad de la técnica.
Lo importante, una limitación de la solo-sección EM y sinapsis de inmunotinción, tal como se presenta aquí, es la incapacidad para estimar con precisión el número de sinapsis absoluta para una región específica del cerebro. De hecho, es importante identificar cualquier cambio morfológico global, como cambios en el volumen total podrían tener un impacto número sináptica. Otra limitación es que ciertos anticuerpos son menos eficientes en la coloración de las regiones del cerebro intacto, parcialmente debido a la extrema densidad de conexiones sinápticas. Experimentamos mayor calidad coloración de vGlut1 y gephyrin usando esta rodaja preparación y subsiguiente fijación de PFA para un máximo de 1 h, en comparación con la fijación inmediata de todo el cerebro en PFA (figura 2). El último conducido a tinción sináptica agrupada, con agujeros en el tejido. Sin embargo, la penetración de anticuerpos vGlut1 todavía está restringida en ambos métodos (un par de decenas de micras). No superar esta limitación, incluso con el anticuerpo de mayor incubación, pero proporcionando la penetración de anticuerpos es mayor que la profundidad total que es reflejada, no debe ser influencia en el resultado final. Además, se debe tener especial cuidado para asegurarse de que la tinción es incluso a lo largo de toda la pila adquirida.
En nuestro estudio, hemos querido distinguir excitatorio de la sinapsis inhibitorias. Por lo tanto, elegimos vGlut1/PSD-95 y vGAT/gephyrin, respectivamente, como estas proteínas son altamente expresadas en el hipocampo del ratón adulto y son específicas de cada sinapsis subtipo4,5. Otros marcadores sinápticos inhibitorias y excitatorias podrían se han utilizado para identificar cada sinapsis respectivos, tales como enriquecido en cada sinapsis, incluyendo receptores NMDA y de AMPA para los receptores excitatorios y GABAA Receptores de las sinapsis inhibitorias. Otros neurotransmisores o neuromoduladores pueden también identificarse con nuestro protocolo, garantizar que los anticuerpos específicos están disponibles, como se muestra para las sinapsis dopaminérgicas en el estriado22. Además, reduce el grosor de cada loncha a 120 μm puede superar parcialmente la baja cantidad de muestras obtenidas con láminas agudas, que es imprescindible para los estudios de las estructuras pequeñas del cerebro como la amígdala.
Futuras aplicaciones de nuestro protocolo podrían aplicarse en el estudio de diversas áreas del cerebro y trastornos. Por ejemplo, en el cuerpo estriado (una región del cerebro asociada con la enfermedad de Parkinson), una combinación de vGlut2/PSD-95 o vGlut1/PSD-95 se puede usar para diferenciar entre las sinapsis excitatorias de aferentes procedentes de la corteza o tálamo, y22.
En conclusión, hemos demostrado un método fiable para examinar el número de sinapsis en los tejidos del cerebro usando marcadores previos y postsinápticos para definir una sinapsis. Pasos críticos incluyen la preparación de buenas rebanadas hippocampal, un tiempo de fijación de hasta 1 hora en PFA, la aplicación suficiente de medio de montaje, el uso de anticuerpos confiables, ajustes de imagen apropiado de adquisición y detección rigurosas puncta sináptica. En última instancia, este método es relativamente rápido y es fácilmente reproducible por cualquier laboratorio que tienen acceso a un microscopio confocal.

El cerebro humano está compuesto por aproximadamente 1014 sinapsis. Número de sinapsis es estrictamente regulado durante el desarrollo y la maduración del sistema nervioso central (SNC). En todo el desarrollo, el número de sinapsis es modulada por la sinaptogénesis y la poda para formar redes neuronales funcionales. Aprendizaje y la memoria son compatibles con la regulación del número de sinapsis y la fuerza, un proceso conocido como potenciación sináptica y depresión1. Lo importante es la estabilización de la sinapsis Maduritas es esencial para mantener las conexiones de red neuronal. Además, se han reportado déficits en la densidad de sinapsis en las primeras etapas de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer (EA)2. Por lo tanto, la capacidad de identificar con precisión y evaluar el número de sinapsis es fundamental para la evaluación de la patología y fisiología cerebral.
La extrema densidad y naturaleza compacta de sinapsis hacen difícil estimar su número preciso en áreas del cerebro intacto. Sinapsis químicas del sistema nervioso están hechas de dos neuronas en aposición estrecha, separados por una hendidura sináptica3. La terminal presináptica o bouton sináptico, surge de un axón y consiste en vesículas acumuladas, que contienen neurotransmisores que definen la especificidad de una sinapsis, es decir, glutamato y ácido gamma - aminobutírico (GABA) para excitatorios y inhibitorio sinapsis, respectivamente. Las membranas de las vesículas contienen vesiculares transportadores específicos para cada neurotransmisor: glutamato vesicular transportador (vGlut) para el glutamato y el transportador vesicular de GABA (vGAT) para GABA. La terminal postsináptica es una estructura muy densa compuesta por varias proteínas, incluyendo proteínas andamio, receptores y moléculas de adhesión. En las sinapsis excitatorias, proteína 95 densidad postsináptica (PSD-95) es el más abundante andamio proteína4, modulación excitatoria N-methyl-D-aspartate(NMDA-) y receptor del ácido α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionico (AMPA) funcionar, mientras que gephyrin anclas receptores inhibitorios a la terminal postsináptica inhibitoria5. En general, la especificidad de las proteínas en compartimientos de pre- y postsinápticos ayuda en la diferenciación y la identificación de subtipos de sinapsis.
La evaluación del número de sinapsis se puede realizar con diferentes técnicas. El más común es el uso de la microscopia electrónica (EM), que permite el análisis de la sinapsis en áreas del cerebro intacto y compacto con alta magnificación y resolución. Sin embargo, esta técnica es muy costosa, requiere preparación de muestras complicadas y es muy lento. Otras técnicas incluyen el uso de la matriz tomografía6, que tiene una gran desventaja en que requiere equipo especializado y costoso realizar el análisis. Además, líneas transgénicas expresando marcadores sinápticos específicos son útiles en evaluar la sinapsis número7, pero la generación de nuevas líneas puede ser restrictivo y costoso, y la sobreexpresión de proteínas puede resultar en no deseado fuera del objetivo fenotipos.
Debido a estas limitaciones y para simplificar, muchos investigadores evaluación número de sinapsis por examinar los niveles de la proteína sináptica total. Sin embargo, puede observarse pérdida de sinapsis antes de cambios sustanciales en la proteína, como estructural remodelación sináptica en la dispersión de aposición pre o postsináptica, con la no degradación de proteínas sinápticas. Además, en AD, los niveles de proteínas sinápticas son reducidas siguientes sinapsis degeneración o muerte neuronal8,9. La cuantificación de los niveles totales no permite esta distinción. Por lo tanto, es necesario desarrollar un método confiable, accesible y preciso para la evaluación del número de sinapsis en el cerebro.
En este artículo describimos cómo bien identificar y determinar el número de sinapsis usando microscopia de la inmunofluorescencia en rebanadas de hipocampo cerebral de roedor. Las sinapsis son definidas por la colocalización de marcadores previos y post sinápticos que aparecen en una distribución de punteado. Demostramos la validez de esta técnica a través del estudio de Wnt de señalización en el cerebro. Wnts son proteínas de secreción importantes para la formación, eliminación y mantenimiento de las sinapsis. La inducción en vivo de un antagonista de la secretada de la cascada de Wnt, Dickkopf-1 (Dkk1), conduce a la pérdida sináptica excitatoria conservando las sinapsis inhibitorias en el hipocampo10. Ilustramos la identificación y conteo de sinapsis inhibitorias y excitatorias en rebanadas de hipocampales de un ratón adulto expresando Dkk1 y resaltar la transferencia de esta técnica a otros tipos de preparaciones de cultivo de tejidos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB5905</td>
			<td>vGlut1 (1:2000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MA1-046</td>
			<td>PSD-95 (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>131 004</td>
			<td>vGAT (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>147011</td>
			<td>Gephyrin (1:500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5392</td>
			<td>MAP2 (1:10000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>Jackson Laboratories</td>
			<td>706-545-148</td>
			<td>Donkey Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 (1:600)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175470</td>
			<td>Donkey Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 (1:600)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td>Fluoromount-G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NA</td>
			<td>FV1000 confocal microscope using a 60x 1.35 numerical aperture (NA) oil objective. For vGlut1, use a 488 laser with a percentage power of 14%. For PSD-95 use a 559 laser with a percentage power of 20%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Volocity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>203</td>
			<td>No 11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1446875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2, 5% CO2</td>
			<td>BOC</td>
			<td>NA</td>
			<td>Cylinder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>7107</td>
			<td>08-1.0mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iDkk1 mice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Mice were obtained by crossing tetO Dkk1 transgenic mice with CaMKII&#945; rtTA2 transgenic mice. TetO Dkk1 transgenic mice and CaMKII&#945; rtTA2 were crossed in a heterozygous state. Both mouse lines were bred in a C57BL/6J background. Single transgenic and WT littermate were used as controls.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents for solutions:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V800372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>255793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg2Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kynurenic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>K3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>107360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5767</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Serum</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S30-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of synapse density in hippocampal rodent brain slices

En el cerebro, las sinapsis son uniones especializadas entre neuronas, determinando la fuerza y la extensión de la señalización neuronal. El número de sinapsis es estrictamente regulado durante el desarrollo y maduración neuronal. Lo importante, déficit en el número de sinapsis puede conducir a la disfunción cognitiva. Por lo tanto, la evaluación del número de sinapsis es parte integral de la neurobiología. Sin embargo, como las sinapsis son pequeñas y muy compactas en el cerebro intacto, la evaluación del número absoluto es un reto. Este protocolo describe un método para fácilmente identificar y evaluar la sinapsis en el hipocampales rebanadas roedores usando microscopia de la inmunofluorescencia. Incluye un procedimiento de tres pasos para evaluar las sinapsis en imágenes de microscopía confocal de alta calidad mediante el análisis de colocalización de proteínas pre- y postsinápticas en rebanadas hippocampal. También explica cómo el análisis se realiza y da ejemplos representativos de sinapsis tanto excitatorias como inhibitorias. Este protocolo proporciona una base sólida para el análisis de las sinapsis y se puede aplicar a cualquier investigación investigar la estructura y función del cerebro.

Pérdida de sinapsis ocurre en enfermedades neurodegenerativas como el anuncio y la enfermedad de Parkinson2,11,12. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes a estos déficits siguen siendo mal entendidos. Deficiencias en la señalización de Wnt se han asociado con AD13,14,15,16,17. Wnts son glucoproteínas secretadas y juegan un papel esencial en la formación de sinapsis y la modulación de la transmisión sináptica18,19,20,21. Recientemente, se identificaron Wnts como reguladores claves de mantenimiento sináptica en el sistema nervioso maduro10,22. Para estudiar con precisión el impacto de Wnt de señalización en las sinapsis en el hipocampo de ratones modificados genéticamente, aprovechó de una preparación de corte de cerebro y microscopía confocal para evaluar los cambios en el número de sinapsis. Se identificaron rebanadas sanos en el que la estructura estaba bien conservada (figura 2A). Por otra parte, la selección de puncta sináptica se definió cuidadosamente, con la exclusión de grandes objetos manchados que probablemente representan agregadas proteínas (figura 2B). Este criterio se aplicó a todas las imágenes, con los mismos parámetros de análisis estricto.
Se utilizó un sistema del modelo transgénico que induce la expresión de la antagonista de Wnt secretada Dkk1 en adulto controlan de ratones (iDkk1) debajo de tetraciclina (véase la Tabla de materiales)10,22. Hemos demostrado que el bloqueo de la señalización de Wnt en el hipocampo adulto provoca pérdida de sinapsis excitatorias específicamente en la región CA1 de radiatum estrato (figura 3). Figura 3A muestra representativas imágenes confocales de marcadores previos y postsinápticos excitatorios (vGlut1 y PSD-95, respectivamente) de rebanadas de hipocampales de ratones iDkk1 expresando Dkk1 por dos semanas, así como sus respectivos controles. Analizamos estas imágenes utilizando el software de Volocity y demostró una reducción significativa en el número de sinapsis excitatorias, cuantificada por la co-localización de puncta vGlut1 y PSD-95-marcado en la región CA1 del hipocampo de ratones de iDkk1 siguiendo la inducción de Dkk1 durante dos semanas (figura 3B, * p &#60; 0.05; Prueba de Kruskal-Wallis; 6 ratones por genotipo). En el CA1 estrato radiatum, el número de sinapsis excitatorias puncta por 1.000 μm3 se redujo de 500 en ratones control a 300 en ratones iDkk1. Por el contrario, expresión de Dkk1 inducida no afectó el número de las sinapsis inhibitorias (identificado por la colocalización entre los marcadores pre y postsinápticos vGAT y gephyrin, respectivamente), como se muestra en la Figura 4A-B (p &#62; 0.05; Prueba de Kruskal-Wallis; 3 ratones por genotipo).
Lo importante, se realizó un análisis de poder estadístico para estimar la cantidad de rebanadas y animales necesarios para generar estos resultados robustos. Con R, se calculó que se necesitaban aproximadamente 35 rebanadas por condición (animales de rebanadas x 6 3 imagenes x 3 = 36) para detectar un tamaño del efecto grande (f = 0.4) con 80% de confianza (energía = 0,8) en un ANOVA unidireccional con la replicación y el bloqueo, como se describe en el paso 3.2.6.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig3.jpg"> 
Figura 3: pérdida de sinapsis excitatorias en rebanadas de hipocampales de ratones iDkk1. (A) representante de imágenes confocales de la CA1 estrato radiatum Mostrar excitatoria sinapsis, identificada por la co-localización de vGlut1 y PSD-95 (flechas blancas). La parte inferior representa un aumento mayor del rectángulo resaltado. Barras de escala = 2 μm. (B) el porcentaje de sinapsis excitatorias entre control y iDkk1 se cuantificó utilizando el software mencionado en la Tabla de materiales (* p &#60; 0.05; Prueba de Kruskal-Wallis; 6 ratones por genotipo). Los datos son ± mentionada aquí SEM. Esta figura se ha modificado de la referencia10. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56153/56153fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56153/56153fig4.jpg"> 
Figura 4: las sinapsis inhibitorias son sin cambios en rebanadas de hipocampales de ratones iDkk1. (A) representante de imágenes confocales de la CA1 estrato radiatum de las sinapsis inhibitorias por la colocalización entre vGAT y gephyrin (flechas blancas). La parte inferior representa un aumento mayor del rectángulo resaltado. Barras de escala = 2 μm. (B) porcentaje de las sinapsis inhibitorias entre ratones control y iDkk1, como cuantificado utilizando software Volocity (p &#62; 0.05; Prueba de Kruskal-Wallis; 3 ratones por genotipo). Los datos son ± mentionada aquí SEM. Esta figura se ha modificado de la referencia10. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56153/56153fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alta sacarosa ACSF componentes</td>
			<td>Concentración</td>
			<td>Notas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>75 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4, 2 H2O</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ácido quinurénico</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ácido pirúvico</td>
			<td>2 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>0,1 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>Añadir después la oxigenación de la solución</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>4 mM</td>
			<td>Añadir después la oxigenación de la solución</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucosa</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sacarosa</td>
			<td>100 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cámara sumergida ACSF componentes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>125 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4, 2 H2O</td>
			<td>1,25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>Añadir después la oxigenación de la solución</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
</tr></tbody></table>			<td>1 mM</td>
			<td>Añadir después la oxigenación de la solución</td>
		
		<tr>
			<td>D-glucosa</td>
			<td>25 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
	

Tabla 1: Composición de ACSF.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tampón de bloqueo/permeabilizing</td>
			<td>Concentración</td>
			<td>Notas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suero de burro</td>
			<td>10%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X</td>
			<td>0.50%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>1 x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x PBS</td>
			<td></td>
			<td>pH a 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>1.37 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>27 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>100 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>18 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% PFA/4% sacarosa</td>
			<td></td>
			<td>pH a 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>1 x</td>
			<td>Diluir de 10 x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>1.33 M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sacarosa</td>
			<td>117 mM</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 2: Buffers utilizados para la tinción inmunofluorescente.

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Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Un protocolo para identificar con precisión y analizar sinapsis en rebanadas hippocampal mediante inmunofluorescencia se describe en este artículo.

Evaluación de la densidad de sinapsis en rebanadas de hipocampo cerebral de roedor

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...

evaluation-of-synapse-density-in-hippocampal-rodent-brain-slices

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.8K vistas.  University College London. Un protocolo para identificar con precisión y analizar sinapsis en rebanadas hippocampal mediante inmunofluorescencia se describe en este artículo.

Video: Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

Preparación de oligómeros β-amiloide 1-42 Y la inducción del deterioro de plasticidad sináptica en rodajas de hipocampo

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Investigación

Neurociencias

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

Etiquetado DiOLISTIC de las neuronas de los roedores y no humanos rodajas de cerebro de los primates

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation de las neuronas del cerebro de roedores Rodajas para el Estudio de la transmisión sináptica y la imagen terminales presinápticos

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dos registros electrofisiológicos de sinápticamente respuestas evocadas neuronal y astroglial en agudas rodajas de hipocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pareadas Grabaciones de células enteras en organotípicos de hipocampo rebanadas

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

Baja densidad primaria del hipocampo Neurona Cultura

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Grabación de la plasticidad sináptica en rebanadas Hippocampal agudas mantenidas en un pequeño volumen reciclado - perfusión- y sistema de cámara de tipo inmersión

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) is a promising approach when pharmacological treatment fails or neurosurgery is not recommended. Acute brain slices coupled to microelectrode arrays (MEAs) represent a valuable tool to study neuronal network interactions and their modulation by electrical stimulation. As compared to conventional extracellular recording techniques, they provide the added advantages of a greater number of observation points and a known inter-electrode distance, which allow studying the propagation path and speed of electrophysiological signals. However, tissue oxygenation may be greatly impaired during MEA recording, requiring a high perfusion rate, which comes at the cost of decreased signal-to-noise ratio and higher oscillations in the experimental temperature. Electrical stimulation further stresses the brain tissue, making it difficult to pursue prolonged recording/stimulation epochs. Moreover, electrical modulation of brain slice activity needs to target specific structures/pathways within the brain slice, requiring that electrode mapping be easily and quickly performed live during the experiment. Here, we illustrate how to perform the recording and electrical modulation of 4-aminopyridine (4AP)-induced epileptiform activity in rodent brain slices using planar MEAs. We show that the brain tissue obtained from mice outperforms rat brain tissue and is thus better suited for MEA experiments. This protocol guarantees the generation and maintenance of a stable epileptiform pattern that faithfully reproduces the electrophysiological features observed with conventional field potential recording, persists for several hours, and outlasts sustained electrical stimulation for prolonged epochs. Tissue viability throughout the experiment is achieved thanks to the use of a small-volume custom recording chamber allowing for laminar flow and quick solution exchange even at low (1 mL/min) perfusion rates. Quick MEA mapping for real-time monitoring and selection of stimulating electrodes is performed by a custom graphic user interface (GUI).

We illustrate how to perform recording and electrical modulation of 4-aminopyridine-induced epileptiform activity in rodent brain slices using microelectrode arrays. A custom recording chamber maintains tissue viability throughout prolonged experimental sessions. Live electrode mapping and selection of stimulating pairs are performed by a custom graphical user interface.

Grabación y modulación de la actividad epileptiforme en rebanadas de cerebro de roedor juntada a arreglos de microelectrodos

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the dendritic filopodia establish contact with a target axon, they begin maturing into spines, leading to the formation of a synapse. Telencephalin (TLCN) is abundantly localized in dendritic filopodia and is gradually excluded from spines. Overexpression of TLCN in cultured hippocampal neurons induces dendritic filopodia formation. We showed that telencephalin strongly binds to an extracellular matrix molecule, vitronectin. Vitronectin-coated microbeads induced phagocytic cup formation on neuronal dendrites. In the phagocytic cup, TLCN, TLCN-binding proteins such as phosphorylated Ezrin/Radixin/Moesin (phospho-ERM), and F-actin are accumulated, which suggests that components of the phagocytic cup are similar to those of dendritic filopodia. Thus, we developed a method for purifying the phagocytic cup instead of dendritic filopodia. Magnetic polystyrene beads were coated with vitronectin, which is abundantly present in the culture medium of hippocampal neurons and which induces phagocytic cup formation on neuronal dendrites. After 24 h of incubation, the phagocytic cups were mildly solubilized with detergent and collected using a magnet separator. After washing the beads, the binding proteins were eluted and analyzed by silver staining and Western blotting. In the binding fraction, TLCN and actin were abundantly present. In addition, many proteins identified from the fraction were localized to the dendritic filopodia; thus, we named the binding fraction as the dendritic filopodia-rich fraction. This article describes details regarding the purification method for the dendritic filopodia-rich fraction.

In this protocol, we introduce a method for purifying the dendritic filopodia-rich fraction from the phagocytic cup-like protrusion structure on cultured hippocampal neurons by taking advantage of the specific and strong affinity between a dendritic filopodial adhesion molecule, TLCN, and an extracellular matrix molecule, vitronectin.

Purificación de la fracción defípoda dendrítica

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Evaluación de la inducción a largo plazo de la depresión en rodajas de cerebelosores adultos

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...