המחברים תודה בנואה Sorre דמיאן Cuvelier, פייר Nassoy, פרנסואה Quemeneur, גיל Toombes על תרומתם חיוני להקים את שיטת nanotube בקבוצה. שייכת הקבוצה ת כדי consortium CNRS את CellTiss, את Labex CelTisPhyBio (ANR-11-LABX0038), פריז מדעי et פרסים (ANR-10-IDEX-0001-02). פ-סי Tsai מומן על ידי EMBO מלגת לטווח ארוך (ALTF 1527-2014) ופעולות מארי קירי (H2020-MSCA-אם-2014, פרוייקט ממברנה-אזרין-אקטין). טרשת נפוצה הוא עמית ג'וניור מהבחורים סימונס החברה של.

המחברים אין לחשוף.

השיטה של משיכת צינורות מן האנשים שנגדם מעניקה מידע עשיר על מערכת חלבון ממברנלי, זה לא רק אמצעי למדידת התכונות המכאניות הבסיסית של הקרום, אך זה עוזר לשפוך אור על המושבים בין חלבוני ממברנה עקמומיות. כפי שפורט במבוא, טכניקות אחרות קיימים כדי למדוד את ההשפעות של עיקול קרום חלבונים, על-ידי המקננת החלבונים עם תת מיקרון ליפוזומים קשור משטח passivated18,19 או על ידי התבוננות היווצרות ספונטנית של בקוריאנית ב micropipette aspirated האנשים שנגדם עם ההזרקה של חלבון20,21. השיטה המתוארת כאן מספקת לחיבור ישיר גיאומטריות אנדוציטוזה, היא ייחודית במתן המדידות הפיזי חשוב של המערכת באותו זמן, כגון חלבון צפיפות, הממברנה מתח הממברנה כוח.
מגבלה חשובה של השיטה היא כי זה לא טריוויאלי לבנות, לכייל את כל הרכיבים מעורב וזמינותו. עם זאת, תוך שילוב של מיקרוסקופיה קונפוקלית, מלקחיים אופטיים ולאחר המיקרומניפולציה מספק מידע מקסימלי,. הרבה רכיבים מסוימים כמפורט במבוא, בהתאם למידע שצריך ללמוד אודות מערכת. הרכיבים מינימלי נאלצת בהצלחה את צימוד עקמומיות של חלבון, או כל שאר פוטנציאליים מצמידים עקמומיות מולקולה, הן של העצמות micropipette מיקרוסקופ קונפוקלי, עם מלקחיים אופטיים להיות לוותר. חשוב מכך, הרבה הכיול (כגון הכיול ממברנה צינור רדיוס וכן לקביעת צפיפות המשטח חלבון) בדרך כלל נחוצים רק לבצעה פעם אחת. מגבלה נוספת של השיטה היא כי זה יכול למדוד בוס אחד בלבד בכל פעם, לדרגה של שניים שלושה כשמרוגזים לשעה (עם תירגול); לעומת זאת מדידה כל מספק שפע של נתונים.
עבור מדידות תפוקה גבוהה יותר או אם זה חיוני כדי ללמוד את האינטראקציה של חלבונים עם כדורית, לא הכרישים גיאומטריות, מבחני אחרים יהיה צורך להיות חקר או מפותחים. המאמצים העתידיים יוקדשו: (1) עיצוב מערכת תפוקה גבוהה יותר שבו מרובים צינורות (מתוך האנשים שנגדם מרובים) יכול להיות שלף, למדוד בו זמנית, ושילוב (2) סופר-רזולוציה מיקרוסקופיה אז ללמוד את הפרטים של לגרדום חלבון זה טפסים בהנאנו.

תהליכים תאיים רבים, כגון אנדוציטוזה, סחר, היווצרות של filopodia, זיהום, וכדומה, מלווים בשינוי דרמטי הצורה של קרום התא1,2. בתא, מספר חלבונים להשתתף תהליכים אלה על ידי איגוד הקרום ושינוי הצורה שלהם. הדוגמאות הבולטים ביותר הם בני משפחת חלבונים Bin/Amphiphysin/מ א (בר), המכיל מאפיין מהותי מעוקל בר תחום3,4,5,6,7. בדרך כלל, הם אינטראקציה עם הקרום על-ידי שמירה התחום בר אל פני השטח, במקרים רבים, גם רדודות הוספת amphipathic helices bilayer. הצורה, בגודל תשלום של התחום בר יחד עם מספר amphipathic helices קובע: (1) לכיוון קרום עקמומיות (כלומר, אם הם יניעו invaginations או בליטות), (2) בסדר גודל של קרום עקמומיות5,8. ראוי לציין, כאן עקמומיות חיובית מוגדרת בתור הצד הקמור של קרום מעוקל, קרי, הבליטה כלפי בחלקיק אינטראקציה, ושליליות אחרת. יתר על כן, מחקרים כמותיים של בר חלבונים חשף כי השפעתם על הקרום תלויה סט של פרמטרים פיזיקליים: משטח צפיפות של חלבונים, מתח הממברנה ממברנה צורה (שטוח לעומת צינורי לעומת כדורית הצורה)7. בהתאם פרמטרים אלה בר חלבונים יכולים: (1) מתנהג כמו חיישנים עקמומיות ממברנה, (2) לכופף ממברנות או (3) זירוז ממברנה scission7.
בשל המספר העצום של רכיבים מעורב שינוי צורה קרום התא, לומד בהיבטים כמותיים של התופעה, כגון אנדוציטוזה, ויוו הוא מאוד מאתגר. במבחנה הכינון של רכיבים מינימלי מחקה מעוקל ממברנות התא מספק אמצעי כדי להשיג הבנה מכניסטית של איך מתעקל קרום חלבונים לפעול. מאמר זה מתאר פרוטוקול שתפעילי. מחדש ממברנה nanotube במבחנה באמצעות חוץ-גופית, מיקרוסקופיה קונפוקלית מלקחיים אופטיים. הגישה ניתן ללמוד, באופן כמותי, כמה חלבונים, שומנים, או מולקולות קטנות אינטראקציה עם ממברנות מעוקל. האנשים שנגדם השומנים משמשים כמודלים של קרום התא, עקמומיות של מי הוא זניח בהשוואה לגודל של מולקולות מתעקל ממברנה אינטראקציה. . הם מוכנים באמצעות שיטת electroformation9 שבו השלפוחיות המוגלתיות נוצרות על ידי לחות סרט השומנים ונפיחות זה לתוך האנשים שנגדם תחת זרם חילופין (AC)10. מצעים הנפוץ ביותר שבו גדלים כשמרוגזים לוחיות גם מוליך למחצה מצופה תחמוצת בדיל אינדיום (ITO) או פלטינה חוטים (Pt-חוטים)11. בעבודה זאת, האנשים שנגדם גדלים Pt-חוטים כמו בשיטה זו הוכח לעבוד הרבה יותר טוב מאשר החלופה בקבלת כשמרוגזים בנוכחות מלחים מאגר12. למרות פרוטוקול electroformation מתואר כאן בפירוט מספיק כדי לשחזר את הכל, אנו להפנות את הקורא למאמרי הקודם בו תוארו דומה ושיטות אחרות של עשיית כשמרוגזים פרט13,14. בידיים שלנו, electroformation-Pt-חוטים בהצלחה הניב כשמרוגזים שילוב של ליפידים סינטטי או טבעי השומנים תמציות במאגר המכיל ~ 100 מ"מ NaCl. יתר על כן, היה גם אפשר לתמצת חלבונים בתוך האנשים שנגדם במהלך צמיחה. תא electroformation לדוגמה מוצג איור 1A; היא כוללת שני ~ 10-ס מארוך Pt-חוטי מוכנס לתוך בעל עשוי טפלון (PTFE) זה יכול להיות אטום משני הצדדים עם coverslips זכוכית דקה ~ 1-2 סנטימטרים (איור 1 א').
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56086/56086fig1.jpg"> איור 1: הגדרת הניסוי. (א) electroformation בוס קאמרית עם מחברים חשמליים המוצמד Pt-חוטים. שמאל (B): מערכת ניסויית מציג את המיקרוסקופ, תא ניסיוני מעל המטרה, שני micropipettes (ימינה ושמאלה) לחבר micromanipulators ונוסף תא ניסיוני עבור צינור למשוך וחלבון זריקה. משמאל: מבט מקרוב על תא ניסיוני רכוב מעל המטרה מציג את הטיפים של השאיפה, את micropipettes הזרקה שנוספה. (ג) A המזרק המצויד מתקן דק מוכנס לתוך micropipette בקצה האחורי שלו. החלק התחתון הוא להציג מקרוב מנפק פנימה micropipette עם הקו המקווקו כחול חלוקה לרמות של micropipette. מערכת זו משמשת כדי למלא את micropipette עם קזאין passivate משטח זכוכית וגם בחזרה מילוי עם שמן מינרלי בעת הצורך. (ד) A מערכת המשמשת האחות µL כמויות של הפתרון חלבון. המחט מחוברת מזרק, אבובים אשר מחובר micropipette הזריקה. הטיפ micropipette בקפידה שקוע בתוך תמיסת חלבון, aspirated אז כדי למלא את הטיפ micropipette. Micropipette ואז בחזרה מלא שמן מינרלי באמצעות מערכת שמוצג בחלונית ג <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56086/56086fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
שפופרת הנאנו ממברנה, הנעות בטווח מ מ-7 nm מספר מאות ננומטר, יכול להיות משך של בוס על ידי כוח חיצוני. שיטה זו תוכנן בתחילה כדי למדוד את המאפיינים אלסטי של קרום התא ושלפוחיות, כגון ה15,כיפוף קשיחות16. בעבודותיו האחרונות, השיטה הוארך כדי ללמוד את האינטראקציה של חלבונים עם ממברנות מעוקל מאת microinjecting את החלבונים ליד ה-7,nanotube משך17. פותחו שיטות אחרות ללמוד מתעקל קרום חלבונים. בשיטה אחת, חלבונים מודגרת עם ליפוזומים בגודל שונה קשור משטח passivated. מיקרוסקופיה קונפוקלית משמש כדי למדוד את חלבון מחייב כפונקציה של ליפוזום קוטר, אשר יכולה להצביע על עקמומיות-induced המיון18,19. שיטה נוספת החלבונים מוזרקים סמוך בוס aspirated מיקרו כדי למדוד את היכולת שלהם באופן ספונטני זירוז בקוריאנית20,21. השיטה המתוארת ב פרוטוקול זה הוא לצורכיכם ללמוד מתעקל ממברנה החלבונים המעורבים אנדוציטוזה, שבו רוב החלבונים בדרך כלל המפגש ממברנה preformed צינורות חיבור של invagination ממברנה המכילים מטען עם קרום פלזמה שטוח המשמש כבסיס. יתר על כן, בשיטה זו, בניגוד ב וזמינותו עם עגינה ליפוזומים קטנים, nanotube ממברנה ללא הרף מחובר הקרום; לכן, זה שיווי משקל מכני עם הבוס, המצב צפוי ויוו. לפיכך, הממברנה הבסיסית פיזיקה חל, אנחנו יכולים להסיק שפע של תכונות מכניות שלנו מדידות22,23,24.
עבור יישום מלא של שיטה זו, הציוד הנדרש כולל מיקרוסקופ קונפוקלי מלקחיים אופטיים, micropipettes אחד או שניים מחובר מיכל מים (איור 1B). על ידי שילוב של כל השלושה, זה האפשרות במקביל למדידת מתח הממברנה, עקמומיות ממברנה, צפיפות המשטח של חלבונים, צינור כוח25. השאיפה micropipette הוא חיוני, היא בנויה בקלות על-ידי הוספת micropipette של זכוכית בעל מחובר מיכל מים, השולטת, באמצעות לחץ הידרוסטטי, שאיפה הלחץ26. את micropipette ואת המחזיק נשלטים על-ידי micromanipulator ו, באופן אידיאלי, בכיוון אחד על ידי אלמנט פייזו-למפעיל לתנועה דיוק. כדי למשוך שפופרת הנאנו, microaspirated בוס תקוע בקצרה בגודל מיקרון חרוז ואז משם יצירת שפופרת הנאנו. ביישום זה, החרוז מתקיים על ידי מלקחיים אופטיים, אשר ניתן לבנות על-ידי ביצוע של פרוטוקול שפורסמו27. זה אפשרי לוותר של מלקחיים אופטיים, למשוך צינוריות בדרכים שונות, אם כי במחיר של מדידות מדויקות כוח. אם זה יותר מדי אתגרי לבנות מלכודת אופטי או אם כוח המידות הם לא חיוניים, כמו למשל אם אדם פשוט רוצה לבדוק את ההעדפה של חלבונים לממברנות מעוקל, יכול להיות משך צינור חרוז aspirated בקצה השני micropipette28. . זה גם ניתן למשוך צינורות באמצעות כוח כבידה29 או30,31לזרום... יתר על כן, מיקרוסקופיה קונפוקלית אינה חיונית גם; עם זאת, זה הוא העדיף אז למדידת צפיפות המשטח של חלבונים. זה גם מאפשר מדידת הרדיוס nanotube מפני קרינה פלואורסצנטית האינטנסיביות של ליפידים בצינור, ובכך ללא תלות ממברנה כוח ומתח. מסיקה רדיוס שפופרת של קרינה פלואורסצנטית חשוב במיוחד אם היחסים בין כמויות אלה סוטה משוואות ומבוססת בשל נוכחותם של חלבוני ממברנה-דבקה25. חשוב, אחד לא יכול לחלק של מלכודת אופטי והן מיקרוסקופיה קונפוקלית, כפי שזה לא יהיה אפשר למדוד את שיפוע הצינור.
השיטה כפי שמתואר פרוטוקול זה שימש ללמוד עקמומיות-induced המיון של חלבונים שונים ממברנה פריפריאלי על צינוריות, בעיקר אלה של בר משפחה25,32,33,34 . היא שודרה גם בערוץ אשלגן transmembrane conically בצורת ש-kvap מועשר על מעוקל צינוריות. באותה דרך כמו בר חלבונים35. על-ידי מיטוב השיטה כדי לכמס חלבונים בתוך בסדר, פרנקי, האינטראקציה של חלבונים עם עקמומיות שלילית נחקר לאחרונה בשם טוב36. יתר על כן, שיטה זו שימש התירי את היווצרות החלבון פיגומים25,37 , ללמוד את המנגנון של הממברנה scission או קו המתח38, חלבון dynamin39, או על ידי בר חלבונים40,41. בנוסף חלבונים, מולקולות קטנות או יונים יכול גם לגרום עקמומיות. באמצעות שיטה זו, יונים של סידן הוצגו לזירוז עקמומיות חיובית תחת תנאים ללא מלח42. מעניין, גם הוכח כי שומנים יכולות לעבור עקמומיות מיון, למרות רק עבור קומפוזיציות הסמוכים demixing נקודה43,44. לסיכום, שיטת יכול לשמש על ידי חוקרים המעוניינים לחקור איך גם רכיבים ממברנלי אינטגרלי (למשל, שומנים או חלבונים transmembrane) או באופן עקיף מחייב מולקולות (גם בתוך או מחוץ כשמרוגזים) אינטראקציה עם ממברנות cylindrically מעוקל, נקודות מבט מכני ולא כמותית. זה גם מיועד למעוניינים מדידת תכונות מכניות של קרום עצמה22,23,45.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850375</td>
			<td>Example lipid used in data for Figure 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethyleneglycol)-2000] [DSPE-PEG(2000)-biotin]</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>880129</td>
			<td>biotinylated lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY-TR-C5-ceramide</td>
			<td>Molecular Probes (ThermoFisher)</td>
			<td>D7540</td>
			<td>fluorescent lipid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY- FLC5-hexadecanoyl phosphatidylcholine (HPC*)</td>
			<td>Molecular Probes (ThermoFisher)</td>
			<td></td>
			<td>fluorescent lipid for protein density calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>egg L-&#945;-phosphatidylcholine (eggPC)</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>840051</td>
			<td>used for calibrating the tube radius constant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-casein from bovine milk (&#62;99%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C6905</td>
			<td>used for passivating the micropipette and the experimental chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+) glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>osmometer</td>
			<td>Loser</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pt-wires, 0.5 mm diameter, 99.99% pure</td>
			<td>Goodfellow USA</td>
			<td>PT005139</td>
			<td>used for GUV electroformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>function generator</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>used to create current for GUV electroformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>putty sealant</td>
			<td>Vitrex (from CML France)</td>
			<td>CRIT 140013</td>
			<td>used to seal the electroformation chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bath sonicator</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td>useful to clean the electroformation chamber, but not crucial</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon TE2000 inverted microscope, eC1 confocal system (Nikon), with two laser lines (&#955; = 488 nm and 543 nm); optical tweezers induced by a 5 W ytterbium fiber continuous wave laser (&#955; &#62; 1070 nm; IPG GmBH Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>an example of a confocal microscopy system equipped with optical tweezers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulators</td>
			<td></td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>borosilicate capillaries (with internal and external radii of 0.78 mm and 1 mm, respectively)</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>30-0036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microforge</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MF-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>piezoelectric actuator</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polystyrene streptavidin coated beads (diameter 3.2 &#181;m)</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>SVP-30-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pulling membrane nanotubes from giant unilamellar vesicles

העיצוב מחדש של קרום התא הוא חלק בלתי נפרד של תופעות סלולר רבות, כגון אנדוציטוזה, סחר בבני אדם, היווצרות של filopodia, וכו '. הרבה חלבונים שונים לשייך ממברנות מעוקל בגלל היכולת שלהם לחוש או זירוז עקמומיות ממברנה. בדרך כלל, תהליכים אלה כוללות מספר רב של חלבונים הפיכתם מורכב מדי ללמוד באופן כמותי בתא. אנו מתארים את פרוטוקול שתפעילי. מחדש ממברנה מעוקל במבחנה, מחקה את מבנה הסלולר מעוקל, כגון בצוואר endocytic. שלפוחית unilamellar ענק (בוס) משמש כמודל של קרום התא, אשר מתח ולחץ פנימי נשלט עם השאיפה micropipette. החלת של נקודת כוח מושך על הבוס באמצעות מלקחיים אופטיים יוצר שפופרת הנאנו עקמומיות גבוהה מחובר קרום שטוח. שיטה זו באופן מסורתי שימש כדי למדוד את התכונות המכאניות הבסיסית של ממברנות השומנים, כגון כפיפת קשיחות. בשנים האחרונות, זה הורחבה כדי ללמוד איך חלבונים אינטראקציה עם ממברנה עקמומיות ועל הדרך שבה הם משפיעים על הצורה והן את המכניקה של ממברנות. מערכת המשלבת חוץ-גופית, microinjection, מלקחיים אופטיים, מיקרוסקופיה קונפוקלית מאפשר מדידה של עקמומיות הממברנה מתח הממברנה, צפיפות המשטח של חלבונים, במקביל. מ מדידות אלה, שניתן להסיק נכסים חשובים רבים מכני ולא מורפולוגי של מערכת חלבונים-הממברנה. בנוסף, אנו להניח את פרוטוקול של יצירת כשמרוגזים בנוכחות ריכוז מלח פיזיולוגית, שיטה לכימות צפיפות המשטח של חלבונים על הקרום של עוצמות קרינה פלואורסצנטית שכותרתו חלבונים ושומנים.

הניסוי למשוך צינור יכול לתת מידע חיוני מכני על הקרום. בהיעדרו של חלבונים או מולקולות אחרות לכפות זוג עם ממברנה עקמומיות, הקרום, שפופרת radius יכול להיות קשור עם קרום המתח על-ידי החלת המילטוניאן Canham-Helfrich את משוואת לרכבת התחתית מהכלא בוס50,51 
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56086/56086eq3v6.jpg">(משוואת 1)
איפה <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56086/56086eq4v3.jpg"> הוא קרום אנרגיה חופשית של הרכבת התחתית, ממברנה K כיפוף קשיחות, r ו- R0 הם, בהתאמה, הממוצע, את רדיוס ספונטנית של עקמומיות, σ קרום המתח, A האזור של הרכבת התחתית, L אורך צינור, ו- f נקודת הכוח שהופעל על ידי הצינורית על החרוז. ב"שיווי r הוא רדיוס שפופרת, מסומן בתור R, והופך f הכוח שפופרת-הכחשה, נ, דהיינו, כוח שיווי משקל שבו הצינור מושך החרוז במלכודת אופטי. כדי לחשב F ו- R, אנו למזער <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56086/56086eq4v3.jpg"> ביחס L ו- r, מניב22,23
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56086/56086eq5v4.jpg">(משוואת 2)
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56086/56086eq6v5.jpg">(משוואה 3)
R 0 מוזנח אם שני כרוזים של הקרום יש הרכב זהה, למרות זאת הוא העריך כי גורמים אחרים, כגון תשלום repulsions יכול לגרום כמה עקמומיות ספונטנית42. המידות כוח, רדיוס צינורות שלף מתוך 100% DOPC כשמרוגזים הן בהסכם מעולה עם תחזיות תיאורטיות בין 2 משוואות משוואה 3 (איור 4). שני המדדים אינם תלויים כפי הכוח נמדד העקירה של החרוז המלכודת אופטי, הרדיוס של עוצמת קרינה פלואורסצנטית, ולכן מתן שתי דרכי חישוב קרום כיפוף קשיחות. שראוי משוואה 2 ו- 3 משוואת התשואות המוצגות נתונים: K = (25.1 ± 1.4) (זאת אומרת ± SD) kBT ו (22.1 ± 1.5) kB.T, בהתאמה, כפי שצוין בעבר נמדד42 .
אם להתנסות עם עקמומיות-מצמד חלבונים, זה הוא הציע להשתמש יותר מתוחכם המשוואה של המילטוניאן מזו משוואה 1, כמו משוואה 1 חשבונות רק עבור עקמומיות ספונטנית יעיל, להסביר ההשפעה של חלבונים על תכונות מכניות של הקרום או אינטראקציות חלבון אפשרי. ראה, למשל,25,35,36,52,53. למרות מודלים עיוניים מתקדמים הם חיוניים עבור הבנה מעמיקה של מערכת חלבון ספציפי-הממברנה, בלי להזדקק להם, זה עדיין אפשרי לקבל מידע שימושי מאוד מן השיטה מושך-צינור.
לדוגמה, כדי לבדוק אם חלבונים חש עקמומיות, שהבוטות היחסית של חלבונים על המרקע נמדד בהשוואה להבוס, אשר נחשב שטוח. האינטראקציה עם עקמומיות חיובית הוא למד על ידי הזרקת החלבונים ליד הצינור עם השני micropipette25. האינטראקציה עם עקמומיות שלילית או את אופן הפעולה של חלבונים transmembrane הוא למד על ידי לבצע או לשחזר חלבונים במהלך בוס היווצרות35,36. העשרת היחסי של בר KvAP חלבונים על קרום צינורות האנשים שנגדם הבסיסית מציינת כי הם מעדיפים מעוקל ממברנות (איור 5). . להיות יותר כמותיים, העשרה זו ייתכן יחושבו מקדם המיון, S, על פי:
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/56086/56086eq7v4.jpg">(משוואת 4)
איפה אניפרוט, ג'קוזי , אניפרוט, בוס עוצמות קרינה פלואורסצנטית חלבונים על המרקע, על הבוס, בהתאמה, והם אנישפתון, ג'קוזי , אני. ליפ, בוס עוצמות קרינה פלואורסצנטית שומנים על המרקע, על הבוס, בהתאמה.
דוגמה נוספת היא מדידה הכוח צינור כמו החלבון נקשר הקרום. איור 5B, ג מראה כי endophilin חלבון של N-בר ש-a2 מפחית בהדרגה את הכוח שפופרת, להקטין את זה לאפס, המציין כי זה הקימו מבנה תלת מימדי שמחזיק את הצינור יציב, אשר נקראת לפיגום. מבנים אלו תפקיד חשוב אנדוציטוזה, על ידי תיקון רדיוס שפופרת, אלא גם הפעלת scission7,41. מדידה של S, כמו גם את תופעות מורפולוגיות מכני זה חלבונים לכפות על ממברנות מספק תובנות חשובות איך הם פועלים על התופעות מעוקלת קרום התא.

<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56086/56086fig4.jpg"> איור 4: נציג תוצאות מדידות מכניות בהיעדרו של חלבונים- המוצגים כוח ליניארית, שפופרת רדיוס התלות מתח הממברנה בשביל קרום DOPC 100%, משלוש מדידות עצמאי, שפורסם בעבר42. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56086/56086fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56086/56086fig5.jpg"> איור 5: התוצאות נציג של עקמומיות חישה לגרדום היווצרות מאת בר חלבונים. (א) עקמומיות חישה של החלבון-בר IRSp53. החלבון החושים עקמומיות ממברנה שלילי, מאוגד בצד הפנימי של הבוס, עם כמות זניחה של מתנה חלבון על הממברנה החיצונית העלעל. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. Reprinted מ-36, תחת יצירתי של מלאי CC-מאת רישיון, זכויות יוצרים 2015, קבוצת הפרסום הטבע. (B) ויוצרים לפיגום חלבונים על-ידי endophilin חלבון N-בר. החלבונים מוזרקים ליד הצינור, לכן מאוגדים על העלעל הממברנה החיצונית. כפי שמתואר37, endophilin נקשר לבסיס של הצינור ויוצר לפיגום שגדלה באופן רציף לאורך הצינור של הבוס לעבר המלכודת אופטי (OT, עיגול לבן). (ג) A kymogram של endophilin לגרדום צמיחה הבוס החרוז, עם הערוצים שומנים וחלבונים בשכבות. העלילה מציגה את צינור כוח, F, כפונקציה של הזמן, t. צירי הזמן את kymogram ואת העלילה זהים (x-ציר משותף). ב B ו- C, סולם בר = 2 מיקרומטר. Reprinted באישור הפניה37, זכויות יוצרים (ריו דה ז'ניירו) האקדמיה הלאומית למדעים. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56086/56086fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles at JoVE.com

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

חלבונים רבים בתא לחוש, זירוז עקמומיות ממברנה. אנו מתארים שיטה למשוך ממברנה צינוריות מן השומנים שלפוחית את האינטראקציה של חלבונים או כל מולקולה עקמומיות-פעיל עם ממברנות מעוקל חוץ גופית בתוך.

משיכת ממברנה צינוריות מן שלפוחית Unilamellar ענק

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

pulling-membrane-nanotubes-from-giant-unilamellar-vesicles

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.9K Views.  PSL Research University, CNRS UMR168. חלבונים רבים בתא לחוש, זירוז עקמומיות ממברנה. אנו מתארים שיטה למשוך ממברנה צינוריות מן השומנים שלפוחית את האינטראקציה של חלבונים או כל מולקולה עקמומיות-פעיל עם ממברנות מעוקל חוץ גופית בתוך.

Video: Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

גיבוש חלבונים בממברנה עבור קביעת מבנה באמצעות Mesophases Lipidic

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1. Many of these are referred to as cell-penetrating peptides, which are frequently noted for their potential as drug delivery vectors1-3. Moreover, there is increasing interest in antimicrobial peptides that operate via non-membrane lytic mechanisms4,5, particularly those that cross bacterial membranes without causing cell lysis and kill cells by interfering with intracellular processes6,7. In fact, authors have increasingly pointed out the relationship between cell-penetrating and antimicrobial peptides1,8. A firm understanding of the process of membrane translocation and the relationship between peptide structure and its ability to translocate requires effective, reproducible assays for translocation. Several groups have proposed methods to measure translocation into large unilamellar lipid vesicles (LUVs)9-13. LUVs serve as useful models for bacterial and eukaryotic cell membranes and are frequently used in peptide fluorescent studies14,15. Here, we describe our application of the method first developed by Matsuzaki and co-workers to consider antimicrobial peptides, such as magainin and buforin II16,17. In addition to providing our protocol for this method, we also present a straightforward approach to data analysis that quantifies translocation ability using this assay. The advantages of this translocation assay compared to others are that it has the potential to provide information about the rate of membrane translocation and does not require the addition of a fluorescent label, which can alter peptide properties18, to tryptophan-containing peptides. Briefly, translocation ability into lipid vesicles is measured as a function of the Foster Resonance Energy Transfer (FRET) between native tryptophan residues and dansyl phosphatidylethanolamine when proteins are associated with the external LUV membrane (Figure 1). Cell-penetrating peptides are cleaved as they encounter uninhibited trypsin encapsulated with the LUVs, leading to disassociation from the LUV membrane and a drop in FRET signal. The drop in FRET signal observed for a translocating peptide is significantly greater than that observed for the same peptide when the LUVs contain both trypsin and trypsin inhibitor, or when a peptide that does not spontaneously cross lipid membranes is exposed to trypsin-containing LUVs. This change in fluorescence provides a direct quantification of peptide translocation over time.

This protocol details a method for the quantitative measure of peptide translocation into large unilamellar lipid vesicles. This method also provides information about the rate of membrane translocation and can be used to identify peptides that efficiently and spontaneously cross lipid bilayers.

מדידת טרנסלוקציה פפטיד לתוך שלפוחית ​​Unilamellar גדול

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

שימוש ברובוט להתגבשות תפוקה גבוהה של חלבונים בממברנה בMesophases Lipidic

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate apoptosis1. Following cellular stress (e.g., DNA damage), the pro-apoptotic BCL-2 family effectors BAK (BCL-2 antagonistic killer 1) and/or BAX (BCL-2 associated X protein) become activated and compromise the integrity of the outer mitochondrial membrane (OMM), though the process referred to as mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP)1. After MOMP occurs, pro-apoptotic proteins (e.g., cytochrome c) gain access to the cytoplasm, promote caspase activation, and apoptosis rapidly ensues2.
In order for BAK/BAX to induce MOMP, they require transient interactions with members of another pro-apoptotic subset of the BCL-2 family, the BCL-2 homology domain 3 (BH3)-only proteins, such as BID (BH3-interacting domain agonist)3-6. Anti-apoptotic BCL-2 family proteins (e.g., BCL-2 related gene, long isoform, BCL-xL; myeloid cell leukemia 1, MCL-1) regulate cellular survival by tightly controlling the interactions between BAK/BAX and the BH3-only proteins capable of directly inducing BAK/BAX activation7,8. In addition, anti-apoptotic BCL-2 protein availability is also dictated by sensitizer/de-repressor BH3-only proteins, such as BAD (BCL-2 antagonist of cell death) or PUMA (p53 upregulated modulator of apoptosis), which bind and inhibit anti-apoptotic members7,9. As most of the anti-apoptotic BCL-2 repertoire is localized to the OMM, the cellular decision to maintain survival or induce MOMP is dictated by multiple BCL-2 family interactions at this membrane.
 Large unilamellar vesicles (LUVs) are a biochemical model to explore relationships between BCL-2 family interactions and membrane permeabilization10. LUVs are comprised of defined lipids that are assembled in ratios identified in lipid composition studies from solvent extracted Xenopus mitochondria (46.5% phosphatidylcholine, 28.5% phosphatidylethanoloamine, 9% phosphatidylinositol, 9% phosphatidylserine, and 7% cardiolipin)10. This is a convenient model system to directly explore BCL-2 family function because the protein and lipid components are completely defined and tractable, which is not always the case with primary mitochondria. While cardiolipin is not usually this high throughout the OMM, this model does faithfully mimic the OMM to promote BCL-2 family function. Furthermore, a more recent modification of the above protocol allows for kinetic analyses of protein interactions and real-time measurements of membrane permeabilization, which is based on LUVs containing a polyanionic dye (ANTS: 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid) and cationic quencher (DPX: p-xylene-bis-pyridinium bromide)11. As the LUVs permeabilize, ANTS and DPX diffuse apart, and a gain in fluorescence is detected. Here, commonly used recombinant BCL-2 family protein combinations and controls using the LUVs containing ANTS/DPX are described.

Biochemically-defined large unilamellar vesicles (LUVs) are a convenient model system to analyze BCL-2 family interactions with immediate implications in better understanding the mitochondrial pathway of apoptosis. A method to produce LUVs, along with standard BCL-2 family protein combinations and controls to examine LUV permeabilization, are presented.

BCL-2 פונקצית בחינת משפחה עם שלפוחית ​​Unilamellar גדולה

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate ...

Giant Liposome Preparation for Imaging and Patch-Clamp Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify and explore the function of these important proteins. However, classical preparations, such as planar bilayers, limit the manipulations and experiments that can be performed on the reconstituted channel and its membrane environment. The more cell-like structure of giant liposomes permits traditional patch-clamp experiments without sacrificing control of the lipid environment.
Electroformation is an efficient mean to produce giant liposomes &gt;10 &mu;m in diameter which relies on the application of alternating voltage to a thin, ordered lipid film deposited on an electrode surface. However, since the classical protocol calls for the lipids to be deposited from organic solvents, it is not compatible with less robust membrane proteins like ion channels and must be modified. Recently, protocols have been developed to electroform giant liposomes from partially dehydrated small liposomes, which we have adapted to protein-containing liposomes in our laboratory.
We present here the background, equipment, techniques, and pitfalls of electroformation of giant liposomes from small liposome dispersions. We begin with the classic protocol, which should be mastered first before attempting the more challenging protocols that follow. We demonstrate the process of controlled partial dehydration of small liposomes using vapor equilibrium with saturated salt solutions. Finally, we demonstrate the process of electroformation itself. We will describe simple, inexpensive equipment that can be made in-house to produce high-quality liposomes, and describe visual inspection of the preparation at each stage to ensure the best results.

Reconstituting functional membrane proteins into giant liposomes of defined composition is a powerful approach when combined with patch-clamp electrophysiology. However, conventional giant liposome production may be incompatible with protein stability. We describe protocols for producing giant liposomes from pure lipids or small liposomes containing ion channels.

הכנת Liposome ענקית הדמיה ותיקון מהדק Electrophysiology

The reconstitution of ion channels into chemically defined lipid membranes for electrophysiological recording has been a powerful technique to identify ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

כינונה מחדש של חלבון טראנסממברנלי, יון ערוץ מתח מגודרת, KvAP, לענק Unilamellar שלפוחית ​​למיקרוסקופי וצמד תיקון ללימודים

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperfusion טכניקה לחקירת הסדרת כלי דם קטן חדירות בחולדה לפדר

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

הדמיה סופר-ברזולוציה המחסור בקרקע בתאים בתרבית

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for phenotypic analyses of extracellular vesicles (EV) including exosomes (Exo) in the peripheral blood and other body fluids. The small size of EV mandates the use of dedicated instruments having a detection threshold around 50-100 nm. Alternatively, EV can be bound to latex microbeads that can be detected by FC. Microbeads, conjugated with antibodies that recognize EV-associated markers/Cluster of Differentiation CD63, CD9, and CD81 can be used for EV capture. Exo isolated from CM can be analyzed with or without pre-enrichment by ultracentrifugation. This approach is suitable for EV analyses using conventional FC instruments. Our results demonstrate a linear correlation between Mean Fluorescence Intensity (MFI) values and EV concentration. Disrupting EV through sonication dramatically decreased MFI, indicating that the method does not detect membrane debris. We report an accurate and reliable method for the analysis of EV surface antigens, which can be easily implemented in any laboratory.

The protocol describes a reproducible method designed for use with cell culture supernatants to detect surface epitopes on small extracellular vesicles (EV). It utilizes specific EV immunoprecipitation using beads coupled with antibodies that recognize surface antigen CD9, CD63, and CD81. The method is optimized for downstream flow cytometry analysis.

זרימה Cytometric ניתוח של שלפוחית חוץ-תאית ממדיה ממוזגים-תא

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules derived from the parental cells. EVs function as intra- and inter-species communication vectors while also contributing to the interaction between bacteria and host organisms in the context of infection and colonization. Given the multitude of functions attributed to EVs in health and disease, there is a growing interest in isolating EVs for in vitro and in vivo studies. It was hypothesized that the separation of EVs based on physical properties, namely size, would facilitate the isolation of vesicles from diverse bacterial cultures. 
The isolation workflow consists of centrifugation, filtration, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography (SEC) for the isolation of EVs from bacterial cultures. A pump-driven tangential flow filtration (TFF) step was incorporated to enhance scalability, enabling the isolation of material from liters of starting cell culture. Escherichia coli was used as a model system expressing EV-associated nanoluciferase and non-EV-associated mCherry as reporter proteins. The nanoluciferase was targeted to the EVs by fusing its N-terminus with cytolysin A. Early chromatography fractions containing 20-100 nm EVs with associated cytolysin A - nanoLuc were distinct from the later fractions containing the free proteins. The presence of EV-associated nanoluciferase was confirmed by immunogold labeling and transmission electron microscopy. This EV isolation workflow is applicable to other human gut-associated gram-negative and gram-positive bacterial species. In conclusion, combining centrifugation, filtration, ultrafiltration/TFF, and SEC enables scalable isolation of EVs from diverse bacterial species. Employing a standardized isolation workflow will facilitate comparative studies of microbial EVs across species.

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Bacteria secrete nanometer-sized extracellular vesicles (EVs) carrying bioactive biological molecules. EV research focuses on understanding their biogenesis, role in microbe-microbe and host-microbe interactions and disease, as well as their potential therapeutic applications. A workflow for scalable isolation of EVs from various bacteria is presented to facilitate standardization of EV research.

בידוד וטיהור מדרגיים של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...