המחברים מבקשים להודות אלינור פלמינג ג&#39;סיקה חן לדיונים מועילים. המימון ניתן על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (NIH-NIAID) פרס R15AI079685 לבין תאגיד מחקר קוטרל פרס קולג&#39; למדע. תמיכה סטודנט נוסף סופק על ידי הווארד יוז רפואי במכון ואת קרן סטנלי.

1. הכנת גדולה שלפוחית ​​ליפידים Unilamellar (&#39;לאב&#39;) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את &#39;לאב&#39; לשמש קרום התא מחקה עבור assay 19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Phosphatidylcholine מערבבים (POPC, 760.10 g / mol), phosphatidylglycerol (POPG. 770.99 g / mol), 5-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl phosphatidylethanolamine (DNS-האפיפיור, 994.350 g / mol) (ליפידים אוואנטי פולאר) מומס כלורופורם ב 50 : יחס 45:5. כפי assay כל דורש הכנה נפרדת של &#39;לאב&#39; הן ניסיוניות ושליטה, שני בקבוקונים עוגת השומנים צריכים להיות מוכנים. 0.376 מ&quot;ג של השומנים הכוללת (0.188 מ&quot;ג POPC, POPG 0.169 מ&quot;ג, ו - 0.019 מ&quot;ג DNS-האפיפיור) הוא בדרך כלל מספיקים כדי להפוך שלפוחית ​​מספיק משפט אחד טרנסלוקציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתנדף כלורופורם באמצעות זרם גז N 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש העוגה השומנים 9-14 שעות ייבוש ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 המניות mM HEPES חיץ פתרון (10 HEPES מ&quot;מ, 238.3 g / mol, 45 mM NaCl, 58.44 g / mol, 1 mM EDTA, 372.24 g / mol pH 7.4). חיץ HEPES הוא רחובored ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מלאי של 0.4 mM חזירי טריפסין (23.3 ק&quot;ג / mol) ב חיץ 10 mM HEPES מוכן לעיל. טריפסין מאוחסן ב -20 ° C ו, הלכה למעשה שלנו, בדרך כלל לא עוברות יותר מ 2 מחזורים להקפיא להפשיר לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מלאי של 4.0 mM באומן בירק, מעכבי טריפסין (8 ק&quot;ג / mol) ב 10 פתרון HEPES חוצץ מ&quot;מ חנות ב -20 ° C. בשימוש שלנו, מניות זה מתחדש מדי חודש ובדרך כלל אינו עובר יותר מ 3 הקפאה / הפשרה מחזורים לפני זה הוא עשה שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הניסוי מחדש שלפוחית ​​multilamellar (MLVs) בשנת פתרון 0.2 מ&quot;מ טריפסין ידי הוספת נפח זהה של מניות 0.4 mM טריפסין ו 10 פתרון HEPES mM חיץ העוגה השומנים יבשים. עבור מדגם אחד של 0.376 מ&quot;ג שומנים בסך הכל, תערובת של 150 μL של פתרון טריפסין ו 150 μL של חיץ HEPES מספיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שליטה מחדש MLVs בתמיסה עם 0.2 מ&quot;מ ו - 2.0 mM טריפסין באומן בירק, מעכבי טריפסין ידי הוספת נפח שווה 0.4 מ&quot;מ טריפסין המניות 4.0 mM מעכב טריפסין על עוגות השומנים יבשים. עבור מדגם אחד של 0.376 מ&quot;ג שומנים בסך הכל, תערובת של 150 μL של פתרון טריפסין ו 150 μL של מעכבי טריפסין מספיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת MLV פתרונות בקבוקוני זכוכית צינור microcentrifuge 1.7 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נושא MLV פתרונות 5 הקפאה / הפשרה מחזורים בחנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את השומנים extruder (ליפידים אוואנטי פולאר) על ידי הצבת שני תומך לסנן לחלח במאגר HEPES על כל פיסת טפלון extruder. המקום קרום לעקוב nuclepore חרוט עם נקבוביות 0.1 מיקרומטר (Whatman, United Kingdom) בין שתי חתיכות טפלון extruder, והמקום חתיכות extruder בתוך המכל מכבש מתכת. מניחים את הסופגניות על spacer את שני החלקים extruder לפני הידוק העליון של מתכת המכל extruder ומעמידים אותו לבעל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את נפח חלל בתוך מכבש עם 500 μL חיץ 10 mM HEPES באמצעות מזרק 250 זכוכית μL למנוע אובדן של מדגם שלפוחית. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען כל מדגם MLV לתוך מכבש ולדחוף את המדגם דרך הממברנה לפחות 21 פעמים כדי להבטיח שלפוחית ​​בגודל אחיד unilamellar. &#39;לאב&#39; מתקבלים שחול הבאים פתרון MLV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &#39;לאב&#39; חנות ב 4 ° C ולהשתמש תוך 48 שעות. </li></ol> 2. כימות LUV ריכוז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> LUV הריכוז היה לכמת ידי קביעת תוכן זרחן הכולל במדגם 20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 8.9 NH 2 SO 4 במים לאחסן nanopure ו בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן w 2.5% / v אמוניום molybdate VI (588.04 g / mol) פתרון במים nanopure. הכן 10% w / v חומצה אסקורבית (176.1 g / mol) פתרון במים nanopure. הגנו על חומצה אסקורבית פתרון מחשיפה לאור על ידי כיסוי הצינור בנייר. חנות הן פתרונות 4 ° C עד 2 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 0.65 פוספט mM חיץ פתרון (פוספט נתרן monobasic נטול מים, 120 ג&#39;/ mol). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן six תקן tuBes. תקני אמור להכיל 0.0 μL, 50 μL (0.0325 μmoles), 100 μL (0.065 μmoles), 175 μL (0.114 μmoles), 250 μL (0.163 μmoles), או 350 μL (0.228 μmoles) של פתרון זרחן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן LUV דוגמיות בשלושה עותקים. כל שפופרת מדגם אמור להכיל כ 0.1 μmoles של &#39;לאב&#39;. ניסיוני ושליטה LUV ריכוזים יש למדוד בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לתקן את כל מלחי זרחן מיובש אבקת באומן בירק, מעכב, שליטה LUV ריק חייב להיות מוכן. ריק אמור להכיל באותו נפח של 0.2 mM trypsin/2.0 פתרון מעכב mM באומן בירק, כפי הוצב לשלוט LUV צינור דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 450 μL של 8.9 NH 2 SO 4 לתוך כל המדגם, רגיל, צינורות ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים דגימות, סטנדרטים, ואת החסר במשך 25 דקות ב 175-210 מעלות בתנור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כל צינורות ולאפשר להם להתקרר. הוספת 150 μL של 30% H 2 O 2 לכל אחד tuBes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים דגימות, סטנדרטים, ואת החסר במשך 30 דקות ב 175-210 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את דגימות, סטנדרטים, ואת החסר מהאש. אם כל הפתרונות הם עדיין לא חסר צבע, להוסיף 50 μL H 2 O 2 לכל צינורות חום במשך 15 דקות נוספות ב 175-210 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3.9 מ&quot;ל nanopure H 2 O, 0.5 מ&quot;ל molybdate אמוניום פתרון 0.5 מ&quot;ל חומצה אסקורבית פתרון צינור אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים את כל צינורות 5-7 דקות באמבט מים רותחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את ספיגת תקן כל המדגם ב 820 ננומטר באמצעות 8453 Agilent UV-Visible ספקטרופוטומטר. שפופרת המכילה זרחן 0.0 mmoles צריך לשמש ריק עבור כל סטנדרטים ניסיוני LUV דגימות. צינור המכיל 0.2 מ&quot;מ trypsin/2.0 mM באומן בירק, פתרון מעכב צריך לשמש ריק לשליטה LUV המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן ליניארי לעומת ספיגת זרחן עקומת התוכן יכול להיות מיוצר להשתמש כדי לחשב את סך phosphorus תוכן LUV ריכוז של הדגימות. </li></ol> 3. הכנת פתרונות פפטיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים פפטיד nanopure H 2 O. פפטידים המשמשים assay זה כמתואר חייב להכיל ערך אחד שאריות טריפטופן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את ספיגת פתרון הפפטיד ב 282 ננומטר בשלושה עותקים. חישוב ריכוז הפפטיד באמצעות מקדם הכחדה טוחנת עבור טריפטופן של 5700 M -1 cm -1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפפטיד מדולל במים nanopure לריכוז סופי של 30 מיקרומטר. חנות ב -20 ° C </li></ol> 4. טרנסלוקציה כימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו דגימות הניסוי והבקרה 1.7 צינורות microcentrifuge מ&quot;ל. הוסף את &#39;לאב&#39; מספיק כל פתרון עבור ריכוז סופי של 250 מיקרומטר. הוסף מספיק באומן בירק, פתרון מעכב כך מעכב כי הוא ריכוז סופי 10X יותר ריכוז טריפסין. הוסף מספיק 10 HEPES חיץ mM להביא את נפח הפתרון הסופי μL 450. </li> &lt;li&gt; 50 פלייס פתרון μL הפפטיד לתוך תא מיקרו fluorometer קוורץ Starna. היחס בין &#39;לאב&#39; ו - פפטיד הוא גבוה מספיק כדי להבטיח כי כמעט כל פפטידים שלמים נמצאים בסמיכות קרובה מספיק לקבוצה dansyl לתת סריג האות גם אם אף אחד מהם לא translocated לתוך שלפוחית. זה עולה בקנה אחד עם סריג דומה נצפתה בתנאי בקרה פפטידים לעשות ולא translocate לתוך שלפוחית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את מדגם הניסוי או שליטה לפתרון פפטיד קובט. זה אמור להביא את ריכוז הפפטיד האחרון 3 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין 25 דקות בניסוי קינטיקה פלורסנט מיד עם תוספת של הניסוי או שליטה LUV פתרון, לוקח קריאה הקרינה לפחות פעם אחת לשנייה. הגדר את גל עירור ב 280 ננומטר, אורך הגל פליטה ב 525 ננומטר, ואת הטמפרטורה ל 25 ° C. באמצעות ספקטרופוטומטר Eclipse קארי פלואורסצנטי, אנו קובעים את הרגישות PMT גבוהה. </li></ol><html> 5. יצירת יחס טרנסלוקציה כמותי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר הקרינה הראשונית (F o) כמו לקרוא את הקרינה אחרי חמש עשרה שניות של איסוף נתונים. ב ההתקנה המכשיר שלנו, מצאנו כי הראשון חמש עשרה שניות של נתונים שנאספו הקרינה אינם אמינים בשל ערבוב, סגירת חדר המדגם, הפרעות אחרות למערכת בנוסף על המדגם. מחלקים כל קריאה לאחר מכן על ידי F o להשיג הקרינה היחסית (F / F 0) בכל נקודת זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממוצע כל קריאות הקרינה היחסית של הרגע האחרון של הניסוי לקבל הקרינה היחסית הממוצעת הסופית <img alt="[F / FO] ממוצע" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את <img alt="[F / FO] ממוצע" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> עבור דגימות השליטה על ידי <img alt="[F / FO] ממוצע" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> עבור דגימות ניסיוני להשיג ערך לתקן הקרינה הסופית. </li></ol>le &quot;&gt; 6. תוצאות נציג תרשים 2 מציג את התוצאות של assay זה פפטיד נציג שהראה טרנסלוקציה חזקים. האות בניסוי הזה (שחור זכר) מראה ירידה ניכרת סריג האות לאורך זמן. עם זאת, חשוב לשלוט על אובדן פוטנציאלי של סריג האות בשל עיכוב טריפסין שלם או גורמים אחרים שאינם קשורים ליכולת טרנסלוקציה. לשם כך, אנחנו תמיד גם למדוד את סריג האות ו &#39;לאב&#39; בין פפטיד המכיל הן טריפסין ו-באומן בירק מעכב טריפסין (אפור זכר, איור 2). בידיים שלנו, זה כבר חשוב לבצע בקרה על פפטיד כל בכל פעם ניסוי פועלת. זה מאפשר לנו בבירור הנכון עבור כל שינוי אות עקב כל ההבדלים בין שלפוחית ​​ההכנות שומנים או רעש המכשירים, אשר יכול להיות משמעותי עבור אותות ניאון חלשה יחסית שנצפה בדרך כלל בריכוזים אלה. החשיבות של בקרת experiment באמצעות &#39;לאב&#39; המכיל מעכבי טריפסין מסומן על ידי הנתונים שמוצג באיור 3. במקרה זה, את האות פפטיד ירד סכום דומה לזה באיור 2 במדגם הניסוי (זכר שחור). עם זאת, מדגם לשלוט מראה ירידה מהירה יותר של הפפטיד הזה, אז טרנסלוקציה הנקי שלה נמוך יותר. סעיף 5 בפרוטוקול שלנו מתאר שיטה פשוטה לכימות טרנסלוקציה מניסוי זה. יחסי טרנסלוקציה גבוהה מעידים על פפטידים translocate ביעילות, יחס טרנסלוקציה עבור הפפטיד תא חודר שמוצג באיור 2 הוא 1.16, בעוד חלושות פפטידים translocating יש יחס טרנסלוקציה קרוב 1. מניסיוננו, תקן את הטעות במשך שלושה ניסויים עצמאיים הופיע עם ההכנות שלפוחית ​​שונה בטווח של 0.01-0.06. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig1.jpg" /> באיור 1. סכמטי של translocatassay יון. ניסויית LUV דגימות (א) הם מסוממים עם פלורסנט פופ dansyl (פסים שחורים) ומכילים במארז טריפסין (מספריים). מעכבי טריפסין (עיגול אדום) משמש כדי לעכב טריפסין מחוץ &#39;לאב&#39;. &#39;לאב&#39; חשופים פפטיד (סגול). פפטיד בשיתוף עם LUV ממברנות מניב סריג אות (ירוק) אשר יורדת ככל פפטידים translocting המפגש טריפסין פנימי מעצורים. שני טריפסין ו מעכב טריפסין הם הגלום לשלוט LUV דגימות (ב) כדי למדוד ירידה סריג אות קשור טרנסלוקציה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig2.jpg" /> באיור 2. נציג נתונים עבור הפפטיד תא חודר. נציג translocating pepide מיקרוביאלית מראה ירידה משמעותית סריג אות לעומת שליטתה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig3.jpg" /> דמות3. נציג נתונים המדגיש את החשיבות של שליטה. עיכוב מושלמת של מערכת העיכול tryptic של הפפטיד הלא translocating מוביל לירידה סריג האות לאורך זמן הניסוי והן לשלוט LUV פתרונות. בגלל ההבדל בין שליטה ועקבות הניסוי הוא קטן יחסית, מוטציה זו מאופיינת בחולשה פפטיד translocating.

<ol>
	<li>Henriques, S. T., Melo, M. N., Castanho, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides+and+antimicrobial+peptides:+how+different+are+they?.">Cell-penetrating peptides and antimicrobial peptides: how different are they?.</a> Biochem. J. 399 (1), 1-1 (2006).</li><li>Trehin, R., Merkle, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chances+and+pitfalls+of+cell+penetrating+peptides+for+cellular+drug+delivery.">Chances and pitfalls of cell penetrating peptides for cellular drug delivery.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 209-209 (2004).</li><li>Temsamani, J., Vidal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+cell-penetrating+peptides+for+drug+delivery.">The use of cell-penetrating peptides for drug delivery.</a> Drug Discov. Today. 9 (23), 1012-1012 (2004).</li><li>Hale, J. D., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+mechanisms+of+action+of+cationic+antimicrobial+peptides+on+bacteria.">Alternative mechanisms of action of cationic antimicrobial peptides on bacteria.</a> Expert Review of Anti-Infective Therapy. 5 (6), 951-951 (2007).</li><li>Nicolas, P., Rosenstein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+host+defense+peptides.">Multifunctional host defense peptides.</a> FEBS J. 276 (22), 6464-6464 (2009).</li><li>Boman, H. G., Agerberth, B., Boman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Action+on+Escherichia-Coli+of+Cecropin-P1+and+Pr-39,+2+Antibacterial+Peptides+from+Pig+Intestine.">Mechanisms of Action on Escherichia-Coli of Cecropin-P1 and Pr-39, 2 Antibacterial Peptides from Pig Intestine.</a> Infection and Immunity. 61 (7), 2978-2978 (1993).</li><li>Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+action+of+the+antimicrobial+peptide+buforin+II:+Buforin+II+kills+microorganisms+by+penetrating+the+cell+membrane+and+inhibiting+cellular+functions.">Mechanism of action of the antimicrobial peptide buforin II: Buforin II kills microorganisms by penetrating the cell membrane and inhibiting cellular functions.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 244 (1), 253-253 (1998).</li><li>Bobone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+thin+line+between+cell-penetrating+and+antimicrobial+peptides:+the+case+of+Pep-1+and+Pep-1-K.">The thin line between cell-penetrating and antimicrobial peptides: the case of Pep-1 and Pep-1-K.</a> J. Pept. Sci. 17 (5), 335-335 (2011).</li><li>Marks, J. R., Placone, J., Hristova, K., Wimley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+Membrane-Translocating+Peptides+by+Orthogonal+High-throughput+Screening.">Spontaneous Membrane-Translocating Peptides by Orthogonal High-throughput Screening.</a> J. Am. Chem. Soc.. , (2011).</li><li>Rosenbluh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+histone+proteins+across+lipid+bilayers+and+Mycoplasma+membranes.">Translocation of histone proteins across lipid bilayers and Mycoplasma membranes.</a> J. Mol. Biol. 345 (2), 387-387 (2005).</li><li>Bárány-Wallje, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+reassessment+of+penetratin+translocation+across+lipid+membranes.">A critical reassessment of penetratin translocation across lipid membranes.</a> Biophys. J. 89 (4), 2513-2513 (2005).</li><li>Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+beta-galactosidase+mediated+by+the+cell-penetrating+peptide+pep-1+into+lipid+vesicles+and+human+HeLa+cells+is+driven+by+membrane+electrostatic+potential.">Translocation of beta-galactosidase mediated by the cell-penetrating peptide pep-1 into lipid vesicles and human HeLa cells is driven by membrane electrostatic potential.</a> Biochemistry. 44 (30), 10189-10189 (2005).</li><li>Orioni, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+perturbation+by+the+antimicrobial+peptide+PMAP-23:+a+fluorescence+and+molecular+dynamics+study.">Membrane perturbation by the antimicrobial peptide PMAP-23: a fluorescence and molecular dynamics study.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1788 (7), 1523-1523 (2009).</li><li>Ladokhin, A. S., Jayasinghe, S., White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+measure+and+analyze+tryptophan+fluorescence+in+membranes+properly,+and+why+bother?.">How to measure and analyze tryptophan fluorescence in membranes properly, and why bother?.</a> Anal. Biochem. 285 (2), 235-235 (2000).</li><li>Epand, R. M., Epand, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomes+as+models+for+antimicrobial+peptides.">Liposomes as models for antimicrobial peptides.</a> Methods Enzymol. 372, 124-124 (2003).</li><li>Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+the+novel+antimicrobial+peptide+buforin+2+with+lipid+bilayers:+Proline+as+a+translocation+promoting+factor.">Interactions of the novel antimicrobial peptide buforin 2 with lipid bilayers: Proline as a translocation promoting factor.</a> Biochemistry. 39 (29), 8648-8648 (2000).</li><li>Matsuzaki, K., Murase, O., Fujii, N., Miyajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+a+channel-forming+antimicrobial+peptide,+magainin+2,+across+lipid+bilayers+by+forming+a+pore.">Translocation of a channel-forming antimicrobial peptide, magainin 2, across lipid bilayers by forming a pore.</a> Biochemistry. 34 (19), 6521-6521 (1995).</li><li>Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Re-evaluating+the+role+of+strongly+charged+sequences+in+amphipathic+cell-penetrating+peptides:+a+fluorescence+study+using+Pep-1.">Re-evaluating the role of strongly charged sequences in amphipathic cell-penetrating peptides: a fluorescence study using Pep-1.</a> FEBS Lett. 579 (20), 4498-4498 (2005).</li><li>Torchilin, V. P., Weissig, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liposomes. , (2003).</li><li>Almeida, P. F., Pokorny, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avanti+Polar+Lipids,+Determination+of+Total+Phosphorus.">Avanti Polar Lipids, Determination of Total Phosphorus.</a> Biochemistry. 1686 (34), 8083-8083 (2009).</li><li>Kobayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+translocation+mechanism+of+the+antimicrobial+peptide+buforin+2.">Membrane translocation mechanism of the antimicrobial peptide buforin 2.</a> Biochemistry. 43 (49), 15610-15610 (2004).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הפרוטוקול המובא כאן יכול לשמש כדי להעריך את השינוי היחסי בריכוז של פפטידים ומחוצה שלפוחית ​​השומנים. שינויים אלה קשורים ליכולת טרנסלוקציה. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות תאים חודר פפטידים עם פוטנציאל כמו וקטורים משלוח סמים. כאשר הריבית בתא חודר פפטידים גדל, זה יהי...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td></tr><tr><td> 16:00-18:01 PG </td><td> אוואנטי ליפידים פולאר </td><td> 840457C </td></tr><tr><td> 01:18 Dansyl PE </td><td> אוואנטי ליפידים פולאר </td><td> 810330C </td></tr><tr><td> 16:00-18:01 PC </td><td> אוואנטי ליפידים פולאר </td><td> 850457C </td></tr><tr><td> חזירי טריפסין </td><td> סיגמא </td><td> T-0303 </td></tr><tr><td> באומן בירק, טריפסין / chymotrypsin מעכב </td><td> סיגמא </td><td> T-9777 </td></tr><tr><td> ה-Mini-extruder </td><td> אוואנטי ליפידים פולאר </td><td> 610000 </td></tr><tr><td> אמוניום molybdate (פסקה) </td><td> אלפא Aesar </td><td> 10811 </td></tr><tr><td> L-חומצה אסקורבית </td><td> סיגמא </td><td> A1417 </td></tr><tr><td> מי חמצן, פתרון של 30% </td><td> Mallinckrodt כימיקלים </td><td> 5240-05 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> סיגמא </td><td> H-3375 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> סיגמא </td><td> S-9625 &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> EDTA </td><td> סיגמא </td><td> E5134 </td></tr><tr><td> לאא 2 PO 4 </td><td> סיגמא </td><td> S-0751 </td></tr></tbody></table>

measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles

יש עניין פעיל פפטידים בקלות לחצות קרום התא ללא סיוע של קולטני קרום התא 1. רבים מהם מתייחסים כאל תא חודר פפטידים, אשר ציין לעיתים קרובות את הפוטנציאל שלהם בתור משלוח סמים וקטורים 1-3. יתר על כן, יש עניין גובר פפטידים מיקרוביאלית שפועלים דרך הממברנה ללא מנגנוני ממס 4,5, במיוחד אלו לחצות קרומים חיידקיים ללא גרימת תמוגה התא ולהרוג תאים על ידי הפרעה תהליכים תאיים 6,7. למעשה, החוקרים הצביעו יותר ויותר את הקשר בין פפטידים התא חודר מיקרוביאלית 1,8. הבנה של המשרד בתהליך של טרנסלוקציה קרום ואת הקשר בין מבנה הפפטיד ואת יכולתו translocate דורש יעילות, מבחני לשחזור עבור טרנסלוקציה. כמה קבוצות הציעו שיטות למדוד טרנסלוקציה לתוך unilamel גדולהשומנים שלפוחית ​​lar (&#39;לאב&#39;) 13/09. &#39;לאב&#39; כמודלים שימושיים קרום התא של חיידקים האיקריוטים והם משמשים לעתים קרובות במחקרים פלורסנט פפטיד 14,15. כאן, אנו מתארים את היישום שלנו של השיטה שפותחה לראשונה על ידי Matsuzaki ועמיתים לעבודה לשקול פפטידים מיקרוביאלית, כגון magainin ו buforin II 16,17. בנוסף לאספקת פרוטוקול שלנו עבור שיטה זו, אנו גם מציגים גישה פשוטה לניתוח נתונים מכמת היכולת טרנסלוקציה באמצעות assay. היתרונות של assay זה טרנסלוקציה לעומת אחרים כי יש לו את הפוטנציאל לספק מידע על שיעור של טרנסלוקציה בממברנה ואינו דורש תוספת של תווית ניאון, אשר יכול לשנות תכונות פפטיד 18, אל טריפטופן המכיל פפטידים. בקיצור, היכולת טרנסלוקציה לתוך שלפוחית ​​שומנים בדם נמדדת כפונקציה של העברת אנרגיה תהודה פוסטר (סריג) בין שאריות טריפטופן יליד דansyl phosphatidylethanolamine כאשר חלבונים הקשורים החיצוני LUV הקרום (איור 1). Cell-חודר פפטידים הם ביקע כפי שהם נתקלים טריפסין מעצורים במארז עם &#39;לאב&#39;, המוביל ההתנערות מן הקרום LUV ועל ירידה סריג האות. הירידה סריג האות שנצפה עבור פפטיד translocating הוא גדול משמעותית מזה שנצפה עבור פפטיד זהה כאשר &#39;לאב&#39; מכילים הן טריפסין ו מעכב טריפסין, או כאשר פפטיד זה לא ספונטני לעבור ממברנות שומנים בדם נחשף טריפסין המכילים &#39;לאב&#39;. שינוי זה מספק כימות הקרינה הישירה של טרנסלוקציה פפטיד לאורך זמן.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles at JoVE.com

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

זה פרוטוקול פרטים שיטה למדידת כמותית של טרנסלוקציה הפפטיד לתוך שלפוחית ​​גדולה השומנים unilamellar. שיטה זו מספקת גם מידע על שיעור של טרנסלוקציה בממברנה והוא יכול לשמש כדי לזהות את הפפטידים זה ביעילות באופן ספונטני לחצות bilayers השומנים.

מדידת טרנסלוקציה פפטיד לתוך שלפוחית ​​Unilamellar גדול

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

measuring-peptide-translocation-into-large-unilamellar-vesicles

Research

JoVE Journal

Biology

13.8K Views.  Wellesley College. זה פרוטוקול פרטים שיטה למדידת כמותית של טרנסלוקציה הפפטיד לתוך שלפוחית ​​גדולה השומנים unilamellar. שיטה זו מספקת גם מידע על שיעור של טרנסלוקציה בממברנה והוא יכול לשמש כדי לזהות את הפפטידים זה ביעילות באופן ספונטני לחצות bilayers השומנים.

Video: Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

בקנה מידה גדול של מסכי ספריות Metagenomic

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Large Volume (20L+) Filtration of Coastal Seawater Samples

The workflow begins with the collection of coastal marine waters for downstream microbial community, nutrient and trace gas analyses. For this method, samples were collected from the deck of the HMS John Strickland operating in Saanich Inlet. This video documents large volume (&ge;20 L) filtration of microbial biomass, ranging between 0.22&mu;m and 2.7&mu;m in diameter, from the water column. Two 20L samples can be filtered simultaneously using a single pump unit equipped with four rotating heads. Filtration is done in the field on extended trips, or immediately upon return for day trips. It is important to record the amount of water passing through each sterivex filter unit. To prevent biofilm formation between sampling trips, all filtration equipment must be rinsed with dilute HCl and deionized water and autoclaved immediately after use. This procedure will take approximately 5 hours plus an additional hour for clean up.

Large Volume 20L+ Filtration of Coastal Seawater Samples

This video documents large volume (&ge;20 L) filtration of microbial biomass, ranging between 0.22&mu;m and 2.7&mu;m in diameter, from the water column.

נפח גדול (20L +) סינון של דגימות מי ים החוף

The workflow begins with the collection of coastal marine waters for downstream microbial community, nutrient and trace gas analyses. For this method, ...

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

הכנס גדול הסביבה הגנום ספריית הפקה

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenesis וניתוח פונקציונלי של תעלות יונים הביעו Heterologously בתאי יונקים

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

מדידה כמותית של טרנסלוקציה GLUT4 על קרום התא על ידי זרימת cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate apoptosis1. Following cellular stress (e.g., DNA damage), the pro-apoptotic BCL-2 family effectors BAK (BCL-2 antagonistic killer 1) and/or BAX (BCL-2 associated X protein) become activated and compromise the integrity of the outer mitochondrial membrane (OMM), though the process referred to as mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP)1. After MOMP occurs, pro-apoptotic proteins (e.g., cytochrome c) gain access to the cytoplasm, promote caspase activation, and apoptosis rapidly ensues2.
In order for BAK/BAX to induce MOMP, they require transient interactions with members of another pro-apoptotic subset of the BCL-2 family, the BCL-2 homology domain 3 (BH3)-only proteins, such as BID (BH3-interacting domain agonist)3-6. Anti-apoptotic BCL-2 family proteins (e.g., BCL-2 related gene, long isoform, BCL-xL; myeloid cell leukemia 1, MCL-1) regulate cellular survival by tightly controlling the interactions between BAK/BAX and the BH3-only proteins capable of directly inducing BAK/BAX activation7,8. In addition, anti-apoptotic BCL-2 protein availability is also dictated by sensitizer/de-repressor BH3-only proteins, such as BAD (BCL-2 antagonist of cell death) or PUMA (p53 upregulated modulator of apoptosis), which bind and inhibit anti-apoptotic members7,9. As most of the anti-apoptotic BCL-2 repertoire is localized to the OMM, the cellular decision to maintain survival or induce MOMP is dictated by multiple BCL-2 family interactions at this membrane.
 Large unilamellar vesicles (LUVs) are a biochemical model to explore relationships between BCL-2 family interactions and membrane permeabilization10. LUVs are comprised of defined lipids that are assembled in ratios identified in lipid composition studies from solvent extracted Xenopus mitochondria (46.5% phosphatidylcholine, 28.5% phosphatidylethanoloamine, 9% phosphatidylinositol, 9% phosphatidylserine, and 7% cardiolipin)10. This is a convenient model system to directly explore BCL-2 family function because the protein and lipid components are completely defined and tractable, which is not always the case with primary mitochondria. While cardiolipin is not usually this high throughout the OMM, this model does faithfully mimic the OMM to promote BCL-2 family function. Furthermore, a more recent modification of the above protocol allows for kinetic analyses of protein interactions and real-time measurements of membrane permeabilization, which is based on LUVs containing a polyanionic dye (ANTS: 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid) and cationic quencher (DPX: p-xylene-bis-pyridinium bromide)11. As the LUVs permeabilize, ANTS and DPX diffuse apart, and a gain in fluorescence is detected. Here, commonly used recombinant BCL-2 family protein combinations and controls using the LUVs containing ANTS/DPX are described.

Biochemically-defined large unilamellar vesicles (LUVs) are a convenient model system to analyze BCL-2 family interactions with immediate implications in better understanding the mitochondrial pathway of apoptosis. A method to produce LUVs, along with standard BCL-2 family protein combinations and controls to examine LUV permeabilization, are presented.

BCL-2 פונקצית בחינת משפחה עם שלפוחית ​​Unilamellar גדולה

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of variants within families or populations can facilitate identification of the genetic factors of disease. Illumina&#39;s panel of genotyping BeadChips allows investigators to genotype thousands or millions of single nucleotide polymorphisms (SNPs) or to analyze other genomic variants, such as copy number, across a large number of DNA samples. These SNPs can be spread throughout the genome or targeted in specific regions in order to maximize potential discovery. The Infinium assay has been optimized to yield high-quality, accurate results quickly. With proper setup, a single technician can process from a few hundred to over a thousand DNA samples per week, depending on the type of array. This assay guides users through every step, starting with genomic DNA and ending with the scanning of the array. Using propriety reagents, samples are amplified, fragmented, precipitated, resuspended, hybridized to the chip, extended by a single base, stained, and scanned on either an iScan or Hi Scan high-resolution optical imaging system. One overnight step is required to amplify the DNA. The DNA is denatured and isothermally amplified by whole-genome amplification; therefore, no PCR is required. Samples are hybridized to the arrays during a second overnight step. By the third day, the samples are ready to be scanned and analyzed. Amplified DNA may be stockpiled in large quantities, allowing bead arrays to be processed every day of the week, thereby maximizing throughput.

A protocol is described that uses Illumina&#39;s Infinium assays to perform large-scale genotyping. These assays can reliably genotype millions of SNPs across hundreds of individual DNA samples in three days. Once generated, these genotypes can be used to check for associations with a variety of different diseases or phenotypes.

Infinium Assay עבור יישומי Genotyping SNP בקנה מידה גדולה

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

כינונה מחדש של חלבון טראנסממברנלי, יון ערוץ מתח מגודרת, KvAP, לענק Unilamellar שלפוחית ​​למיקרוסקופי וצמד תיקון ללימודים

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

ויזואליזציה של מולקולות DNA גדולות קשור Surface עם DNA חלבון פלואורסצנטי כריכת פפטיד

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many different proteins associate with curved membranes because of their ability to sense or induce membrane curvature. Typically, these processes involve a multitude of proteins making them too complex to study quantitatively in the cell. We describe a protocol to reconstitute a curved membrane in vitro, mimicking a curved cellular structure, such as the endocytic neck. A giant unilamellar vesicle (GUV) is used as a model of a cell membrane, whose internal pressure and surface tension are controlled with micropipette aspiration. Applying a point pulling force on the GUV using optical tweezers creates a nanotube of high curvature connected to a flat membrane. This method has traditionally been used to measure the fundamental mechanical properties of lipid membranes, such as bending rigidity. In recent years, it has been expanded to study how proteins interact with membrane curvature and the way they affect the shape and the mechanics of membranes. A system combining micromanipulation, microinjection, optical tweezers, and confocal microscopy allows measurement of membrane curvature, membrane tension, and the surface density of proteins, concurrently. From these measurements, many important mechanical and morphological properties of the protein-membrane system can be inferred. In addition, we lay out a protocol of creating GUVs in the presence of physiological salt concentration, and a method of quantifying the surface density of proteins on the membrane from fluorescence intensities of labeled proteins and lipids.

Many proteins in the cell sense and induce membrane curvature. We describe a method to pull membrane nanotubes from lipid vesicles to study the interaction of proteins or any curvature-active molecule with curved membranes in vitro.

משיכת ממברנה צינוריות מן שלפוחית Unilamellar ענק

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

מדידת טרנסלוקציה פפטיד לתוך שלפוחית ​​Unilamellar גדול

מדידת טרנסלוקציה פפטיד לתוך שלפוחית Unilamellar גדול