המחברים מאשרים תמיכה עבור עבודה זו על ידי מענקים U54 RR022220 ו P50 GM076547 ל- JDA מהמכון הלאומי האמריקני לבריאות. FDM הוא פוסט דוקטורט עם המכון הקנדי לחקר הבריאות. אנו מודים גם למרכז לוקסמבורג למערכות ביו-רפואה ולאוניברסיטת לוקסמבורג לתמיכה.

<ol>
	<li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van't Riet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+the+bacterial+growth+curve.">Modeling of the bacterial growth curve.</a> Appl Environ Microbiol. 56 (6), 1875-1881 (1990).</li><li>Sellick, C. A., Campbell, R. N., Reece, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galactose+metabolism+in+yeast-structure+and+regulation+of+the+leloir+pathway+enzymes+and+the+genes+encoding+them.">Galactose metabolism in yeast-structure and regulation of the leloir pathway enzymes and the genes encoding them.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 269, 111-150 (2008).</li><li>Yoshikawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+phenotypic+analysis+for+identification+of+genes+affecting+growth+under+ethanol+stress+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Comprehensive phenotypic analysis for identification of genes affecting growth under ethanol stress in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEMS Yeast Res. 9 (1), 32-44 (2009).</li><li>Bryan, A. K., Goranov, A., Amon, A., Manalis, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+mass,+density,+and+volume+during+the+cell+cycle+of+yeast.">Measurement of mass, density, and volume during the cell cycle of yeast.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (3), 999-1004 (2010).</li><li>Baryshnikova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+fitness+and+genetic+interactions+in+yeast+on+a+genome+scale.">Quantitative analysis of fitness and genetic interactions in yeast on a genome scale.</a> Nat Methods. 7 (12), 1017-1024 (2010).</li><li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+landscape+of+a+cell.">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327 (5964), 425-431 (2010).</li><li>Collins, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+dissection+of+protein+complexes+involved+in+yeast+chromosome+biology+using+a+genetic+interaction+map.">Functional dissection of protein complexes involved in yeast chromosome biology using a genetic interaction map.</a> Nature. 446 (7137), 806-810 (2007).</li><li>Zackrisson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scan-o-matic:+High-Resolution+Microbial+Phenomics+at+a+Massive+Scale.">Scan-o-matic: High-Resolution Microbial Phenomics at a Massive Scale.</a> G3 (Bethesda). 6 (9), 3003-3014 (2016).</li><li>Bean, G. J., Jaeger, P. A., Bahr, S., Ideker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ultra-high-density+screening+tools+for+microbial+'omics'.">Development of ultra-high-density screening tools for microbial 'omics'.</a> PloS One. 9 (1), e85177 (2014).</li><li>Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bet+hedging+in+yeast+by+heterogeneous,+age-correlated+expression+of+a+stress+protectant.">Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant.</a> PLoS Biol. 10 (5), e1001325 (2012).</li><li>Herricks, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-Cell+Doubling+Evaluation+by+Living+Arrays+of+Yeast.">One-Cell Doubling Evaluation by Living Arrays of Yeast.</a> ODELAY! G3 (Bethesda). 7 (1), 279-288 (2017).</li><li>Mast, F. D., Ratushny, A. V., Aitchison, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+cell+biology.">Systems cell biology.</a> J Cell Biol. 206 (6), 695-706 (2014).</li><li>Edelstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+methods+of+microscope+control+using+&#181;Manager+software.">Advanced methods of microscope control using &#181;Manager software.</a> J Biol Methods. 1 (2), e10 (2014).</li></ol>

למחברים אין מה לגלות.

Assay ODLAY יש כמה נקודות קריטיות להבטחת המדידות פנוטיפי לשחזור ואמין. הנקודה הקריטית הראשונה היא הכנה עקבית של תרבויות השמרים. יש להקפיד לקצור את תאי השמרים מן הצמיחה הלוגריתמית. אם תרבויות יש רווי, אז ההטרוגניות האוכלוסייה שלהם יהיה מוגבר אשר עלול לערפל הטרוגניות הנגרמת על ידי גורמים גנטיים או סביבתיים ( למשל, מקור פחמן) 11 . הנקודה הקריטית השנייה היא הכנה עקבית של התקשורת. באופן כללי, נפח גדול של פתרון 10X מדיה מלאי צריך להיות שנוצר ולאחר מכן נעשה שימוש לאורך זמן כדי למזער את האפקטים אצווה. גיבוש מדיה לפי משקל, ככל הניתן, מסייע לשפר את עקביות המדיום לאורך זמן על ידי הבטחת צפיפות של אגר ואת התוכן הכולל של המים של agarose ניתן לפקח מקרוב. הנקודה הקריטית השלישית כוללת מזעור או ביטול כל דפורמציה מכנית של agarose אותי. דפורמציה מכנית של התקשורת תהיה הנפוצה ביותר להתרחש במהלך ההפרדה של agarose מן שקופיות הזכוכית. כמו טכניקות מעבדה רבות, בפועל נדרש לשלוט בשלב זה. שינוי בזמן בפיגור כפי שמתואר באיור 4 , קשורה לעיתים קרובות לאחד משלושת הגורמים: עיוות מכני של המדיום agarose, וריאציה בעובי אגר מעוצב, או מקור אור יציב. אם המדיום agarose משתנה Z- גובה על פני מערך מנומר, וריאציה גובה עלול להציף את טווח של שגרת פוקוס אוטומטי, גורם לתמונות הראשונית להיות קצת מחוץ להתמקד. מסיבה זו, לבדוק את גובה המיקוד במספר כתמים במרכז לאורך הקצוות של מערך הבחין כדי להבטיח את שגרת פוקוס אוטומטי יש מספיק טווח Z כדי למצוא את המיקוד. אם יש צורך, השתמש בחלונית &#39;פוקוס אוטומטי&#39; כדי להגדיל את טווח המיקוד ולהגדיל את מספר שלבי המיקוד. קונדיט שלישי אפשרייון שעלול להוביל להתמקדות ירודה הוא מקור אור לא יציב או מהבהב, אשר יכול לשבש את ציון המיקוד מחושב עבור Z- גובה מסוים. נורות הלוגן טונגסטן נוטים להבהב הרבה לפני הנורות לשרוף. ההשפעה של המיקוד לקוי הוא ציין בדוגמה אחת שבה עקומות הצמיחה לטבול בין הראשון והשני נקודות זמן ( איור 5 א ), ואילו במקום הסמוך אין לטבול אותו ( איור 5 ב &#39; ). במקרה זה, מצב המיקוד המסכן הוקל על ידי החלפת מקור האור הלוגן טונגסטן. בפועל, המחברים מצאו כי כדי להפחית את הבהוב של 100W טונגסטן נורות הלוגן, הנורות צריך להיות מוחלף כל 500 שעות או בערך כל 2 חודשים כאשר המיקרוסקופים נמצאים תחת שימוש כבד. כדי למנוע בעיות מיקוד ירודות מנורה מהבהבת, החלף את מקור האור של הלוגן טונגסטן לעיתים קרובות או החלף את נורת ההלוגן באמצעות מקור אור דיודה. Anדוגמא למערך המציג וריאציה נמוכה בזמני ההכפלה וכן זמני פיגור אחידים יותר מוצגים באיור 6 . מערך נתונים זה נלקח עם דיודה מאיר אשר מספק תאורה יציבה יותר לאורך זמן תוך ביצוע פוקוס אוטומטי. בעוד שרבים מהנקודות שהוזכרו כאן לאופטימיזציה של הכנת המדיה עשויות להיות מובנות מאליהן, בספרות המסכים הגדולים ביותר לא משכפלים היטב זה עם זה 8 , 11 . לכן, יש לנו תיאר בקפידה את ההכנה של תרבויות התקשורת agarose כך מסכי פנוטיפי לשחזור יותר עשוי להיווצר. Assay ODLAY מוגבל כעת התפוקה בהשוואה להצמדת מבחני מבוסס כגון מערכים גנטיים סינתטיים או assay Scan-O-Matic. בעוד שיטות אלה להגדיל את מספר זנים נמדדים, הם חסרים יכולת לפתור תאים בודדים אNd ולכן לא ניתן למדוד הטרוגניות האוכלוסייה שאנו רואים בתוך זנים שמרים משובטים. מקור ההטרוגניות של אוכלוסייה זו אינו מובנת כיום, אך מיזוג הטכנולוגיה והחישוב כפי שמוצג כאן מציע הזדמנות להתייחסות אובייקטיבית למנגנונים הסלולאריים הבסיסיים 12 . המחברים מבקשים לציין כי ODELAY כרגע מותאם רק עבור מותג מיקרוסקופ מסוים סוג הגוף. שינוי ODLAY עבור מערכות מיקרוסקופ אחרות הוא ישר קדימה אבל ידרוש ידע של קוד פתוח 13 API. עם זאת, הן ה- API, כמו גם את הסקריפטים ODELAY כתובים להיות מותאמים בקלות למערכות שונות מבחני ניסיוני. בעוד ODELAY פותחה במקור עבור שמרים, היינו מסוגלים לנצל את זה ללא שינוי כדי לבחון את הצמיחה של Mycobacterium smegmatis . תצפית של המושבה האחרת להרכיב מיקרואורגניזמים הואאפשרי עם שינויים בקוד המקור שסופק 11 . באופן כללי, ODELAY הוא כלי רב עוצמה וגמיש להשוואת מיקרואורגניזמים הגדלים בתנאים סביבתיים שונים הפרעות גנטיות.

פנוטיפים גדילה של מיקרואורגניזמים הם אינדיקציה חזקה של הכושר הגנטי הבסיסי שלהם למצב סביבתי נתון. הצמיחה מופרדת באופן קלאסי לשלושה משטרי צמיחה שונים: שלב השלב, שלב הפאזה וצמיחת פאזה נייחת 1 . כל שלב גדילה יכול לגלות היבטים שונים של כושר התלויים בתנאים סביבתיים וגנטיים שונים. לדוגמה, זמן השהיה, או משך הזמן האורגניזם מבלה בשלב השהיה לפני תחילת הצמיחה מעריכי, יכול להצביע על יכולתו של אורגניזם להגיב לתנאים סביבתיים שונו 2 . הכפלת זמן הגידול במהלך שלב הפלט, המדד הנפוץ ביותר של כושר הסלולר, מגלה את היעילות הכוללת של יכולתו של אורגניזם לחלק על ידי חילוף החומרים ושימוש בחומרים סביבתיים לשכפול. שלב נייחים, שבו הצמיחה לאחר שלב יומן מופחת במהירות, הוא אינדיקטור נוסף של כושר, שהוא קבועLy משמש נקודת סיום הצמיחה במקום מבוססי מבחני שמרים צמיחה. כמה שמרים צמיחה שמרים זמינים כיום נחשב שיטות סטנדרטיות להערכת פנוטיפים הצמיחה בשמרים 3 , 4 , 5 . מבחני אלה מבוססים בעיקר על שיטות גידול שמרים או על מוצק או בתקשורת נוזלית. על מוצק התקשורת, המושבה להצמיד מבחני להעביר מספר קטן של תאים על גבי אגר מוצק עם סיכה, תאים שמרים מותר לגדול לתקופה מוגדרת של זמן. המושבות הם צילמו ואז הגודל שלהם מושווים בנקודת קצה מסוף 6 . אלה מושבות pinning המושבה הוכיחו חזקים וניתן להרחבה כדי ליצור מסך רחב הגנום. לאחרונה, הדמיה תקופתית באמצעות סורקים שטוחה שטוח עדשות יחיד רפלקס (SLR) מצלמות שולבו אלה מבחני להקליט צמיחה המושבה לאורך זמן 7 , 8, 9 . עם זאת, הפתרון של התקנים אלה מונע מהם לגלות תאים בודדים ולכן, אלה מושבות הצמיד המושבה לא ישירות לצפות בפיגור זמן ולא ניתן להבחין וריאציה בין תאים בודדים לגדול לתוך מושבות. מבחני צמיחה מבוססי נוזלים הועסקו גם כדי לבצע מסכי גנום רחבים 3 . צימוד assay צמיחה נוזלית עם מיקרוסקופ זמן לשגות חשף ההטרוגניות האוכלוסייה בזמן הכפלת תאים בודדים זהים גנטית, אשר מציעה נקודת מבט חשובה להבנת רגולציה גנטית הסתגלות סביבתית. עם זאת, assay זה אינו מודד היבטים אחרים של צמיחה כגון זמן השהיה כושר נשיאה 10 . כאן אנו מציגים שיטה לאפיין את כל שלבי הצמיחה של המושבה להרכיב מיקרואורגניזמים על מדיה מוצקה באמצעות assay אנחנו מונח ODELAY 11 . ODELAY מורכב utiliZing גבוהה התפוקה זמן לשגות מיקרוסקופ כדי להקליט תמונות של תאים בודדים גדל לתוך מושבות על מוצק התקשורת. אוכלוסייה זו של תאים בודדים הגדלים לתוך מושבות מגלה את ההטרוגניות הבסיסית של האוכלוסייה, אשר לא זוהה על ידי מדידות פחות רגישות אחרות כגון ניקוד נקודות קצה סופיות. אנו מדגימים את השיטה על שמרים, אבל ODELAY ניתן להחיל על כל אורגניזם זה מראה בניגוד מיקרוסקופ שדה בהיר.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1013">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Agarose UltraPure</td>
			<td style="width:131px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">16500500</td>
			<td style="width:413px;">Gel Temp 36C, Gel Strength (1%) 1.2g/sq cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract Peptone (YEP)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1422-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Complete Suplement Mixture (CSM)</td>
			<td style="width:131px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MP114560222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Polyethylene Glycol 3350 (av. mol. wt. 3000-3700)</td>
			<td style="width:131px;">SigmaAldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Strain BY4741</td>
			<td style="width:131px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">95400.BY4741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Strain BY4742</td>
			<td style="width:131px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">95400.BY4742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50mL Falcon tubes</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430291</td>
			<td>1 case</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15mL Falcon tubes</td>
			<td style="width:131px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2 x 3 inch 1.0mm thick slides 1/2 gross</td>
			<td style="width:131px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">48382-179</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well plate flat bottom</td>
			<td style="width:131px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:119px;">353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Hydra liquid handleing robot</td>
			<td style="width:131px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">1096-DT-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Hamilton Microlab Star Liquid Handleing Robot</td>
			<td style="width:131px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">hydra 100 mL tips Extended Length DARTS</td>
			<td style="width:131px;">Thermo</td>
			<td style="width:119px;">5527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Synergy H4 Plate Reader</td>
			<td style="width:131px;">Biotek</td>
			<td style="width:119px;">H4MLFAD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Leica DMI6000 B Microscope</td>
			<td style="width:131px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Leica 10X/0.3NA objective</td>
			<td style="width:131px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">11506289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">Hamamatsu ORCA Flash 4.0 Camera</td>
			<td style="width:131px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:119px;">C11440-22CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">MATLAB with image processing tool box</td>
			<td style="width:131px;">Mathworks</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">MicroManager</td>
			<td style="width:131px;">Open Imaging</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://micro-manager.org/</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:351px;">ODELAY Microscope Control (MATLAB scripts and GUI)</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>www.aitchisonlab.com\ODELAY for Matlab scripts and software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">ODELAY Microscope Chamber</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>www.aitchisonlab.com\ODELAY for Mechanincal Drawings</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:351px;">ODELAY Agar Molds</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>www.aitchisonlab.com\ODELAY for mold drawings</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

odelay: a large-scale method for multi-parameter quantification of yeast growth

פנוטיפים גדילה של מיקרואורגניזמים הם אינדיקטור חזק של הכושר הגנטי הבסיסי שלהם וניתן להפריד בין 3 משטרי צמיחה: שלב בפיגור, שלב שלב, שלב נייח. כל שלב גדילה יכול לגלות היבטים שונים של כושר הקשורים לתנאים סביבתיים וגנטיים שונים. מדידות ברזולוציה גבוהה וכמותית של כל 3 שלבי הצמיחה הם בדרך כלל קשה להשיג. כאן אנו מציגים שיטה מפורטת לאפיין את כל השלבים 3 צמיחה על מדיה מוצקה באמצעות assay שנקרא תא בודד הכפלת הערכה של מערכים חיים של שמרים (ODELAY). ODLAY מכמת פנוטיפים הצמיחה של תאים בודדים גדל מושבות על מדיה מוצקה באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופ. שיטה זו יכולה ישירות לבחון את ההטרוגניות האוכלוסייה עם כל פרמטר הצמיחה בתאים זהים גנטית גדל מושבות. הטרוגניות אוכלוסייה זו מציעה נקודת מבט ייחודית להבנת רגולציה גנטית ואפיגנטית ותגובותהפרעות גנטיות וסביבתיות. בעוד שיטת ODLAY מודגם באמצעות שמרים, זה יכול להיות מנוצל על כל המושבה היוצרים מיקרואורגניזם זה גלוי על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר.

<html> תמונות לדוגמה של שמרים גדל במיקרוסקופ זמן לשגות מוצגים באיור 3 ב . לאחר עיבוד הזמן לשגות תמונות, נתונים נציג קבוצה השוואת זנים שמרים BY4741 &amp; BY4742 מוצג באיור 4 . במערך זה לדוגמה, יש וריאציה מעט מאוד זמן הכפלה בין עמדות שונות על הצלחת. אם בינוני agarose מוכן כראוי, אז סטייה ברורה הן זמן הכפלת זמן השהיה יהיה ברור עמדות נקודה חופפות עם האזור המעוות של ג&#39;ל agarose. בעוד שכפול פעמים נראה אחיד יחסית, דוגמה זו מציגה שינויים במידות הזמן בפיגור. מערך נתונים עקבי יותר מוצג באיור 6 . במערך זה זמן הפיגור וכפל הזמן הם אחידים. <html> Files / ftp_upload / 55879 / 55879fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1: אגר עובש עובש. הרכיבים של עובש אגר מוצגים ב ( א ). להרכיב את הבסיס כפי שמוצג ב ( B ) ולאחר מכן מהדק את הבסיס עם קליפים קלסר קטן. מניחים את החלקים זקוף יותר בחלל של הבסיס ( ג ) ולאחר מכן המחנה שקופיות עובש כפי שמוצג ( D ). מבט צד מראה את הזווית של התבנית ואת הכיוון של קרף עובש הדרוש הפרדה עקבית של אגר מן השקופית זכוכית ( E ). הערה המיקום של האגודל ואת האצבע, כמו גם את הקו הישר של אגר להפריד את השקופית ( F ) ולשים לב את החץ האופקי. קו ההפרדה צריך לנוע באופן שווה לכיוון החצים האנכיים. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55879/55879fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <html> = &quot;Jove_content&quot; עבור: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig2.jpg" /> איור 2: שיטת סוניקציה ואיתור. Sonicate את הצלחת במים הקרח באמצעות מחזיק דלי צנטריפוגות לעזור לתמוך את הצלחת ( א ). הנח את הצלחות ממדרגות 3.8.1 החוצה לזיהוי על צלחת agarose ( B ). כמו כן, לארגן את הטיפים כך את הקצה השמאלי ביותר קצה יש עצה אחת במצב C10 ולאחר מכן ארבעה טיפים אחרים עם הקצוות שלהם מנותקים כך שהם לא לקרוס את מחזיק צלחת ( ג ). מניחים את הטיפים הנותרים בארבעה קופסאות כך שהמקומות הפנימיים של 24 הטייסים כבושים ( D ). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55879/55879fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 55879fig3.jpg &quot;/&gt; איור 3: ODELAY ממשק משתמש גרפי. צילום מסך של ממשק משתמש גרפי עבור &quot;ODELAY_Microscopecontrol.m&quot; ( A ). ממשק זה מאפשר ניטור של המצלמה עבור התאמת הגדרות תאורה מיקרוסקופ עבור מצבי epifluorescent ובהיר שדה. החצים האדומים מצביעים על הלחצנים &#39;פוקוס&#39; ו&#39;מעבר &#39;המפעילים את המצלמה כדי לרכוש תמונות במהירות ולפתוח את תריס האור המועבר בהתאמה. החצים הכחולים משמשים להעתקת הבמה למקור ולאחר מכן הגדרת המקור עם הלחצן &quot;Go Origin&quot; ו- &quot;Set&quot;. חיצים ירוקים מצביעים על &quot;אפס&quot; ו &quot;ODELAY !!!&quot; לחצנים המאפסים מצבי תמונה של ODELAY לתנאים הנוכחיים ומפעילים אוסף תמונות של ODELAY. זמן לשגות תמונות של שמרים גדל על בינוני מוצק ב 0, 3, 6, ו 9 שעות לאחר תצפית ( ב ). צילום מסך של ממשק המשתמש הגרפי עבור &quot;ODELAY_IPT.m&quot; או th<html> עיבוד תמונה כלי ( C ). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55879/55879fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig4.jpg" /> איור 4: דוגמה פלט ODLAY. מערך נתונים זה משווה זנים BY4741 ו BY4742 על מדיה YPD. נתון זה הוא דוגמה של שקף agarose מוכן היטב; עם זאת, הגדרות פוקוס אוטומטי אינן אופטימליות. הנתונים המוצגים בכל עמוד, משמאל לימין, הם: יכולת הנשיאה ביומן 2 באזור המושבה; הכפלת הזמן, נתון דקות; ו בפיגור זמן, נתון דקות. בדוגמה זו, פעמים הכפלה של כל הכתמים על קו השקופית אגר למעלה גם עם כמות קטנה של זמן הכפלת כפול לכיוון העמודה. עם זאת, פעמים בפיגור להשתנות במידה ניכרת במערך זה._upload / 55879 / 55879fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig5.jpg" /> איור 5: דוגמאות לעקומת הצמיחה. דוגמה זו ממחישה כיצד המיקוד הראשוני המסכן עלול לגרום לזמן השהיה המשוער (t lag ) להגדלה ( A ), ואילו המיקום הסמוך מציג זמן פיגור קצר יותר ( B ). T d הוא זמן הכפלת דקות, ו l בפיגור הוא זמן השהיה דקות. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55879/55879fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55879/55879fig6.jpg" /> איור 6: דוגמה לניסוי המבוצע בהצלחה. הXample של זן BY4742 נבדק לאחר החלפת נורת הלוגן טונגסטן עם מנורה דיודה ולהבטיח את המיקוד האוטומטי מוגדר כראוי. נראה כי כל זמני ההכפלה חופפים היטב והזמן בפיגור נראה עקבי. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55879/55879fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth at JoVE.com

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

אנו מציגים שיטה לכימות פנוטיפים הצמיחה של תאים שמרים בודדים כפי שהם גדלים לתוך מושבות על מדיה מוצקה באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופ בשם, אחת הכפלה הערכה של מערכים חיים של שמרים (ODELAY). הטרוגניות האוכלוסייה של תאים זהים גנטית גדל לתוך מושבות ניתן לצפות ישירות לכמת.

ODLAY: שיטה בקנה מידה גדול עבור כימות רב פרמטר של גידול שמרים

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

odelay-large-scale-method-for-multi-parameter-quantification-yeast

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

8.1K Views.  Institute for Systems Biology.  אנו מציגים שיטה לכימות פנוטיפים הצמיחה של תאים שמרים בודדים כפי שהם גדלים לתוך מושבות על מדיה מוצקה באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופ בשם, אחת הכפלה הערכה של מערכים חיים של שמרים (ODELAY). הטרוגניות האוכלוסייה של תאים זהים גנטית גדל לתוך מושבות ניתן...

Video: ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

בקנה מידה גדול של מסכי ספריות Metagenomic

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the expression pattern of a target protein across the entire brain are relatively easy to answer when using IHC in small brains, such as those of rodents. However, answering the same questions in large and convoluted brains, such as those of primates presents a number of challenges. Here we present a systematic approach for immunodetection of target proteins in an adult monkey brain. This approach relies on the tissue embedding and sectioning methodology of NeuroScience Associates (NSA) as well as tools developed specifically for batch-staining of free-floating sections. It results in uniform staining of a set of sections which, at a particular interval, represents the entire brain. The resulting stained sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to measure protein levels, the population of neurons expressing a certain protein.

Large-scale immunodetection of target proteins across the entire primate brain is possible by employing novel tissue embedding and sectioning methods combined with the use of creative apparatus for batch staining of multiple free-floating sections at a given time.

אצווה Immunostaining לגילוי בקנה מידה גדול חלבון הנמצא במוח הקופים שלמים

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

בידוד הרחבת בקנה מידה גדול של תאים אנושיים למבוגרים האנדותל המושבה יצירת אב

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to mammals, zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

בקנה מידה גדול דג הזברה מבוסס ב-vivo מולקולה קטנה מסך

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), and delta-cells (somatostatin) that are embedded in the exocrine tissues and comprise 1-2% of the entire pancreas. There is a close correlation between body and pancreas weight. Total beta-cell mass also increases proportionately to compensate for the demand for insulin in the body. What escapes this proportionate expansion is the size distribution of islets. Large animals such as humans share similar islet size distributions with mice, suggesting that this micro-organ has a certain size limit to be functional. The inability of large animal pancreata to generate proportionately larger islets is compensated for by an increase in the number of islets and by an increase in the proportion of larger islets in their overall islet size distribution. Furthermore, islets exhibit a striking plasticity in cellular composition and architecture among different species and also within the same species under various pathophysiological conditions. In the present study, we describe novel approaches for the analysis of biological image data in order to facilitate the automation of analytic processes, which allow for the analysis of large and heterogeneous data collections in the study of such dynamic biological processes and complex structures. Such studies have been hampered due to technical difficulties of unbiased sampling and generating large-scale data sets to precisely capture the complexity of biological processes of islet biology. Here we show methods to collect unbiased "representative" data within the limited availability of samples (or to minimize the sample collection) and the standard experimental settings, and to precisely analyze the complex three-dimensional structure of the islet. Computer-assisted automation allows for the collection and analysis of large-scale data sets and also assures unbiased interpretation of the data. Furthermore, the precise quantification of islet size distribution and spatial coordinates (i.e. X, Y, Z-positions) not only leads to an accurate visualization of pancreatic islet structure and composition, but also allows us to identify patterns during development and adaptation to altering conditions through mathematical modeling. The methods developed in this study are applicable to studies of many other systems and organisms as well.

Novel computer-assisted methods of large-scale procurement and analysis of immunohistochemically stained pancreatic specimens are described: (1) Virtual Slice capture of the entire section; (2) Mass analysis of large-scale data; (3) Reconstruction of 2D Virtual Slices; (4) 3D islet mapping; and (5) Mathematical analysis.

בסיוע מחשב ויזואליזציה בקנה מידה גדול כימות המוניים הלבלב איילט, התפלגות גודל ואדריכלות

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

Yeast Colony Embedding Method

Patterning of different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms also display patterns of cell types. For example, in the yeast S. cerevisiae, sporulated cells and pseudohyphal cells are not uniformly distributed in colonies. The functional importance of patterning and the molecular mechanisms that underlie these patterns are still poorly understood.
One challenge with respect to investigating patterns of cell types in fungal colonies is that unlike metazoan tissue, cells in colonies are relatively weakly attached to one another. In particular, fungal colonies do not contain the same extensive level of extracellular matrix found in most tissues . Here we report on a method for embedding and sectioning yeast colonies that reveals the interior patterns of cell types in these colonies. The method can be used to prepare thick sections (0.5 &mu;) useful for light microscopy and thin sections (0.1 &mu;) suitable for transmission electron microscopy. Asci and pseudohyphal cells can easily be distinguished from ovoid yeast cells by light microscopy , while the interior structure of these cells can be visualized by EM.
The method is based on surrounding colonies with agar, infiltrating them with Spurr's medium, and then sectioning. Colonies with a diameter in the range of 1-2 mm are suitable for this protocol. In addition to visualizing the interior of colonies, the method allows visualization of the region of the colony that invades the underlying agar.

A method for embedding yeast colonies allowing sectioning for light and electron microscopy. This protocol allows determination of the distribution of sporulated cells and pseudohyphal cells within colonies providing a new tool toward understanding the organization of cell types within a fungal community.

במושבה שמרים והטבעה שיטה

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

Growth Assays to Assess Polyglutamine Toxicity in Yeast

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's disease, and Huntington's disease 1. Huntington's disease (HD) is caused by the abnormal expansion of a polyglutamine (polyQ) region within the protein huntingtin. The polyQ-expanded huntingtin protein attains an aberrant conformation (i.e. it misfolds) and causes cellular toxicity 2. At least eight further neurodegenerative diseases are caused by polyQ-expansions, including the Spinocerebellar Ataxias and Kennedy&#x2019;s disease 3.
The model organism yeast has facilitated significant insights into the cellular and molecular basis of polyQ-toxicity, including the impact of intra- and inter-molecular factors of polyQ-toxicity, and the identification of cellular pathways that are impaired in cells expressing polyQ-expansion proteins 3-8. Importantly, many aspects of polyQ-toxicity that were found in yeast were reproduced in other experimental systems and to some extent in samples from HD patients, thus demonstrating the significance of the yeast model for the discovery of basic mechanisms underpinning polyQ-toxicity. 
A direct and relatively simple way to determine polyQ-toxicity in yeast is to measure growth defects of yeast cells expressing polyQ-expansion proteins. This manuscript describes three complementary experimental approaches to determine polyQ-toxicity in yeast by measuring the growth of yeast cells expressing polyQ-expansion proteins. The first two experimental approaches monitor yeast growth on plates, the third approach monitors the growth of liquid yeast cultures using the BioscreenC instrument. 
Furthermore, this manuscript describes experimental difficulties that can occur when handling yeast polyQ models and outlines strategies that will help to avoid or minimize these difficulties. The protocols described here can be used to identify and to characterize genetic pathways and small molecules that modulate polyQ-toxicity. Moreover, the described assays may serve as templates for accurate analyses of the toxicity caused by other disease-associated misfolded proteins in yeast models.

This manuscript describes three complementary protocols for assessing the toxicity of polyglutamine (polyQ)-expansion proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. These protocols can easily be modified to monitor the toxicity of other misfolded proteins in yeast.

מבחני גידול כדי להעריך את רעילות Polyglutamine על שמרים

Protein misfolding is associated with many human diseases, particularly neurodegenerative diseases, such as Alzheimer&#x2019;s disease, Parkinson's ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with a molecular mass smaller than 1.5 kDa. Although the definitive molecular identity of the pore is still under debate, proteins such as cyclophilin D, VDAC and ANT contribute to mtPTP formation. While the involvement of mtPTP opening in cell death is well established1, accumulating evidence indicates that the mtPTP serves a physiologic role during mitochondrial Ca2+ homeostasis2, bioenergetics and redox signaling 3.
mtPTP opening is triggered by matrix Ca2+ but its activity can be modulated by several other factors such as oxidative stress, adenine nucleotide depletion, high concentrations of Pi, mitochondrial membrane depolarization or uncoupling, and long chain fatty acids4. In vitro, mtPTP opening can be achieved by increasing Ca2+ concentration inside the mitochondrial matrix through exogenous additions of Ca2+ (calcium retention capacity). When Ca2+ levels inside mitochondria reach a certain threshold, the mtPTP opens and facilitates Ca2+ release, dissipation of the proton motive force, membrane potential collapse and an increase in mitochondrial matrix volume (swelling) that ultimately leads to the rupture of the outer mitochondrial membrane and irreversible loss of organelle function.
Here we describe a fluorometric assay that allows for a comprehensive characterization of mtPTP opening in isolated mouse heart mitochondria. The assay involves the simultaneous measurement of 3 mitochondrial parameters that are altered when mtPTP opening occurs: mitochondrial Ca2+ handling (uptake and release, as measured by Ca2+ concentration in the assay medium), mitochondrial membrane potential, and mitochondrial volume. The dyes employed for Ca2+ measurement in the assay medium and mitochondrial membrane potential are Fura FF, a membrane impermeant, ratiometric indicator which undergoes a shift in the excitation wavelength in the presence of Ca2+, and JC-1, a cationic, ratiometric indicator which forms green monomers or red aggregates at low and high membrane potential, respectively. Changes in mitochondrial volume are measured by recording light scattering by the mitochondrial suspension. Since high-quality, functional mitochondria are required for the mtPTP opening assay, we also describe the steps necessary to obtain intact, highly coupled and functional isolated heart mitochondria.

A spectrofluorometric protocol for the measurement of the mitochondrial permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria is presented here. The assay involves the simultaneous measurement of mitochondria Ca2+ handling, mitochondrial membrane potential and mitochondrial volume. The procedure for obtaining high-quality and functional heart mitochondria is also described.

מדידת פרמטר-Multi של הפתיחה הנקבובית מעבר החדירות בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of variants within families or populations can facilitate identification of the genetic factors of disease. Illumina&#39;s panel of genotyping BeadChips allows investigators to genotype thousands or millions of single nucleotide polymorphisms (SNPs) or to analyze other genomic variants, such as copy number, across a large number of DNA samples. These SNPs can be spread throughout the genome or targeted in specific regions in order to maximize potential discovery. The Infinium assay has been optimized to yield high-quality, accurate results quickly. With proper setup, a single technician can process from a few hundred to over a thousand DNA samples per week, depending on the type of array. This assay guides users through every step, starting with genomic DNA and ending with the scanning of the array. Using propriety reagents, samples are amplified, fragmented, precipitated, resuspended, hybridized to the chip, extended by a single base, stained, and scanned on either an iScan or Hi Scan high-resolution optical imaging system. One overnight step is required to amplify the DNA. The DNA is denatured and isothermally amplified by whole-genome amplification; therefore, no PCR is required. Samples are hybridized to the arrays during a second overnight step. By the third day, the samples are ready to be scanned and analyzed. Amplified DNA may be stockpiled in large quantities, allowing bead arrays to be processed every day of the week, thereby maximizing throughput.

A protocol is described that uses Illumina&#39;s Infinium assays to perform large-scale genotyping. These assays can reliably genotype millions of SNPs across hundreds of individual DNA samples in three days. Once generated, these genotypes can be used to check for associations with a variety of different diseases or phenotypes.

Infinium Assay עבור יישומי Genotyping SNP בקנה מידה גדולה

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting factors, such as labor intensive sample preparations, low detection limits, slow scan speeds, intensive method optimization for each metabolite, and the inability to measure both positively and negatively charged ions in single experiments. Therefore, a novel metabolomics protocol could advance metabolomics studies. Amide-based hydrophilic chromatography enables polar metabolite analysis without any chemical derivatization. High resolution MS using the Q-Exactive (QE-MS) has improved ion optics, increased scan speeds (256 msec at resolution 70,000), and has the capability of carrying out positive/negative switching. Using a cold methanol extraction strategy, and coupling an amide column with QE-MS enables robust detection of 168 targeted polar metabolites and thousands of additional features simultaneously.&#160; Data processing is carried out with commercially available software in a highly efficient way, and unknown features extracted from the mass spectra can be queried in databases.

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. Utilizing normal-phased liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry with polarity switching and a rapid duty cycle, we describe a protocol to analyze the polar metabolic composition of biological material with high sensitivity, accuracy, and resolution.

אסטרטגיה בקנה מידה גדולה Metabolomics רגיש, כמותי

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...