המחברים רוצים להכיר דטלף שומאן, ג&#39;ניפר סאטון (תרמו פישר סיינטיפיק) ונתנאל סניידר (אוניברסיטת פנסילבניה) לדיונים חשובים בכיול מסה ועיבוד נתונים. מחקר שפורסם בפרסום זה נתמכה על ידי המכון הלאומי לסרטן של המכון הלאומי לבריאות במספר פרס R00CA168997. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות.

1. הכנת LC-MS ריאגנטים, הקמת שיטת כרומטוגרפיה, וקביעת נהלי הפעלה מכשיר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת ממסים LC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 500 שלבי מיליליטר ניידים. הוא אמוניום אצטט 20 מ&quot;מ ו15 מ&quot;מ אמוניום הידרוקסיד ב3% אצטוניטריל / מים, pH הסופי 9.0; ו-B הוא אצטוניטריל 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן רופף מכסה את הבקבוק, למקם אותו בsonicator אמבט מים, וsonicate עבור 10 דקות ללא חימום נוסף. (שלב זה הוא להבטיח שכל מלחי אמוניום מתמוססים לחלוטין ושאין בועות אוויר שיורית.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 250 מיליליטר העברת הממס לבקבוק זכוכית מיליליטר 250 לשימוש LC-MS, ולשמור את היתרה ב 4 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון כיול טווח מסה הנמוך. חשוב להשתמש בתערובת כיול טווח מסה נמוכה מותאמת אישית עבור יישומי metabolomics כדי להבטיח שהמונים מדויקים זוהו במשקל מולקולרי נמוך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל 5 מ&quot;ג של שני sodiאממ fluoroacetate וחומצת homovanillic ולפזר אותם לתוך 5 מיליליטר מים כדי להפוך את הריכוז סופי של 1 מ&quot;ג / מיליליטר. ממיסים diazinon במתנול כדי להפוך את הריכוז סופי של 10 מ&quot;ג / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין 1 מיליליטר של תמיסת כיול מסה נמוכה שלילית, לערבב 960 מיליליטר טרמו פתרון כיול שלילי עם 20 מיליליטר של fluoroaceate נתרן וחומצת פתרון homovanillic. כדי להפוך 1 מיליליטר של תמיסת כיול מסה נמוכה חיובית, לערבב 990 מיליליטר טרמו פתרון כיול חיובי ו10 מיליליטר פתרון diazinon. (פתרון כיול המסה הנמוכה צריך להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס ולהיות מוכן טרי בכל 2 חודשים.) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיול של QE-MS בטווח מסה נמוכה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ביצוע כיול טווח מסה נמוך, לבצע כיול סטנדרטי מסה (m / z, 150-2,000) במצבים חיוביים ושליליים המבוססים על הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שכיול מסה רגיל עובר, להתאים את טווח הסריקה ל60-900 מ &#39;/ z בלוח הבקרה של המכשירוCID מקור 25 eV למצב חיובי ו35 eV למצב שלילי מיושם. (זה ייתן אותות חזקים של יון בר קפאין ויון סולפט. טווח הסריקה כאן הוא קבוע, כי מ &#39;/ z האחרון לא צריך להיות גדול יותר מאשר 15x של m / z מתחיל) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שמקור יון הוא יציב, ולאחר מכן לבצע את הכיול המותאם אישית. הערה: מקור יציב מוגדר כפחות מ -10% מהשונות יון הנוכחיות הכוללת במצב חיובי, ופחות מ 15% במצב שלילי. יוני הכיול המותאמים אישית ומתאים מ &#39;/ z מופיעים בטבלה 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקים את מכשור LC-MS לניתוח המטבוליט קוטב. LC הוא מצמידים את QE-MS להפרדת המטבוליט וזיהוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצייד את QE-MS עם בדיקה מחוממת electrospray יינון (H-ESI). הגדר את הפרמטרים כוונון הרלוונטיים לבדיקה כפי שמופיעה ברשימה: טמפרטורת תנור, 120 מעלות צלזיוס; גז נדן, 30; גז עזר, 10; לטאטא גז 3,; לרסס מתח, 3.6 קילו וולט עבורמצב חיובי ו2.5 קילו וולט עבור מצב שלילי. הגדר את טמפרטורת נימים ב320 ° C, ו-S-עדשה ב55. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות שיטת סריקה מלאה כדלקמן: טווח מלא סריקה: 60-900 (m / z); רזולוציה: 70,000; זמן הזרקה מרבי: 200 אלפיות שני עם זמני הזרקה טיפוסיים סביב 50 אלפיות שניים; בקרה אוטומטית רווח (AGC): 3,000,000 יונים. הגדרות אלה יגרמו למחזור עבודה של כ 550 msec לבצע סריקות במצב חיובי ושלילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקים את שיטת כרומטוגרפיה. מעסיק עמודה אמיד (100 x 2.1 id מ&quot;מ, מ&quot;מ 3.5) להפרדת מתחם בטמפרטורת חדר 13,15. השלב הנייד הוא כפי שתואר לעיל, והשלב נייד B הוא אצטוניטריל. השתמש בשיפוע ליניארית כדלקמן: 0 דקות, 85% B; 1.5 דקות, 85% B, 5.5 דקות, 35% B; 10min, 35% B, 10.5 דקות, 35% B, 14.5 דקות, 35% B, 15 דקות, 85% B, ו20 דקות, B. 85% קצב הזרימה הוא 0.15 מיליליטר / דקה 0-10 דקות ו15 ל20 דקות, ו0.3 מיליליטר / דקה 10.5-14.5 דקות. </li></ol></li></ol> 2. Preparation של דוגמאות המטבוליט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ממס חילוץ. מערבבים 40 מיליליטר מתנול (כיתה LC-MS) ו10 מיליליטר מים (כיתה LC-MS) בצינור 50 מיליליטר, ולשמור אותו במקפיא -80 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 1 לפני השימוש. הערה: הליך זה ואת הצעדים הבאים יכולים להיות שונה עבור החילוץ של רקמות ביולוגיות ודגימות נוזלים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 8 תאי HCT לסרטן מעי גס בתרבות בשלוש 10 מנות סנטימטר או 6 צלחות היטב עם מדיום גידול מלא, RPMI 1640 תוספת 10% חום בסרום שור עוברי מומת ו100,000 יחידות פניצילין / L ו100 סטרפטומיצין מ&quot;ג / ליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תאים מגיעים למפגש 80%, להסיר במהירות בינונית, ומניח את הצלחת או צלחת על גבי 13,15 קרח יבשים. הוספת מיצוי 1 מיליליטר ממס באופן מיידי (80% מתנול / מים), ולהעביר את הצלחת למקפיא -80 מעלות צלזיוס. למנה 10 סנטימטר, להוסיף 3 מיליליטר של מיצוי בממסים היטב כל אחד. (נסה להסיר את המדיום ככל האפשר כדי למנוע את אפקט דיכוי יון בשל מלחים שיורית מבינוני.)</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את הצלחת ל15 דקות. הסר אותו מהמקפיא, ומגרד תאים לתוך הממס על קרח יבש. מעביר את הפתרון ל1.7 צינורות מיליליטר Eppendorf, ו צנטריפוגות עם המהירות של 20,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. (הכן מטבוליטים תא משלוש מנות נפרדות כדי להפוך את שלוש דגימות לשכפל. המטרה של שמירה על שני צינורות היא שיש אחד כגיבוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את supernatant לשני צינורות Eppendorf חדשים, ולייבש אותם בחלל ריק במהירות. זה לוקח בערך 3-6 שעות בהתאם לוואקום במהירות בשימוש. (יכולות להיות גם מיובשים דגימות לילה מתחת לגז חנקן.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צינורות הייבוש, חנות של כל דגימה ב-80 ° C במקפיא. כאשר מוכן, מחדש דגימה אחת ל20 מיליליטר מים (כיתה LC-MS), ולהזריק 5 מיליליטר לLC-QE-MS לניתוח. </li></ol></li></ol> 3. הגדרה של רצף לדוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הכיול בוצע כראוי על QE-MS, לאזן עמודת LC למשך 5 דקות עם 85% בזרימהשיעור 0.15 מיליליטר / דק &#39;, המהווה את המצב ההתחלתי של שיפוע LC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את רצף המדגם בסדר אקראי. הערה: בדרך זו, שהיא מחלקת התנודות הוצגו על ידי LC-MS לכל דגימה ומבטיחה השוואה מדויקת יותר בין מדגמים שונים. כל 6 דגימות, להוסיף ריצה לשטוף, אשר המניות באותה שיטת MS, למעט שיפוע LC הוא 95% עבור 10 דקות ואחריו איזון עמודה 5 דקות ב85% בקצב זרימה של 0.15 מיליליטר / דקה. להוסיף דגימות ריקות (100% מים) אחרי כל הסיבוב לשטוף להעריך את הרקע של המערכת ולשאת מעל הרמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הרצף וברגע שעמודת LC תערוכות לחץ יציב, סביב 400 psi, להתחיל את ריצת הרצף. אם אין דוגמא אחרת להפעלה לאחר רצף זה, ולאחר מכן להוסיף ריצה להפסיק בסופו של הרצף, שבו יש קצב זרימה של 0 מיליליטר / דקה בסוף השיפוע ולבחור &quot;המתנה&quot; לאחר שסיים את רצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפעיל מחדש את אותו המדגם להגדיר שעות 12 לאחר כיול. (I זהים להעריך את תנודות השגיאה ההמונית לאחר כיול). </li></ol> 4. הודעה ניתוח כלי ניקוי ותחזוקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של רצף, לשטוף את העמודה עם 95% בקצב זרימה של 0.2 מיליליטר / דקה במשך 2 שעות, ואם יש צורך, להפוך את העמודה לפני הכביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את עמודת LC ולהתחבר ישירות לLC יון המקור על ידי איגוד. הכן את חומרי ניקוי, מים / מתנול / חומצה פורמית (v: v: v, 90:10:0.2), להגדיר MS במצב המתנה, ומערכת השטיפה LC-MS בקצב זרימה של 0.1 מיליליטר / דקה במשך שעה 1 כדי להסיר שיורי זירז מלחים או זיהומים אחרים. מנמיכים את קצב הזרימה אם יש לחץ במערכת יותר מדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את טמפרטורת נימים על 50 מעלות צלזיוס, ולהסיר את כלוב היונים. מוציא בזהירות את קונוס לטאטא יון וצינור העברת יון לאחר טמפרטורת הנימים יורדת ל 50 ° C. השתמש ברשת מחוספס, כמו נייר זכוכית, כדי להסיר זיהומים שנשארו על פני השטח של חרוט לטאטא יון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את העברת יוןצינור לתוך צינור פלקון 15 מיליליטר מכיל 10 מיליליטר 90% מים / מתנול עם 0.1% חומצה פורמית. לאחר sonicating הצינור בsonicator אמבט מים עבור 20 דקות, למזוג הממס בפנים, תחליף אותו במתנול הטהור 10 מיליליטר וsonicate עוד 20 דקות. (במידת צורך, sonication ניתן לעשות ב-C ° 40 או טמפרטורה גבוהה עוד יותר כדי להשיג תוצאות ניקוי טובות יותר.) </li></ol> 5. ניתוח של LC-MS נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח את רצף המדגם פועל בצורה חלקה, לאחר שסיים את שתי הדגימות הראשונות ברצף, בדוק פסגות למטבוליטים לא ידועים. השתמש בקובץ CSV רישום שמות המטבוליט, נוסחה כימית ניטראלית ומצב זיהוי (חיובי או שלילי), כקובץ הקלט וקובץ הפלט מכיל פסגות חילוץ וטעייה המונית בעמודים לדקה. אם צורת השיא היא חריגה או השגיאה ההמונית כבויה יותר מ 5 עמודים לדקה, ולאחר מכן את שאר הרצף שחייב להיפסק ופתרון בעיות שצריך לעשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את השיטה &quot;יישור שיאומיצוי מסגרת &quot;על תוכנה זמינה באופן מסחרי. בחר נתונים גולמיים מLC-MS ולקבץ אותם. לאסוף דגימות באמצע הרצף הארוך כמו לדוגמא התייחסות כרומטוגרפיה ליישור שיא. העלה זרע מסגרת כולל מטבוליטים ידועים לניתוח הממוקד מטבוליטים עם הנתונים שנאספו ואת זרע המסגרת המתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוח נתונים במצב חיובי ושלילי בנפרד. השתמש בהגדרת ברירת המחדל עבור פרמטרים נוספים. כבה את פונקציית החיפוש באתר ולהפעיל את זרימת העבודה. לייצא את הנתונים מעובדים כגיליון Excel המכיל אזור שיא של כל מסגרת. ערכות הראשונות של מסגרות מתאימות למטבוליטים ברשימה הממוקד. הערה: לניתוח המטבוליט ממוקד, מידע מטבוליטים מתקבל על סמך המחקרים הקודמים 13,15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח המטבוליט לא ממוקד, לבחור את השיטה של ​​&quot;מיצוי רכיב&quot;. טען דגימות ריקות לחיסור רקע. סף שנקבע על שיא עוצמהלא 10 5, רוחב מ &#39;/ z של 10 עמודים לדקה ויחס אות לרעש של 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במסד נתוני metabolome אנושי לזיהוי תרכובות ידועות. שימוש במסנן קורות חיים כדי להסיר את הרכיבים עם קורות חיים גדולים בתוך דגימות לשכפל. באופן ידני לעבור כל רכיב ולבחור את אלה עם שיא מוגדר היטב או הבדל גדול יחסית בסוגי מדגמים שונים לחיפוש באתר. נתוני יצוא עם להיטים במסד נתונים. (יישור שיא יכל לעקוף אם ציון יישור השיא הוא נמוך מדי.) </li></ol>

<ol>
	<li>Fiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+genomics,+metabolome+analysis,+and+biochemical+modelling+to+understand+metabolic+networks.">Combining genomics, metabolome analysis, and biochemical modelling to understand metabolic networks.</a> Comparative and Functional Genomics. 2 (3), 155-168 (2001).</li><li>Mulleder, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prototrophic+deletion+mutant+collection+for+yeast+metabolomics+and+systems+biology.">A prototrophic deletion mutant collection for yeast metabolomics and systems biology.</a> Nature Biotechnology. 30 (12), 1176-1178 (2012).</li><li>Patel, V. R., Eckel-Mahan, K., Sassone-Corsi, P., Baldi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CircadiOmics:+Integrating+circadian+genomics,+transcriptomics,+proteomics+and+metabolomics.">CircadiOmics: Integrating circadian genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics.</a> Nature Methods. 9 (8), 772-773 (2012).</li><li>Ideker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+genomic+and+proteomic+analyses+of+a+systematically+perturbed+metabolic+network.">Integrated genomic and proteomic analyses of a systematically perturbed metabolic network.</a> Science. 292 (5518), 929-934 (2001).</li><li>Jonsson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+identifying+differences+in+large+series+of+metabolomic+samples+analyzed+by+GC/MS.">A strategy for identifying differences in large series of metabolomic samples analyzed by GC/MS.</a> Analytical Chemistry. 76 (6), 1738-1745 (2004).</li><li>Jonsson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+data+analysis+for+detecting+and+identifying+differences+between+samples+in+GC/MS-based+metabolomic+analyses.">High-throughput data analysis for detecting and identifying differences between samples in GC/MS-based metabolomic analyses.</a> Analytical Chemistry. 77 (17), 5635-5642 (2005).</li><li>Weljie, A. M., Newton, J., Mercier, P., Carlson, E., Slupsky, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+profiling:+Quantitative+analysis+of+1H+NMR+metabolomics+data.">Targeted profiling: Quantitative analysis of 1H NMR metabolomics data.</a> Analytical Chemistry. 78 (13), 4430-4442 (2006).</li><li>Wiklund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+GC/TOF-MS-based+metabolomics+data+for+identification+of+biochemically+interesting+compounds+using+OPLS+class+models.">Visualization of GC/TOF-MS-based metabolomics data for identification of biochemically interesting compounds using OPLS class models.</a> Analytical Chemistry. 80 (1), 115-122 (2008).</li><li>Xia, J., Bjorndahl, T. C., Tang, P., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetaboMiner--semi-automated+identification+of+metabolites+from+2D+NMR+spectra+of+complex+biofluids.">MetaboMiner--semi-automated identification of metabolites from 2D NMR spectra of complex biofluids.</a> BMC Bioinformatics. 9, 507 (2008).</li><li>Lu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=13C+NMR+isotopomer+analysis+reveals+a+connection+between+pyruvate+cycling+and+glucose-stimulated+insulin+secretion+(GSIS).">13C NMR isotopomer analysis reveals a connection between pyruvate cycling and glucose-stimulated insulin secretion (GSIS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (5), 2708-2713 (2002).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+the+rate+of+the+glutamate/glutamine+cycle+in+the+human+brain+b.+in+vivo+13C+NMR.">Determination of the rate of the glutamate/glutamine cycle in the human brain b. in vivo 13C NMR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 8235-8240 (1999).</li><li>Kitteringham, N. R., Jenkins, R. E., Lane, C. S., Elliott, V. L., Park, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+reaction+monitoring+for+quantitative+biomarker+analysis+in+proteomics+and+metabolomics.">Multiple reaction monitoring for quantitative biomarker analysis in proteomics and metabolomics.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (13), 1229-1239 (2009).</li><li>Locasale, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomics+of+human+cerebrospinal+fluid+identifies+signatures+of+malignant+glioma.">Metabolomics of human cerebrospinal fluid identifies signatures of malignant glioma.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics : MCP. 11 (6), 10-1074 (2012).</li><li>Wolf-Yadlin, A., Hautaniemi, S., Lauffenburger, D. A., White, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+reaction+monitoring+for+robust+quantitative+proteomic+analysis+of+cellular+signaling+networks.">Multiple reaction monitoring for robust quantitative proteomic analysis of cellular signaling networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5860-5865 (2007).</li><li>Yuan, M., Breitkopf, S. B., Yang, X., Asara, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+positive/negative+ion-switching,+targeted+mass+spectrometry-based+metabolomics+platform+for+bodily+fluids,+cells,+and+fresh+and+fixed+tissue.">A positive/negative ion-switching, targeted mass spectrometry-based metabolomics platform for bodily fluids, cells, and fresh and fixed tissue.</a> Nature Protocols. 7 (5), 872-881 (2012).</li><li>Ramanathan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=It+is+time+for+a+paradigm+shift+in+drug+discovery+bioanalysis:+From+SRM+to+HRMS.">It is time for a paradigm shift in drug discovery bioanalysis: From SRM to HRMS.</a> Journal of Mass Spectrometry : JM. 46 (6), 595-601 (2011).</li><li>Lu, W., Clasquin, M. F., Melamud, E., Amador-Noguez, D., Caudy, A. A., Rabinowitz, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolomic+analysis+via+reversed-phase+ion-pairing+liquid+chromatography+coupled+to+a+stand+alone+orbitrap+mass+spectrometer.">Metabolomic analysis via reversed-phase ion-pairing liquid chromatography coupled to a stand alone orbitrap mass spectrometer.</a> Analytical Chemistry. 82 (8), 3212-3221 (2010).</li><li>Michalski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra+high+resolution+linear+ion+trap+orbitrap+mass+spectrometer+(orbitrap+elite)+facilitates+top+down+LC+MS/MS+and+versatile+peptide+fragmentation+modes.">Ultra high resolution linear ion trap orbitrap mass spectrometer (orbitrap elite) facilitates top down LC MS/MS and versatile peptide fragmentation modes.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics : MCP. 11 (3), 10-1074 (2012).</li><li>Michalski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics+using+Q+exactive,+a+high-performance+benchtop+quadrupole+orbitrap+mass+spectrometer.">Mass spectrometry-based proteomics using Q exactive, a high-performance benchtop quadrupole orbitrap mass spectrometer.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics : MCP. 10 (9), (2011).</li><li>Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Untargeted+Metabolomics+from+Biological+Sources+Using+Ultraperformance+Liquid+Chromatography-High+Resolution+Mass+Spectrometry.">Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry.</a> UPLC-HRMS). J. Vis. Exp. (75), (2013).</li><li>Gika, H. G., Theodoridis, G. A., Wingate, J. E., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within-day+reproducibility+of+an+HPLC-MS-based+method+for+metabonomic+analysis:+Application+to+human+urine.">Within-day reproducibility of an HPLC-MS-based method for metabonomic analysis: Application to human urine.</a> Journal of Proteome Research. 6 (8), 3291-3303 (2007).</li><li>Want, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+metabolic+profiling+procedures+for+urine+using+UPLC-MS.">Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS.</a> Nature Protocols. 5 (6), 1005-1018 (2010).</li></ol>

המחברים מצהירים שום ניגוד עניינים.

השלבים הקריטיים ביותר לפרופיל המטבוליט מוצלח בתאים תוך שימוש בפרוטוקול זה הם: 1) שליטה על מדיום הגידול והפקה מדוקדקת של התאים; 2) לשנות את שיטת LC מבוסס על שיטת התקנת MS, כדי להבטיח שיש מספיק (בדרך כלל לפחות 10 נקודות נתונים) על פני שיא כדי לכמת; 3) עושה כיול מסה נמוך לפני הפעלת דגימות; 4) הזרקה לא יותר מ 5 מיליליטר, כדי למנוע זמן שמירת הסטה והרחבת שיא הנגרמת על ידי מים; ו5) הכנה והפעלת דגימות להשוואה באותו אצווה כדי למזער את ההשפעות אצווה. הסטנדרטים (טבלת 1) שנבחרה כאן לכיול טווח מסה נמוך ניתנים להחלפה. כל תרכובת ידועה עם m / z שנופל לתוך טווח הסריקה ההמונית, הוא התנהג יפה במקור H &#39;חדשות ארכיאולוגיות, והוא מסיס במים, מתנול, או אצטוניטריל הם מועמדים סבירים לתקני כיול. מומלץ מאוד כדי לאחסן את כל פתרונות כיולt 4 ° C כדי לייצב קפאין וגם כדי למזער את האידוי של מתנול או אצטוניטריל בפתרון הכיול, כך שביצועי הכיול יכולים להיות לשעתקו יותר. בהשוואה לטווח המוני רגיל, מ &#39;/ z 150 ל 2,000, כיול טווח מסה נמוך שצריך לעשות בתדירות גבוהה יותר, לפחות פעם ביומיים. זרימת עבודה זו, מממס חילוץ, ממס הכינון מחדש, שלב LC נייד, למסת כיול טווח נמוך ו-MS טווח סריקה עברה אופטימיזציה כדי למדוד מטבוליטים קוטב. זה כולל חומצות אמינו, אצטיל חומצות אמינו, חומרי ביניים מסלול גליקוליזה, nucleosides, ביניים מחזור TCA, חלק ביניים מסלול חילוף חומרים של אחד פחמן וכן הלאה. עם זאת, שינויים של פרוטוקול זה לכיתות אחרות של מטבוליטים, כגון קואנזים (CoA) מינים, folates, פוספוליפידים הם אפשריים. לדוגמא, תעודות מקוריות הן יציבים יותר בתנאים חומציים, ולכן התוספת של חומצה ל80% מתנול / מים תהיה מועילה לשדרגישות לנדוד CoA. כמו כן, תעודות מקוריות ושומנים נוטים להיות הרבה משקולות מולקולריות גדולות, ובכך טווח הסריקה מ &#39;/ z צריך להיות מותאם 60-900 לטווח הראוי שיכסה מטבוליטים אלה. אף שחלק מתוצאות החיפוש של מסד נתונים של רכיבים לא ממוקדות חפיפה עם הרשימה הממוקד, הוא עדיין בעל חשיבות לבנות רשימה ממוקדת זו בהתבסס על סדר עדיפויות המחקר. מאז מטבוליטים ברשימה הממוקד הם נמוכים יותר מסף העצמה הממוצע, מידע על מטבוליטים אלה יוסר במהלך עיבוד. הרשימה ממוקדת כוללת מידע בזמן שמירה, אשר נותן לנו ביטחון גבוה יותר לזיהוי המטבוליט ולכמת. יתרון נוסף אחד עם הגדרת QE-MS הוא שספקטרומטריית מסת טנדם יכולה לאפשר זיהוי נוסף של מטבוליטים. נושא אחד הקשורים לזרימת עבודה זו הוא שinse מחט H-ESIRT הוא רגיש למליחות של הדגימות, כמו הרגישות תהיה בסכנה במידה רבה אם יש כמויות גבוהות של מלחים בלתי נדיף. לכן, תוכן מלח מזעור מדגימות, וניקוי שיגרתי של הטור ולהכניס מחט H-ESI יהיה מועיל כדי להבטיח נתונים באיכות טובה ולהגדיל את חייו של הטור. לסיכום, פרוטוקול זה מעסיק LC-QE-MS לניתוח בהצלחה מטבוליטים קוטב מהתאים בתרבית, בצעדים מינימאליים מדגם הכנה ורכישת נתונים מהיר. ניתן לבצע שינויים קטנים בהכנת מדגם להשיג נתונים ממקורות ביולוגיים אחרים כגון סרום וברקמות. לדוגמא, מאז מתנול הטהור ניתן להוסיף סרום נוזלי יתווסף לבצע ריכוז מתנול סופי 80% להפקת מטבוליטים קוטב. לדגימות רקמה, נדרשים ערבוב וערבוב קפדני כדי להשיג יעילות מיצוי טובה יותר. בדרך כלל מיליליטר סרום 10 אורקמת 1 מ&quot;ג היא מספיק לניתוח מטבוליטים. ניתן לנתח את הנתונים הגולמיים הן במצב ממוקד, אם יש מטבוליטים ידועים בדוגמאות, ובאופן בלתי ממוקד ואחרי חיפוש באתר HRMS. metabolomics מבוסס HRMS הוא עדיין בשלביה המוקדמים. להתקדמות בעתיד, טכניקות הניסוי יכולות להיות מותאמות יותר, מידע HRMS מטבוליט נוסף ודפוסי פיצול MS / MS יהיו אלגוריתמים מועילים ורלוונטיים, כגון יישור שיא, אינטגרציה שיא, אשכולות איזוטופ וכן הלאה, יכול לשפר את היעילות ודיוק של עיבוד נתונים. סופו של דבר, עם זאת, רבים מהשאלות שמעבדת הכתובות שלנו בחילוף חומרים מוגבלות על ידי פרשנות מדוקדקת של נתונים לאחר העיבוד. עם טכניקות metabolomics בקנה מידה גדולה אלה, אנו מוגבלים לעתים קרובות על ידי הפרשנות של הנתונים וההערכה של השערות שנוצרו שלנו. לכן, כל ניסויי metabolomics צריכים להיות מנוסחים סביב שאלות ספציפיות.

Metabolomics, שהוגדר כניסוי שמודד מטבוליטים מרובים בו זמנית, כבר שטח של עניין רב. Metabolomics מספק readout ישיר של פיזיולוגיה מולקולרית וספק תובנות פיתוח ומחלות כגון סרטן 1-4. תהודה מגנטית גרעינית (NMR) וספקטרומטריית גז כרומטוגרפיה מסה (GC-MS) הן בין המכשירים 5-9 הנפוצים ביותר. NMR, במיוחד נעשה שימוש בניסויי שטף מאז תרכובות האיזוטופ הכבד שכותרתו, כגון 13 מטבוליטים C שכותרתו, הם NMR פעיל 10,11. עם זאת, אסטרטגיה זו דורשת טוהר מדגם גבוה יחסית וכמות מדגם גדולה, אשר מגבילה את היישומים שלה בmetabolomics. בינתיים, הנתונים שנאספו מתמ&quot;ג ניתוח הצרכים אינטנסיבי והקצאת מתחם של ספקטרום NMR המורכב הוא קשה. GC-MS כבר בשימוש נרחב למטבוליטים קוטב ומחקרי שומנים בדם, אבל זה דורש compoun נדיפיםDS ולכן לעתים קרובות derivatization של מטבוליטים, שלעתים כרוך כימיה מורכבת שיכול להיות זמן רב ומכניס רעש ניסיוני. כרומטוגרפיה נוזלית (LC) מצמידים ספקטרומטריית מסת quadrupole משולשת משתמשת quadrupole הראשון לבחירת יוני ההורה שלמים, אשר לאחר מכן מקוטעים בquadrupole השני, בעוד quadrupole השלישי משמש לבחירת ברים אופייניים או יונים בתו. שיטה זו, המתעדת את המעבר מיוני הורה ליונים בתו ספציפי, שמכונה ניטור תגובה מרובה (MRM). MRM הוא שיטה מאוד רגישה, ספציפית וחזקה עבור שתי מולקולה קטנה וquantitation חלבון 12-15,21. עם זאת, MRM יש מגבלות שלה. כדי להשיג סגוליות גבוה שיטת MRM צריכה להיות בנויה לכל המטבוליט. שיטה זו מורכבת מזיהוי שבר ספציפי ומתאימים אנרגיית התנגשות מותאמת, אשר דורשת מראש ידע של נכסrties של מטבוליטים של עניין, כגון מידע על מבנה כימי. לכן, עם כמה יוצאים מן הכלל הכולל אובדן הניטרלי של שברים נפוצים, לא ניתן לזהות מטבוליטים ידועים בשיטה זו. בשנים האחרונות, ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה מכשירים (HRMS) כבר פורסמו, כגון סדרת LTQ-Orbitrap וExactive, QuanTof, וTripleTOF 5600 16-18,22. HRMS יכול לספק המוני לחייב יחס (m / z) של יוני שלם בשגיאה של כמה עמודים לדקה. לכן, מכשיר HRMS המופעל על ידי איתור כל היונים המבשר (כלומר מצב סריקה מלא) ניתן לקבל מידע מבני ישיר מהמסה המדויקת והרכב יסודות וכתוצאה מכך של אנליטי, ומידע זה יכול לשמש כדי לזהות מטבוליטים פוטנציאליים. ואכן, ניתן לקבל את כל המידע על מתחם עם מסה מדויקת, עד לרמה של איזומרים מבניים. כמו כן, מלאשיטת סריקה אינה דורשת ידע קודם של מטבוליטים ואינו דורשת אופטימיזציה של שיטה. יתר על כן, מאחר שניתן לנתח את כל היונים עם מ &#39;/ z נופל לתוך טווח הסריקה, יש HRMS קיבולת בלתי מוגבלת כמעט במונחים של מספר מטבוליטים שניתן לכמת בטווח אחת בהשוואה לשיטת MRM. HRMS הוא גם דומה לMRM quadrupole משולש ביכולת כמותית בשל מחזור העבודה הקצרה וכתוצאה מכך מספר דומה של נקודות נתונים שניתן להשיג בטרשת נפוצה סריקה מלאה. לכן, HRMS מספק גישה חלופית לmetabolomics כמותית. לאחרונה, גרסה משופרת של HRMS מכונה ספקטרומטריית מסת Q-Exactive (QE-MS) יכול להיות מופעלת תחת המיתוג בין מצבים חיוביים ושליליים עם זמני מחזור מהיר מספיק בשיטה אחת, אשר מרחיבה את טווח הגילוי 19. כאן אנו מתארים את האסטרטגיה שלנו באמצעות metabolomics QE-MS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Positive calibration mix</td>
			<td style="width:117px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:120px;">#88323</td>
			<td style="width:207px;">It is light sensitive. Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Negative calibration mix</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>#88324</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Diazinon</td>
			<td style="width:117px;">Sant Cruz Biotechnology</td>
			<td>#C0413</td>
			<td style="width:207px;">It causes eyes irritation, so work in hood. Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">H-ESI needle insert</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>#1303200</td>
			<td style="width:207px;">This could be replaced or cleaned with 5 % Formic acid/water (remove rubber ring) if clogged.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Xbridge amide column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>#186004860</td>
			<td style="width:207px;">Guard column is recommend to increase column lifetime.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a strategy for sensitive, large scale quantitative metabolomics

פרופיל המטבוליט היה נכס יקר בחקר חילוף חומרים בבריאות ובחוליים. עם זאת, יש לי פלטפורמות הנוכחיות גורמים מגבילים שונים, כגון הכנות עבודה אינטנסיבית מדגם, מגבלות זיהוי נמוכות, מהירויות סריקה איטיות, אופטימיזציה בשיטה אינטנסיבית עבור כל המטבוליט, וחוסר היכולת למדוד גם באופן חיובי ויונים טעונים שלילי בניסויים אחת. לכן, פרוטוקול metabolomics רומן יכול לקדם מחקרי metabolomics. כרומטוגרפיה הידרופילי מבוססת אמיד מאפשרת ניתוח המטבוליט קוטבי ללא כל derivatization כימי. MS ברזולוציה גבוהה באמצעות Q-Exactive (QE-MS) השתפר אופטיקה יון, גדל במהירויות סריקה (256 msec ברזולוציה 70,000), ויש לו את היכולת לבצע מיתוג חיובי / שלילי. משתמש באסטרטגית חילוץ מתנול קרה, וצימוד עמודה אמיד עם QE-MS מאפשרת זיהוי חזק של 168 מטבוליטים ממוקדים קוטב ואלפים תכונות נוספות בו זמנית. Datעיבוד מתבצע עם תוכנה זמינה באופן מסחרי בצורה יעילה ביותר, ותכונות ידועות שחולצו מן הספקטרום ההמוני ניתן שאילתה במסדי נתונים.

Watch this Scientific Journal Video about A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics at JoVE.com

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

פרופיל המטבוליט היה נכס יקר בחקר חילוף חומרים בבריאות ובחוליים. ניצול כרומטוגרפיה נוזלית בהדרגה נורמלית מצמידים ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה עם מיתוג קוטביות ומחזור עבודה מהיר, אנו מתארים פרוטוקול לנתח את הרכב חילוף חומרים הקוטבי של חומר ביולוגי עם רגישות גבוהה, דיוק, ורזולוציה.

אסטרטגיה בקנה מידה גדולה Metabolomics רגיש, כמותי

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

a-strategy-for-sensitive-large-scale-quantitative-metabolomics

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

20.9K Views.  Cornell University.  פרופיל המטבוליט היה נכס יקר בחקר חילוף חומרים בבריאות ובחוליים. ניצול כרומטוגרפיה נוזלית בהדרגה נורמלית מצמידים ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה עם מיתוג קוטביות ומחזור עבודה מהיר, אנו מתארים פרוטוקול לנתח את הרכב חילוף חומרים הקוטבי של...

Video: A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

בקנה מידה גדול של מסכי ספריות Metagenomic

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the expression pattern of a target protein across the entire brain are relatively easy to answer when using IHC in small brains, such as those of rodents. However, answering the same questions in large and convoluted brains, such as those of primates presents a number of challenges. Here we present a systematic approach for immunodetection of target proteins in an adult monkey brain. This approach relies on the tissue embedding and sectioning methodology of NeuroScience Associates (NSA) as well as tools developed specifically for batch-staining of free-floating sections. It results in uniform staining of a set of sections which, at a particular interval, represents the entire brain. The resulting stained sections can be subjected to a wide variety of analytical procedures in order to measure protein levels, the population of neurons expressing a certain protein.

Large-scale immunodetection of target proteins across the entire primate brain is possible by employing novel tissue embedding and sectioning methods combined with the use of creative apparatus for batch staining of multiple free-floating sections at a given time.

אצווה Immunostaining לגילוי בקנה מידה גדול חלבון הנמצא במוח הקופים שלמים

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoproteomics כמותיים חומצת שומן מגורה Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

בידוד הרחבת בקנה מידה גדול של תאים אנושיים למבוגרים האנדותל המושבה יצירת אב

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to mammals, zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Zebrafish has emerged as a powerful in vivo platform for phenotype-based drug screens and chemical genetic analysis. Here, we demonstrate a simple, practical method for large-scale screening of small molecules using zebrafish embryos.

בקנה מידה גדול דג הזברה מבוסס ב-vivo מולקולה קטנה מסך

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. QFA can be applied to focused observations of single cultures but is most useful for genome-wide genetic interaction or drug screens investigating up to thousands of independent cultures. The central experimental method is the inoculation of independent, dilute liquid microbial cultures onto solid agar plates which are incubated and regularly photographed. Photographs from each time-point are analyzed, producing quantitative cell density estimates, which are used to construct growth curves, allowing quantitative fitness measures to be derived. Culture fitnesses can be compared to quantify and rank genetic interaction strengths or drug sensitivities. The effect on culture fitness of any treatments added into substrate agar (e.g. small molecules, antibiotics or nutrients) or applied to plates externally (e.g. UV irradiation, temperature) can be quantified by QFA.
The QFA workflow produces growth rate estimates analogous to those obtained by spectrophotometric measurement of parallel liquid cultures in 96-well or 200-well plate readers. Importantly, QFA has significantly higher throughput compared with such methods. QFA cultures grow on a solid agar surface and are therefore well aerated during growth without the need for stirring or shaking.
QFA throughput is not as high as that of some Synthetic Genetic Array (SGA) screening methods5,6. However, since QFA cultures are heavily diluted before being inoculated onto agar, QFA can capture more complete growth curves, including exponential and saturation phases3. For example, growth curve observations allow culture doubling times to be estimated directly with high precision, as discussed previously1.
Here we present a specific QFA protocol applied to thousands of S. cerevisiae cultures which are automatically handled by robots during inoculation, incubation and imaging. Any of these automated steps can be replaced by an equivalent, manual procedure, with an associated reduction in throughput, and we also present a lower throughput manual protocol. The same QFA software tools can be applied to images captured in either workflow.
We have extensive experience applying QFA to cultures of the budding yeast S. cerevisiae but we expect that QFA will prove equally useful for examining cultures of the fission yeast S. pombe and bacterial cultures.

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is a complementary series of experimental and computational methods for estimating microbial culture fitnesses. QFA estimates the effect of genetic mutations, drugs or other applied treatments on microbe growth. Experiments scaling from focussed analysis of single cultures to thousands of parallel cultures can be designed.

כושר ניתוח כמותי של זרימת עבודה

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of variants within families or populations can facilitate identification of the genetic factors of disease. Illumina&#39;s panel of genotyping BeadChips allows investigators to genotype thousands or millions of single nucleotide polymorphisms (SNPs) or to analyze other genomic variants, such as copy number, across a large number of DNA samples. These SNPs can be spread throughout the genome or targeted in specific regions in order to maximize potential discovery. The Infinium assay has been optimized to yield high-quality, accurate results quickly. With proper setup, a single technician can process from a few hundred to over a thousand DNA samples per week, depending on the type of array. This assay guides users through every step, starting with genomic DNA and ending with the scanning of the array. Using propriety reagents, samples are amplified, fragmented, precipitated, resuspended, hybridized to the chip, extended by a single base, stained, and scanned on either an iScan or Hi Scan high-resolution optical imaging system. One overnight step is required to amplify the DNA. The DNA is denatured and isothermally amplified by whole-genome amplification; therefore, no PCR is required. Samples are hybridized to the arrays during a second overnight step. By the third day, the samples are ready to be scanned and analyzed. Amplified DNA may be stockpiled in large quantities, allowing bead arrays to be processed every day of the week, thereby maximizing throughput.

A protocol is described that uses Illumina&#39;s Infinium assays to perform large-scale genotyping. These assays can reliably genotype millions of SNPs across hundreds of individual DNA samples in three days. Once generated, these genotypes can be used to check for associations with a variety of different diseases or phenotypes.

Infinium Assay עבור יישומי Genotyping SNP בקנה מידה גדולה

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, log-phase, and stationary-phase. Each growth phase can reveal different aspects of fitness that are related to various environmental and genetic conditions. High-resolution and quantitative measurements of all 3 phases of growth are generally difficult to obtain. Here we present a detailed method to characterize all 3 growth phases on solid media using an assay called One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY quantifies growth phenotypes of individual cells growing into colonies on solid media using time-lapse microscopy. This method can directly observe population heterogeneity with each growth parameter in genetically identical cells growing into colonies. This population heterogeneity offers a unique perspective for understanding genetic and epigenetic regulation, and responses to genetic and environmental perturbations. While the ODELAY method is demonstrated using yeast, it can be utilized on any colony forming microorganism that is visible by bright field microscopy.

We present a method for quantifying growth phenotypes of individual yeast cells as they grow into colonies on solid media using time-lapse microscopy termed, One-cell Doubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Population heterogeneity of genetically identical cells growing into colonies can be directly observed and quantified.

ODLAY: שיטה בקנה מידה גדול עבור כימות רב פרמטר של גידול שמרים

Growth phenotypes of microorganisms are a strong indicator of their underlying genetic fitness and can be segregated into 3 growth regimes: lag-phase, ...

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water deficit or pathogens plays a crucial role. Identifying small molecules that regulate stomatal movement can therefore contribute to understanding the physiological basis by which plants adapt to their environment. Large-scale screening approaches that have been used to identify regulators of stomatal movement have potential limitations: some rely heavily on the abscisic acid (ABA) hormone signaling pathway, therefore excluding ABA-independent mechanisms, while others rely on the observation of indirect, long-term physiological effects such as plant growth and development. The screening method presented here allows the large-scale treatment of plants with a library of chemicals coupled with a direct quantification of their transpiration by thermal imaging. Since evaporation of water through transpiration results in leaf surface cooling, thermal imaging provides a non-invasive approach to investigate changes in stomatal conductance over time. In this protocol, Helianthus annuus seedlings are grown hydroponically and then treated by root feeding, in which the primary root is cut and dipped into the chemical being tested. Thermal imaging followed by statistical analysis of cotyledonary temperature changes over time allows for the identification of bioactive molecules modulating stomatal aperture. Our proof-of-concept experiments demonstrate that a chemical can be carried from the cut root to the cotyledon of the sunflower seedling within 10 minutes. In addition, when plants are treated with ABA as a positive control, an increase in leaf surface temperature can be detected within minutes. Our method thus allows the efficient and rapid identification of novel molecules regulating stomatal aperture.

Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus

We provide a method for identifying modulators of foliar transpiration by large-scale screening of a compound library.

זיהוי של הרגולטורים הרומן של דיות צמח על ידי הקרנת הדמיה תרמית בקנה מידה גדול בהליוציץ השנתי

Plant adaptation to biotic and abiotic stresses is governed by a variety of factors, among which the regulation of stomatal aperture in response to water ...

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific histone modifications, such as H3K27ac, to help identify cis-regulatory DNA elements. The manual process to complete a ChIP-Seq is labor intensive, technically challenging, and often requires large-cell numbers (&#62;100,000 cells). The method described here helps to overcome those challenges. A complete semiautomated, microscaled H3K27ac ChIP-Seq procedure including cell fixation, chromatin shearing, immunoprecipitation, and sequencing library preparation, for batch of 48 samples for cell number inputs less than 100,000 cells is described in detail. The semiautonomous platform reduces technical variability, improves signal-to-noise ratios, and drastically reduces labor. The system can thereby reduce costs by allowing for reduced reaction volumes, limiting the number of expensive reagents such as enzymes, magnetic beads, antibodies, and hands-on time required. These improvements to the ChIP-Seq method suit perfectly for large-scale epigenetic studies of clinical samples with limited cell numbers in a highly reproducible manner.

This paper describes a semiautomated, microscaled ChIP-Seq protocol of DNA regions associated with a specific histone modification (H3K27ac) using a ChIP liquid-handler platform, followed by library preparation using tagmentation. The procedure includes control assessment for quality and quantity purposes and can be adopted to other histone modifications or transcription factors.

הליך ChIP-Seq חצי-אטומי למחקרים אפיגנטיים בקנה מידה גדול

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...