ברצוננו להודות CSIC על התמיכה הכלכלית שגבה את הפרויקט, מריאנה פינטור Di לסיוע טכני שלה עם מיקרוסקופיה קונפוקלית; כדי חוסה Báez לאונרדו עבור תיקונים כתב היד שלו; כדי לוצ'יאנו קוראה על מסירותו ליצירתו של הוידאו; כדי Rosano נטליה שהשאלת את הקול שלה עבור הווידאו ואת מרכז מניות דרוזופילה בלומינגטון למתן את המניות השתמשו במחקר זה. Apa1 נגד monoclonal-Ptc שפותחה על ידי איזבל גררו שהושג מ התפתחותי מחקרים ליפידים הבנק (DSHB) תחת חסותה של NICHD ומתוחזק על ידי אוניברסיטת איווה, במחלקה למדעי הביולוגיה, איווה סיטי, IA 52242.

יום 1
1. איסוף של culturing הגלמים.
<ol>
	<li>להסיר את 0 h לאחר היווצרות puparium (APF) או prepupae באמצעות מברשת רטובה של בקבוקונים בתרבית ומניחים בקבוקונים חדשים כמעט להשלים תקופת פיתוח (ראה 2.1 ו- 2.2). 
	הערה: צריך להיות מתוחזק אוכלוסיה בריאה של זבובים באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים culturing. לאחר שלושה או ארבעה ימים שבהם הביצים מוטלות, ניתן להסיר את המבוגרים בקבוקונים. כדי לאפשר את התפתחות אופטימלית של האנשים. הם נשמרים בטמפרטורה קבועה עד הזחלים לחלל השלישי ליזום להתגלמות. המעבר זחל הגולמי מסומן על ידי היווצרות prepupa נחשב את 0 h APF. Prepupa הוא זחל לבנים משותק הכולל של המלבן, צורה עם בולטות קדמית spiracles עגולה.</li>
</ol>
יום 2
2. העברה, ניתוח של קיבוע.
<ol>
	<li>להעביר את הגלמים (2 h לפני הזמן פיתוח הוא להשלים) באמצעות מברשת צבע, עד השקופית מיקרוסקופ עם סרט הדבקה דו-צדדי דבקה זה. מקם את הגלמים כדי ליצור שורה עם מעלה הגבי צדדים cephalic מסתיים פונות לאותו הכיוון.</li>
	<li>לחזור לשקופית מיקרוסקופ טמפרטורה קבועה ולאפשר הגלמים להשלים את הזמן המתאים התפתחותית (כלומר 24-30 h APF). 
	הערה: השקופית מיקרוסקופ עם קלטת דו-צדדית יהיה פלטפורמה חלוף ניתוח כדי להסיר את המקרה הגולמי (ראו להלן). זמן לשגות בשקופית מיקרוסקופ (מחוץ המבחנה) עוזר לייבש את התיק הגולמי עושה את. זה בקלות שבירים עם מלקחיים.</li>
	<li>הסר את operculum המקרה הגולמי באמצעות מלקחיים.</li>
	<li>לפענח את המקרה עם מלקחיים (כפי שמוצג בסרטון) ביצוע קו לאורך הצד של הגולם הסוף סימטרית. זה אפשרי לזהות את הצורה פנימי של הגולם שהופך ניכר רווח מעל הציר של האגף הגולמי ההארה מתאימות. שטח זה משמש מדריך כדי לבצע את הפתיחה ללא פגיעה הגולם.</li>
	<li>הסרת חלקים של המקרה, לאסוף אותם ליד הגבול נפתח ולהסתובב איתם לצד הנגדי שבו הקלטת דו-צדדית יחזיק אותם. בסוף הקרע הגלמים יהיה כמעט "עירום", שרק חתיכה קטנה של התיק לסקר את הקצה האחורי. הערה: מטרת להשאיר כמות קטנה של התיק סימטרית בקצה העליון נועד להבטיח שחרור חלק מהתיק אותן לשקופית עם קלטת דו-צדדית. ההיגיון העומד מאחורי פעולה זו היא כי אם תסיר מדי של התיק אתה מאוד להסתכן בפגיעה הגולם. לעומת זאת אם תסיר מעט מדי, הגולם לא בקלות יבוא חינם של התיק.</li>
	<li>לדחוף למטה (עם מלקחיים) השארית של התיק. תנועה זו מעלה בקצה הקדמי של הגולם, ומאפשר גם בראש וגם החזה להישאר בעמדה מועדף לדבוק וכדי להעביר בשלב שלאחר מכן.</li>
	<li>קח שקופית חדשה עם סרט הדבקה דו-צדדי, היפוך זה גולם או שורה הגלמים. אנו ממליצים על ביצוע גישה זו על ידי התבוננות תנועות בסיועם stereomicroscope כדי למנוע שבירה של הגלמים.</li>
	<li>הקש מעט כדי להפוך את הגלמים לדבוק הקלטת, בעדינות והחלק את השקופית כדי להסיר את הגלמים משאר המקרים. היפוך השקופית למיקרוסקופ: הגלמים יהיה תקוע בצד הגבי ברמה של הראש שלהם / אזור בית החזה.</li>
	<li>מכסה כל הגלמים עירום עם 4% paraformaldehyde, לחכות 10 דקות. מניסיוננו, זו מאובדן זמן עם מקבע מסייע לשינוי מרקם של הקוטיקולה הפיכתה המשרד, פחות דביק, קל לטפל. 
	הערה: כדי לבצע את החילוץ חומצה ריבונוקלאית (RNA), paraformaldehyde תחליף עבור באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) עשה עם RNase ללא מים ולהסיר את הכנפיים הגולמי עושה חתך (בעזרת מספריים) ליד נקודת הציר של כל גפה. באמצעות מלקחיים, להעביר את הכנף הגולמי צינור microcentrifuge עם 1 מ"ל של ריאגנט guanidinium thiocyanate ופנול. לאחר איסוף סך של 50-80 כנפיים, לאחסן את הצינור microcentrifuge ב-80 מעלות צלזיוס עד ביצוע ה RNA החילוץ10,11.</li>
	<li>עושים חתך קטן על האזור ציר של הזרוע או בקרבתה. לאפשר את מקבע להגיע האפיתל כנף. באמצעות פיפטה (p200) מיושרות מקבע מעל הכנף. בעת שטיפה החלף מזוהמים שמלמדות עם חדש. לאחר שטיפה, ממשיך האגף לשבועיים למשך 5 דקות. 
	הערה: למרות התמרון הזה עוזר לסלק את רוב רקמת מזהמים, כמה hemocytes, טיפות השמן יכול להישאר לכודים בין הרבדים אפיתל הגבי ו הגחון של האגף (ראה איור 1 א').</li>
	<li>דמעה עם מלקחיים מגבול לציפורן (כפי שמוצג בסרטון) מרחיבה את החור ועל הפעלת על שחרורו של האפיתל כנף מן הקרום לציפורן. ברגע הרקמה כנף הוא שוחרר, השאירו זה הפתרון paraformaldehyde להשלמת 30 דקות של קיבעון.</li>
	<li>להעביר את הכנפיים קבוע אחד נקוו 4 צלחת פלסטיק מלאים PBST (טריטון X-100 0.05%). חנות בן לילה ב 4 º C.</li>
</ol>
יום 3
3. ראשי נוגדן הדגירה.
<ol>
	<li>Permeabilize הרקמה המקננת הכנפיים הגולמי ב- PBST (טריטון X-100 0.2%) למשך 15 דקות באמצעות פלטפורמה נדנדה כדי להקל על תנועה בינונית נוזלי עדין. 
	הערה: עד הרכבה הדגימות, השלבים צריכה להתבצע באמצעות פלטפורמה נדנדה.</li>
	<li>לחסום את הדגימות באמצעות PBSTA (BSA 3%, טריטון X-100 0.1%) לשעה.</li>
	<li>להשתמש המאגר אותו לדלל נוגדן ראשוני (העכבר אנטי-Ptc, בטחונות) של דגירה הכנפיים הגולמי בן לילה ב 4 º C.</li>
</ol>
יום 4
4. משני נוגדן הדגירה.
<ol>
	<li>שטיפת דגימות דקות 4 x 10 כל אחד עם PBST (טריטון X-100 0.05%)</li>
	<li>דגירה עם נוגדנים משניים (למשל, העכבר אנטי מצומדת כדי fluorochrome) מדולל על הריכוז המתאים ב- PBSTA (BSA 3%, טריטון X-100 0.1%) בטמפרטורת החדר בחושך, כבר שעתיים. 
	הערה: אם זה מתאים, השתמש 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) ו/או phalloidin כדי counterstain את הרקמה. הוסף רגשים אלו עם הנוגדן משני לוקח בחשבון את אורך הגל של פליטה של fluorochromes כדי למנוע את החפיפה של אותות.</li>
	<li>שטיפת דגימות דקות 4 x 10 כל אחד עם PBST (טריטון X-100 0.05%)</li>
</ol>
5. הרכבה
<ol>
	<li>להכין מדגם שקופית על-ידי הצבת נקודות 4 של לק שקוף על השקופית מיקרוסקופ כאילו היו הקודקודים של ריבוע.</li></ol>הם יהיו הנקודות שבו ינוח coverslips, המסייע למנוע ריסוק הרקמה.
	<li>מקום 30 µL של הרכבה מדיה (גליצרול/טריס-HCl 80 אחוז) במרכז הכיכר של הנקודות עשה עם לק מבלי לגעת באחת הפינות (נקודות). לוקחים פיפטה עם טיפ החתוכה צהוב, לטעון כמה כלי תקשורת הרכבה, ואז מצייר באגפים הגולמי במספר.</li>
	<li>העברה כנפיים הגולמי הנקודה של הרכבה מדיה בשקופית מיקרוסקופ. בעזרת טיפ, התפשטה התקשורת הרכבה, להטביע את הכנפיים הגולמי כדי למנוע מהם צף. המורפולוגיה של הרקמה יישמרו אם הכנפיים יישאר שטוח הזכוכית המכסה ממוקם על. לפני הצבת הזכוכית המכסה, הסר את בועות האוויר.</li>
	<li>הנמך את coverslip על גבי הדגימות מנסה למנוע את הדור של בועות אוויר. תנועה זו יכול להיעשות בעזרת מלקחיים.</li>

<ol>
	<li>Serrano, N., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limb+morphogenesis:+connections+between+patterning+and+growth.">Limb morphogenesis: connections between patterning and growth.</a> Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartments+and+appendage+development+in+Drosophila.">Compartments and appendage development in Drosophila.</a> Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).</li><li>Klein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+disc+development+in+the+fly:+the+early+stages.">Wing disc development in the fly: the early stages.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).</li><li>Beira, J. V., Paro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+legacy+of+Drosophila+imaginal+discs.">The legacy of Drosophila imaginal discs.</a> Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).</li><li>De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+basis+for+vein+pattern+variations+in+insect+wings.">Developmental basis for vein pattern variations in insect wings.</a> Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+vein+patterning+in+Drosophila+and+the+analysis+of+intercellular+signaling.">Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).</li><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drawing+lines+in+the+Drosophila+wing:+initiation+of+wing+vein+development.">Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development.</a> Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).</li><li>De Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+wing:+The+development+of+the+veins.">Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins.</a> Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).</li><li>Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis.">Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis.</a> Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).</li><li>Bolatto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+distribution+of+Patched-related+protein+in+the+Drosophila+embryo.">Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo.</a> Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).</li><li>Zuniga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+encoding+novel+secreted+and+transmembrane+proteins+are+temporally+and+spatially+regulated+during+Drosophila+melanogaster+embryogenesis.">Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis.</a> BMC Biol. 7, 61 (2009).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

השיטה של דיסקציה המתואר בסרטון זה יכול לשמש כדי להכין דוגמאות באיכות גבוהה דרוזופילה כנפיים הגולמי של שלבי ההתפתחות השונים עבור סוגים רבים של טכניקות (למשל, immunofluorescence, cDNA סינתזה כדי מבחני ה-PCR, גופית ווינג פיתוח). במונחים של שיטה זו מעורב המדען השתמשו 24-30 h APF. עם זאת צריך להיות שום מכשול בתוך הפעולות החיוניות דיסקציה של גולם צעיר או מבוגר. שינויים ייתכן שיש לבצע כדי להכיל גולם שלב קטן יותר.
הפרוטוקול יכול להתבצע לנתח גולם אחד או מספר הגלמים באותו זמן. זה עוזר כדי להאיץ את התהליך להגיע אל מספר רב של כנפיים גזור להקל. במקרה זה יש אפשרות להסיר שורה של 4-5 הגלמים באותו זמן. באפשרותך להסיר את הגלמים ביחד או אם זה לא אפשרי, להמשיך להסיר בנפרד על גבי השקופית אותו (ראה סעיף III של הוידאו: "מרובים הגלמים לנתיחה"). כדי להסיר את הגולם עירום מהתיק שנפתח, חשוב כי הקצה האחורי הוא קטן מספיק. ניתן להסיר את התיק לחלוטין; למרות שזה העברת מהר יותר, הסרת התיק הוא מאתגר, ויש סיכון גדול יותר של פגיעה הגולם.
ניסיון מכתיבה זה תמרון חשוב לשקול לעזוב (את האחרון 2 h כדי להשלים את זמן פיתוח כאמור) הגולם קשור השקופית מיקרוסקופ בתוך החממה אך בחוץ את המבחנה. זו קפיצה הזמן עוזר לייבש את התיק לשבור להקל. עוד צעד קריטי במהלך ניתוח עבור אימונוהיסטוכימיה, היא לקלף את הקוטיקולה המכסה האפיתל כנף, ובכך מעניק גישה של הנוגדן השטח אגף שלם. שלב זה צריך להיעשות לאחר תיקון למשך מספר דקות (לפחות 5 דקות לאחר ביצוע החתך בנקודת הציר) כי מקבע מייצב הרקמות ומשנה את עקביות לציפורן, שהופך אותו קל יותר לקלף.
בעת ביצוע כל הצעדים אימונוהיסטוכימיה, ודא כי הכנפיים הן בתנועה מתמדת (נדנדה פלטפורמה). התנועה מסייעת לשפר את מחלף חדירה של הפתרונות במהלך שוטף, incubations. עם זאת, חשוב לבצע אותם בעדינות הימנעות המופע של עיוותים בלתי רצויה המורפולוגיה של מבנה שברירי זה (קרי, זה מספיק כי תנודות של פלטפורמת להזיז מעט את נוזלי המכיל בינוני הדגימות).
הליך זה מספק גישה משלימים שיטות שפורסם כבר כנף הגולמי לנתיחה.

דרוזופילה כנפיים מפותחים של הדיסקים דמותי כנף. הבראשיתי של הדיסקים האלה כנף הם לשים בצד במהלך התפתחות עובריים כקבוצות קטנות של תאים דמותי 20-30 invaginate של האפיתל מתחלקים. בעוד הזחל הולך וגדל השלב לחלל, מיטוזה מתרחש בתאים דמותי במועדים האופיינית ספציפיים, העלאת המספרים שלה (כ 50000 תאים) ויוצרים את הכנף דיסק1,2,3, 4. כמו התאים להתרבות, הם אופנה אפיתל צינורי, וכתוצאה מכך ספירלה קומפקטי מתקפל עצמית. במהלך להתגלמות, טלסקופים האפיתל דיסק מחוץ לאגף טופס דו שכבתי, הורידים האורך להתחיל בתור לקונות ביניהם, אשר מתרחשת פעמיים במהלך כנף התפתחותית5,6.
הסידור של ורידים תמיד יש תבנית זהה; היכולת לזהות בקלות כל שינוי בתוך היווצרות הורידים הופך מוטציות גלוי מאוד (למשל חסרים או מיותרים וורידים, שינוי עמדות וריד, וכו '). מעניין, הווריאציות פנוטיפ בדרך כלל הראיות של מוטציות מוכרות או רומן רכיבים של איתות המסלולים הרלוונטיים לפיתוח כנף. אחד המסלולים זה ממלא תפקיד בקביעת המיקום ושמירה על הווריד וטריטוריות intervein הוא קיפוד (Hh) מסלול6,7,8.
בהתחשב בחשיבות של האגף הגולמי כמערכת מודל, חשוב יהיה להשיג דגימות באיכות טובה לעבוד עם. בעבר, מדענים שפרסמו פרוטוקולים לנתח דרוזופילה כנפיים לא העניק מדריך המתאים כדי להשיג דגימות עביד. ללא ההדרכה של חוקר אחד לא יכול בבירור להמחיש את התהליך. בגישות חלופיות אלה ויבתר הגולם לחלק שני, הפרדת האגף מן הרקמה שמסביב, שטפתי שוב ושוב לפנות את הפסולת. סוג זה של הגישה תביעות לעזוב את האגף חינם של מזהם אבל עקב התנסות קודמת התהליך הוא איטי יותר, ויש סיכוי גבוה יותר להתפשר על המבנה של בכנפיים השבריריות9.
ההליך המתואר כאן פותחה על ידי הדרישה למצוא שיטה מהירה ויעילה להשיג דגימות כנף הגולמי מתאימים לזהות חלבונים ספציפיים או התמלילים באמצעות פרוטוקולים immunodetection או מבחני (PCR) תגובת שרשרת של פולימראז. כדי להמחיש זאת, ביטוי של לוקליזציה של Patched (Ptc או הקולטן הקנוני של הנתיב Hh) מזוהה בדגימות כנף הגולמי, מתן פרוטוקול הכולל את הפרטים הרלוונטיים כדי לבצע בהצלחה את השלם נוהל.

<table><tbody><tr><td>Stereomicroscope with cool light illumination</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Rocking platform</td><td>Biometra (WT 16)</td><td>042-500</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>StarFrost</td><td>8037/1</td><td></td></tr><tr><td>Cover glasses (24 x 32 mm)</td><td>Deltalab</td><td>D102432</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>F.S.T</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Lawton</td><td>63-1400</td><td></td></tr><tr><td>Multi-well plastic dish</td><td>Thermo Scientific</td><td>144444</td><td></td></tr><tr><td>p100 or p200 pipette</td><td>Finnpipette (Labsystems)</td><td>9400130</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS (Dulbecco)</td><td>Gibco</td><td>21600-010</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Bio Basic INC.</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Mallinckrodt</td><td>5092</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>497</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Ambion</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>DEPC treated water</td><td>MO.BIO</td><td>17011-200</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL&lt;br/&gt; (working dilution 1/800)</td><td>Invitrogen</td><td>A11030</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 &amp;mu;g/mL&lt;br/&gt; (working dilution 1/100)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td><td></td><td>By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI, 1 mg/mL&lt;br/&gt; (working dilution 1/5000)</td><td>Invitrogen</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol&lt;br/&gt; (1/600 working dilution)</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Canton S (fly stock)</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a rapid and efficient method to dissect pupal wings of drosophila suitable for immunodetections or pcr assays

אגף פיתוח melanogaster דרוזופילה הוא מודל אידיאלי ללמוד מורפוגנזה ברמת רקמות. תוספות אלה לפתח מתוך קבוצה של תאים בשם אגף דיסקים דמותי נוצר במהלך התפתחות. הזחל הדיסקים דמותי צומחים, להגדיל את מספר התאים ויוצרים מבנים אפיתל monolayered. בתוך התיק הגולמי הדיסקים דמותי באד החוצה ומקפלים לתוך bilayers לאורך קו זה הופך לשולי העתידי של האגף. במהלך תהליך זה, מקורם הורידים primodia האורך וריד תאים הגבי ו הגחון פוטנציאליים של משטחי הכנף. במהלך השלב הגולמי הפסים של וריד תאים של כל שטח תקשורת על מנת ליצור צינורות חזק; במקביל, קרוס-הורידים מתחילים היווצרותם.
עם העזרה של סמנים מולקולריים המתאים, זה אפשרי לזהות את המרכיבים המרכזיים להלחין את האגף במהלך התפתחותו. מסיבה זו, היכולת לזהות במדויק התמלילים או חלבונים במבנה זה חיוני ללמוד שלהם שפע ולוקליזציה הקשורות לתהליך הפיתוח של האגף.
ההליך המתואר כאן מתמקדת על מניפולציה כנפיים הגולמי, מתן הנחיות מפורטות כיצד לנתח את האגף במהלך השלב הגולמי. . הקרע של רקמות הגולמי קשה יותר לביצוע מאשר מקביליהם הזחלים לחלל השלישי. זו הסיבה מדוע גישה זו פותחה, כדי לקבל דוגמאות איכותי מהיר ויעיל. פרטים לגבי אופן immunostain ו הר דגימות אלה כנף, כדי לאפשר את הפריט החזותי של חלבונים או מרכיבי התא, ניתנים בפרוטוקול. עם המומחיות הקטנה אפשרי לאסוף 8-10 כנפיים הגולמי באיכות גבוהה תוך זמן קצר.

הפרוטוקול מציע שיטה פשוטה עבור קבלת דגימות כנף הגולמי לשמור המורפולוגיה מוכר של האגף. מן ההכנות הללו זה ניתן לקבל ערימות של תמונות יכול להיות מוקרן דו-ממדיים או תלת-ממד, לחקור הפצה ו/או ההעשרה של חלבונים במהלך הבידול של האגף. (ראה ההערה ב- 2.9) פרוטוקול דומה ניתן לאסוף גדול כנף הגולמי המדגם (50-80 מעורבים wings הגולמי) הדרושים כדי לסנתז חומצה deoxyribonucleic משלימים (cDNA), התבנית המשמשת ב- PCR תגובות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55854/55854fig1.jpg"> 
איור 1 : קיפוד ג'ין מסלול ב דרוזופילה כנפיים הגולמי 
(א) תוקנו, הקולטן הקנוני של מסלול הקיפוד, היה מדמיין ב 24-30 h APF באמצעות העכבר אנטי - Ptc. הגרעינים היו counterstained עם דאפי ואילו אקטין חוטים הם visualized באמצעות phalloidin של ירוק-פלורסנט. התפלגות אקטין מסייעת למקם כנף ורידים והקשר שלה עם ביטוי שתוקנה . באותו זמן, phalloidin הכתם מגלה הנוכחות של כמה hemocytes, טיפות השמן (עיגולים גדולים) כמו זיהום רקמות. 20 x הגדלה, הקדמי הוא למעלה. קנה המידה של בר, 100 מיקרומטר (B) Amplicons כדי אקטין (ליין 1, 280 bp) ו- ptc (ליין 2, 236 bp) התקבלו באמצעות cDNA synthetized מהדגימה כנף RNA שליח (mRNA) שנוצרו על-ידי פרוטוקול ניתוח דומה. MW, משקל מולקולרי. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55854/55854fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays at JoVE.com

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

היכולת לזהות במדויק התמלילים או חלבונים ברקמות דרוזופילה הוא קריטי עבור הלומדים שלהם שפע ולוקליזציה הקשורות לתהליך הפיתוח. הנה התיאור של תהליך פשוט לנתח כנפיים הגולמי. אלה כנפיים יכול לשמש כדוגמאות מספר טכניקות (אימונוהיסטוכימיה, PCR assay, וכו ').

שיטה מהירה ויעילה לנתח הגולמי כנפי דרוזופילה מתאים Immunodetections או מבחני ה-PCR

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

a-rapid-efficient-method-to-dissect-pupal-wings-drosophila-suitable

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

8.0K Views.  Laboratorio de Biología del Desarrollo. היכולת לזהות במדויק התמלילים או חלבונים ברקמות דרוזופילה הוא קריטי עבור הלומדים שלהם שפע ולוקליזציה הקשורות לתהליך הפיתוח. הנה התיאור של תהליך פשוט לנתח כנפיים הגולמי. אלה כנפיים יכול לשמש כדוגמאות מספר טכניקות (אימונוהיסטוכימיה, PCR assay, וכו ').

Video: A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

חיתוך של דרוזופילה מלאנוסטר שרירי הטיסה לגישות omics

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Genetics

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

ויזואליזציה של Proprioceptors ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים וגלמים

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Neuroscience

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

חיתוך, צביעה של השחלות הגולמי דרוזופילה

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and behavioral evolution. Drosophila olfactory tissues house the olfactory receptor neurons (ORNs) that detect volatile chemical cues in addition to hydro- and thermo-sensory neurons. In this protocol, we describe the dissection of developing peripheral olfactory tissue of the adult Drosophila species. We first describe how to stage and age Drosophila larvae, followed by the dissection of the antennal disc from early pupal stages, followed by the dissection of the antennae from mid-pupal stages and adults. We also show methods where preparations can be utilized in molecular techniques, such as the RNA extraction for qRT-PCR, RNAseq, or immunohistochemistry. These methods can also be applied to other Drosophila species after species-specific pupal development times are determined, and respective stages are calculated for appropriate aging.

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Here, we present a protocol to stage and dissect developing olfactory tissue from Drosophila species. The dissected tissue can later be used for molecular analyses, such as quantitative RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) or RNA sequencing (RNAseq), as well as in vivo analyses such as immunohistochemistry or in situ hybridization.

הכנת לפתח רקמות היקפיים חוש הריח עבור מולקולרית וניתוח Immunohistochemical ב דרוזופילה

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

דיסקציה של הרשתית הגולמי דרוזופילה אימונוהיסטוכימיה, ניתוח המערבי של RNA בידוד

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in multicellular organisms. The TGF-&#946; superfamily includes TGF-&#946;, bone morphogenetic protein (BMPs), Activins, Growth and Differentiation Factors, and Nodals. It has long been known that the amount of ligand exposed to cells is important for its effects. It was thought that long-range concentration gradients set up embryonic pattern. However, recently it has become clear that the timing of exposure to these ligands is also important for their downstream transcriptional consequences. A TGF-&#946; superfamily ligand cannot have a developmental consequence until it is released from the cell in which it was produced. Until recently, it was difficult to determine when these ligands were released from cells. Here we show how to measure the release of a Drosophila BMP called Decapentaplegic (Dpp) from the cells of the wing primordium or wing disc. This method could be modified for other systems or signaling ligands.

Imaging Dpp Release from a Drosophila Wing Disc

The timing of exposure to ligands may impact their developmental consequences. Here we show how to image release of a Drosophila bone morphogenetic protein (BMP) called Dpp from cells of the wing disc.

שחרור הדמיה מתוך דיסק כנף של דרוזופילה

The transforming Growth Factor-beta (TGF-&#946;) superfamily is essential for early embryonic patterning and development of adult structures in ...

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic morphologies 1-3. During pupation, which spans approximately 96 hours (at 25 &deg;C), proliferating populations of imaginal cells replace the larval epidermis to generate the adult abdominal segments. These imaginal cells, born during embryogenesis, exist as lateral pairs of histoblast nests in each abdominal segment of the larvae. Four pairs of histoblast nests give rise to the adult dorsal cuticle (anterior and posterior dorsal nests), the ventral cuticle (ventral nests) and the spiracles associated with each segment (spiracle nests) 4. Upon puparation, these diploid cells (distinguishable by size from the larger polyploid larval epidermal cells- LECs) begin a stereotypical process of proliferation, migration and replacement of the LECs. Various molecular and genetic tools can be employed to investigate the contributions of genetic pathways involved in morphogenesis of the adult abdomen. Ultimate adult phenotypes are typically analyzed following dissection of adult abdominal cuticles. However, investigation of the underlying molecular processes requires immunohistochemical analyses of the pupal epithelium, which present unique challenges. Temporally dynamic morphogenesis and the interactions of two distinct epithelial populations (larval and imaginal) generate a fragile tissue prone to excessive cell loss during dissection and subsequent processing. We have developed methods of dissection, fixation, mounting and imaging of the Drosophila pupal abdominem epithelium for immunohistochemical studies that generate consistent high quality samples suitable for confocal or standard fluorescent microscopy.

Drosophila Pupal Abdomen Immunohistochemistry

Antibody staining of the Drosophila pupae can enhance genetic analyses of adult abdominal developmental genetics. We present our protocol for dissection, fixation and antibody staining of staged Drosophila pupal abdomen.

תסיסנית גלמי אימונוהיסטוכימיה בטן

The Drosophila pupal abdomen is an established model system for the study of epithelial morphogenesis and the development of sexually dimorphic ...

Biology

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, innate immune cells perform a number of essential functions, such as fighting infection, clearing necrotic debris, and stimulating matrix deposition. In order to fully understand the diverse signaling events that regulate this immune response, it is crucial to observe the complex behaviors of (and interactions that occur between) multiple cell lineages in vivo, and in real-time, with the high spatio-temporal resolution. The optical translucency and the genetic tractability of Drosophila embryos have established Drosophila as an invaluable model to live-image and dissect fundamental aspects of inflammatory cell behavior, including mechanisms of developmental dispersal, clearance of apoptotic corpses&#160;and/or microbial pathogens, and recruitment to wounds. However, more recent work has now demonstrated that employing a much later stage in the Drosophila lifecycle &#8211; the Drosophila pupa &#8211; offers a number of distinct advantages, including improved RNAi efficiency, longer imaging periods, and significantly greater immune cell numbers. Here we describe a protocol for imaging wound repair and the associated inflammatory response at the high spatio-temporal resolution in live Drosophila pupae. To follow the dynamics of both re-epithelialization and inflammation, we use a number of specific in vivo fluorescent markers for both the epithelium and innate immune cells. We also demonstrate the effectiveness of photo-convertible fluorophores, such as Kaede, for following the specific immune cell subsets, to track their behavior as they migrate to, and resolve from, the injury site.

Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae

Here we present a protocol for live-imaging wound repair and the associated inflammatory response at high spatio-temporal resolution in vivo. This method utilizes the pupal stage of Drosophila development to enable long-term imaging and tracking of specific cell populations over time and is compatible with efficient RNAi-mediated gene inactivation.

לטווח ארוך In Vivo מעקב של תאים דלקתיים הדינמיקה בתוך דרוזופילה הגלמים

During the rapid inflammatory response to tissue damage, cells of the innate immune system are quickly recruited to the injury site. Once at the wound, ...

Immunology and Infection

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Flow cytometry has been widely used to obtain information about DNA content in a population of cells, to infer relative percentages in different cell cycle phases. This technique has been successfully extended to the mitotic tissues of the model organism Drosophila melanogaster for genetic studies of cell cycle regulation in vivo. When coupled with cell-type specific fluorescent protein expression and genetic manipulations, one can obtain detailed information about effects on cell number, cell size and cell cycle phasing in vivo. However this live-cell method has relied on the use of the cell permeable Hoechst 33342 DNA-intercalating dye, limiting users to flow cytometers equipped with a UV laser. We have modified this protocol to use a newer live-cell DNA dye, Vybrant DyeCycle Violet, compatible with the more common violet 405nm laser. The protocol presented here allows for efficient cell cycle analysis coupled with cell type, relative cell size and cell number information, in a variety of Drosophila tissues. This protocol extends the useful cell cycle analysis technique for live Drosophila tissues to a small benchtop analyzer, the Attune Acoustic Focusing Cytometer, which can be run and maintained on a single-lab scale.

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

A protocol for cell cycle analysis of live Drosophila tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer is described. This protocol simultaneously provides information about relative cell size, cell number, DNA content and cell type via lineage tracing or tissue specific expression of fluorescent proteins in vivo.

ניתוח מחזור תא חי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; רקמות באמצעות התמקדות Cytometer אקוסטית לכוונן וה-DNA ויולט Vybrant DyeCycle כתם

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent adult integument. Their immobility and transparency make them ideal for in vivo live imaging experiments. Many studies have focused on the dorsal epithelial monolayer of the pupal&#160;notum because of its accessibility and relatively large size. In addition to the studies of epithelial mechanics and development, the notum has been an ideal tissue to study wound healing. After an injury, the entire epithelial repair process can be captured by live imaging over 6-12 h. Despite the popularity of the notum for live imaging, very few published studies have utilized fixed notum samples. Fixation and staining are common approaches for nearly all other Drosophila tissues, taking advantage of the large repertoire of simple cellular stains and antibodies. However, the pupal notum is fragile and prone to curling and distortion after removal from the body, making it challenging to complement live imaging. This protocol offers a straightforward method for fixing and staining the pupal notum, both intact and after laser-wounding. With this technique, the ventral side of the pupa is glued down to a coverslip to immobilize the pupa, and the notum is carefully removed, fixed, and stained. The notum epithelium is mounted on a slide or between two coverslips to facilitate imaging from the tissue&#39;s dorsal or ventral side.

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The present protocol details the preparation and visualization of fixed tissue of the Drosophila pupal notum. It can be used for either intact or wounded tissue, and the original architecture of the tissue is preserved. The procedures for dissecting, fixing, and staining are all described in this article.

ניתוח, תיקון והדמיה של ה-Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent ...

שיטה מהירה ויעילה לנתח הגולמי כנפי דרוזופילה מתאים Immunodetections או מבחני ה-PCR

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video