ברצוננו להודות CSIC על התמיכה הכלכלית שגבה את הפרויקט, מריאנה פינטור Di לסיוע טכני שלה עם מיקרוסקופיה קונפוקלית; כדי חוסה Báez לאונרדו עבור תיקונים כתב היד שלו; כדי לוצ'יאנו קוראה על מסירותו ליצירתו של הוידאו; כדי Rosano נטליה שהשאלת את הקול שלה עבור הווידאו ואת מרכז מניות דרוזופילה בלומינגטון למתן את המניות השתמשו במחקר זה. Apa1 נגד monoclonal-Ptc שפותחה על ידי איזבל גררו שהושג מ התפתחותי מחקרים ליפידים הבנק (DSHB) תחת חסותה של NICHD ומתוחזק על ידי אוניברסיטת איווה, במחלקה למדעי הביולוגיה, איווה סיטי, IA 52242.

יום 1
1. איסוף של culturing הגלמים.
<ol>
	<li>להסיר את 0 h לאחר היווצרות puparium (APF) או prepupae באמצעות מברשת רטובה של בקבוקונים בתרבית ומניחים בקבוקונים חדשים כמעט להשלים תקופת פיתוח (ראה 2.1 ו- 2.2). 
	הערה: צריך להיות מתוחזק אוכלוסיה בריאה של זבובים באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים culturing. לאחר שלושה או ארבעה ימים שבהם הביצים מוטלות, ניתן להסיר את המבוגרים בקבוקונים. כדי לאפשר את התפתחות אופטימלית של האנשים. הם נשמרים בטמפרטורה קבועה עד הזחלים לחלל השלישי ליזום להתגלמות. המעבר זחל הגולמי מסומן על ידי היווצרות prepupa נחשב את 0 h APF. Prepupa הוא זחל לבנים משותק הכולל של המלבן, צורה עם בולטות קדמית spiracles עגולה.</li>
</ol>
יום 2
2. העברה, ניתוח של קיבוע.
<ol>
	<li>להעביר את הגלמים (2 h לפני הזמן פיתוח הוא להשלים) באמצעות מברשת צבע, עד השקופית מיקרוסקופ עם סרט הדבקה דו-צדדי דבקה זה. מקם את הגלמים כדי ליצור שורה עם מעלה הגבי צדדים cephalic מסתיים פונות לאותו הכיוון.</li>
	<li>לחזור לשקופית מיקרוסקופ טמפרטורה קבועה ולאפשר הגלמים להשלים את הזמן המתאים התפתחותית (כלומר 24-30 h APF). 
	הערה: השקופית מיקרוסקופ עם קלטת דו-צדדית יהיה פלטפורמה חלוף ניתוח כדי להסיר את המקרה הגולמי (ראו להלן). זמן לשגות בשקופית מיקרוסקופ (מחוץ המבחנה) עוזר לייבש את התיק הגולמי עושה את. זה בקלות שבירים עם מלקחיים.</li>
	<li>הסר את operculum המקרה הגולמי באמצעות מלקחיים.</li>
	<li>לפענח את המקרה עם מלקחיים (כפי שמוצג בסרטון) ביצוע קו לאורך הצד של הגולם הסוף סימטרית. זה אפשרי לזהות את הצורה פנימי של הגולם שהופך ניכר רווח מעל הציר של האגף הגולמי ההארה מתאימות. שטח זה משמש מדריך כדי לבצע את הפתיחה ללא פגיעה הגולם.</li>
	<li>הסרת חלקים של המקרה, לאסוף אותם ליד הגבול נפתח ולהסתובב איתם לצד הנגדי שבו הקלטת דו-צדדית יחזיק אותם. בסוף הקרע הגלמים יהיה כמעט "עירום", שרק חתיכה קטנה של התיק לסקר את הקצה האחורי. הערה: מטרת להשאיר כמות קטנה של התיק סימטרית בקצה העליון נועד להבטיח שחרור חלק מהתיק אותן לשקופית עם קלטת דו-צדדית. ההיגיון העומד מאחורי פעולה זו היא כי אם תסיר מדי של התיק אתה מאוד להסתכן בפגיעה הגולם. לעומת זאת אם תסיר מעט מדי, הגולם לא בקלות יבוא חינם של התיק.</li>
	<li>לדחוף למטה (עם מלקחיים) השארית של התיק. תנועה זו מעלה בקצה הקדמי של הגולם, ומאפשר גם בראש וגם החזה להישאר בעמדה מועדף לדבוק וכדי להעביר בשלב שלאחר מכן.</li>
	<li>קח שקופית חדשה עם סרט הדבקה דו-צדדי, היפוך זה גולם או שורה הגלמים. אנו ממליצים על ביצוע גישה זו על ידי התבוננות תנועות בסיועם stereomicroscope כדי למנוע שבירה של הגלמים.</li>
	<li>הקש מעט כדי להפוך את הגלמים לדבוק הקלטת, בעדינות והחלק את השקופית כדי להסיר את הגלמים משאר המקרים. היפוך השקופית למיקרוסקופ: הגלמים יהיה תקוע בצד הגבי ברמה של הראש שלהם / אזור בית החזה.</li>
	<li>מכסה כל הגלמים עירום עם 4% paraformaldehyde, לחכות 10 דקות. מניסיוננו, זו מאובדן זמן עם מקבע מסייע לשינוי מרקם של הקוטיקולה הפיכתה המשרד, פחות דביק, קל לטפל. 
	הערה: כדי לבצע את החילוץ חומצה ריבונוקלאית (RNA), paraformaldehyde תחליף עבור באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) עשה עם RNase ללא מים ולהסיר את הכנפיים הגולמי עושה חתך (בעזרת מספריים) ליד נקודת הציר של כל גפה. באמצעות מלקחיים, להעביר את הכנף הגולמי צינור microcentrifuge עם 1 מ"ל של ריאגנט guanidinium thiocyanate ופנול. לאחר איסוף סך של 50-80 כנפיים, לאחסן את הצינור microcentrifuge ב-80 מעלות צלזיוס עד ביצוע ה RNA החילוץ10,11.</li>
	<li>עושים חתך קטן על האזור ציר של הזרוע או בקרבתה. לאפשר את מקבע להגיע האפיתל כנף. באמצעות פיפטה (p200) מיושרות מקבע מעל הכנף. בעת שטיפה החלף מזוהמים שמלמדות עם חדש. לאחר שטיפה, ממשיך האגף לשבועיים למשך 5 דקות. 
	הערה: למרות התמרון הזה עוזר לסלק את רוב רקמת מזהמים, כמה hemocytes, טיפות השמן יכול להישאר לכודים בין הרבדים אפיתל הגבי ו הגחון של האגף (ראה איור 1 א').</li>
	<li>דמעה עם מלקחיים מגבול לציפורן (כפי שמוצג בסרטון) מרחיבה את החור ועל הפעלת על שחרורו של האפיתל כנף מן הקרום לציפורן. ברגע הרקמה כנף הוא שוחרר, השאירו זה הפתרון paraformaldehyde להשלמת 30 דקות של קיבעון.</li>
	<li>להעביר את הכנפיים קבוע אחד נקוו 4 צלחת פלסטיק מלאים PBST (טריטון X-100 0.05%). חנות בן לילה ב 4 º C.</li>
</ol>
יום 3
3. ראשי נוגדן הדגירה.
<ol>
	<li>Permeabilize הרקמה המקננת הכנפיים הגולמי ב- PBST (טריטון X-100 0.2%) למשך 15 דקות באמצעות פלטפורמה נדנדה כדי להקל על תנועה בינונית נוזלי עדין. 
	הערה: עד הרכבה הדגימות, השלבים צריכה להתבצע באמצעות פלטפורמה נדנדה.</li>
	<li>לחסום את הדגימות באמצעות PBSTA (BSA 3%, טריטון X-100 0.1%) לשעה.</li>
	<li>להשתמש המאגר אותו לדלל נוגדן ראשוני (העכבר אנטי-Ptc, בטחונות) של דגירה הכנפיים הגולמי בן לילה ב 4 º C.</li>
</ol>
יום 4
4. משני נוגדן הדגירה.
<ol>
	<li>שטיפת דגימות דקות 4 x 10 כל אחד עם PBST (טריטון X-100 0.05%)</li>
	<li>דגירה עם נוגדנים משניים (למשל, העכבר אנטי מצומדת כדי fluorochrome) מדולל על הריכוז המתאים ב- PBSTA (BSA 3%, טריטון X-100 0.1%) בטמפרטורת החדר בחושך, כבר שעתיים. 
	הערה: אם זה מתאים, השתמש 4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) ו/או phalloidin כדי counterstain את הרקמה. הוסף רגשים אלו עם הנוגדן משני לוקח בחשבון את אורך הגל של פליטה של fluorochromes כדי למנוע את החפיפה של אותות.</li>
	<li>שטיפת דגימות דקות 4 x 10 כל אחד עם PBST (טריטון X-100 0.05%)</li>
</ol>
5. הרכבה
<ol>
	<li>להכין מדגם שקופית על-ידי הצבת נקודות 4 של לק שקוף על השקופית מיקרוסקופ כאילו היו הקודקודים של ריבוע.</li></ol>הם יהיו הנקודות שבו ינוח coverslips, המסייע למנוע ריסוק הרקמה.
	<li>מקום 30 µL של הרכבה מדיה (גליצרול/טריס-HCl 80 אחוז) במרכז הכיכר של הנקודות עשה עם לק מבלי לגעת באחת הפינות (נקודות). לוקחים פיפטה עם טיפ החתוכה צהוב, לטעון כמה כלי תקשורת הרכבה, ואז מצייר באגפים הגולמי במספר.</li>
	<li>העברה כנפיים הגולמי הנקודה של הרכבה מדיה בשקופית מיקרוסקופ. בעזרת טיפ, התפשטה התקשורת הרכבה, להטביע את הכנפיים הגולמי כדי למנוע מהם צף. המורפולוגיה של הרקמה יישמרו אם הכנפיים יישאר שטוח הזכוכית המכסה ממוקם על. לפני הצבת הזכוכית המכסה, הסר את בועות האוויר.</li>
	<li>הנמך את coverslip על גבי הדגימות מנסה למנוע את הדור של בועות אוויר. תנועה זו יכול להיעשות בעזרת מלקחיים.</li>

<ol>
	<li>Serrano, N., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limb+morphogenesis:+connections+between+patterning+and+growth.">Limb morphogenesis: connections between patterning and growth.</a> Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartments+and+appendage+development+in+Drosophila.">Compartments and appendage development in Drosophila.</a> Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).</li><li>Klein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+disc+development+in+the+fly:+the+early+stages.">Wing disc development in the fly: the early stages.</a> Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).</li><li>Beira, J. V., Paro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+legacy+of+Drosophila+imaginal+discs.">The legacy of Drosophila imaginal discs.</a> Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).</li><li>De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+basis+for+vein+pattern+variations+in+insect+wings.">Developmental basis for vein pattern variations in insect wings.</a> Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).</li><li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wing+vein+patterning+in+Drosophila+and+the+analysis+of+intercellular+signaling.">Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).</li><li>Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drawing+lines+in+the+Drosophila+wing:+initiation+of+wing+vein+development.">Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development.</a> Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).</li><li>De Celis, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+in+the+Drosophila+wing:+The+development+of+the+veins.">Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins.</a> Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).</li><li>Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis.">Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis.</a> Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).</li><li>Bolatto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+distribution+of+Patched-related+protein+in+the+Drosophila+embryo.">Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo.</a> Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).</li><li>Zuniga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+encoding+novel+secreted+and+transmembrane+proteins+are+temporally+and+spatially+regulated+during+Drosophila+melanogaster+embryogenesis.">Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis.</a> BMC Biol. 7, 61 (2009).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

השיטה של דיסקציה המתואר בסרטון זה יכול לשמש כדי להכין דוגמאות באיכות גבוהה דרוזופילה כנפיים הגולמי של שלבי ההתפתחות השונים עבור סוגים רבים של טכניקות (למשל, immunofluorescence, cDNA סינתזה כדי מבחני ה-PCR, גופית ווינג פיתוח). במונחים של שיטה זו מעורב המדען השתמשו 24-30 h APF. עם זאת צריך להיות שום מכשול בתוך הפעולות החיוניות דיסקציה של גולם צעיר או מבוגר. שינויים ייתכן שיש לבצע כדי להכיל גולם שלב קטן יותר.
הפרוטוקול יכול להתבצע לנתח גולם אחד או מספר הגלמים באותו זמן. זה עוזר כדי להאיץ את התהליך להגיע אל מספר רב של כנפיים גזור להקל. במקרה זה יש אפשרות להסיר שורה של 4-5 הגלמים באותו זמן. באפשרותך להסיר את הגלמים ביחד או אם זה לא אפשרי, להמשיך להסיר בנפרד על גבי השקופית אותו (ראה סעיף III של הוידאו: "מרובים הגלמים לנתיחה"). כדי להסיר את הגולם עירום מהתיק שנפתח, חשוב כי הקצה האחורי הוא קטן מספיק. ניתן להסיר את התיק לחלוטין; למרות שזה העברת מהר יותר, הסרת התיק הוא מאתגר, ויש סיכון גדול יותר של פגיעה הגולם.
ניסיון מכתיבה זה תמרון חשוב לשקול לעזוב (את האחרון 2 h כדי להשלים את זמן פיתוח כאמור) הגולם קשור השקופית מיקרוסקופ בתוך החממה אך בחוץ את המבחנה. זו קפיצה הזמן עוזר לייבש את התיק לשבור להקל. עוד צעד קריטי במהלך ניתוח עבור אימונוהיסטוכימיה, היא לקלף את הקוטיקולה המכסה האפיתל כנף, ובכך מעניק גישה של הנוגדן השטח אגף שלם. שלב זה צריך להיעשות לאחר תיקון למשך מספר דקות (לפחות 5 דקות לאחר ביצוע החתך בנקודת הציר) כי מקבע מייצב הרקמות ומשנה את עקביות לציפורן, שהופך אותו קל יותר לקלף.
בעת ביצוע כל הצעדים אימונוהיסטוכימיה, ודא כי הכנפיים הן בתנועה מתמדת (נדנדה פלטפורמה). התנועה מסייעת לשפר את מחלף חדירה של הפתרונות במהלך שוטף, incubations. עם זאת, חשוב לבצע אותם בעדינות הימנעות המופע של עיוותים בלתי רצויה המורפולוגיה של מבנה שברירי זה (קרי, זה מספיק כי תנודות של פלטפורמת להזיז מעט את נוזלי המכיל בינוני הדגימות).
הליך זה מספק גישה משלימים שיטות שפורסם כבר כנף הגולמי לנתיחה.

דרוזופילה כנפיים מפותחים של הדיסקים דמותי כנף. הבראשיתי של הדיסקים האלה כנף הם לשים בצד במהלך התפתחות עובריים כקבוצות קטנות של תאים דמותי 20-30 invaginate של האפיתל מתחלקים. בעוד הזחל הולך וגדל השלב לחלל, מיטוזה מתרחש בתאים דמותי במועדים האופיינית ספציפיים, העלאת המספרים שלה (כ 50000 תאים) ויוצרים את הכנף דיסק1,2,3, 4. כמו התאים להתרבות, הם אופנה אפיתל צינורי, וכתוצאה מכך ספירלה קומפקטי מתקפל עצמית. במהלך להתגלמות, טלסקופים האפיתל דיסק מחוץ לאגף טופס דו שכבתי, הורידים האורך להתחיל בתור לקונות ביניהם, אשר מתרחשת פעמיים במהלך כנף התפתחותית5,6.
הסידור של ורידים תמיד יש תבנית זהה; היכולת לזהות בקלות כל שינוי בתוך היווצרות הורידים הופך מוטציות גלוי מאוד (למשל חסרים או מיותרים וורידים, שינוי עמדות וריד, וכו '). מעניין, הווריאציות פנוטיפ בדרך כלל הראיות של מוטציות מוכרות או רומן רכיבים של איתות המסלולים הרלוונטיים לפיתוח כנף. אחד המסלולים זה ממלא תפקיד בקביעת המיקום ושמירה על הווריד וטריטוריות intervein הוא קיפוד (Hh) מסלול6,7,8.
בהתחשב בחשיבות של האגף הגולמי כמערכת מודל, חשוב יהיה להשיג דגימות באיכות טובה לעבוד עם. בעבר, מדענים שפרסמו פרוטוקולים לנתח דרוזופילה כנפיים לא העניק מדריך המתאים כדי להשיג דגימות עביד. ללא ההדרכה של חוקר אחד לא יכול בבירור להמחיש את התהליך. בגישות חלופיות אלה ויבתר הגולם לחלק שני, הפרדת האגף מן הרקמה שמסביב, שטפתי שוב ושוב לפנות את הפסולת. סוג זה של הגישה תביעות לעזוב את האגף חינם של מזהם אבל עקב התנסות קודמת התהליך הוא איטי יותר, ויש סיכוי גבוה יותר להתפשר על המבנה של בכנפיים השבריריות9.
ההליך המתואר כאן פותחה על ידי הדרישה למצוא שיטה מהירה ויעילה להשיג דגימות כנף הגולמי מתאימים לזהות חלבונים ספציפיים או התמלילים באמצעות פרוטוקולים immunodetection או מבחני (PCR) תגובת שרשרת של פולימראז. כדי להמחיש זאת, ביטוי של לוקליזציה של Patched (Ptc או הקולטן הקנוני של הנתיב Hh) מזוהה בדגימות כנף הגולמי, מתן פרוטוקול הכולל את הפרטים הרלוונטיים כדי לבצע בהצלחה את השלם נוהל.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="809">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:349px;">Stereomicroscope with cool light illumination</td>
			<td style="width:175px;">Nikon&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SMZ1000</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rocking platform</td>
			<td>Biometra (WT 16)</td>
			<td>042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope slides</td>
			<td>StarFrost</td>
			<td>8037/1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cover glasses (24 x 32 mm)</td>
			<td>Deltalab</td>
			<td>D102432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Scissors</td>
			<td>Lawton</td>
			<td>63-1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Multi-well plastic dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>144444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">p100 or p200 pipette</td>
			<td>Finnpipette (Labsystems)</td>
			<td>9400130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1X PBS (Dulbecco)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21600-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4% paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BSA</td>
			<td>Bio Basic INC.</td>
			<td>9048-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>5092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TRIzol Reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DEPC treated water</td>
			<td>MO.BIO</td>
			<td>17011-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:349px;">Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL 
			(working dilution 1/800)</td>
			<td style="width:175px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A11030</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="153">
			<td height="153" style="height:153px;width:349px;">Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 &#956;g/mL 
			(working dilution 1/100)</td>
			<td style="width:175px;">Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:349px;">DAPI, 1 mg/mL 
			(working dilution 1/5000)</td>
			<td style="width:175px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">62248</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:58px;width:349px;">Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol 
			(1/600 working dilution)</td>
			<td style="width:175px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:349px;">Canton S (fly stock)</td>
			<td style="width:175px;">Bloomington Drosophila Stock Center&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid and efficient method to dissect pupal wings of drosophila suitable for immunodetections or pcr assays

אגף פיתוח melanogaster דרוזופילה הוא מודל אידיאלי ללמוד מורפוגנזה ברמת רקמות. תוספות אלה לפתח מתוך קבוצה של תאים בשם אגף דיסקים דמותי נוצר במהלך התפתחות. הזחל הדיסקים דמותי צומחים, להגדיל את מספר התאים ויוצרים מבנים אפיתל monolayered. בתוך התיק הגולמי הדיסקים דמותי באד החוצה ומקפלים לתוך bilayers לאורך קו זה הופך לשולי העתידי של האגף. במהלך תהליך זה, מקורם הורידים primodia האורך וריד תאים הגבי ו הגחון פוטנציאליים של משטחי הכנף. במהלך השלב הגולמי הפסים של וריד תאים של כל שטח תקשורת על מנת ליצור צינורות חזק; במקביל, קרוס-הורידים מתחילים היווצרותם.
עם העזרה של סמנים מולקולריים המתאים, זה אפשרי לזהות את המרכיבים המרכזיים להלחין את האגף במהלך התפתחותו. מסיבה זו, היכולת לזהות במדויק התמלילים או חלבונים במבנה זה חיוני ללמוד שלהם שפע ולוקליזציה הקשורות לתהליך הפיתוח של האגף.
ההליך המתואר כאן מתמקדת על מניפולציה כנפיים הגולמי, מתן הנחיות מפורטות כיצד לנתח את האגף במהלך השלב הגולמי. . הקרע של רקמות הגולמי קשה יותר לביצוע מאשר מקביליהם הזחלים לחלל השלישי. זו הסיבה מדוע גישה זו פותחה, כדי לקבל דוגמאות איכותי מהיר ויעיל. פרטים לגבי אופן immunostain ו הר דגימות אלה כנף, כדי לאפשר את הפריט החזותי של חלבונים או מרכיבי התא, ניתנים בפרוטוקול. עם המומחיות הקטנה אפשרי לאסוף 8-10 כנפיים הגולמי באיכות גבוהה תוך זמן קצר.

הפרוטוקול מציע שיטה פשוטה עבור קבלת דגימות כנף הגולמי לשמור המורפולוגיה מוכר של האגף. מן ההכנות הללו זה ניתן לקבל ערימות של תמונות יכול להיות מוקרן דו-ממדיים או תלת-ממד, לחקור הפצה ו/או ההעשרה של חלבונים במהלך הבידול של האגף. (ראה ההערה ב- 2.9) פרוטוקול דומה ניתן לאסוף גדול כנף הגולמי המדגם (50-80 מעורבים wings הגולמי) הדרושים כדי לסנתז חומצה deoxyribonucleic משלימים (cDNA), התבנית המשמשת ב- PCR תגובות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55854/55854fig1.jpg"> 
איור 1 : קיפוד ג'ין מסלול ב דרוזופילה כנפיים הגולמי 
(א) תוקנו, הקולטן הקנוני של מסלול הקיפוד, היה מדמיין ב 24-30 h APF באמצעות העכבר אנטי - Ptc. הגרעינים היו counterstained עם דאפי ואילו אקטין חוטים הם visualized באמצעות phalloidin של ירוק-פלורסנט. התפלגות אקטין מסייעת למקם כנף ורידים והקשר שלה עם ביטוי שתוקנה . באותו זמן, phalloidin הכתם מגלה הנוכחות של כמה hemocytes, טיפות השמן (עיגולים גדולים) כמו זיהום רקמות. 20 x הגדלה, הקדמי הוא למעלה. קנה המידה של בר, 100 מיקרומטר (B) Amplicons כדי אקטין (ליין 1, 280 bp) ו- ptc (ליין 2, 236 bp) התקבלו באמצעות cDNA synthetized מהדגימה כנף RNA שליח (mRNA) שנוצרו על-ידי פרוטוקול ניתוח דומה. MW, משקל מולקולרי. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55854/55854fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays at JoVE.com

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

היכולת לזהות במדויק התמלילים או חלבונים ברקמות דרוזופילה הוא קריטי עבור הלומדים שלהם שפע ולוקליזציה הקשורות לתהליך הפיתוח. הנה התיאור של תהליך פשוט לנתח כנפיים הגולמי. אלה כנפיים יכול לשמש כדוגמאות מספר טכניקות (אימונוהיסטוכימיה, PCR assay, וכו ').

שיטה מהירה ויעילה לנתח הגולמי כנפי דרוזופילה מתאים Immunodetections או מבחני ה-PCR

Wing development in Drosophila melanogaster is an ideal model for studying morphogenesis at tissue level. These appendages develop from a group of cells ...

a-rapid-efficient-method-to-dissect-pupal-wings-drosophila-suitable

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

8.0K Views.  Laboratorio de Biología del Desarrollo. היכולת לזהות במדויק התמלילים או חלבונים ברקמות דרוזופילה הוא קריטי עבור הלומדים שלהם שפע ולוקליזציה הקשורות לתהליך הפיתוח. הנה התיאור של תהליך פשוט לנתח כנפיים הגולמי. אלה כנפיים יכול לשמש כדוגמאות מספר טכניקות (אימונוהיסטוכימיה, PCR assay, וכו ').

Video: A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-הדמיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; גלמי עין

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell replacement therapies. Terminally differentiated cell types could be used for the treatment of various degenerative diseases. In vitro differentiation of these cells towards tissues of the lung, liver and pancreas requires as a first step the generation of definitive endodermal cells. This step is rate-limiting for further differentiation towards terminally matured cell types such as insulin-producing beta cells, hepatocytes or other endoderm-derived cell types. Cells that are committed towards the endoderm lineage highly express a multitude of transcription factors such as FOXA2, SOX17, HNF1B, members of the GATA family, and the surface receptor CXCR4. However, differentiation protocols are rarely 100% efficient. Here, we describe a method for the purification of a CXCR4+ cell population after differentiation into the DE by using magnetic microbeads. This purification additionally removes cells of unwanted lineages. The gentle purification method is quick and reliable and might be used to improve downstream applications and differentiations.

Here, we describe a method for the purification of differentiated human embryonic stem cells that are committed towards the definitive endoderm for the improvement of downstream applications and further differentiations.

שיטה מהירה ויעילה עבור טיהור של תאים האנדודרם המופקים מתאי גזע עובריים אנושיים

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used therapeutically, in the near future, to restore function to damaged organs. Nevertheless, several technical issues, including the highly invasive procedure of isolating MSCs and the inefficiency surrounding their amplification, currently hamper the potential clinical use of these therapeutic modalities. Herein, we introduce a highly efficient method for the generation of dedifferentiated fat cells (DFAT), MSC-like cells. Interestingly, DFAT cells can be differentiated into several cell types including adipogenic, osteogenic, and chondrogenic cells. Although other groups have previously presented various methods for generating DFAT cells from mature adipose tissue, our method allows us to produce DFAT cells more efficiently. In this regard, we demonstrate that DFAT culture medium (DCM), supplemented with 20% FBS, is more effective in generating DFAT cells than DMEM, supplemented with 20% FBS. Additionally, the DFAT cells produced by our cell culture method can be redifferentiated into several tissue types. As such, a very interesting and useful model for the study of tissue dedifferentiation is presented.

We have modified the conditions for DFAT cell generation and provide herein information regarding the use of an improved growth medium for the production of these cells.

שיטה יעילה להשיג תאי Dedifferentiated שומן

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

הבידול מהירה, מכוונת של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע Pluripotent האנושי עובריים או מושרה

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

חיתוך, צביעה של השחלות הגולמי דרוזופילה

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

שיטה פשוטה ויעילה כדי לבודד Keratinocytes האנושי העיקרי של רקמת עור מבוגר

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of cells or tissues in model organisms. These systems contain two components as separate transgenic lines. A driver line expresses a transcriptional activator under the control of tissue-specific promoters/enhancers, and a reporter/effector line harbors a target gene placed downstream to the binding site of the transcription activator. Animals harboring both components induce tissue-specific transactivation of a target gene expression. Precise spatiotemporal expression of the gene in targeted tissues is critical for unbiased interpretation of cell/gene activity. Therefore, developing a method for generating exclusive cell/tissue-specific driver lines is essential. Here we present a method to generate highly tissue-specific targeted expression system by employing a &#34;Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated&#34; (CRISPR/Cas)-based genome editing technique. In this method, the endonuclease Cas9 is targeted by two chimeric guide RNAs (gRNA) to specific sites in the first coding exon of a gene in the Drosophila genome to create double-strand breaks (DSB). Subsequently, using an exogenous donor plasmid containing the transactivator sequence, the cell-autonomous repair machinery enables homology-directed repair (HDR) of the DSB, resulting in precise deletion and replacement of the exon with the transactivator sequence. The knocked-in transactivator is expressed exclusively in cells where the cis-regulatory elements of the replaced gene are functional. The detailed step-by-step protocol presented here for generating a binary transcriptional driver expressed in Drosophila fgf/branchless-producing epithelial/neuronal cells can be adopted for any gene- or tissue-specific expression.

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Here, we present a method for generating tissue-specific binary transcription systems in Drosophila by replacing the first coding exon of genes with transcription drivers. The CRISPR/Cas9-based method places a transactivator sequence under the endogenous regulation of a replaced gene, and consequently facilitates transctivator expression exclusively in gene-specific spatiotemporal patterns.

אסטרטגיית יעיל ליצירת מערכות רקמות ספציפיות שעתוק בינאריים ב דרוזופילה על-ידי עריכת הגנום

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a reliable protocol for the dissection of the delicate Drosophila pupal retina. Our surgical approach utilizes readily-available microdissection tools to open pupae and precisely extract eye-brain complexes. These can be fixed, subjected to immunohistochemistry, and retinas then mounted onto microscope slides and imaged if the goal is to detect cellular or subcellular structures. Alternatively, unfixed retinas can be isolated from brain tissue, lysed in appropriate buffers and utilized for protein gel electrophoresis or mRNA extraction (to assess protein or gene expression, respectively). Significant practice and patience may be required to master the microdissection protocol described, but once mastered, the protocol enables relatively quick isolation of mainly undamaged retinas.

Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation

This paper presents a surgical method for dissecting Drosophila pupal retinas along with protocols for the processing of tissue for immunohistochemistry, western analysis, and RNA-extraction.&#160;

דיסקציה של הרשתית הגולמי דרוזופילה אימונוהיסטוכימיה, ניתוח המערבי של RNA בידוד

The Drosophila pupal retina provides an excellent model system for the study of morphogenetic processes during development. In this paper, we present a ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

מפשיר Culturing, Cryopreserving שורות תאים דרוזופילה

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or complete loss of viability at different stages of development. Our lab has developed a method to assess viability in Drosophila from embryo to fully mature adult. The method relies on quantifying the number of progeny present at different stages during development, starting with hatched embryos. After embryos have been quantified, additional stages are counted, including L1/L2, pupae, and mature adults. After all stages have been examined, a statistical analysis such as the chi-square test is used to determine if there is a significant difference between the starting number of progeny (hatched embryos) and later stages culminating in the observed number of adults, thus rejecting or accepting the null hypothesis (that the number of hatched embryos will be equal to the number of larvae, pupae, and adults recorded throughout the stages of development). The primary advantage of this assay is its simplicity and accuracy, as it does not require an embryo rinse to transfer them to the food vial, avoiding losses from technical errors. Although the protocol described here does not directly examine L2/L3 larvae, additional steps can be added to account for these. Comparing the number of hatched embryos, L1, pupae, and adults can help determine if viability was compromised during the L2/L3 stages for further studies (the use of colored food helps with visual identification of larvae). Overall, this method can help Drosophila researchers and educators determine when viability is compromised during the fly life cycle. Routine assessment of stocks using this assay can prevent accumulation of secondary mutations that may affect the phenotype of the originally isolated mutant, especially if the original mutations affect fitness. For this reason, our lab maintains multiple copies of each of our Dm ime4 alleles and routinely checks the purity of each stock with this method in addition to other molecular analyses.&#160;

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

This protocol is designed to assess the viability of Drosophila at every developmental stage, from embryo to adult. The method can be used to determine and compare the viability of different genotypes or growth conditions.

שיטה ישירה ופשוטה להערכת דרוזופילה מלאנוגסטרהכדאיות מעובר למבוגר

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...