מיקרוסקופ קונפוקלי נרכש בכספים מ ארה ב הלאומית למדע קרן (NSF), גרנט #DBI-0722569. המחקר נתמך על ידי ארה ב הלאומית מכוני בריאות/לאומי המכון של גנרל רפואי למדעים (NIH/NIGMS) גרנט #GM085290, ארה ב המחלקה של ההגנה (DOD) גרנט #W81XWH-16-1-0466 מוענק ברוסטר חומרי גלם. אי חיוניים נתמך על ידי מענק כדי UMBC הווארד יוז מכון רפואי דרך המכללה מראש לתואר ראשון במדעי החינוך תוכנית, להעניק #52008090. פ מ בראון נתמכה על ידי ארצות הברית מחלקת של החינוך GAANN מלגת, מלגת בוגר מאירהוף ממומן על ידי מענק NIH/NIGMS #GM055036, Assistantship של מחקר שמומן על ידי משרד ההגנה האמריקאי גרנט #W81XWH-16-1-0466.

<ol>
	<li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+ends:+a+dynamic+protein+network+controls+the+fate+of+microtubule+tips.">Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 309-322 (2008).</li><li>Conde, C., C&#225;ceres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+assembly,+organization+and+dynamics+in+axons+and+dendrites.">Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites.</a> Nat Rev Neurosci. 10 (5), 319-332 (2009).</li><li>Kaverina, I., Straube, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cell+migration+by+dynamic+microtubules.">Regulation of cell migration by dynamic microtubules.</a> Semin Cell Dev Biol. 22 (9), 968-974 (2011).</li><li>Kollman, J. M., Merdes, A., Mourey, L., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+nucleation+by+&#947;-tubulin+complexes.">Microtubule nucleation by &#947;-tubulin complexes.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (11), 709-721 (2011).</li><li>Howard, J., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth,+fluctuation+and+switching+at+microtubule+plus+ends.">Growth, fluctuation and switching at microtubule plus ends.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (8), 569-574 (2009).</li><li>Schulze, E., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+and+stable+populations+of+microtubules+in+cells.">Dynamic and stable populations of microtubules in cells.</a> J Cell Biol. 104 (2), 277-288 (1987).</li><li>Gundersen, G. G., Kalnoski, M. H., Bulinski, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+populations+of+microtubules:+Tyrosinated+and+nontyrosinated+alpha+tubulin+are+distributed+differently+in+vivo.">Distinct populations of microtubules: Tyrosinated and nontyrosinated alpha tubulin are distributed differently in vivo.</a> Cell. 38 (3), 779-789 (1984).</li><li>Li, R., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+polymer+polarity:+how+the+cytoskeleton+builds+a+polarized+cell.">Beyond polymer polarity: how the cytoskeleton builds a polarized cell.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (11), 860-873 (2008).</li><li>Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+for+monitoring+in+vivo+microtubule+structures.">A transgenic zebrafish for monitoring in vivo microtubule structures.</a> Dev Dyn Off Publ Am Assoc Anat. 239 (10), 2695-2699 (2010).</li><li>W&#252;hr, M., Tan, E. S., Parker, S. K., Detrich, H. W., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+cleavage+plane+determination+in+early+amphibian+and+fish+embryos.">A model for cleavage plane determination in early amphibian and fish embryos.</a> Curr Biol CB. 20 (22), 2040-2045 (2010).</li><li>Tran, L. D., Hino, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+microtubules+at+the+vegetal+cortex+predict+the+embryonic+axis+in+zebrafish.">Dynamic microtubules at the vegetal cortex predict the embryonic axis in zebrafish.</a> Development. 139 (19), 3644-3652 (2012).</li><li>Butler, R., Wood, J. D., Landers, J. A., Cunliffe, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+chemical+modulation+of+spastin-dependent+axon+outgrowth+in+zebrafish+embryos+indicates+a+role+for+impaired+microtubule+dynamics+in+hereditary+spastic+paraplegia.">Genetic and chemical modulation of spastin-dependent axon outgrowth in zebrafish embryos indicates a role for impaired microtubule dynamics in hereditary spastic paraplegia.</a> Dis Model Mech. 3 (11-12), 743-751 (2010).</li><li>Yoo, S. K., Lam, P. -. Y., Eichelberg, M. R., Zasadil, L., Bement, W. M., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microtubules+in+neutrophil+polarity+and+migration+in+live+zebrafish.">The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish.</a> J Cell Sci. 125 (23), 5702-5710 (2012).</li><li>Andersen, E. F., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+movements+in+vivo+correlate+with+specific+neurite+formation+downstream+of+LIM+homeodomain+transcription+factor+activity.">Centrosome movements in vivo correlate with specific neurite formation downstream of LIM homeodomain transcription factor activity.</a> Development. 139 (19), 3590-3599 (2012).</li><li>Lee, S. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+the+microtubule+and+actin+cytoskeleton+in+zebrafish+epiboly.">Dynamic regulation of the microtubule and actin cytoskeleton in zebrafish epiboly.</a> Biochem Biophys Res Commun. 452 (1), 1-7 (2014).</li><li>Bulinski, J. C., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilization+and+post-translational+modification+of+microtubules+during+cellular+morphogenesis.">Stabilization and post-translational modification of microtubules during cellular morphogenesis.</a> BioEssays. 13 (6), 285-293 (1991).</li><li>Magiera, M. M., Janke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+16+-+Investigating+Tubulin+Posttranslational+Modifications+with+Specific+Antibodies.">Chapter 16 - Investigating Tubulin Posttranslational Modifications with Specific Antibodies.</a> Methods Cell Biol. 115, 247-267 (2013).</li><li>Hong, E., Jayachandran, P., Brewster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+polarity+protein+Pard3+is+required+for+centrosome+positioning+during+neurulation.">The polarity protein Pard3 is required for centrosome positioning during neurulation.</a> Dev Biol. 341 (2), 335-345 (2010).</li><li>Westermann, S., Weber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-translational+modifications+regulate+microtubule+function.">Post-translational modifications regulate microtubule function.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (12), 938-948 (2003).</li><li>Jayachandran, P., Olmo, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-associated+protein+1b+is+required+for+shaping+the+neural+tube.">Microtubule-associated protein 1b is required for shaping the neural tube.</a> Neural Develop. 11, 1 (2016).</li><li>Nam, S. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Tau,+a+microtubule+associated+protein,+in+Drosophila+photoreceptor+morphogenesis.">Role of Tau, a microtubule associated protein, in Drosophila photoreceptor morphogenesis.</a> Genes N Y N 2000. 54 (11), 553-561 (2016).</li><li>Abal, M., Piel, M., Bouckson-Castaing, V., Mogensen, M., Sibarita, J. -. B., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+release+from+the+centrosome+in+migrating+cells.">Microtubule release from the centrosome in migrating cells.</a> J Cell Biol. 159 (5), 731-737 (2002).</li><li>Delgehyr, N., Sillibourne, J., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+nucleation+and+anchoring+at+the+centrosome+are+independent+processes+linked+by+ninein+function.">Microtubule nucleation and anchoring at the centrosome are independent processes linked by ninein function.</a> J Cell Sci. 118 (8), 1565-1575 (2005).</li><li>Manning, J. A., Lewis, M., Koblar, S. A., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+function+for+the+centrosomal+protein+NEDD1+in+zebrafish+development.">An essential function for the centrosomal protein NEDD1 in zebrafish development.</a> Cell Death Differ. 17 (8), 1302-1314 (2010).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn Off Publ Am Assoc Anat. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Beck, A. P., Watt, R. M., Bonner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+Lateral+Mounting+of+Zebrafish+Embryos:+Analysis+of+Spinal+Cord+Development.">Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development.</a> JoVE J Vis Exp. (84), e50703 (2014).</li><li>F&#214;ldes-Papp, Z., Demel, U., Tilz, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+scanning+confocal+fluorescence+microscopy:+an+overview.">Laser scanning confocal fluorescence microscopy: an overview.</a> Int Immunopharmacol. 3 (13-14), 1715-1729 (2003).</li><li>. ImageJ User Guide - IJ 1.46 Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/</a> (2010)</li><li>. Z-functions - ImageJ Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.net/Z-functions">https://imagej.net/Z-functions</a> (2017)</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

כיום ישנן שיטות רבות הדמיה MT הדינמיקה של התפתחות מוקדמת של דג זברה, ועד הדמיה חיה של מולקולות מתויגות immunolabeling של קבוע רקמות11,12,13,14. למרות MTs בתא יחיד יכולה להתקיים במצבים דינמיים או יציבה, epithelialization הוא תהליך שבו MTs בהדרגה התייצבו לאורך זמן. באמצעות סמנים עבור MTs יציבה ודינמית מציע דרך להמחיש את התופעה. השיטה המוצגת כאן ממנף את העוצמה של תוכנת הדמיה תלת-ממדית כדי לכמת את המעבר דינאמי יציבה אוכלוסיות MT ב חתך רוחב של רקמה עוברית דג זברה. פרוטוקול 2, השיטה משמשת תווית אוכלוסיה שונות של nascent MTs ולעקוב אחר השעות הנוספות? התגרענות ואת הצמיחה שלהם.
MTs הם שקשה לחסלם תמונה במצב מקורי שלהם עקב שלהם נטיה depolymerize. לכן, מרכיב המפתח של שיטה זו הוא קיבוע מהיר של MTs לכל אורך העובר כולו. זו מושגת על ידי מתחיל את הקיבעון בטמפרטורות פיזיולוגית באמצעות מאגר זה מייצבת את MTs וגם מגביר את החדירות של העובר. הזמן קיבוע חשוב גם כמו והפחיתה את הקיבעון נכשל לעצור MTs תוך קיבוע יתר מטשטשים את epitopes, מתנגש עם הנוגדן מחייב. הזמן קיבוע המוצע של 3-4 h עובד עם עוברי כי הם של gastrulation מאמצע עד 24 שעות לאחר ההפריה. עוברי לקראת סוף ציר הזמן הצעיר להיות קבועה עבור קרוב ל-3 שעות בעוד עוברי מבוגרים ייתכן שתצטרך את כל 4 שעות. אפילו עם קיבוע נאות, MTs depolymerize עם הזמן כך חלוקתה, immunolabeling חייבת להתבצע תוך שבוע אחד של תיקון.
ברגע הרקמה הוא קבוע כראוי, יכול מתעוררות בעיות עם immunolabeling. הבעיה הנפוצה ביותר נתקל כבר מסכן חדירה דרך המרכז של הרקמה, במיוחד, אם מקטעים רבים מדי מודגרת בבאר אותו. הגדלת ריכוז נוגדן ואת הדגירה העיקרי את זמן נוגדנים ראשיים ומשניים, בשילוב עם חיזוק של דטרגנטים כדי לשפר את permeabilization של העוברים להפחיתם מרבית הבעיות immunolabeling. אם הנוגדן תיוג נכשל בשל בעיות immunolabeling או קיבעון, זה אפשרי לקבוע את הגורם על-ידי בדיקת נוגדן תיוג דפוס. קיבוע עניים לגרום תיוג אינטנסיבי ממברנה ומפוזר תיוג בציטופלסמה, ואילו קיבוע יתר וכתוצאה מכך חלש תיוג זה ישמר MT אדריכלות. חדירה המסכן של הנוגדן, עם זאת, תופיע אזורים במרכז של הרקמה ללא תיוג.
היכולת לנתח MT תמונות באופן משמעותי תלויה באיכות גבוהה הדמיה. כדי ללכוד MT אורך בתלת-ממד, הגודל המינימלי Z-צעד אפשרי עבור המטרה ו מפתח נומרי אמור לשמש. התמונות המוצגות כאן נלקחו בשבי עם 63 X שמן emersion המטרה עם 1.4 מפתח נומרי בהפקת הבאות: פיקסל = 240 nm, Z-צעד = 0.1 מיקרומטר, Z-מחסנית גודל = מיקרומטר 16.252. כי רוחב הר בודד 25 ננומטר, בערך פי 10 מתחת למגבלה של הרזולוציה של מיקרוסקופ אור, המדד הזה לא יכול להיות מדויק נמדד בעזרת טכניקה זו. במקום זאת, ניתן למדוד אורכים MT היחידה שווה או גדול מגודל הפיקסל המזעריות השגה כל בשלושה ממדים. קו ו/או מסגרת בממוצע ניתן לשפר את הגדרת אות MT. MT ניתוח צריך להיות שמורות עבור מקטעים באיכות גבוהה. בעוד רקמות עם קיבוע המסכנה לא יכולה להיות עם תמונה וניתח, overfixation מתון יכול להיות אוזנו על-ידי בקפידה הגדלת עוצמת לייזר ולהשיג כדי לזהות את האות חלש תוך שמירה על טווח דינמי רחב. חדירה נוגדן עני, ואילו לא היו אופטימאליים, ניתן לתקן על ידי הגבלת ייבוא תמונות לאזורים היטב עם תוויות, וכתוצאה מכך הדמיה מקטע דק יותר (5-10 מיקרומטר). רקע גבוה מ תיוג יכול לקבל פיצוי על-ידי כוונון הגדרות המסנן. עם זאת, אם כל אחד התאמות אלה נעשים, זה הכרחי לוודא כי הסף מסננים באופן קביל על כל מטוס של Z-המחסנית.
תמונה תלת-ממדית ניתוח תוכנה מאפשר הנסיין לכמת MT אורך, שטח, זווית, שפע, ומדדים אחרים במרחב תלת-ממדי של מקטעי רקמת קבוע. השיטה המתוארת כאן מספק הנחיות להשגת נתונים כאלה באמצעות תוכנה זמינים מסחרית. עם זאת, המודולים סינון עשוי להיות מותאם כדי הציבור תוכנה משופרת עם תוספים הרלוונטיים ו/או פקודות מאקרו, שזמינה לכל ניתוח. לפני ניתוח, בתמונות raw חייב להיות thresholded כדי להימנע כולל רקע ושאינם ספציפיים אותות כימות. לאחר ניתוח השלמת נתונים מועברים לגליונות אלקטרוניים עביד, מסקנות רבות יכול להיעשות מתוך ערכת הנתונים. אחד החישובים שנעשו כאן היה Glu-טובולין פסים פסים β-טובולין, או היחס של MTs יציבה ל MTs הכולל שבו 1 מייצג שלד התא כולו MT התייצבה ברועי. אם הנסיין שרוצה להשלים נתונים כמותיים שלהם, יצירת תבנית קובץ מלוטש תמונות מתויגות (TIFF) תמונה עם סרגלי קנה מידה הוא מאמץ עם תוכנת ניתוח תמונה תלת-ממדית.
Assay זו מאפשרת ניתוח תפקודי של חלבונים מעורבים MT הרכבה, בתוך vivo. אם immunolabeling מבוצעת על לסירוגין מקטעים טורי, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ללמוד MTs דינמית ויציבה של העובר אותו. בעתיד, שינויים כגון דטרגנטים מוגבר או שינו זוויות ההטבעה יאפשר השימוש בשיטות אלה עבור מבוגרים העוברים ומגוון רחב של שאלות אנטומיים.

Microtubules (MTs) הם פולימרים של α - ו β-טובולין. זה להרכיב לתוך protofilaments ליניארית, כמה מהם לשלב כדי ליצור צינור חלול1,2. MTs הם מבנים מקוטב, עם בצמיחה מהירה פלוס מסתיים, הגדלים לאט מינוס מסתיים שמעוגנים את centrosome או אחרים ארגון microtubule center (MTOC)3. דה נובו היווצרות MT הוא שיזם התגרענות בγ-טובולין. הטבעת מורכבת (γ-TURC), אשר מספק תבנית עבור הרכבה MT4. בתא נתון כלשהו, שתי האוכלוסיות של MTs ניתן להבחין את הפניה הזאת מעל בקצב שונה. MTs דינמי לחקור את הסביבה התאית שלהם על ידי מיתוג בין שלבי צמיחה הצטמקות בתהליך המכונה יציבות דינאמית5. בניגוד MTs דינמי, MTs יציב שאינו גדל, יש מחצית חיים ארוך יותר מאשר MTs דינמי6.

עשורים של מחקר ב ביולוגיה של התא יש מספק מערך מתוחכם של כלים ללמוד MT מבנה ותפקוד וכתוצאה גוף גדול של ידע על אלה אלמנטים cytoskeletal. למשל, MTs לשחק תפקיד המרכזי ובשימור תא קוטביות, אשר לא רק לייחס קוטביות מהותי שלהם, אלא גם כלפי ההתפלגות subcellular דיפרנציאלית של יציבה לעומת דינמי MTs7, 8. לעומת זאת, הרבה פחות מובנת על אדריכלות MT ותפקוד בסביבות מורכבות יותר תלת-ממדיים (3-D), כגון העובר חוליות, בחלקו בשל האתגר של הדמיה של שלד התא MT ברזולוציה גבוהה. למרות מגבלה זו, הדור האחרון של GFP-הבעת הטרנסגניים קווים שהמדבקה MTs או ארעי ביטוי מתויג fluorescently MT סמני גדל ההבנה שלנו של השינויים הדינמיים MTs עוברים וסלולר שלהם, תפקיד התפתחותי העובר דג זברה. הרשת MT יכול לדימות הטרנסגניים שורות אילו טובולין מתבצע ישירות פולימרים9 או טובולין עם תוויות מסומנות באופן עקיף באמצעות חלבונים הקשורים MT Doublecortin-כמו-קינאז (Dclk) או Ensconsin (EMTB)10, 11. קווים אחרים (וגם בונה) נוצרו לאפשר הערכה של קוטביות מהותי MT על-ידי תיוג במיוחד הר plus מסתיים או centrosome-מעוגן מינוס מסתיים11,12,13, 14. הכוח של כלים אלה טמון ביכולת בחקר דינמיקה MT ב live, פיתוח אורגניזמים. מחקרים גילו, לדוגמה, התפלגות מרחבית ודינאמי של MTs אוכלוסיות תאים מסוים, כיוון mitotic spindles ברקמות שעברו מורפוגנזה (אינדיקטור של המטוס של חלוקת התא), את הקוטביות של הפולימר MT ככל שהוא מתייחס לתהליכים כגון התארכות התא, הגירה, קצב הצמיחה MT נקבע על ידי שביט מהירות9,13,15. המגבלה של כלים אלה היא כי הם לא ברצון להפלות בין אוכלוסיות MT יציבה ודינמית.

ציור מן הספרות ביולוגיה התא עשיר, שיטות immunolabeling תמונה יציבה ודינמית MTs ב העובר דג זברה מתוארים כאן, אשר הם משלימים על השימוש הטרנסגניים קווים. השימוש הנרחב של כזה שיטות immunolabeling דג זברה יש כבר הקשו במידת מה על ידי הקושי בשימור תקינות MT במהלך ההליך קיבעון. פרוטוקול 1 מתאר שיטה ממוטב עבור סך immunolabeling, דינמי, וחצו MTs יציב ב סעיפים hindbrain המתפתח דג זברה. יתרה מזאת, שיטה פשוטה באמצעות מסחרית התוכנה הזמין מתואר לכמת אוכלוסיות אלה MT. MTs יציב נבדלים MTs דינמי המבוסס על מספר שינויים post-translational של α-טובולין, כגון acetylation ו- detyrosination, אשר מצטברים MTs יציבה לאורך זמן16,17. העובר דג זברה, acetylation חל על MTs ciliary, עצב אך לא על יציבה לאטמוספרה MTs18, הגבלת את התועלת של סמן זה לתת-ערכה של MTs מיוצב. לעומת זאת, detyrosination מופיע כך שיתרחשו MTs יציבה כל העובר דג זברה18. שינוי post-translational זה חושף את חומצה גלוטמית carboxy-מסוף של α-טובולין (detyrosinated טובולין)18 , ניתן להבחין באמצעות אנטי-Glu-טובולין19. למרות detyrosination מעדיפים מתרחש MTs יציב, ראיות מציין את השינוי post-translational הוא תוצאה של, יותר מאשר גורם לחוסר יציבות MT16. האוכלוסייה MT הדדיים, המורכב MTs דינמי, מזוהה באמצעות נוגדן, אנטי-Tyr-טובולין, זה במיוחד מזהה את הצורה tyrosinated של α-טובולין19. בעקבות immunolabeling עם סמנים אלה קונאפוקלית הדמיה, ניתן לבצע ניתוח כמותי של MTs (אורך, מספר ושפע היחסי) באזורים מוגדרים של הצינור העצבי המתפתח. שיטה יעילה מסופק כאן לביצוע ניתוח זה באמצעות תוכנת עיבוד תמונה תלת-ממדית. בשיטה זו ניתן להחיל על שאלות בנוגע מורפוגנזה לבין הממסד או ההבשלה של התא קוטביות20. אכן, לפתח של מערכים מקוטב של MTs יציב מלווה אירועים התפתחותיים רבים, כולל מורפוגנזה קולט אור21, epithelialization של תאים בפיתוח שפופרת פגמים בתעלה18 ו האקסון היווצרות8.

פרוטוקול 2 מתאר ויוו עיבוד של assay ביולוגיה התא כדי לנתח MTs במהלך שלהם הרכבה שלב (התגרענות/anchorage וצמיחה)22,23. MTs המתהווה nucleated-centrosome, לאחר מכן מעוגנת תוספות subdistal של אמא צנטריול23. מתוארת שיטה לנתח nascent לצמיחה מחודשת MT בעקבות depolymerization. פרוטוקול זה מספק פרטים על הטיפול nocodazole depolymerize MTs, ההליך שטיפה סמים ואת תקופת ההחלמה שלאחר הטיפול. MT מחדש את הצמיחה מנוטר על מרווח קבועs שטיפה פוסט מאת immunolabeling עם סמנים עבור MTs הכולל (אנטי-β-טובולין) לצד סמני centrosome (אנטי-γ-טובולין) ואת גרעין (4', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי)), על פי כללי בהליכים המתוארים תחת פרוטוקול 1. השלב depolymerization MT של פרוטוקול זה חיוני כפי שהיא מאפשרת הערכה של דה נובו MT צמיחה ולא סיומת של MTs שישנו. טכניקה זו ולכן היא נבדלת הליכים אחרים שפורסמו למדידת שיעורי צמיחה MT (בהעדר depolymerization) באמצעות סמן קצה פלוס כגון end מחייב חלבון 3 דבוקה חלבון פלואורסצנטי ירוק (EB3-GFP), כפי שמוצג טראן. et al., 201211. יתר על כן, וזמינותו זה שימושי במיוחד עבור ניתוח עוברי פגומים בהרכבה דה נובו MT, כגון המוטציות NEDD1 שדווחה בעבר שבו גיוס של γ-טובולין כדי centrosome פגום, וכתוצאה מכך לא שלם היווצרות שפופרת פגמים בתעלה, ליקויים עצביים24.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td></td><td></td><td>Used to treat petridishes.&amp;nbsp;&amp;nbsp; Prepare 1% agarose&lt;br/&gt; by heating a solution of&amp;nbsp; 1 gram agarose per 100 ml 1X embryo medium in a microwave&lt;br/&gt; until polymerized.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Kpipes</td><td>Sigma</td><td>P7643</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&amp;middot;2H2O</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>American Bioanalyticals</td><td>AB01424</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2670-500G</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Fisher</td><td>BP1605</td><td></td></tr><tr><td>Triton-x</td><td>American Bioanalyticals</td><td>AB02025</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fade mounting medium</td><td>Invitrogen</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-&amp;beta;-tubulin</td><td>Developmental studies Hybridoma Bank</td><td>E7</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Rabbit anti-&amp;gamma;-tubulin</td><td>Genetex</td><td>GTX113286</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Rabbit anti-&amp;alpha;-tubulin</td><td>Genetex</td><td>GTX108784</td><td>1/1000*</td></tr><tr><td>Rabbit anti-detyrosinated-tubulin</td><td>Millipore</td><td>AB3201</td><td>1/200-1/1000*&amp;nbsp; Titrate antibody with first use of new lot.</td></tr><tr><td>Rabbit anti-tyrosinated-tubulin</td><td>Millipore</td><td>ABT171</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Mouse anti-centrin</td><td>Millipore</td><td>04-1624</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Goat 488 anti-rabbit</td><td>Thermofisher</td><td>A11008</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Goat 594 anti-rabbit</td><td>Thermofisher</td><td>A11012</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Goat 594 anti-mouse</td><td>Thermofisher</td><td>A11005</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Goat 488 anti-mouse</td><td>Thermofisher</td><td>A11001</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Vibratome</td><td>1500</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>555227F</td><td></td></tr><tr><td>100 mm petri dish</td><td>Cell treat</td><td>229693</td><td></td></tr><tr><td>35 mm petri dish</td><td>Cell treat</td><td>229638</td><td></td></tr><tr><td>50 ml falcon tube</td><td>Fisher</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Woven nylon mesh 70 um</td><td>Amazon.com</td><td>B0043D1SZG&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Glass pipette</td><td>Fisher</td><td>NC-999363-9</td><td></td></tr><tr><td>Aquarium sealant</td><td>Amazon.com, by MarineLand</td><td>Silicone Sealer 1 oz (Tube)&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ring stand</td><td>Fisher</td><td>14-675BO</td><td></td></tr><tr><td>Microbore PTFE Tubing, 0.022&quot;ID</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-06417-21</td><td></td></tr><tr><td>Modeling clay</td><td>Amazon.com</td><td>Sargent Art 22-4000</td><td>Any wax or oil based non-toxic modeling clay will suffice</td></tr><tr><td>Clamp</td><td>Fisher</td><td>02-215-466</td><td></td></tr><tr><td>60ml syringe</td><td>Fisher</td><td>14-820-11</td><td></td></tr><tr><td>Embryo medium (E3)</td><td></td><td></td><td>34.8 g NaCl&lt;br/&gt; 1.6 g KCl&lt;br/&gt; 5.8 g CaCl2&amp;middot;2H2O&lt;br/&gt; 9.78 g MgCl2&amp;middot;6H2O&lt;br/&gt; &lt;br/&gt; To prepare a 60X stock, dissolve the ingredients in H2O, to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 with NaOH. Autoclave. To prepare 1X medium, dilute 16.5 mL of the 60X stock to 1 L.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Blocking Solution</td><td></td><td></td><td>50 ml TBS-NP-40&lt;br/&gt; 2.5 ml normal goat serum&lt;br/&gt; 1 g BSA&lt;br/&gt; 625 &amp;micro;l Triton-X</td></tr><tr><td>TBS-NP-40 (pH 7.6)</td><td></td><td></td><td>155 mM NaCl&lt;br/&gt; 10 mM Tris HCl&lt;br/&gt; 0.1% NP-40</td></tr><tr><td>2x MAB (pH6.4)</td><td></td><td></td><td>160 mM KPIPES&lt;br/&gt; 10 mM EGTA&lt;br/&gt; 2 mM MgCl2</td></tr><tr><td>Commercial 3-D Image processing Software</td><td>PerkinElmer</td><td>Volocity (V 6.2)</td><td></td></tr><tr><td>Dry block heater&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>12621-108</td><td>Used as a hot plate to melt agarose in Protocol 1.</td></tr><tr><td>Dissecting Microscope</td><td>Leica</td><td>MZ12</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>Flat embedding mold</td><td>emsdiasum.com</td><td>BEEM 70904-01</td><td></td></tr><tr><td>Public domain image processing software</td><td>NIH</td><td>ImageJ (V 1.5)</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">* Success varies by lot number</td></tr></tbody></table>

use of immunolabeling to analyze stable, dynamic, and nascent microtubules in the zebrafish embryo

Microtubules (MTs) הם דינמיים ושבירה במבנים מאתגר התמונה ויוו, בפרט העוברים בעלי. החוליות. שיטות Immunolabeling מתוארים כאן ולנתח אוכלוסיות נפרדות של MTs בצינור העצבי המתפתח של העובר דג זברה. כאשר המוקד הוא על רקמה עצבית, מתודולוגיה זו ישימה בהרחבה לרקמות אחרות. ההליכים ממוטבים מוקדם עד אמצע-somitogenesis-שלב עוברי (1 somite כדי 12 somites), אולם הם יכולים להיות מותאמים למגוון שלבים אחרים עם התאמות קלות יחסית. הפרוטוקול הראשון מספק שיטה להעריך את התפוצה המרחבית של MTs יציבה ודינמית ולבצע ניתוח כמותי של אוכלוסיות אלה עם תוכנות עיבוד תמונה. גישה זו משלימה הכלים הקיימים כדי התמונה microtubule dynamics והפצה בזמן אמת, באמצעות קווים הטרנסגניים או בביטוי ארעית של בונה מתויגות. ואכן, כלים כאלה הם מאוד שימושי, אולם הם אינם ברצון מבחינים בין MTs דינמית ויציבה. היכולת תמונה ולנתח אוכלוסיות נפרדות microtubule אלה יש השלכות חשובות על מנגנונים ההבנה שבבסיס תא קיטוב, מורפוגנזה. פרוטוקול השני מתאר טכניקה כדי לנתח nascent MTs במיוחד. זו מושגת על-ידי לכידתו של מאפייני הצמיחה דה נובו MTs לאורך זמן, בעקבות microtubule depolymerization עם nocodazole הסמים ותקופת ההתאוששות לאחר שטיפה סמים. טכניקה זו לא הוחל עדיין במחקר של MTs בדג זברה עוברי, אבל וזמינותו יקר על חקירת הפונקציה ויוו של חלבונים מעורבים microtubule הרכבה.

ניתוח של MTs יציבה ודינמית באמצעות immunolabeling פרוטוקול 1, ההתפלגות של MT תת האוכלוסיות במהלך המוקדמות (קיל עצבית) ו- (מוט עצבית) מאוחר, שלבי הפיתוח שפופרת פגמים בתעלה מתגלה, באמצעות Glu-טובולין טובולין Tyr כסמני בשביל יציבה ודינמית MTs, בהתאמה. MTs דינמי שולטים ב- hindbrain בשלב קיל עצבית (4-5 somites) (איור 2א-ד). כפי בשדרית מתפתח המטה עצבית (11-12 somites), שלב של epithelialization משופר, MTs איכותית פחות הם immunoreactive עם הנוגדן אנטי-Tyr-טובולין (איור 2E-H), ובמיוחד המוט הגחון. לעומת זאת, Glu-טובולין פזורים punctate ברחבי בשדרית עצבית (איור 3י-ם), אך הוא מועשר במוט עצבית הגחון לאורך ספינלי MT (איור 3E-H). ראשי חץ הצבע על חבילות MT ספציפי או מבנים איפה תיוג הוא גדל.
למרות נוגדנים anti-Glu-טובולין והן אנטי-Tyr-טובולין היו מיוצר מאותו המין המארח (מניעת תיוג ניסוי כפול), תוצאות אלה מציינים כי סמנים MT יציבה ודינמית לעיתים רחוקות חופפים זה לזה hindbrain דג זברה. ראשית, מוט עצבית הגחון יש יותר יציבה (איור 3F) מאשר דינמי MTs (איור 2F). המגמה הפוך במוט העצבי הגבי, בקנה אחד עם מודל של דג זברה neurulation שבו הרקמה הגבי נשאר דינמי עד הצינור העצבי נוצר20. שנית, בעוד mitotic הצירים מסומנות באופן מלא עם הנוגדן טיר-טובולין בשדרית עצבית (איור 2D, ראשי חץ), רק בבסיס בכישור, חופפת centrosome, נקראת עם הסמן יציבות (Glu-טובולין איור 3 D, ראשי חץ). Immunofluorescence β-טובולין, המשותף בשני מבחני, מודיע הנסיין של ההתפלגות של MTs כל ומספק בסיס לביטול שאינם ספציפיים תיוג.
מדידת אובייקטים באמצעות תוכנת ניתוח תלת-ממדי התמונה יוצרת כמות גדולה של נתונים ניתן לארגן לתוך טבלה נוחה (טבלה 2). כדי להפוך את אורך, count ומדידות שטח, אנו משתמשים רק קבוצת משנה של הנתונים הזמינים לנתח. אחד המרכיבים של הנתונים אותם אנו לא מנתחים נוסף הוא המספר של חפצים המזוהים. מספר זה משמש פקד איכות פנימית, כפי שהמספר לא אמור להשתנות באופן נרחב בין כמו מקטעים, היחס של גרעינים ל MTs צריך להישאר דומה במצב בטיפול אחד. חריג חשוד טעות הוא מחוון או הניתוח צריך אפשרות להפעיל מחדש עם מסננים מנוכי עונתיות או התמונה גרוע מדי הנקרא לנתח. לפיכך, כל התמונות חריג חשוד טעות צריך להיות reanalyzed עם ההגדרות המכווננות. חריג חשוד טעות בסעיף צריך להיבדק עבור סימני תיוג עניים או נזק פיזי זה עשוי להתבטא ספירות אובייקט חריג. לאחר סיום הניתוח, איכות מבוקר, מידע שימושי ניתן לשחזר מן הנתונים הגולמיים כגון ממוצע אורך MTs מוחלט ויציב MTs או היחס של MTs יציבה ל MTs הכולל (טבלה 3). בנוסף מדידות אלה, רבים מדדים אחרים ניתן להשיג באמצעות ניתוח תמונה תלת-ממדית תוכנה זו ניתן להשתמש כדי לצייר מסקנות על MTs או ביחס שלהם מבנים אחרים התאית (גרעין, centrosome, וכו ').
דה נובו שיטת ההרכבה MT הטיפול nocodazole depolymerizes MTs וכתוצאה מכך תיוג ' מאטום לשקוף ' (איור 4א, 4 D, ו- 4g). כמו MTs ולצמיחה מחודשת, הם נמתחים מסימוני centrosome (איור 4B, 4E, ו- 4 שעות), לעומת זאת, זה ייתכן שלא יהיה ברור במטוס יחיד בשל שלהם מסלולים שאינם מישורי (איור 4C, 4F, ו- 4I). בכל זאת, כמה תוכנות ניתוח תמונה מסוגלים מדידת אורכי בתלת-ממד, המאפשר הערכה של MT צמיחה לאחר הכשלון nocodazole (טבלה 4). הערה חשוב זה ניתן להשיג את ערכת הנתונים בטבלה 4 הוא כי האורך הממוצע של MTs מופיע כדי להגדיל לאורך זמן לאחר הכשלון nocodazole בכל האזורים של הצינור העצבי מנותח. כפי שהוזכר לעיל, סוגים אחרים של מדדים המתקבל תמונה תלת-ממדית ניתוח תוכנה יכול לספק הסלולר ההקשר לפענוח המידע MT (לדוגמה, היחס בין MTs לכל גרעין).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55792/55792fig1.jpg"> 
איור 1 : איור של מכשירי שטיפה דה נובו Assay הרכבה MT. שיבוץ היא תקריב של זרימה דרך המכשיר עשוי רשת מודבקים לתוך שפופרת צנטרפוגה 50-mL חתך לאורכו. רשת השינוי compartmentalizes זרימה דרך המכשיר כך מספר קבוצות הניסוי ניתן לעבד בו זמנית. במהלך השימוש, העובר בינוני מתווסף המזרק, זורם באיטיות דרך הצנרת כדי למלא זרימה דרך המכשיר, מתן שטיפה קבועה כל הקבוצות ניסיוני. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55792/55792fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55792/55792fig2.jpg"> 
איור 2: שימוש immunolabeling כדי תמונה דינמית MTs. Dechorionated עוברי תוקנו בשלבים המתאימים (4-5 ב- A-D ו- 12-13 somites ב E-H), אשר הייתה מצויה לרוחבה למחלקה דרך hindbrain, immunolabeled עם נוגדנים נגד β-טובולין (ירוק ב A ו- E) כדי לסמן כל MTs, tyrosinated α-טובולין (אדום ב B ו F) כדי לחשוף את אוכלוסיות MT דינמי. MTs דינמי מאוד ניתן לראות את התמונות הממוזגות (C, G) ו שלהם הגדלה גבוהה יותר (ד, ח) כאזורי איפה התווית הצהובה גלוי (חץ ברה , H). גודל ברים = 25 מיקרומטר (A-C ו- E-G) ו- 10 מיקרומטר (D ו- H). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55792/55792fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55792/55792fig3.jpg"> 
Figure 3: השימוש immunolabeling כדי תמונה יציבה MTs. Dechorionated העוברים היו קבועים, למחלקה דרך hindbrain, immunolabeled בשלבים המתאימים (somites 4-5 ב- A -D ו- 12-13 somites ב E-H). MTs יציב מסומנות עם נוגדנים נגד הצורה detyrosinated של α-טובולין (Glu-טובולין) (אדום ב B ו F) בעוד MTs סה כ היו דמיינו של נוגדן β כללי-טובולין (ירוק ב A ו- E). סימנים אדומים וצהובים התמונות הממוזגות (C, G) ו שלהם הגדלה גבוהה יותר (ד, ח) מייצגים אזורים של הר גבוהה יציבות (חץ ברה, H). גודל ברים = 25 מיקרומטר (A-C ו- E-G) ו- 10 מיקרומטר (D ו- H). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55792/55792fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55792/55792fig4.jpg"> 
איור 4: השימוש immunolabeling כדי התמונה המתהווה MTs. Dechorionated עוברי קבוע ב 4-5 somites, אשר הייתה מצויה לרוחבה למחלקה דרך hindbrain. קטעים היו immunolabeled עם β-טובולין (D, E, ו- F) כדי לסמן גדל MTs, γ-טובולין(A, Bו- C) כדי לסמן את נקודת התגרענות/centrosome. באזור הגבי של הצינור העצבי הוא לכוד (A, D; B, E C -f) מוצגים בהגדלה גבוהה יותר (G, H, אני, בהתאמה) כדי לחשוף את הגרעינים (דאפי, כחול), centrioles (וγ-טובולין, אדום) וסיכום MTs (β-טובולין, ירוק). ראשי חץ לבן: colocalization של MTs, centrioles; ראשי חץ צהוב: צנטריול השני של התא הוא גלוי. גודל ברים = 25 מיקרומטר (A-F) ו- 10 מיקרומטר (G-אני). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55792/55792fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/55792/55792table1.jpg"> 
טבלה 1: הגדרות ברירת המחדל עבור סינון אובייקטים בתוכנת ניתוח תמונה תלת-ממדית.
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/55792/55792table2.jpg"> 
בטבלה 2: נציג ערכת נתונים גולמיים שהושג באמצעות ניתוח תמונות תלת-ממדי תוכנה כדי לנתח יציבה MTs. כל עמודה מייצגת מדידות של מקטע יחיד. מינימום: המידה הקטנה ביותר; מקס: מדידה הגדול; SD: סטיית תקן; SE: שגיאה סטנדרטית.
<img alt="Table 3" src="/files/ftp_upload/55792/55792table3.jpg"> 
טבלה 3: דוגמאות של נתונים (datasets) אשר ניתן להשיג תלת-ממדי התמונה ניתוח תוכנה לכמת MTs יציב. בחר מדידות של אורך כלומר סה כ (β-טובולין) ויציבה (Glu-טובולין) MTs מחושב על ידי לוקח הממוצע של אורך השלד רעה עבור התווית הרלוונטיות של כל הדגימות (עיין בטבלה 2) ואת היחס של האורווה לסך MTs ( Glu-tubulin מפספס לכל β-טובולין פסים) מחושב על ידי לקיחת הרוזן β-טובולין הממוצע מחולק על ידי הרוזן Glu-טובולין הממוצע.
<img alt="Table 4" src="/files/ftp_upload/55792/55792table4.jpg"> 
בטבלה 4: דוגמאות של נתונים (datasets) אשר ניתן להשיג תמונה תלת-ממדית ניתוח תוכנה כדי לנתח דה נובו MT הרכבה. תוצאות נציג מכלול דה נובו MT הניסוי, השוואת נתונים (datasets) השיג עבור שלוש נקודות זמן התאוששות (1, 5, 10 דקות) לאחר כשלון nocodazole. עבור כל נקודת זמן, מדידות השיג עבור ספירת גרעיני, centrioles (puncta וγ-טובולין), מספר MTs הכולל (β-טובולין פסים), מוצגים עבור נבחרת מחוזות הדמיה ניתח (חתך של הצינור העצבי המתפתח).

Watch this Scientific Journal Video about Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo at JoVE.com

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Immunolabeling שיטות כדי לנתח אוכלוסיות נפרדות של microtubules במוח דג זברה המתפתח מתוארים כאן, אשר חלים באופן נרחב לרקמות אחרות. הפרוטוקול הראשון מתאר שיטה ממוטב עבור immunolabeling microtubules יציבה ודינמית. פרוטוקול השני מספק שיטה כדי התמונה ולכמת nascent microtubules במיוחד.

השימוש Immunolabeling כדי לנתח Microtubules יציב, דינמי, המתהווה של העובר דג זברה

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

use-immunolabeling-to-analyze-stable-dynamic-nascent-microtubules

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.2K Views.  University of Maryland, Baltimore County. Immunolabeling שיטות כדי לנתח אוכלוסיות נפרדות של microtubules במוח דג זברה המתפתח מתוארים כאן, אשר חלים באופן נרחב לרקמות אחרות. הפרוטוקול הראשון מתאר שיטה ממוטב עבור immunolabeling microtubules יציבה ודינמית. פרוטוקול השני מספק שיטה כדי התמונה ולכמת nascent microtubules במיוחד.

Video: Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish embryos, injection of plasmid DNA results in mosaic expression, allowing for the visualization of single cells or small clusters of cells 1 . We describe how injection of plasmid DNA encoding membrane-targeted Green Fluorescent Protein (mGFP) under the control of a ubiquitous promoter can be used for imaging cells undergoing neurulation. Central to this protocol is the methodology for imaging labeled cells at high resolution in sections and also in real time. This protocol entails the injection of mGFP DNA into young zebrafish embryos. Embryos are then processed for vibratome sectioning, antibody labeling and imaging with a confocal microscope. Alternatively, live embryos expressing mGFP can be imaged using time-lapse confocal microscopy. We have previously used this straightforward approach to analyze the cellular behaviors that drive neural tube formation in the hindbrain region of zebrafish embryos 2. The fixed preparations allowed for unprecedented visualization of cell shapes and organization in the neural tube while live imaging complemented this approach enabling a better understanding of the cellular dynamics that take place during neurulation.

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early embryo is the ability to image cells at high resolution. We describe here a technique for labeling single cells or small clusters of cells in whole zebrafish embryos with membrane-targeted Green Fluorescent Protein.

סימון תאים הדמיה למוח האחורי של דג הזברה

Key to understanding the morphogenetic processes that shape the early vertebrate embryo is the ability to image cells at high resolution. In zebrafish ...

Neuroscience

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

ניתוח<em&gt; In vivo</em&gt; נדידת תאים באמצעות השתלות תא והדמיה זמן לשגות עוברי דג הזברה

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

התבוננות mitotic חטיבת Dynamics בעובר דג הזברה לחיות

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Immunostaining Phospho-epitopes in Ciliated Organs of Whole Mount Zebrafish Embryos

The rapid proliferation of cells, the tissue-specific expression of genes and the emergence of signaling networks characterize early embryonic development of all vertebrates. The kinetics and location of signals - even within single cells - in the developing embryo complements the identification of important developmental genes. Immunostaining techniques are described that have been shown to define the kinetics of intracellular and whole animal signals in structures as small as primary cilia. The techniques for fixing, imaging and processing images using a laser-scanning confocal compound microscope can be completed in as few as 36 hr.
Zebrafish (Danio rerio) is a desirable organism for investigators who seek to conduct studies in a vertebrate species that is affordable and relevant to human disease. Genetic knockouts or knockdowns must be confirmed by the loss of the actual protein product. Such confirmation of protein loss can be achieved using the techniques described here. Clues into signaling pathways can also be deciphered by using antibodies that are reactive with proteins that have been post-translationally modified by phosphorylation. Preserving and optimizing the phosphorylated state of an epitope is therefore critical to this determination and is accomplished by this protocol.
This study describes techniques to fix embryos during the first 72 hr of development and co-localize a variety of relevant epitopes with cilia in the Kupffer&#39;s Vesicle (KV), the kidney and the inner ear. These techniques are straightforward, do not require dissection and can be completed in a relatively short period of time. Projecting confocal image stacks into a single image is a useful means of presenting these data.

Techniques are described to immunostain phospho-epitopes in whole zebrafish embryos and then conduct two-color fluorescent confocal localization in cellular structures as small as primary cilia. The techniques for fixing and imaging can define the location and kinetics of the appearance or activation of specific proteins.

Phospho-אפיטופים Immunostaining באיברים ריסי של עוברי דג הזברה שלמים הר

The rapid proliferation of cells, the tissue-specific expression of genes and the emergence of signaling networks characterize early embryonic development ...

Chemistry

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and optical transparency. In particular, the zebrafish embryo has become an important organism to study vertebrate kidney organogenesis as well as multiciliated cell (MCC) development. To visualize MCCs in the embryonic zebrafish kidney, we have developed a combined protocol of whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) and whole mount immunofluorescence (IF) that enables high resolution imaging. This manuscript describes our technique for co-localizing RNA transcripts and protein as a tool to better understand the regulation of developmental programs through the expression of various lineage factors.

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Cilia development is vital to proper organogenesis. This protocol describes an optimized method to label and visualize ciliated cells of the zebrafish.

להמחיש Multiciliated בתאים דג זברה באמצעות פרוטוקול משולב של פלורסנט הר שלמה בחיי עיר הכלאה, Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily accessible at all stages of development. Moreover, their optical clarity allows high resolution imaging of cell and molecular dynamics in the natural environment of the intact embryo. We are using a live imaging approach to analyze cell behaviors during neural crest cell migration and the outgrowth and guidance of neuronal axons.
Live imaging is particularly useful for understanding mechanisms that regulate cell motility processes. To visualize details of cell motility, such as protrusive activity and molecular dynamics, it is advantageous to label individual cells. In zebrafish, plasmid DNA injection yields a transient mosaic expression pattern and offers distinct benefits over other cell labeling methods. For example, transgenic lines often label entire cell populations and thus may obscure visualization of the fine protrusions (or changes in molecular distribution) in a single cell. In addition, injection of DNA at the one-cell stage is less invasive and more precise than dye injections at later stages.
Here we describe a method for labeling individual developing neurons or neural crest cells and imaging their behavior in vivo. We inject plasmid DNA into 1-cell stage embryos, which results in mosaic transgene expression. The vectors contain cell-specific promoters that drive expression of a gene of interest in a subset of sensory neurons or neural crest cells. We provide examples of cells labeled with membrane targeted GFP or with a biosensor probe that allows visualization of F-actin in living cells1.
Erica Andersen, Namrata Asuri, and Matthew Clay contributed equally to this work.

This protocol describes imaging of individual neurons or neural crest cells in living zebrafish embryos. This method is used to examine cellular behaviors and actin localization using fluorescence confocal time-lapse microscopy.

הדמיה חיה של תנועתיות התא ואת cytoskeleton אקטין של נוירונים בודדים לבין תאים קרסט עצבית בעוברים דג הזברה

The zebrafish is an ideal model for imaging cell behaviors during development in vivo. Zebrafish embryos are externally fertilized and thus easily ...

Biology

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

כל הר אימונוהיסטוכימיה בזיבפיש עוברים וזחלים

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

<meta charset="utf8"></head><body>פרוטוקול מיקרוסקופיה מרובת תצוגות מעודנת עבור עוברים של דגי זברה

Light Sheet Microscopy Imaging and Mounting Strategies for Early Zebrafish Embryos

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In particular, a multiview system, which allows sample rotation, enables imaging of entire embryos from different angles. However, in most imaging sessions with a multiview system, sample mounting is a troublesome process as samples are usually prepared in a polymer tube. To aid in this process, this protocol describes basic mounting strategies for imaging early zebrafish development between the 70% epiboly and early somite stages. Specifically, the study provides statistics on the various positions the embryos default to at the 70% epiboly and bud stages within the chorion. Furthermore, it discusses the optimum number of angles and the interval between angles required for imaging whole zebrafish embryos at the early stages of development so that cellular-scale information can be extracted by fusing the different views. Finally, since the embryo covers the entire field of view of the camera, which is required to obtain a cellular-scale resolution, this protocol details the process of using bead information from above or below the embryo for the registration of the different views.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר Spotlight: אסטרטגיות להרכבת עוברים של דגי זברה עבור מיקרוסקופ גיליון אור מרובה תצוגות ברזולוציה גבוהה — טכניקות להדמיה ושחזור תמונה

A sample preparation strategy for imaging early zebrafish embryos within an intact chorion using a light-sheet microscope is described. It analyzes the different orientations that embryos acquire within the chorion at the 70% epiboly and bud stages and details imaging strategies for obtaining cellular-scale resolution throughout the embryo using the light-sheet system.

אסטרטגיות הדמיה והרכבה של מיקרוסקופ גיליון אור עבור עוברים מוקדמים של דגי זברה

Light sheet microscopy has become the methodology of choice for live imaging of zebrafish embryos over long time scales with minimal phototoxicity. In ...

השימוש Immunolabeling כדי לנתח Microtubules יציב, דינמי, המתהווה של העובר דג זברה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

סימון תאים הדמיה למוח האחורי של דג הזברה

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

ניתוח

התבוננות mitotic חטיבת Dynamics בעובר דג הזברה לחיות

Phospho-אפיטופים Immunostaining באיברים ריסי של עוברי דג הזברה שלמים הר

להמחיש Multiciliated בתאים דג זברה באמצעות פרוטוקול משולב של פלורסנט הר שלמה בחיי עיר הכלאה, Immunofluorescence

הדמיה חיה של תנועתיות התא ואת cytoskeleton אקטין של נוירונים בודדים לבין תאים קרסט עצבית בעוברים דג הזברה

כל הר אימונוהיסטוכימיה בזיבפיש עוברים וזחלים

אסטרטגיות הדמיה והרכבה של מיקרוסקופ גיליון אור עבור עוברים מוקדמים של דגי זברה

אסטרטגיות הדמיה והרכבה של מיקרוסקופ גיליון אור עבור עוברים מוקדמים של דגי זברה