Name: brain membrane fractionation: an ex vivo approach to assess subsynaptic protein localization
Uploaded: 2017-05-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי Ministerio de EconomÃ ¢ â, ¬ â &quot;¢ â, ¬ â&quot; ¢ DE / Salud קרלוס השלישי (SAF2014-55700-P, PCIN-2013-019-C03-03 ו- PIE14 / 00034), המכון לאקדמיה של אוניברסיטת אקרה ), ובדוקטורט ו - FC שייכים לקבוצת המחקר &quot;נוירופרמקולוגיה וכאב&quot; (Generalitat de Catalunya, 2014 SGR 1251). . היצירה נתמכה גם על ידי &quot;תוכנית הפיסכיאדאריות ביקור בקרנות מיוחדות&quot; מ - CAPES (ברזיל) ל FC

כל ההליכים הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת ברצלונה לשימוש בבעלי חיים וטיפול בבעלי חיים (CEEA), בהתאם לקווים המנחים המתוארים במדריך לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה 11 ובעקבות הקהילה האירופית, חוק 86/609 / CCE, FELASA ו- ARRIVE. לפיכך, עכברים שוכנים בכלובים סטנדרטיים, עם גישה למודעה libitum למזון ומים, והם נשמרים בתנאים סטנדרטיים מבוקרים (12 שעות כהה / אור מחזור החל בשעה 7:30 בבוקר, 22 ° C טמפרטורה, ו 66% לחות). 1. קבלת עכבר Synaptosomes המוח באמצעות מעבר Surorose רציפה הערה: שיטה זו דווחה בעבר 10 . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ בידוד טרי (IB), pH 7.4; 2 סוכרוז M; 1 סוכרוז M / 0.1 מ&quot;מ CaCl 2 ; ו 0.1 מ&quot;מ CaCl 2 (ראה טבלה 1 ). צינת הפתרונות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Saלהקריב חמישה עכברים על ידי נקע צוואר הרחם. לערוף במהירות להסיר את המוח של כל חיה. לנתח את האזור המוח של עניין (כלומר, את ההיפוקמפוס, 0.25-0.35 גרם של רקמות טריות) ומניחים אותו 5 מ&quot;ל פוטר- Elvehjem צינור זכוכית על קרח עם 1 מ&quot;ל של IB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize הרקמה באמצעות stogener homogenizing (10 משיכות ב 700-900 סיבובים לדקה), מועדף באמבט קרח כדי למנוע התחממות המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הרקמה homogenized (1 מ&quot;ל) לתוך צינור 15 מ&quot;ל המכיל 6 מ&quot;ל של סוכרוז M 2 ו 2.5 מ&quot;ל של 0.1 מ&quot;מ CaCl 2 ב 4 מעלות צלזיוס. מערבבים לאט על ידי הפניית הצינור. הערה: תוספת סידן חיונית לשמירה על יחסי הגומלין בין האברונים ובכך לשמר את המבנה של &quot;הצפיפויות&quot; השונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הפתרון בצינור 12 צנטריפוגות מ&quot;ל ולאט לאט להוסיף 2.5 מ&quot;ל של 1 סוכרוז M / 0.1 מ&quot;מ CaCl 2 על גבי כל צינור כדי ליצור את שיפוע סוכרוז. הערה: תווית את המיקום oF ממשק שיפוע על צינור צנטריפוגה באמצעות סמן קבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול ולאזן את צינורות צנטריפוגה עם פתרון IB בתוך תומכת הפלדה המקביל שלהם עם העפעפיים הסגירה שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות במשך 3 שעות ב 100,000 x גרם ו 4 ° C באמצעות צנטריפוגה דלי נדנדה נדנדה. מלא לחלוטין את הרוטור עם כל תומך פלדה (אפילו ריק, אם נדרש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את השכבה העליונה המכילה myelin. עם פיפטה פסטר, לאסוף את הטבעת הלבנה בין 1.25-M ו 1-M סוכרוז interfase המקביל לחלק synaptosome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את synaptosomes עם 9X נפח שלהם באמצעות IB בצינור צנטריפוגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול ולאזן את צינורות צנטריפוגה עם פתרון IB בתוך תומכת הפלדה המקביל שלהם עם העפעפיים הסגירה שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות במשך 30 דקות ב 15,000 x גרם ו 4 ° C באמצעות צנטריפוגה דלי נדנדה נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את supernatant ו resuspend thE גלולה עם 1.1 מ&quot;ל של פתרון IB. איסוף 100 μL של פתרון זה צנטריפוגלי צנטריפוגה 5 דקות ב 11,000 x ו 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה synaptosomal 5% נתרן dodecyl סולפט (SDS) ולאחסן את המדגם ב -20 מעלות צלזיוס. הערה: מדגם זה יתאים את החלק השלם synaptosome לניתוח נוסף כתם המערבי. את החלק הנותר synaptosomal (~ 1 מ&quot;ל) יכול להיות מוקפא ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש או מעובד עבור שבירה subsynaptic הבאים. סינפוזומים או סינפסות מטוהרים מייצגים בין 1 ל 2% מכלל נפח ההיפוקמפוס 12 . </li></ol> 2. בידוד, post- ו extrasynaptic- בידוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2x חיץ טרי solubilization, pH 6.0; 1x חיץ solubilization, pH 6.0; חיץ solubilization, pH 8.0; ו 0.1 מ&quot;מ CaCl 2 (ראה טבלה 1 ). צינת הפתרונות על הקרח. הערה: ה- pH של פתרונות אלה צריך להיות מדויקY מותאם כדי להשיג פיצול subsynaptic טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לדלל את החלק 1 מ&quot;ל resuspended חלק סינפטוזומלי (ראה שלב 1.12) עם 5 מ&quot;ל של 0.1 מ&quot;מ CaCl 2 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את אותו נפח (5 מ&quot;ל) של חיץ קר 2x קר solubilization, pH 6.0, ו דגירה של 50 דקות על הקרח תחת תסיסה גבוהה בכוס על הקרח. הערה: בעוד 1% של Triton X-100 ב pH 6.0 solubilizes כל חלבונים ממברנה פלזמה, הוא משמר חלבונים בתוך אנשי קשר או צמתים סינפטיים ( כלומר, מבנים preysynaptic מראש) 4 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הפתרון בצינור צנטריפוגות. לשקול ולאזן את צינורות עם כרכים שווה של 0.1 מ&quot;מ CaCl 2 ו 2x פתרון חיץ solubilization, pH 6.0, בתוך תומך פלדה המתאימים שלהם עם העפעפיים הסגירה שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות במשך 30 דקות ב 40,000 x גרם ו 4 ° C באמצעות צנטריפוגה דלי נדנדה נדנדה. התוצאה supernatant מייצג את החלק extrasynaptic,ואת גלולה תואמת את צמתים סינפטיים ( כלומר, שברים מראש ו postsynaptic). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכז את supernatant המכיל את החלק extrasynaptic ל 200 נפח μL הסופי באמצעות צינור 15 מ&quot;ל 10K מסנן צנטריפוגה ב XG 4,000 ו 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזרז את החלק הנוסף extrasynaptic מרוכזת (200 μL) עם 5 כרכים (1 מ&quot;ל) של אצטון מראש (-20 מעלות צלזיוס) לילה ב -20 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, צנטריפוגות שבר extrasynaptic במשך 30 דקות ב 18,000 x ו -15 ° C. לאחר צנטריפוגה, להשמיד את אצטון supernatant ויבש את גלולה כדי להסיר כל עקבות של אצטון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, resuspend גלולה המכילה את החלבונים extrasynaptic עם μL 200 של 5% SDS. Sonicate גלולה, אם נדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבלי לשבש את זה, בזהירות לשטוף את גלולה המכילה את שברים מראש ו postsynaptic עם 2 מ&quot;ל של חיץ solubilization 1x, pH 6.0. מחק את המאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspendגלולה עם 10 מ&quot;ל של חיץ solubilization 1x, pH 8.0, באמצעות פיפטה זכוכית פסטר. הערה: בעוד 1% של Triton X-100 ב pH 8.0 solubilizes ההתמחות presynaptic, זה משמר את הצפיפות postsynaptic מסיס 4 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה ההשעיה במשך 50 דקות על הקרח תחת תסיסה גבוהה בכוס על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הפתרון בצינור צנטריפוגות. לשקול ולאזן את צינורות עם תמיסה 1x solubilization חיץ, pH 8.0, בתוך תומך פלדה המתאימים שלהם עם העפעפיים הסגירה שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות במשך 30 דקות ב 40,000 x גרם ו 4 ° C באמצעות צנטריפוגה דלי נדנדה נדנדה; וכתוצאה מכך supernatant מתאים את שבר presynaptic ואת גלולה לחלק postsynaptic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהליך supernatant המכיל את שבר presynaptic, כמתואר צעדים 2.6-2.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את גלולה המכילה חלק postsynaptic עם μL 200 של 5% SDS. Sonicate גלולה, אניF נדרש. </li></ol> 3. לנתח את הדגימות על ידי immunoblot כדי לאמת את החלוקה הממברנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את כמות החלבון בכל חלק ( כלומר, השברים הכולל, תוספת, לפני ואחרי סינפטית) באמצעות assay חומצה bicinchoninic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 20 מיקרוגרם של חלבון מכל חלק לדלל אותו לנפח הסופי של μL 50 ב SDS-polyacrylamide ג&#39;ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) חיץ מדגם. מרתיחים במשך 5 דקות ב 100 מעלות צלסיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפריד את החלבונים על ידי SDS-PAGE אלקטרופורזה 10%, עם ג&#39;ל ריכוז 4% תחת צמצום התנאים. Electrophorese במתח קבוע של 80 V עד הצבע נכנס ג&#39;ל התחתון ולאחר מכן להגביר את המתח 120 V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את החלבונים לקרום PVDF לחסום עם פתרון חסימת IB למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר תחת רעידות מתמשך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של קרום לילה ב 4 מעלות צלזיוס עם הנוגדן העיקרי המצוין ( כלומר, נגד SNAP-25,אנטי PSD-95, anti-synaptophysin, או אנטי GPR37) מדולל פתרון חסימת IB תחת רעידות מתמשכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הממברנה שלוש פעמים (10 דקות כל אחד) עם פתרון כביסה IB לחסל נוגדן ראשוני מאוגד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם הנוגדן המשני המצוין במשך 90 דקות בתנאים כהים בטמפרטורת החדר תחת רעד מתמשך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הממברנה שלוש פעמים (10 דקות כל אחד) עם פתרון כביסה IB לחסל נוגדנים משני לא מאוגד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הממברנה עם המצע chemiluminescent (להכין את התערובת בתנאים חשוכים בעקבות 1: 1 פרופורציה של פתרון A ו- B המסופק על ידי היצרן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הממברנה במכשיר זיהוי chemiluminescent. </li></ol>

<ol>
	<li>Foster, M., Sherrington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Part+III:+The+Central+Nervous+System.">Part III: The Central Nervous System.</a> A Text Book of Physiology. , (1897).</li><li>Peters, A., Palay, S. L., Webster, H. D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The fine structure of the nervous system. , (1991).</li><li>Harris, K. M., Weinberg, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+Synapses+in+the+Mammalian+Brain.">Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, 005587-005587 (2012).</li><li>Phillips, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presynaptic+particle+web:+ultrastructure,+composition,+dissolution,+and+reconstitution.">The presynaptic particle web: ultrastructure, composition, dissolution, and reconstitution.</a> Neuron. 32, 63-77 (2001).</li><li>Pinheiro, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solubilization+and+immunological+identification+of+presynaptic+alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic+acid+receptors+in+the+rat+hippocampus.">Solubilization and immunological identification of presynaptic alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors in the rat hippocampus.</a> Neurosci. Lett. 336, 97-100 (2003).</li><li>Rebola, N., Pinheiro, P. C., Oliveira, C. R., Malva, J. O., Cunha, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+localization+of+adenosine+A(1)+receptors+in+nerve+terminals+and+synapses+of+the+rat+hippocampus.">Subcellular localization of adenosine A(1) receptors in nerve terminals and synapses of the rat hippocampus.</a> Brain Res. 987, 49-58 (2003).</li><li>Rebola, N., Canas, P. M., Oliveira, C. R., Cunha, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+synaptic+and+subsynaptic+localization+of+adenosine+A2A+receptors+in+the+hippocampus+and+striatum+of+the+rat.">Different synaptic and subsynaptic localization of adenosine A2A receptors in the hippocampus and striatum of the rat.</a> Neuroscience. 132, 893-903 (2005).</li><li>Rodrigues, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Presynaptic+Control+by+ATP+of+Glutamate+Release+via+Facilitatory+P2X1,+P2X2/3,+and+P2X3+and+Inhibitory+P2Y1,+P2Y2,+and/or+P2Y4+Receptors+in+the+Rat.">Dual Presynaptic Control by ATP of Glutamate Release via Facilitatory P2X1, P2X2/3, and P2X3 and Inhibitory P2Y1, P2Y2, and/or P2Y4 Receptors in the Rat.</a> J. Neurosci. 25, 6286-6295 (2005).</li><li>Gar&#231;&#227;o, P., Oliveira, C. R., Cunha, R. A., Agostinho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsynaptic+localization+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+subunits:+a+comparative+study+in+the+mouse+and+rat+striatum.">Subsynaptic localization of nicotinic acetylcholine receptor subunits: a comparative study in the mouse and rat striatum.</a> Neurosci. Lett. 566, 106-110 (2014).</li><li>Lopes, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+parkinson's+disease-associated+receptor+GPR37+in+the+hippocampus:+functional+interplay+with+the+adenosinergic+system.">The role of parkinson's disease-associated receptor GPR37 in the hippocampus: functional interplay with the adenosinergic system.</a> J. Neurochem. 134, 135-146 (2015).</li><li>Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Special+Report:+The+1996+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals.">Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> ILAR J. 38, 41-48 (1997).</li><li>Rusakov, D. A., Harrison, E., Stewart, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapses+in+hippocampus+occupy+only+1-2%+of+cell+membranes+and+are+spaced+less+than+half-micron+apart:+a+quantitative+ultrastructural+analysis+with+discussion+of+physiological+implications.">Synapses in hippocampus occupy only 1-2% of cell membranes and are spaced less than half-micron apart: a quantitative ultrastructural analysis with discussion of physiological implications.</a> Neuropharmacology. 37, 513-521 (1998).</li><li>Zeng, Z., Su, K., Kyaw, H., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+endothelin+receptor+type-B-like+gene+enriched+in+the+brain.">A novel endothelin receptor type-B-like gene enriched in the brain.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 559-567 (1997).</li><li>Bodenmuller, H., Schilling, E., Zachmann, B., Schaller, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuropeptide+head+activator+loses+its+biological+acitivity+by+dimerization.">The neuropeptide head activator loses its biological acitivity by dimerization.</a> EMBO J. 5, 1825-1829 (1986).</li><li>Rezgaoui, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuropeptide+head+activator+is+a+high-affinity+ligand+for+the+orphan+G-protein-coupled+receptor+GPR37.">The neuropeptide head activator is a high-affinity ligand for the orphan G-protein-coupled receptor GPR37.</a> J. Cell Sci. 119, 542-549 (2006).</li><li>Gand&#236;a, J., Fern&#225;ndez-Due&#241;as, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Parkinson's+disease-associated+GPR37+receptor-mediated+cytotoxicity+is+controlled+by+its+intracellular+cysteine-rich+domain.">The Parkinson's disease-associated GPR37 receptor-mediated cytotoxicity is controlled by its intracellular cysteine-rich domain.</a> J. Neurochem. 125, 362-372 (2013).</li><li>Meyer, R. C., Giddens, M. M., Schaefer, S. A., Hall, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GPR37+and+GPR37L1+are+receptors+for+the+neuroprotective+and+glioprotective+factors+prosaptide+and+prosaposin.">GPR37 and GPR37L1 are receptors for the neuroprotective and glioprotective factors prosaptide and prosaposin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9529-9534 (2013).</li><li>Takahashi, R., Imai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pael+receptor,+endoplasmic+reticulum+stress,+and+Parkinson's+disease.">Pael receptor, endoplasmic reticulum stress, and Parkinson's disease.</a> J. Neurol. 250, 9 (2003).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

The protocol presented here constitutes a powerful biochemical tool for the study of the subsynaptic distribution of specific proteins within any brain region. However, there are some drawbacks inherent to the technique that deserve to be highlighted here. For instance, one of the main limitations is the relatively large amount of tissue needed to purify a reasonable amount of protein in order to perform the immunoblot analysis of all subsynaptic fractions. This issue might be related to the fact that synapses (i.e., synaptosomes) represent only 1-2% of the total hippocampal volume12. Indeed, between 1 and 1.5 g of fresh tissue (i.e., the hippocampus) is needed to perform a successful fractionation; otherwise, the yield is too low to assess the identity, as well as the localization, of the protein being studied. 
Conversely, if an excess of brain tissue is used, then the separation procedure will not be optimal. It is also critical to carefully adjust the pH of the solutions to ensure an optimal subsynaptic fractionation. Consequently, every time a brain membrane fractionation is performed, it is mandatory to validate the efficiency of each fraction before any further study. Importantly, the following protocol it is unlikely to be suitable for the subsynaptic fractionation of inhibitory synapses because of its differential structure and distribution. However, all these drawbacks do not overshadow the enormous usefulness of this experimental procedure, which, without any doubt, will become a universal methodology for the study of the synapse.

שידור סינפטית מסתמך על השלמות הפיזית של הסינפסה, מושג שנחזה כבר בתחילת 1897 על ידי פוסטר ו Sherrington 1 . לכן, הבנת התפלגות של מרכיבים ניירוטרנסמיים מרכזיים ( למשל, תעלות יונים, קולטנים וכו &#39; ) חיונית להבהרת הפונקציה הסינפטית, הן בתנאים הנורמליים והן בפתולוגים. מיקרוסקופית אלקטרונים (EM) תרמה רבות לרעיון ultrastructural הנוכחי של סינפסות מערכת העצבים המרכזית (CNS). בדרך זו, EM הקימה היטב את ההבדלים בין צפיפות טרום-פוסטינפטית, אשר מופרדים על ידי סדק של מרחק אחיד למדי (~ 25 ננומטר) 2 . מעניין, את מנגנון postsynaptic מציגה רציפה יחסית, עיבוי צפוף אלקטרונים מתחת קרום הפלזמה שלה, שנקרא צפיפות postsynaptic, או PSD 2 . לעומת זאת, במנגנון presynaptic, הודעה<html> E רשת רציפה cytomatrix מסודרת בדיוק מתחת קרום פלזמה, אשר חיוני היישור ואת עגינה של שלפוחית ​​סינפטי לאזור קרום פלזמה פעיל 3 . לפיכך, EM מהווה את הגישה הניסויית הזהב לסקור את החלוקה של חלבונים בתוך סינפסה CNS נשמר מבנית. עם זאת, המידע שסופק על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הוא סטטי. ואכן, הצטברות הראיות עולה כי סינפסות vivo הם דינמיים מאוד, ובכך חווים שינויים מבניים דרמטי על שידור סינפטי מתמשכת. בנוסף, המורפולוגיה ואת הרכב הסינפסות יכול להשתנות בכל אזורי CNS שונים על התפתחות, התבגרות, הזדקנות, ופיתוח של תנאים נוירופתולוגי. בסך הכל, פרוטוקול התמקד בידוד חלבונים השייכים תאים סינפטי שונים בתנאים פיזיולוגיים מייצג כלי רב ערך עבור מחקר מקיף יותר של תפקוד סינפטי. Lace = &quot;jove_content&quot;&gt; כאן, אנו מתארים סוג זה של גישה ניסויית משלימה, המאפשרת העשרה ביוכימית הכנה של תאים שונים קרום סינפטי, כלומר, תוספת, מראש ו-דפוסי postsynaptic הממברנה. שיטה זו שברירית הממברנה, שתוארה לראשונה על ידי Philips et al . (2001) 4 , מבוסס על שינוי pH כי מחלישה את אינטראקציות דבק המתרחשים בתוך מראש ו postsynaptic המנגנון. ראשית, באמצעות דטרגנטים מתונה ב pH 6.0, ניתן להבחין צומת adherers המחזיקה מראש ו postsynaptic המנגנון וכי נשמר מן תחום קרום extrasynaptic, אשר solubilized ולכן ניתן לחלץ מן אנשי הקשר הסינפטי. לאחר מכן, העלאת ה- pH מ 6.0 ל 8.0 בנוכחות דטרגנטים מתון מחליש את כוח צומת adherens שמחזיק את אזור פעיל presynaptic בחוזקה הצפיפות postsynaptic. לפיכך, התא presynaptic הוא כל כךLubilized ויכול להיות מופרדים צפיפות postsynaptic, אשר נשמר בעיקר בגלל ריכוז של חומר ניקוי בשימוש לא לקדם solubilization שלה 4 . מעניין, יעילות הפיצול, בסופו של דבר גבוה מ -90%, ניתן לאשר על ידי סמנים subsynaptic שונים: i ) synaptosomal הקשורים חלבון 25 (SNAP-25), מן אזור פעיל presynaptic; Ii ) synaptophysin, מן חלק extrasynaptic ( כלומר, מחוץ לאזור פעיל כולל microsomes); ו iii ) postsynaptic צפיפות חלבון 95 (PSD-95), מן צפיפות postsynaptic. יש לציין, שיטה זו שבירת המוח קרום שימש בהצלחה. לפיכך, ניתן היה לקבוע במדויק את לוקליזציה subynaptic של קולטנים שונים, כגון קולטנים שונים של אלפא-אמינו-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (AMPA) 5 , אדנוזין קולטן A 1 (A 1 R) 6 ,אדנוזין קולטן 2A (A 2A R) 7 , אדנוזין טריפוספט (ATP) קולטנים P2 8 , קולטן אצטילכולין ניקוטין 9 , ו קולטן מחלת פרקינסון הקשורים GPR37 10 . עם זאת, מספר מגבלות עלול לעכב את הערכה נכונה של התפלגות הסינפטי של חלבון עצבי מסוים. לכן, בהליך זה, אנו לא רק לתאר באופן מלא את הפרוטוקול כולו, אבל אנחנו גם להדגיש כמה נקודות קריטיות להיחשב, כגון כמות גדולה למדי של רקמות הצורך, התשואה חלבון נמוך, ואת הדרישה המנדטורית כדי לאמת את היעילות של כל הפרדה לפני ביצוע הניסוי מוגדר.

<table><tbody><tr><td>Sucrose</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,316,211,211</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>2,112,211,210</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H2O</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,313,961,210</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail Set III</td><td>Millipore, Darmstadt, Germany</td><td>535140</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,236,541,209</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,311,651,604</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Non fat dry milk</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,216,591,211</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,314,941,210</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>4873</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Pancreac Qu&amp;iacute;mica SL, Barcelona, Spain</td><td>1,316,781,211</td><td></td></tr><tr><td>Basic 20 pH</td><td>Crison, Alella, Spain</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytron VDI 12 Adaptable Homogenizer</td><td>VWR, Radnor, PA, USA.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Clear Tubes (14x89mm)</td><td>Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona</td><td>344059</td><td>Tubes should be filled almost completely when used to prevent collapsing due to ultracentrifugation.</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Centrifugal filters Ultracel -10K</td><td>Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5430R</td><td>Eppendorf, Hamburgo, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima L-90K Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcelona</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonifier 250</td><td>Branson, Danbury, Connecticut</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amersham Imager 600</td><td>GE Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spain</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable Glass Pasteur Pippetes 230 mm</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>612-1702</td><td></td></tr><tr><td>Compact Balance EK-610</td><td>A&amp;amp;D, Tokyo, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce&amp;trade; BCA Protein Assay Kit</td><td>Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal west pico chemiluminescent substrate</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GR 200 Precision Balance</td><td>A&amp;amp;D, Tokyo, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-GPR37</td><td>Homemade antibody anti-GPR37 produced and validated in Francisco Ciruela Laboratory.</td><td></td><td>Primary antibodies used at a final concentration of 0.250 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-synaptophysin</td><td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td><td></td><td>Primary antibodies diluted 1:10,000</td></tr><tr><td>HRP-conjugated goat anti-mouse IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.</td><td></td><td>Secondary antibody diluted 1:10,000</td></tr><tr><td>HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.</td><td></td><td>Secondary antibody diluted 1:30,000</td></tr></tbody></table>

brain membrane fractionation: an ex vivo approach to assess subsynaptic protein localization

הערכת הרכב החלבון הסינפטי ותפקודו מהווה אתגר חשוב בתחום מדעי המוח. עם זאת, לא קל להעריך נוירוטרנסמינציה המתרחשת בתוך סינפסות כי זה מוסדר מאוד על ידי אינטראקציות חלבונים דינמי דינמי ואירועים זרחן. לפיכך, כאשר כל שיטה משמשת כדי ללמוד שידור סינפטית, המטרה העיקרית היא לשמור על שינויים אלה פיזיולוגיים חולף. כאן, אנו מציגים פרוטוקול קרום המוח פרוקציה המייצג תהליך חסון לבודד חלבונים השייכים תאים סינפטית שונים. במילים אחרות, פרוטוקול מתאר מתודולוגיה ביוכימי לבצע העשרת חלבון מ presynaptic, postsynaptic, ו extrasynaptic תאים. ראשית, synaptosomes, או מסופים סינפטי, מתקבלים נוירונים המכילים את כל תאים סינפטיים באמצעות שיפוע סוכרוז רציפה. ראוי לציין, את האיכות של ההכנה הראשונית הממברנה הסינפטי הזה הוא גקריטי. לאחר מכן, בידוד של תאים subsynaptic שונים מושגת עם solubilization קל באמצעות דטרגנטים מתונים בתנאים pH דיפרנציאלי. זה מאפשר הפרדה לפי צנטריפוגה ו צנטריפוגות isopycnic. לבסוף, העשרת החלבון בתאים הסובסינפטיים השונים ( כלומר, שברי קרום לפני ואחרי) נבדקה באמצעות ניתוח אימונובלוט תוך שימוש בסמנים חלבונים סינפטיים המאופיינים היטב ( כלומר, SNAP-25, PSD-95 ו- synaptophysin, בהתאמה), ובכך מאפשר הערכה ישירה של התפלגות הסינפטי של כל חלבון נוירונים מסוים.

המתודולוגיה המתוארת שימשה בעיקר לניתוח subsynaptic של חלבונים עצביים בכלל לבידוד אפיון ביוכימי של קולטנים סינפטיים 5 , 6 , 7 , 8 , 9 בפרט. מעניין, התוצאה נציג מוצג כאן להראות את התועלת של הליך זה ניסיוני לניתוח ההפצה בהיפוקמפוס subsynaptic של קולטן G יתום-מצמידים חלבון- כלומר, קולטן פרקינסון הקשורות GPT37 10 . GPR37 זוהה במקור באמצעות חיפושים homologues עבור אנדותלין ו receptors bombesin 13 , אם כי זה נמצא לא להיקשר אנדותלינים או פפטידים קשורים. במקומו, GPR37 הוצע להיות מופעל על ידי ראש activator pEptide 14 , 15 , 16 , ולאחרונה, על ידי neospeptides prosaposin ו prosaptide 17 , אם כי האסוציאציות הללו עדיין לא קיבל אוניברסלית. GPR37 קיבל את תשומת הלב הרבה ביותר עבור הקישור שלו מחלת פרקינסון 18 . לכן, יש עניין משמעותי לדעת את הנוירוביולוגיה של קולטן זה מסקרן, הן בתנאים נורמליים ופתולוגיים. לכן, גילוי לוקליזציה subpraptic GPR37 עשוי לעזור להבהיר את תפקידה בתוך המוח. לשם כך, ההיפוקמפוס היה מבודד לראשונה מ C57BL / 6J (WT) ו GPR37-KO עכברים בגיל שמונה שבועות. לאחר מכן, שברים עודפים, לפני ואחרי subynaptic היו מטוהרים באמצעות פרוטוקול פיצול הממברנה (ראה איור 1 עבור סקירה סכמטית של ההליך). לאחר מכן, purities של תאים אלה subsynaptic אומתו על ידיהפרדה של סמנים סינפטיים בהתאמה: i ) סמן שלפוחית ​​extrasynaptic (synaptophysin); Ii ) סמן אזור פעיל presynaptic (SNAP-25); ו 3 ) סמן צפיפות postsynaptic (PSD95). לפיכך, העשירות ב synaptophysin, SNAP-25, ו PSD95 בתוך שברים, לפני ואחרי subseaptic, בהתאמה, נותחו על ידי immunoblot באמצעות נוגדנים ספציפיים נגד חלבונים אלה ( איור 2 ). לפיכך, יעילות של שבירה של לפחות 90% נמצאה עבור כל סמן סינפטי שנבדק ( איור 3 ), בדומה לאלה שתוארו לעיל 6 . מעניין, GPR37 immunoreactivity היה שופע יותר (n = 3, P &lt;0.001) בחלק extrasynaptic בהשוואה presynaptic (20 ± 4%) ו postsynaptic (36 ± 2%) שברים ( איור 3 ). בנוסף, הנתונים שלנו הצביעו על כך, בעוד נוכחים באזור פעיל presynaptic, GPR37 היה בעיקר loממוצעת בצפיפות postsynaptic (n = 3, P &lt;0.05) ( איור 3 ). בסך הכל, פרוטוקול קרום המוח פרוקציה מותר להעריך את התפלגות subsynaptic של GPR37 בהיפוקמפוס העכבר, ובכך לספק מידע בעל ערך עבור מניפולציות עתידיות של קולטן יתום זה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55661/55661fig1.jpg" /> איור 1: תרשים זרימה סכמטי תרשים של פרוטוקול פיצול הממברנה. כל הליכי הניסוי מתוארים בעמודה השמאלית, ואילו אוסף המדגם מתואר בעמודה הימנית. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55661/55661fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55661/55661fig2.jpg" /> דמות2: התפלגות Subsynaptic של GPR37 בהיפוקמפוס העכבר. נציג immunoblot מראה Synaptophysin, SNAP-25 ו PSD-95 כמו מראש, מראש ו postsynaptic סמנים סינפטיים ספציפיים, כמו גם gore37 immunoreactivity בשברים סינפטיים בהיפוקמפוס של WT ו GPR37-KO עכברים. היפופוקל סינפטוזה (Syn) היו מחולקים לתוך extrasynaptic (תוספת) ו presynaptic (טרום) אזורי פעיל צפיפות postsynaptic (פוסט) שברים. אלה נבדקו על ידי immunoblot (20 מיקרוגרם של חלבון / נתיב) באמצעות ארנב נגד סינפפטופיסין (1: 3,000), עכבר anti-SNAP-25 (1: 3,000), ארנב נגד PSD95 (1: 3,000), נגד ארנב -GPR37 (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) נוגדנים. הנוגדן הראשוני התגלה באמצעות שימוש ב- HRP - מצומצם נגד ארנבת (1 / 30,000) או ארנב נגד עכבר (1: 30,000) נוגדן. נתונים אלה מופקים מתוך הפניה 10 , באישור. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55661/55661fig2large.jpg" target="_blank">לחץ על ח</a>Ere כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55661/55661fig3.jpg" /> איור 3: כימות יחסית של העשרה GPR37 בשברים בהיפוקמפוס חוץ, מראש, ו postsynaptic. עוצמות של להקות immunorelotted המקביל extrasynaptic (תוספת, טור צהוב), presynaptic (טרום, עמודה ירוקה), ו postsynaptic (פוסט, עמודה אדום) שברים, שמוצג באיור 2, נמדדו על ידי סריקה densitometric. צפיפות היו לכמת מ להקות לא רווי. ערכים מנורמל (ב% של הסריקה densitometric יחסית, RDS) באמצעות כמות של Synaptophysin, SNAP-25, PSD95, ו GPR37 בחלק המועשר ביותר הוצגו כאמצעי ± SEM של שלושה ניסויים עצמאיים 10 . הכוכביות מציינות נתונים שונים באופן מובהק: p &lt;0.05, p &lt;0.001 (1-ANOVA עם מבחן פוסט של Bonferroni פוסט ). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55661/55661fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization at JoVE.com

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

כאן, אנו מציגים פרוטוקול קרום המוח פרוקציה המייצג תהליך חסון לבודד חלבונים השייכים תאים סינפטית שונים.

קרום המוח Fractation: An<em&gt; אקס ויוו</em&gt; גישה כדי להעריך לוקליזציה חלבון subsynaptic

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

brain-membrane-fractionation-an-ex-vivo-approach-to-assess

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

10.3K Views.  Universitat de Barcelona, L'Hospitalet de Llobregat.  כאן, אנו מציגים פרוטוקול קרום המוח פרוקציה המייצג תהליך חסון לבודד חלבונים השייכים תאים סינפטית שונים. 

Video: Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

הכנת Synaptoneurosomes מ - עכבר Cortex באמצעות צבע רציפה Percoll-סוכרוז צפיפות

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

Neuroscience

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

המוח פרוס Biotinylation:<em&gt; Ex Vivo</em&gt; גישה למדוד סחר חלבון פלזמה ממברנה אזור ספציפי בתאי עצב בוגרים

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in the late 1960&#8217;s, proteins associated with the synaptic plasma membrane can be isolated by ultracentrifugation on a sucrose density gradient. Once synaptic membranes are isolated, the macromolecular complex known as the post-synaptic density can be subsequently isolated due to its detergent insolubility. The techniques used to isolate synaptic plasma membranes and post-synaptic density proteins remain essentially the same after 40 years, and are widely used in current neuroscience research. This article details the fractionation of proteins associated with the synaptic plasma membrane and post-synaptic density using a discontinuous sucrose gradient. Resulting protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

This article details the enrichment of proteins associated with the synaptic plasma membrane by ultracentrifugation on a discontinuous sucrose gradient. The subsequent preparation of post-synaptic density proteins is also described. Protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

הכנת Synaptic פלזמה ממברנה וחלבוני צפיפות Postsynaptic באמצעות שיפוע סוכרוז רציף

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

ניצול מתודולוגיות משולב להגדיר את התפקיד של משלוח ממברנה פלזמה במהלך אקסון מסעף ו העצבית המורפוגנזה

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to na&#239;ve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment. 
High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/na&#239;ve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.

The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.

גבוהה פרופיל Proteome Synaptic החלטה כמותי של אזורים במוח העכבר לאחר למידה אפליה שמיעתית

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Electroconvulsive Seizures in Rats and Fractionation of Their Hippocampi to Examine Seizure-induced Changes in Postsynaptic Density Proteins

Electroconvulsive seizure (ECS) is an experimental animal model of electroconvulsive therapy, the most effective treatment for severe depression. ECS induces generalized tonic-clonic seizures with low mortality and neuronal death and is a widely-used model to screen anti-epileptic drugs. Here, we describe an ECS induction method in which a brief 55-mA current is delivered for 0.5 s to male rats 200 - 250 g in weight via ear-clip electrodes. Such bilateral stimulation produced stage 4 - 5 clonic seizures that lasted about 10 s. After the cessation of acute or chronic ECS, most rats recovered to be behaviorally indistinguishable from sham &#34;no seizure&#34; rats. Because ECS globally elevates brain activity, it has also been used to examine activity-dependent alterations of synaptic proteins and their effects on synaptic strength using multiple methods. In particular, subcellular fractionation of the postsynaptic density (PSD) in combination with Western blotting allows for the quantitative determination of the abundance of synaptic proteins at this specialized synaptic structure. In contrast to a previous fractionation method that requires large amount of rodent brains, we describe here a small-scale fractionation method to isolate the PSD from the hippocampi of a single rat, without sucrose gradient centrifugation. Using this method, we show that the isolated PSD fraction contains postsynaptic membrane proteins, including PSD95, GluN2B, and GluA2. Presynaptic marker synaptophysin and soluble cytoplasmic protein &#945;-tubulin were excluded from the PSD fraction, demonstrating successful PSD isolation. Furthermore, chronic ECS decreased GluN2B expression in the PSD, indicating that our small-scale PSD fractionation method can be applied to detect the changes in hippocampal PSD proteins from a single rat after genetic, pharmacological, or mechanical treatments.

Electroconvulsive seizure (ECS) is an experimental animal model of electroconvulsive therapy for severe depression. ECS globally stimulates activity in the hippocampus, leading to synaptogenesis and synaptic plasticity. Here, we describe methods for ECS induction in rats and for subcellular fractionation of their hippocampi to examine seizure-induced changes in synaptic proteins.

חשמל התקפים חולדות ו Fractionation של Hippocampi שלהם כדי לבחון תפיסה-induced שינויים בחלבונים Postsynaptic צפיפות

Electroconvulsive seizure (ECS) is an experimental animal model of electroconvulsive therapy, the most effective treatment for severe depression. ECS ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a protein, it is vital to also determine its distribution. Here, we describe a protocol employing immunofluorescence, confocal microscopy, and computer-based analysis to determine the distribution of the synaptic protein Mover (also called TPRGL or SVAP30). We compare the distribution of Mover to that of the synaptic vesicle protein synaptophysin, thereby determining the distribution of Mover in a quantitative manner relative to the abundance of synaptic vesicles. Notably, this method could potentially be implemented to allow for comparison of the distribution of proteins using different antibodies or microscopes or across different studies. Our method circumvents the inherent variability of immunofluorescent stainings by yielding a ratio rather than absolute fluorescence levels. Additionally, the method we describe enables the researcher to analyze the distribution of a protein on different levels: from whole brain slices to brain regions to different subregions in one brain area, such as the different layers of the hippocampus or sensory cortices. Mover is a vertebrate-specific protein that is associated with synaptic vesicles. With this method, we show that Mover is heterogeneously distributed across brain areas, with high levels in the ventral pallidum, the septal nuclei, and the amygdala, and also within single brain areas, such as the different layers of the hippocampus.

Here, we describe a quantitative approach to determining the distribution of a synaptic protein relative to a marker protein using immunofluorescence staining, confocal microscopy, and computer-based analysis.

לכימות ההתפלגות הטרוגנית של חלבון סינפטיים במוח העכבר בעזרת Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Microtransplantation of Synaptic Membranes to Reactivate Human Synaptic Receptors for Functional Studies

Excitatory and inhibitory ionotropic receptors are the major gates of ion fluxes that determine the activity of synapses during physiological neuronal communication. Therefore, alterations in their abundance, function, and relationships with other synaptic elements have been observed as a major correlate of alterations in brain function and cognitive impairment in neurodegenerative diseases and mental disorders. Understanding how the function of excitatory and inhibitory synaptic receptors is altered by disease is of critical importance for the development of effective therapies. To gain disease-relevant information, it is important to record the electrical activity of neurotransmitter receptors that remain functional in the diseased human brain. So far this is the closest approach to assess pathological alterations in receptors' function. In this work, a methodology is presented to perform microtransplantation of synaptic membranes, which consists of reactivating synaptic membranes from snap frozen human brain tissue containing human receptors, by its injection and posterior fusion into the membrane of Xenopus laevis oocytes. The protocol also provides the methodological strategy to obtain consistent and reliable responses of &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) and &#947;-aminobutyric acid (GABA) receptors, as well as novel detailed methods that are used for normalization and rigorous data analysis.

The protocol demonstrates that by performing microtransplantation of synaptic membranes into Xenopus laevis oocytes, it is possible to record consistent and reliable responses of &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid and &#947;-aminobutyric acid receptors.

מיקרו-טרנספלנטציה של ממברנות סינפטיות להפעלה מחדש של קולטנים סינפטיים אנושיים למחקרים פונקציונליים

Excitatory and inhibitory ionotropic receptors are the major gates of ion fluxes that determine the activity of synapses during physiological neuronal ...

Subcellular Fractionation for the Isolation of Synaptic Components from the Murine Brain

Synaptic terminals are the primary sites of neuronal communication. Synaptic dysfunction is a hallmark of many neuropsychiatric and neurological disorders. The characterization of synaptic sub-compartments by biochemical isolation is, therefore, a powerful method to elucidate the molecular bases of synaptic processes, both in health and disease. This protocol describes the isolation of synaptic terminals and synaptic sub-compartments from mouse brains by subcellular fractionation. First, sealed synaptic terminal structures, known as synaptosomes, are isolated following brain tissue homogenization. Synaptosomes are neuronal pre- and post-synaptic compartments with pinched-off and sealed membranes. These structures retain a metabolically active state and are valuable for studying synaptic structure and function. The synaptosomes are then subjected to hypotonic lysis and ultracentrifugation to obtain synaptic sub-compartments enriched for synaptic vesicles, synaptic cytosol, and synaptic plasma membrane. Fraction purity is confirmed by electron microscopy and biochemical enrichment analysis for proteins specific to sub-synaptic compartments. The presented method is a straightforward and valuable tool for studying the structural and functional characteristics of the synapse and the molecular etiology of various brain disorders.

This protocol presents a robust, detailed method to obtain highly pure synaptosomes, synaptic vesicles, and other synaptic fractions from the mouse brain. This method enables the evaluation of synaptic processes, including the biochemical analysis of protein localization and function with compartmental resolution.

פיצול תת-תאי לבידוד רכיבים סינפטיים ממוח מורין

Synaptic terminals are the primary sites of neuronal communication. Synaptic dysfunction is a hallmark of many neuropsychiatric and neurological ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein using the profiles of fluorescence intensity across the plasma membrane. Measured fluorescence profiles are fitted by a model for membrane and cytoplasm fluorescence distribution along a line applied perpendicularly to the cell periphery. This model is constructed from the fluorescence intensity values in reference cells expressing a fluorescently-tagged marker for cytoplasm and with FM 4-64-labeled plasma membrane. The method can be applied to various cell types and organisms; however, only plasma membranes of non-neighboring cells can be evaluated. This fast microscopy-based method is suitable for experiments, where subtle and dynamic changes of plasma membrane-associated markers are expected and need to be quantified, e.g., in the analysis of mutant versions of proteins, inhibitor treatments, and signal transduction observations. The method is implemented in a multi-platform R package that is coupled with an ImageJ macro that serves as a user-friendly interface.

Here, we present a protocol to perform a quantitative analysis of the level of plasma-membrane association for fluorescently-tagged peripherally-associated protein. The method is based on the computational decomposition of membrane and cytoplasmic component of signal observed in cells labeled with plasma membrane fluorescent marker.

קביעת חלוקה למחיצות של קרום פלזמה חלבונים הקשורים באופן עקיף

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

קרום המוח Fractation: An

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video