The authors thank Dr. Mike Ehlers and his laboratory members for originally demonstrating the protocol for subcellular fractionation of synaptic plasma membranes. We also thank Wendy Horsfall for management of the mouse colonies. This work was supported by operating grants from CIHR (AJR and AS).

הפרוטוקול הבא תואם את ההנחיות של המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים ואושר על ידי הפקולטה לרפואה וטיפול בבעלי חיים ועדת רוקחות באוניברסיטת טורונטו. .1 הכינו חובה ריאגנטים כפי שהיא מתוארת בטבלה 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת פרוטאז וphosphatase (במידת צורך) מעכבים לכל פתרונות, מאגרי סוכרוז וDDH 2 O בריכוזים המפורטים בטבלה 1. חשוב: בצע את כל השלבים על 4 מעלות צלזיוס וטרום מגניב כל חומרים כימיים והציוד לפני תחילת הניסוי. לייבל כל הצינורות, כולל צינורות ultracentrifuge, עם סמן קבוע. </li></ol> .2 Dissection של מוח האזור המתאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב בעלי החיים על ידי עקירה או עריפת ראש בצוואר הרחם. בית ולהרדים חיות בהתאם למדיניות מוסדית וממשלתית בטיפול בבעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהירות להסיר את המוח דואר מהגולגולת ומניחים על בלוק נתיחה מצונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את האזור במוח המתאים מרקמות טריות והמשך לשלב 3. </li></ol> Homogenization רקמות .3 עם זכוכית הטפלון Homogenizer מנוע מונע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 50-100 מ&quot;ג (לSPM), או 100-200 מ&quot;ג (לPSD) של הרקמה גזור בצינור פוליפרופילן 13 מ&quot;ל שכותרת המכיל 4 מ&quot;ל של תמיסת סוכרוז 0.32 HEPES שנאגר M. להעביר את המדגם למטחנה / homogenizer רקמת זכוכית טפלון מחודד 15 מ&quot;ל, להגדיר את כונן מנוע ל900 סל&quot;ד (הגדרת 7) וhomogenize המדגם עם 12 משיכות במשך תקופה 30 שניות. השתמש homogenizer זכוכית טפלון שונה בין דגימות, או לשטוף את homogenizer עם מים מזוקקים קרים בין דגימות ולנגב יבשים עם Kimwipe. הערה: עד 4 גרם של רקמה ניתן הומוגני ב4 מ&quot;ל של תמיסת סוכרוז 0.32 HEPES שנאגר M, עם זאת רצוי להשתמש בפחות רקמה כדי להבטיח חלוקה נכונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את המדגם הומוגני בחזרה to באותו צינור פוליפרופילן 13 מ&quot;ל. מילואים של homogenate וחנות 100 μl ב-80 ° C לכימות חלבון שלאחר מכן וניתוח כתם מערבי בסך הכל חלק קטן חלבון. </li></ol> .4 מהירות נמוכה צנטריפוגה להסיר חלק הגרעיני (תשואות Supernatant S1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה homogenate בהרוטור זווית קבועה ב900 XG 10 דקות ב 4 ° C. מעבירים את supernatant (S1) לחדש, שכותרתו 13 צינור מ&quot;ל וresuspend גלולה שבריר הגרעיני (P1) ב500 μl של 0.32 סוכרוז HEPES שנאגר M. הערה: החלק (P1) יכול להיות מאוחסן על -80 מעלות צלזיוס ומשמש לניתוח כתם מערבי של השבר הגרעיני. </li></ol> .5 העשרה של חלק הגולמי Synaptosomal (תשואות גלולה P2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה supernatant (S1) ב 10,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C.. הסר את supernatant (S2) ובמילואים 500 μl בצינור microcentrifuge לאחסן ב-80 ° C לקוואנט חלבון שלאחר מכןification וניתוח כתם מערבי של cytosolic / חלק קרום האור. Resuspend גלולה שנותר synaptosomal הגולמי שבריר (P2) ב1 מ&quot;ל של תמיסת סוכרוז HEPES שנאגר 0.32 M ולאחר מכן להוסיף עוד פתרון סוכרוז HEPES שנאגר 3 מ&quot;ל של 0.32 M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב g x 10,000 ל15 דקות ב 4 ° C.. הסר את supernatant (S2 &#39;) וμl 500 מילואים בצינור microcentrifuge לאחסן ב-80 ° C לכימות חלבון שלאחר מכן וניתוח כתם המערבי של cytosolic / חלק קרום האור. להציל את כדור synaptosomal הגולמי שטף (P2 &#39;) בצינור פוליפרופילן. </li></ol> .6 Lysing (Hypoosmotic הלם) של חלק הגולמי Synaptosomal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse גלולה synaptosomal הגולמי (P2 &#39;) בצינור פוליפרופילן על ידי resuspending זה ב 1 מ&quot;ל של DDH 2 O. להוסיף עוד 3 מ&quot;ל של DDH 2 O, להעביר לhomogenizer רקמת זכוכית טפלון, וhomogenize ביד עם 3 משיכות. הערה: חשובלבצע שלב זה במהירות אפשרית ובמהירות המשך לשלב 6.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימות מhomogenizer בחזרה לתוך צינור פוליפרופילן 13 מ&quot;ל ובמהירות להתאים את המדגם חזרה ל4 HEPES מ&quot;מ עם 16 μl של 1 פתרון M HEPES, להפוך לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב דגימות על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להבטיח lysing מלא. </li></ol> .7 העשרה של חלק Synaptosomal ממברנה (P3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב g x 25,000 עבור 20 דקות ב 4 ° C.. הסר את supernatant הגולמי לפוחי שבריר (S3) ולהזמין אותו בצינור 5 מ&quot;ל לאחסון ב-80 ° C לכימות חלבון שלאחר מכן וניתוח כתם מערבי. Resuspend חלק קרום synaptosomal (P3) ב 1 מ&quot;ל של תמיסת סוכרוז 0.32 HEPES שנאגר M. </li></ol> .8 הכנת רציף סוכרוז Gradient <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet בדיוק 3.5 מ&quot;ל של תמיסת סוכרוז HEPES שנאגר 1.2 M ובדיוק 3.0 מ&quot;ל כל אחד מ1.0 M ו0.8 M HEPEתמיסת סוכרוז נאגר S לתוך נפרד 6 מ&quot;ל הצמד צינורות כובע. הערה: זה נעשה מראש למדוד את ההיקפים של המאגרים הנמצאים בשימוש על מנת להפוך את שיפוע סוכרוז. מדידה מדויקת של הכמויות חשוב לוודא שהשיפועים וכתוצאה מכך יהיו מאוזנת לultracentrifugation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות pipet פסטר זכוכית ונורה, להעביר 1.2 M-נאגר HEPES תמיסת סוכרוז ל12 מ&quot;ל צינור ultracentrifuge polyallomer. שכבה בזהירות את תמיסת סוכרוז HEPES שנאגר 1.0 M על גבי תמיסת סוכרוז HEPES שנאגר 1.2 M. לבסוף, שכבת תמיסת סוכרוז HEPES שנאגר 0.8 M על גבי תמיסת סוכרוז HEPES שנאגר 1.0 M. השתמש pipet פסטר טרי עבור כל תמיסת סוכרוז ודואג שלא להפריע את שיפוע סוכרוז. תנודות ממערבולת ספסל או microcentrifuge יפריעו את השלמות של השיפוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות pipet פסטר, שכבת שבריר synaptosomal resuspended הקרום (P3) על גבי שיפוע סוכרוז רציף מוכן.ודא שההדרגות מאוזנת במשקלם בתוך הדלי של הרוטור דלי מתנדנד. אם הדליים אינם מאוזנים, להשתמש pipet P200 להוסיף בזהירות 0.32 סוכרוז HEPES שנאגר M לחלק העליון של השיפוע ולאזן את דליי הרוטור. </li></ol> .9 פלזמה של Synaptic פלזמה ממברנה (SPM) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ultracentrifuge ברוטור מתנדנד דלי ב150,000 XG לשעה 2 ב 4 ° C.. מוציא בזהירות את שיפועי סוכרוז מדליי ultracentrifuge. באמצעות מחט G 18 ומזרק 1 מ&quot;ל, לנקב את הצינור בחלק התחתון של שלבי הביניים פתרון סוכרוז HEPES שנאגר 1.0 M / M 1.2 ולמשוך את השכבה הסינפטית קרום פלזמה (SPM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום לעצמך את עוצמת הקול שכל דגימת SPM תופסת במזרק 1 מ&quot;ל. מניחים את שכבת SPM שנאסף בצינורות ultracentrifuge עבה קיר 3.5 מ&quot;ל, להוסיף בדיוק 2.5 כרכים של 4 HEPES מ&quot;מ כדי להתאים את ריכוז סוכרוז מ1.2 M ל0.32 מ &#39;ברגע שכל דגימה הייתה להתאיםed ל0.32 M סוכרוז, לאזן את הצינורות עם 0.32 תמיסת סוכרוז HEPES שנאגר M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ultracentrifuge בהרוטור זווית קבוע ב200,000 XG ל30 דקות ב 4 ° C. להסיר ולסלק supernatant. Resuspend גלולה קרום פלזמה הסינפטי (SPM) ב300 μl של 50 פתרון HEPES מ&quot;מ / 2 מ&quot;מ EDTA. דגימות חנות ב -80 ° C עד המשמשות למערביות סופג. </li></ol> 10. הכנת חלק צפיפות Postsynaptic (PSD) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר דגימות SPM על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פתרון של 0.54% טריטון X-100 ב50 פתרון HEPES מ&quot;מ / 2 מ&quot;מ EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצינור 5 מ&quot;ל קלקר, לשלב 2.7 מ&quot;ל של-100 X / שבריר טריטון HEPES / פתרון EDTA ו300 μl SPM ולסובב את המדגם עבור 15 דקות ב 4 ° C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימות ל3.5 מ&quot;ל צינורות ultracentrifuge עבה קיר ודגימות צנטריפוגות ב XG 32,000 עבור 20 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שומרים לעצמנו את supernatant (טריטון X-100 חלק מסיס [TS]) ולאחסן ב -80; ° C. הערה: בשלב זה, את הכדור מייצג את החלק היחסי &quot;PSD-1T&quot;. טיפול שני עם חומר ניקוי יהיה לייצר חלק &quot;PSD-2T&quot;. אם חלק PSD-1T הוא רצוי, המשך לשלב 10.6. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לייצר חלק PSD-2T, resuspend גלולה ב 3 מ&quot;ל של .0.5% טריטון X-100 ב50 HEPES מ&quot;מ / 2 פתרון mM EDTA. סובב דגימות ל15 דקות ב 4 ° C.. צנטריפוגה דגימות 32,000 XG ל20 דקות ב 4 ° C והמשיכו לשלב 10.6. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant וresuspend גלולה postsynaptic (PSD) ב50 פתרון HEPES מ&quot;מ / 2 מ&quot;מ EDTA. הערה: resuspension הנפח עשוי להיות תלוי בגודל של גלולה; נפח של 50-75 μl מומלץ. בגלל חלק PSD הוא חלק חומר ניקוי מסיס, זה לעתים קרובות יש צורך להוסיף 1-2 μl של .0.5% SDS כדי לאפשר resuspension של חלבון מלא. דגימות חנות ב -80 ° C עד המשמשות למערביות סופג. </li></ol>

<ol>
	<li>Delint-Ramirez, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+composition+of+NMDA+receptor+signaling+complexes+differs+between+membrane+subdomains+and+is+modulated+by+PSD-95+and+PSD-93.">In vivo composition of NMDA receptor signaling complexes differs between membrane subdomains and is modulated by PSD-95 and PSD-93.</a> The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 30, 8162-8170 (2010).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+psychiatric+disease+risk+factors+DISC1+and+TNIK+interact+to+regulate+synapse+composition+and+function.">The psychiatric disease risk factors DISC1 and TNIK interact to regulate synapse composition and function.</a> Mol Psychiatry. 16, (2010).</li><li>Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reinsertion+or+degradation+of+AMPA+receptors+determined+by+activity-dependent+endocytic+sorting.">Reinsertion or degradation of AMPA receptors determined by activity-dependent endocytic sorting.</a> Neuron. 28, 511-525 (2000).</li><li>Tomita, S., Fukata, M., Nicoll, R. A., Bredt, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+interaction+of+stargazin-like+TARPs+with+cycling+AMPA+receptors+at+synapses.">Dynamic interaction of stargazin-like TARPs with cycling AMPA receptors at synapses.</a> Science. 303, 1508-1511 (2004).</li><li>Ehlers, M. D., Heine, M., Groc, L., Lee, M. C., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusional+trapping+of+GluR1+AMPA+receptors+by+input-specific+synaptic+activity.">Diffusional trapping of GluR1 AMPA receptors by input-specific synaptic activity.</a> Neuron. 54, 447-460 (2007).</li><li>Bats, C., Groc, L., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+between+Stargazin+and+PSD-95+regulates+AMPA+receptor+surface+trafficking.">The interaction between Stargazin and PSD-95 regulates AMPA receptor surface trafficking.</a> Neuron. 53, 719-734 (2007).</li><li>Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+level+controls+postsynaptic+composition+and+signaling+via+the+ubiquitin-proteasome+system.">Activity level controls postsynaptic composition and signaling via the ubiquitin-proteasome system.</a> Nat Neurosci. 6, 231-242 (2003).</li><li>Cartier, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biochemical+and+functional+protein+complex+involving+dopamine+synthesis+and+transport+into+synaptic+vesicles.">A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles.</a> J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).</li><li>Rodriguez de Lores, A., Alberici, M., De Robertis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+and+enzymic+studies+of+cholinergic+and+non-cholinergic+synaptic+membranes+isolated+from+brain+cortex.">Ultrastructural and enzymic studies of cholinergic and non-cholinergic synaptic membranes isolated from brain cortex.</a> Journal of Neurochemistry. 14, 215-225 (1967).</li><li>Gray, E. G., Whittaker, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+nerve+endings+from+brain:+an+electron-microscopic+study+of+cell+fragments+derived+by+homogenization+and+centrifugation.">The isolation of nerve endings from brain: an electron-microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation.</a> J Anat. 96, 79-88 (1962).</li><li>Cotman, C. W., Taylor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+structural+studies+on+synaptic+complexes+from+rat+brain.">Isolation and structural studies on synaptic complexes from rat brain.</a> J Cell Biol. 55, 696-711 (1972).</li><li>Cotman, C. W., Banker, G., Churchill, L., Taylor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+postsynaptic+densities+from+rat+brain.">Isolation of postsynaptic densities from rat brain.</a> The Journal of Cell Biology. 63, 441-455 (1974).</li><li>Carlin, R. K., Grab, D. J., Cohen, R. S., Siekevitz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+postsynaptic+densities+from+various+brain+regions:+enrichment+of+different+types+of+postsynaptic+densities.">Isolation and characterization of postsynaptic densities from various brain regions: enrichment of different types of postsynaptic densities.</a> The Journal of Cell Biology. 86, 831-845 (1980).</li><li>Jones, D. H., Matus, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+synaptic+plasma+membrane+from+brain+by+combined+flotation-sedimentation+density+gradient+centrifugation.">Isolation of synaptic plasma membrane from brain by combined flotation-sedimentation density gradient centrifugation.</a> Biochim Biophys Acta. 356, 276-287 (1974).</li><li>Kennedy, M. B., Bennett, M. K., Erondu, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+immunochemical+evidence+that+the+"major+postsynaptic+density+protein"+is+a+subunit+of+a+calmodulin-dependent+protein+kinase.">Biochemical and immunochemical evidence that the "major postsynaptic density protein" is a subunit of a calmodulin-dependent protein kinase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80, 7357-7361 (1983).</li><li>Moon, I. S., Apperson, M. L., Kennedy, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+tyrosine-phosphorylated+protein+in+the+postsynaptic+density+fraction+is+N-methyl-D-aspartate+receptor+subunit+2B.">The major tyrosine-phosphorylated protein in the postsynaptic density fraction is N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2B.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 3954-3958 (1994).</li><li>Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rat+brain+postsynaptic+density+fraction+contains+a+homolog+of+the+Drosophila+discs-large+tumor+suppressor+protein.">The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein.</a> Neuron. 9, 929-942 (1992).</li><li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+amphetamine-induced+hyperactivity+and+reward+in+mice+overexpressing+the+dopamine+transporter.">Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4405-4410 (2008).</li><li>Ma, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity-induced+Gadd45b+promotes+epigenetic+DNA+demethylation+and+adult+neurogenesis.">Neuronal activity-induced Gadd45b promotes epigenetic DNA demethylation and adult neurogenesis.</a> Science. 323, 1074-1077 (2009).</li><li>Budreck, E. C., Scheiffele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroligin-3+is+a+neuronal+adhesion+protein+at+GABAergic+and+glutamatergic+synapses.">Neuroligin-3 is a neuronal adhesion protein at GABAergic and glutamatergic synapses.</a> The European Journal of Neuroscience. 26, 1738-1748 (2007).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arc/Arg3.1+regulates+an+endosomal+pathway+essential+for+activity-dependent+beta-amyloid+generation.">Arc/Arg3.1 regulates an endosomal pathway essential for activity-dependent beta-amyloid generation.</a> Cell. 147, 615-628 (2011).</li><li>Huttner, W. B., Schiebler, W., Greengard, P., De Camilli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapsin+I+(protein+I),+a+nerve+terminal-specific+phosphoprotein.+III.+Its+association+with+synaptic+vesicles+studied+in+a+highly+purified+synaptic+vesicle+preparation.">Synapsin I (protein I), a nerve terminal-specific phosphoprotein. III. Its association with synaptic vesicles studied in a highly purified synaptic vesicle preparation.</a> J Cell Biol. 96, 1374-1388 (1983).</li><li>Nagy, A., Baker, R. R., Morris, S. J., Whittaker, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+preparation+and+characterization+of+synaptic+vesicles+of+high+purity.">The preparation and characterization of synaptic vesicles of high purity.</a> Brain Res. 109, 285-309 (1976).</li><li>Cheng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+and+absolute+quantification+of+postsynaptic+density+proteome+isolated+from+rat+forebrain+and+cerebellum.">Relative and absolute quantification of postsynaptic density proteome isolated from rat forebrain and cerebellum.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics : MCP. 5, 1158-1170 (2006).</li><li>Sheng, M., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+postsynaptic+architecture+of+excitatory+synapses:+a+more+quantitative+view.">The postsynaptic architecture of excitatory synapses: a more quantitative view.</a> Annu Rev Biochem. 76, 823-847 (2007).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning : a Laboratory Manual. , (1989).</li><li>Eggena, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+histone+H1+as+a+cognate+antigen+of+the+ulcerative+colitis-associated+marker+antibody+pANCA.">Identification of histone H1 as a cognate antigen of the ulcerative colitis-associated marker antibody pANCA.</a> J Autoimmun. 14, 83-97 (2000).</li><li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homodimerization+of+the+beta2-adrenergic+receptor+as+a+prerequisite+for+cell+surface+targeting.">Homodimerization of the beta2-adrenergic receptor as a prerequisite for cell surface targeting.</a> J Biol Chem. 279, 33390-33397 (2004).</li><li>Bernocco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+detergent+fractionation+of+primary+neurons+for+proteomics+studies.">Sequential detergent fractionation of primary neurons for proteomics studies.</a> Proteomics. 8, 930-938 (2008).</li><li>Grunewald, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+localization+and+cytosolic+overexpression+of+LASP-1+correlates+with+tumor+size+and+nodal-positivity+of+human+breast+carcinoma.">Nuclear localization and cytosolic overexpression of LASP-1 correlates with tumor size and nodal-positivity of human breast carcinoma.</a> BMC Cancer. 7, 198 (2007).</li><li>Heimann, K., Percival, J. M., Weinberger, R., Gunning, P., Stow, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+isoforms+of+actin-binding+proteins+on+distinct+populations+of+Golgi-derived+vesicles.">Specific isoforms of actin-binding proteins on distinct populations of Golgi-derived vesicles.</a> J Biol Chem. 274, 10743-10750 (1999).</li><li>Neff, R. A., Gomez-Varela, D., Fernandes, C. C., Berg, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+scaffolds+for+nicotinic+receptors+on+neurons.">Postsynaptic scaffolds for nicotinic receptors on neurons.</a> Acta Pharmacol Sin. 30, 694-701 (2009).</li><li>Cella, N., Cornejo-Uribe, R. R., Montes, G. S., Hynes, N. E., Chammas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lysosomal-associated+membrane+protein+LAMP-1+is+a+novel+differentiation+marker+for+HC11+mouse+mammary+epithelial+cells.">The lysosomal-associated membrane protein LAMP-1 is a novel differentiation marker for HC11 mouse mammary epithelial cells.</a> Differentiation. 61, 113-120 (1996).</li><li>Otera, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomal+targeting+signal+receptor+Pex5p+interacts+with+cargoes+and+import+machinery+components+in+a+spatiotemporally+differentiated+manner:+conserved+Pex5p+WXXXF/Y+motifs+are+critical+for+matrix+protein+import.">Peroxisomal targeting signal receptor Pex5p interacts with cargoes and import machinery components in a spatiotemporally differentiated manner: conserved Pex5p WXXXF/Y motifs are critical for matrix protein import.</a> Mol Cell Biol. 22, 1639-1655 (2002).</li><li>Goubaeva, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+mitochondrial+connexin+43+regulates+apoptosis.">Cardiac mitochondrial connexin 43 regulates apoptosis.</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 97-103 (2007).</li><li>Lamers, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+S-100B,+neuron-specific+enolase+(NSE),+myelin+basic+protein+(MBP)+and+glial+fibrillary+acidic+protein+(GFAP)+in+cerebrospinal+fluid+(CSF)+and+blood+of+neurological+patients.">Protein S-100B, neuron-specific enolase (NSE), myelin basic protein (MBP) and glial fibrillary acidic protein (GFAP) in cerebrospinal fluid (CSF) and blood of neurological patients.</a> Brain Res Bull. 61, 261-264 (2003).</li><li>Arunachalam, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Munc18-1+is+critical+for+plasma+membrane+localization+of+syntaxin1+but+not+of+SNAP-25+in+PC12+cells.">Munc18-1 is critical for plasma membrane localization of syntaxin1 but not of SNAP-25 in PC12 cells.</a> Mol Biol Cell. 19, 722-734 (2008).</li><li>Brandstatter, J. H., Fletcher, E. L., Garner, C. C., Gundelfinger, E. D., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+the+presynaptic+cytomatrix+protein+bassoon+among+ribbon+synapses+in+the+mammalian+retina.">Differential expression of the presynaptic cytomatrix protein bassoon among ribbon synapses in the mammalian retina.</a> Eur J Neurosci. 11, 3683-3693 (1999).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest to disclose.

יש כמה שלבים בהליך שהם קריטיים לתוצאה מוצלחת. בשלב 3, חשובה שמידת הומוגניות עקבית מושגת עבור כל דגימה. כאשר מאחד רקמה עם homogenizer המנוע מונע, מהירות קבועה משמשת לא רק לסיבוב של העלי, אלא גם עם מספר משיכות. זמן הדגירה בהלם אוסמוטי צריך להיות מדויק, שכן יצירת הומוגניות או דגירה ממושכת בפתרון hypotonic תהיה lyse מיטוכונדריה ולזהם את מדגם SPM. עוד צעד קריטי בהכנה של חומרים כימיים, במיוחד פתרונות סוכרוז; אם molarity של תמיסת סוכרוז הוא שגוי ההליך לא יעבוד. לכן, צריכים להיות מוכנים פתרונות סוכרוז על ידי שקילת סוכרוז, ההמסה ב4 פתרון HEPES מ&quot;מ לאחר מכן הוספת 4 HEPES מ&quot;מ לנפח הסופי המדויק. טיפ פתרון בעיות: לבנות שיפוע מבחן עם פתרונות סוכרוז מוכנים enבטוח שהשיפוע מורכב כראוי. הוספת ריכוזים שונים של כחול bromophenol (לדוגמא, ריכוז סופי של 0.005% -0.02% w / v) לשתיים משלושת פתרונות סוכרוז לסייע בהדמיה של שלוש שכבות נפרדות. חשוב להגביל את כמות הזמן בין כאשר השיפוע מורכב וכאשר צינורות centrifuged. דיפוזיה רגילה תהרוס את השיפוע לאורך זמן, וזה האיץ אם יש רטט על הספסל שבו השיפוע מאוחסן. טרום pipetting של פתרונות לaliquots פרט מאפשר לכרכים מדויקים לpipetted עם pipet פסטר זכוכית. זה גם מקטין את הזמן בין הרכבה וultracentrifugation שיפוע. טיפ פתרון בעיות: לבנות &quot;שיפוע מבחן&quot; עם צבע כחול bromophenol כפי שתואר לעיל באותו הזמן כהדרגתי סוכרוז לצורך הניסוי. היושרה של השיפוע ובכך יכולה להיות במעקב לאורך זמן. שיפוע הבדיקה ישמש כמחוון של דיפוזיה אם הדרגתיים הם התאספו מדי זמן רב מראש או חשופים לרעידות. לבסוף, חשוב לאסוף את דגימת SPM בקטן כמו נפח ככל האפשר, שכן יש צורך לדלל לאחר מכן את המדגם עם 2.5 כרכים של מים. באופן אידיאלי המדגם צריך להיות שנאסף בנפח של 0.4-.7 מ&quot;ל באמצעות מזרק 1 סמ&quot;ק. מומלץ לבנות הדרגתיים רציף במהלך ספין 20 דקות האחרונות בשלב 7 להגביל את הזמן בין הרכבה וultracentrifugation שיפוע. הפרוטוקול כולל את ההמלצה להזמין את כל השברים השונים ולאחסן את אלה ב-80 ° C לניתוח שלאחר מכן. אנחנו הוכחנו ההעשרה של חלבונים לאחר הסינפטי באיור 2 רק כמה מהשברים הללו. עם זאת, מומלץ למדוד את הרמות של חלבון של ריבית בכל אחד מהשברים כדי להבין ההפצה שלה. השוואת distribution של חלבון בשברים עם חלבוני סמן subcellular אחרים גם יעזור כדי לוודא שתנאי הניסוי השיגו חלוקה הרצויה. טבלה 2 מסכמת סמני חלבון נפוץ בשימוש שיכול לשמש כמדדים לשלבים של חלוקה 8,27- 38. ניצול שיפוע סוכרוז רציף נעשה שימוש נרחב כדי להעשיר את ממברנות פלזמה הסינפטי. לשיטה זו היתרון על פני מילויים Percoll רציפים בכך שהפרשי סוכרוז רציפים קלות יותר לעשות ואינו דורש ציוד מיוחד. עם זאת, שיטה זו לא יכולה להיות מספיק כדי למקם חלבון של עניין בדיוק, ועבור יישומים אלה שיפוע Percoll עשוי להיות מועדף.

נוירונים לתקשר באמצעות סינפסות, ואיכות תקשורת זה מוסדרת במידה רבה על ידי שינויים בהרכב החלבונים בסינפסה. בפרט, החלבונים הממוקמים בצפיפות פוסט סינפטי להשתתף בתקשורת עצבית על ידי קולטני הנוירוטרנסמיטר אינטימי פיגומים עם מערכות העברת האותות שלהם 1. יתר על כן, שינויים מתמשכים בכוחו של היעילות הסינפטית נשלטים על ידי התוספת או גריעה של קולטנים בצפיפות פוסט סינפטי 1-6. לכן, הבידוד והכימות של חלבונים סינפטיים הוא טכניקה הכרחית ושימושית כדי לקבל תובנה הדרכים שנוירונים מגיבים לגירויים ולשנות יעילות הסינפטית 7. מאמר זה מתאר טכניקה נפוצה לבודד חלבונים סינפטיים מרקמת המוח של מכרסמים על ידי ultracentrifugation על הדרגתיים סוכרוז רציף. חלק קרום פלזמה הסינפטי יכול להיות מועשר ומבודד המבוסס עלצפיפותה בסוכרוז, שנקבע באופן אמפירי להיות דומה ל1.2 M סוכרוז. בהתאם לשאלה הביולוגית, ניתן להפריד שברים subcellular על ידי הדרגתיים רציף או רציף של שני סוכרוז או Percoll. הדרגתיים רציף יאפשר להפרדת חלבונים לשברים מרובים; זו יכולה להיות שימושית במיוחד כדי להדגים את שיתוף הלוקליזציה של חלבונים בתוך שבריר נתון 8. עם זאת, הכנת הדרגתיים רציף היא מפרכת יותר, ואין צורך ליישומים רבים. הדרגתיים רציף קלים יותר יחסית להכנה וניתן להשתמש בם כדי להפריד בין חלבונים לכמה שברים, בדרך כלל מוגדרים. הדרגתיים רציף שמורכבים משלוש שכבות סוכרוז של molarity הגדלת היה בשימוש נרחב לבודד את חלבונים הקשורים לממברנה הסינפטי הפלזמה (SPM). חלק קרום פלזמה הסינפטי זה יכול להיות מעובד בהמשך לfractio צפיפות פוסט סינפטיn (PSD) על ידי טיפול בחומר ניקוי ובידוד של חלק חומר הניקוי מסיס. כאשר תהליך זה תואר לראשונה בשנתי ה -1960 9,10, במיקרוסקופ אלקטרונים שימש כדי להדגים את האברונים וקרומים כי בערך להגדיר את קרום הפלזמה הסינפטי ושברים צפיפות פוסט סינפטי 9-14. מחקרים אלה הוכיחו את ההכללה של ממברנות של לפני ואחרי הסינפטי ושלפוחית ​​סינפטית בשבריר SPM; לאחר טיפול חומר ניקוי בעיקר האלקטרונים צפופים, צפיפות פוסט סינפטי היתה גלויות לעין. בהליך, הלם hypotonic משמש ללצבוט את התהליכים סינפטיים מהגוף התא 10. צעד זה מנצל את העובדה שהמיטוכונדריה הן עמידה יותר בפני זעזועים האוסמוטי ונותרה על כנן, ולכן הם המשקע בתחתית שיפוע סוכרוז (איור 1). שימוש באותה טכניקת העשרה זו, שברי SPM וPSD היו ראשון ביוכימיתשהוגדר על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide ורצף של רכיבי החלבון העיקריים 15-17. ניתוח כתם בהמשך המערבי נעשה שימוש כדי לזהות ולכמת את הרמות של חלבונים סינפטיים ועוד להגדיר שברים אלה (איור 2). יש לנו להשתמש בטכניקה זו במעבדות שלנו לכמת את השינויים ברמות הסינפטי של טרנספורטר דופאמין המתרחשות כאשר מוקד Slc6a3 משוכפל בעכברים 18. יש לנו גם השתמשתי בטכניקה זו בעכברים חסרי קולטן NMDA לחשוף ירידות סינפסה הספציפית בחלבונים שהם חלק מinteractome DISC1 19. זה בא לידי ביטוי מניתוח כתם מערבי שברי SPM מכילים חלבונים סינפטיים קרום שלפוחית, סמני endosome, חלבוני המיטוכונדריה, אנזימים סינטטיים קרום הקשורים ומולקולות הולכים אותות, כמו גם רכיבים נפרד מצפיפות פוסט סינפטי וממברנות פלזמה הסינפטי 20-23. Eשברים PSD ven יכולים להיות זיהום עם חלבוני המיטוכונדריה בשפע וייתכן שיהיה צורך לבצע שקיעת שיפוע שנייה או שלבים לטיהור נוספים כדי להסיר אותם 13. לאחרונה, ספקטרומטריית מסה כמותית סיפקה רשימה של מעל 100 חלבונים בצפיפות פוסט סינפטי לבד, כמו גם אינדיקציה לשפע היחסי של רכיבים אלה 24,25.

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES, pH 7.4</td><td>BioShop</td><td>HEP003.100</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BioShop</td><td>HEP001.500&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose&amp;nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SUC507.1</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BioBasic</td><td>EB0185</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>BioShop</td><td>PMS123.5</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>BioShop</td><td>APR600.1</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>BioShop</td><td>LEU001.1</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>BioShop</td><td>PEP605.5</td><td></td></tr><tr><td>Benzamidine</td><td>BioShop</td><td>BEN601.25</td><td></td></tr><tr><td>Sodium fluoride</td><td>BioShop</td><td>SFL001.100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyrophosphate</td><td>BioShop</td><td>SPP310.100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium orthovanadate</td><td>BioShop</td><td>SOV664.10</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-glycerophosphate</td><td>BioShop</td><td>GYP001.10</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BioShop</td><td>TRX506.500</td><td></td></tr><tr><td>18 G x 1 &amp;frac12;&amp;rdquo; needle</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>1 cc syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Glass Teflon homogenizer Kontes Duall 23</td><td>VWR</td><td>KT885450-0023</td><td></td></tr><tr><td>IKA Model RW 16 basic stirrer</td><td>IKA Works</td><td>2572100</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall SM-24 fixed angle rotor</td><td>ThermoScientific</td><td>29017</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC 6 Plus centrifuge</td><td>ThermoScientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>Thinwall polyallomer tubes (13.2 ml)</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti rotor swinging bucket</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Beckman L-80 floor ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thickwall polycarbonate tubes (3.5 ml)</td><td>Beckman Coulter</td><td>349622</td><td></td></tr><tr><td>TLA-100.3 fixed angle rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>349481</td><td></td></tr><tr><td>Beckman TL-100 tabletop ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of synaptic plasma membrane and postsynaptic density proteins using a discontinuous sucrose gradient

טכניקות חלוקה subcellular עצביות מאפשרות כימות של חלבונים שנסחרים ומסינפסה. כפי שתואר במקור בשנתי ה -1960 מאוחר, חלבונים הקשורים עם קרום הפלזמה הסינפטי יכולים להיות מבודדים על ידי ultracentrifugation בשיפוע צפיפות סוכרוז. ברגע שקרומים הסינפטי מבודדים, המורכב macromolecular ידוע כצפיפות פוסט סינפטי יכול להיות מבודד לאחר מכן בשל insolubility חומר הניקוי שלה. הטכניקות המשמשות כדי לבודד ממברנות פלזמה הסינפטי וחלבוני צפיפות פוסט סינפטי יישארו זהה במהות לאחר 40 שנים, ונמצאות בשימוש נרחב במחקר מדעי המוח נוכחי. מאמר זה מפרט את חלוקה של חלבונים הקשורים עם קרום הפלזמה הסינפטי וצפיפות פוסט סינפטי באמצעות שיפוע סוכרוז רציף. הכנות חלבון וכתוצאה מכך מתאימות למערבי סופג או ניתוח 2D DIGE.

הכנת שיפוע צפיפות סוכרוז צריכה לגרום להפרדה ברורה של שלושה פתרונות הטוחנות של סוכרוז (0.8, 1.0, ו1.2 M סוכרוז). ראה איור 3 א לדוגמא של השיפוע לפני מדגם החלבון הוא הוסיף. אם השיפוע מוכן יותר מדי מראש, או אם הוא מוכן על משטח ספסל עם רטט מציוד אחר, השיפוע יהיה בסכנה והפרדה ראויה לא תושג. אם הפרדה ברורה של שלושה הפתרונות אינה נראה לעין, מומלץ להפוך את שיפוע חדש לפני הוספת מדגם החלבון. ראו איור 3 ב לדוגמא של שיפוע סוכרוז (חץ שחור) כאשר מדגם החלבון הוא הוסיף. בעקבות צנטריפוגה, שלא צריך להיות להקות ברורות של שברים חלבון בכל שלבי ביניים (0.32 / 0.8, 0.8 / 1.0, 1.0 / 1.2). בנוסף גלולה צריכה להיות גלויה בחלק התחתון של הצינור. ראו איור 3 ג לדוגמאשל להקות שבריר לאחר ultracentrifugation. אם שברים הם רק diffusely נוכחים בשלבי הביניים, סביר להניח כי השיפוע היה בסיכון ועיבוד נוסף לא מומלץ. מערבי סופג בסך הכל, SPM וחלבון PSD1T דגימות מסטריאטום העכבר בא לידי ביטוי באיור 2. ההעשרה של חלבונים סינפטיים כמו GluR1, PSD95, וCaMKII, ניתן דמיין ידי טעינת סכום קבוע של חלבון (10 מיקרוגרם) מכולל, SPM , ושברים PSD. חלבוני Perisynaptic כמו טרנספורטר דופאמין (DAT) מועשרים בשבריר SPM, אך בוטלו בצעדי חומר ניקוי הבאים של תהליך העשרת PSD. כדי להבטיח טעינה שווה ערך, יכולות להיות דמיינו רמות חלבון על קרום הכתם המערבי על ידי צביעה עם Ponceau אדום 26. &quot;פקדי טעינה&quot; המבוסס על נוגדן לעתים קרובות דווח בספרות, אבל זה עשוי להיות מטעה שכן חלבונים סינפטיים יכולים להיות הבדלמוסדר erentially בקבוצות טיפול ניסיוניות. אם &quot;שליטת טעינה&quot; המבוסס על נוגדן היא רצויה, מומלץ ראשון לקבוע העמסת חלבון שווה ערך על ידי צביעת Ponceau, ולאחר מכן לבדוק כמה חלבוני התייחסות לזהות את אלה שלא לשנות בקבוצות ניסוי השונות. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51896/51896fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1 זרימת עבודה של חלוקה subcellular להעשיר SPM ושברים חלבון מסוג PSD. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51896/51896fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2 כתם הנציג מערבי בסך הכל, SPM, וחלבון PSD1T מסטריאטום העכבר. 10 מיקרוגרם של תמצית חלבון נפתרו על SDS-denaturing, אקריל 10%ג&#39;לים אמיד, והועבר לממברנות PVDF. בהמשך לכך כתמים אלה הודגרו עם נוגדנים ראשוניים לαCaMKII, GluR1, PSD-93, וPSD-95, אשר כל הרכיבים של צפיפות פוסט סינפטי. בהתאם לכך, חלבונים אלה מועשרים בSPM והשברים PSD. לחלופין, כתמים הודגרו עם נוגדן ראשוני לDAT, הממוקם בקרומי presynaptic בסטריאטום. בעוד DAT מועשר בשבריר SPM, זה לא חלק ממכלול PSD, וimmunoreactivity לא נצפה בחלק PSD. נוגדנים נגד אקטין או נתרן / אשלגן ATPase (משאבת Na / K) יכולים לשמש כבקרת טעינה, למרות שחלקם תנאי ניסוי עשויים להשפיע על הרמות של חלבונים אלה, כמו גם וכך שליטת הטעינה המתאימה צריכה להיקבע באופן אמפירי. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51896/51896fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3. </strong&gt; דוגמאות מייצגות של שיפוע סוכרוז לפני ואחרי ultracentrifugation. א לאחר השיפוע מוכן, לא צריך להיות שלושה שלבים הנראים כאשר הצינור מתקיים עד האור. החצים הלבנים מצביעים על שלבי הביניים בין 0.8 / 1.0 M פתרונות סוכרוז ו1.0 / 1.2 M פתרונות סוכרוז. B. כאשר המדגם נטען על גבי השיפוע, זה בתמיסת סוכרוז 0.32 M וינוח על גבי 0.8 שכבת סוכרוז M. ג לאחר צנטריפוגה, homogenate יפריד לכמה שברים. החלק צף בשלבי הביניים של פתרונות סוכרוז 0.8 / 1.0 M יהיה מועשר בממברנות המיאלין. החלק בשלבי הביניים של פתרונות סוכרוז 1.0 / 1.2 M מייצג את חלק SPM שנאסף עם מחט ומזרק. גלולה בחלק התחתון של הצינור היא מועשרת לחלבונים במיטוכונדריה. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Soluמשא </td><td> סוכרוז HEPES שנאגר </td><td> מעכבי פרוטאז </td><td> * מעכבי Phophatase </td></tr><tr><td> 1 M HEPES pH 7.4 </td><td> 0.32 M סוכרוז ב4 HEPES מ&quot;מ (pH 7.4) </td><td> 0.25 מ&quot;מ PMSF (מניית 250 מ&quot;מ באתנול, 1,000x) </td><td> 10 מ&quot;מ נתרן פלואוריד (מניית 500 מ&quot;מ, 50x) </td></tr><tr><td> 4 HEPES מ&quot;מ pH 7.4 </td><td> 0.8 M סוכרוז ב4 HEPES מ&quot;מ (pH 7.4) </td><td> 1.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​Aprotinin (מ&quot;ג 1.5 המניה / מ&quot;ל, 1,000x) </td><td> 2.5 מ&quot;מ נתרן Pyrophosphate (מניית 250 מ&quot;מ, 100x) </td></tr><tr><td> DDH 2 O </td><td> 1.0 M סוכרוז ב4 HEPES מ&quot;מ (pH 7.4) </td><td> 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​leupeptin (מניית 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל, 1,000x) </td><td> 1.0 ב-glycerophosphate מ&quot;מ (מניית 200 מ&quot;מ, 200x) </td></tr><tr><td> 50 HEPES מ&quot;מ (pH 7.4) 2 מ&quot;מ EDTA </td><td> 1.2 M סוכרוז ב4 HEPES מ&quot;מ (pH 7.4) </td><td> 0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​Benzamidine (מניית 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל, 1,000x) </td><td> 5.0מ&quot;מ נתרן Orthovanadate (מניית 500 מ&quot;מ, 100x) </td></tr><tr><td></td><td></td><td> 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​Pepstatin (מניית 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​באתנול, 500x) </td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 1 ריאגנטים הנדרש <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="614" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:88px;"> חלק </td><td style="width:191px;"> חלק חלבון </td><td style="width:335px;"> סמן חלבון </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> P1 </td><td> גרעיני </td><td> H1 היסטון 27 </td></tr><tr height="72"><td height="72" style="height:72px;"> S1 </td><td> cytosol / ממברנות </td><td style="width:335px;"> calnexin 28 (reticulum endoplasmic), טובולין 29 (שלד תא), 30 GAPDH (cytosol), 58K Golgi פרוהחלבון ה31 ב( מנגנון Golgi) </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> P2 ו P2 &#39; </td><td> synaptosomes הגולמי </td><td style="width:335px;"> יחידות משנה קולטן AMPA וNMDA 32 </td></tr><tr height="48"><td height="48" style="height:48px;"> S2 וS2 &#39; </td><td> cytosol / ממברנות אור </td><td style="width:335px;"> nNOS1 29, GAPDH (cytosol) (cytosol), LAMP1 33 (הליזוזום), PEX14 34 (peroxisome) </td></tr><tr height="45"><td height="45" style="height:45px;"> P3 </td><td> synaptosome / מיטוכונדריה </td><td style="width:335px;"> VDAC 35 (מיטוכונדריה), יחידות משנה קולטן AMPA וNMDA (synaptosome) </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> S3 </td><td> שלפוחית ​​הסינפטית </td><td style="width:335px;"> SV2 8, synaptophysin 8 </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> 0.8 M / M 1.0 </td><td> מ &#39;<html> ילין </td><td style="width:335px;"> חלבון המיאלין בסיסי 36 </td></tr><tr height="45"><td height="45" style="height:45px;"> 1.0 M / M 1.2 </td><td> SPM </td><td style="width:335px;"> תת יחידות AMPA וNMDA קולטן, סמן סינפטי (SNAP25 8), neurexin 32, neuroligin 32 </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> 1.2 MP </td><td> מיטוכונדריה </td><td style="width:335px;"> 35 VDAC </td></tr><tr height="61"><td height="61" style="height:61px;"> PSD (1T) </td><td> PSD </td><td style="width:335px;"> 32 PSD93, PSD95 32, תת יחידות AMPA וNMDA קולטן, neuroligin, 32 PICK1, CaMKII 32 </td></tr><tr height="24"><td height="24" style="height:24px;"> TS </td><td> ממברנות presynaptic </td><td style="width:335px;"> SNAP25, Munc18 37, בסון 38, neurexin </td></tr><tr height="43">ight: 43px; &quot;&gt; PSD-2T </td><td> PSD המועשר </td><td style="width:335px;"> יחידות משנה קולט PSD95, AMPA וNMDA, PICK1, CaMKII </td></tr></tbody></table> רשימת טבלת 2 של סמני חלבון להבחין שברי subcellular

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient at JoVE.com

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

מאמר זה מפרט את ההעשרה של חלבונים הקשורים עם קרום הפלזמה הסינפטי על ידי ultracentrifugation על שיפוע סוכרוז רציף. ההכנה הבאה של חלבוני צפיפות פוסט סינפטי מתואר גם. הכנות חלבון מתאימות למערבי סופג או ניתוח 2D DIGE.

הכנת Synaptic פלזמה ממברנה וחלבוני צפיפות Postsynaptic באמצעות שיפוע סוכרוז רציף

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

preparation-synaptic-plasma-membrane-postsynaptic-density-proteins

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

31.1K Views.  University of Toronto.  מאמר זה מפרט את ההעשרה של חלבונים הקשורים עם קרום הפלזמה הסינפטי על ידי ultracentrifugation על שיפוע סוכרוז רציף. ההכנה הבאה של חלבוני צפיפות פוסט סינפטי מתואר גם. הכנות חלבון מתאימות למערבי סופג או ניתוח 2D DIGE. 

Video: Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate neurotransmission that occurs within synapses because it is highly regulated by dynamic protein-protein interactions and phosphorylation events. Accordingly, when any method is used to study synaptic transmission, a major goal is to preserve these transient physiological modifications. Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments. In other words, the protocol describes a biochemical methodology to carry out protein enrichment from presynaptic, postsynaptic, and extrasynaptic compartments. First, synaptosomes, or synaptic terminals, are obtained from neurons that contain all synaptic compartments by means of a discontinuous sucrose gradient. Of note, the quality of this initial synaptic membrane preparation is critical. Subsequently, the isolation of the different subsynaptic compartments is achieved with light solubilization using mild detergents at differential pH conditions. This allows for separation by gradient and isopycnic centrifugations. Finally, protein enrichment at the different subsynaptic compartments (i.e., pre-, post- and extrasynaptic membrane fractions) is validated by means of immunoblot analysis using well-characterized synaptic protein markers (i.e., SNAP-25, PSD-95, and synaptophysin, respectively), thus enabling a direct assessment of the synaptic distribution of any particular neuronal protein.

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments.

קרום המוח Fractation: An<em&gt; אקס ויוו</em&gt; גישה כדי להעריך לוקליזציה חלבון subsynaptic

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Biochemistry

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

הגנום כולו כימות של תרגום ניצני שמרים על-ידי יצירת פרופיל ריבוזום

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

הכנת Synaptoneurosomes מ - עכבר Cortex באמצעות צבע רציפה Percoll-סוכרוז צפיפות

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma membrane and then transported to the early endosomes. The internalized proteins could be transited to the lysosome for degradation or recycled back to the plasma membrane. A robust endocytic recycling pathway is required to balance the removal of membrane materials from endocytosis. Various proteins are reported to regulate the pathway, including ADP-ribosylation factor 6 (ARF6). Density gradient ultracentrifugation is a classical method for cell fractionation. After the centrifugation, organelles are sedimented at their isopycnic surface. The fractions are collected and used for other downstream applications. Described here is a protocol to obtain a recycling endosome-containing fraction from transfected mammalian cells using density gradient ultracentrifugation. The isolated fractions were subjected to standard Western blotting for analyzing their protein contents. By employing this method, we identified that the plasma membrane targeting of engulfment and cell motility 1 (ELMO1), a Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (Rac1) guanine nucleotide exchange factor, is through ARF6-mediated endocytic recycling.

This paper aims to present a protocol for preparing recycling endosomes from mammalian cells using sucrose density gradient ultracentrifugation.

צפיפות הדרגתית אולטרה-מרכזית לחקירת מיחזור אנדוציטי בתאי יונקים

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs being translated by ribosomes, and analyze polysome associated factors. While automated gradient makers and gradient fractionation systems are commonly used with this technique, these systems are generally expensive and can be cost-prohibitive for laboratories that have limited resources or cannot justify the expense due to their infrequent or occasional need to perform this method for their research. Here, a protocol is presented to reproducibly generate polysome profiles using standard equipment available in most molecular biology laboratories without specialized fractionation instruments. Moreover, a comparison of polysome profiles generated with and without a gradient fractionation system is provided. Strategies to optimize and produce reproducible polysome profiles are discussed. Saccharomyces cerevisiae is utilized as a model organism in this protocol. However, this protocol can be easily modified and adapted to generate ribosome profiles for many different organisms and cell types.

This protocol describes how to generate a polysome profile without using automated gradient makers or gradient fractionation systems.

פרופיל פוליזום ללא יצרני שיפועים או מערכות פיצול

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

בידוד אתרי מגע מיטוכונדריאליים

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the synthesis of iron-sulfur clusters, lipids, or proteins, Ca2+ buffering, and the induction of apoptosis. Likewise, mitochondrial dysfunction results in severe human diseases such as cancer, diabetes, and neurodegeneration. In order to perform these functions, mitochondria have to communicate with the rest of the cell across their envelope, which consists of two membranes. Therefore, these two membranes have to interact constantly. Proteinaceous contact sites between the mitochondrial inner and outer membranes are essential in this respect. So far, several contact sites have been identified. In the method described here, Saccharomyces cerevisiae mitochondria are used to isolate contact sites and, thus, identify candidates that qualify for contact site proteins. We used this method to identify the mitochondrial contact site and cristae organizing system (MICOS) complex, one of the major contact site-forming complexes in the mitochondrial inner membrane, which is conserved from yeast to humans. Recently, we further improved this method to identify a novel contact site consisting of Cqd1 and the Por1-Om14 complex.

מחבר זרקור: חשיפת אתרי קשר מיטוכונדריאליים ותובנות אדריכליות 

Mitochondrial contact sites are protein complexes that interact with mitochondrial inner and outer membrane proteins. These sites are essential for the communication between the mitochondrial membranes and, thus, between the cytosol and the mitochondrial matrix. Here, we describe a method to identify candidates qualifying for this specific class of proteins.

שיטה משופרת לבידוד אתרי מגע מיטוכונדריאליים

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

ניצול מתודולוגיות משולב להגדיר את התפקיד של משלוח ממברנה פלזמה במהלך אקסון מסעף ו העצבית המורפוגנזה

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to na&#239;ve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment. 
High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/na&#239;ve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.

The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.

גבוהה פרופיל Proteome Synaptic החלטה כמותי של אזורים במוח העכבר לאחר למידה אפליה שמיעתית

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

הכנת Synaptic פלזמה ממברנה וחלבוני צפיפות Postsynaptic באמצעות שיפוע סוכרוז רציף

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

קרום המוח Fractation: An

הגנום כולו כימות של תרגום ניצני שמרים על-ידי יצירת פרופיל ריבוזום

הכנת Synaptoneurosomes מ - עכבר Cortex באמצעות צבע רציפה Percoll-סוכרוז צפיפות

צפיפות הדרגתית אולטרה-מרכזית לחקירת מיחזור אנדוציטי בתאי יונקים

פרופיל פוליזום ללא יצרני שיפועים או מערכות פיצול

שיטה משופרת לבידוד אתרי מגע מיטוכונדריאליים

שיטה משופרת לבידוד אתרי מגע מיטוכונדריאליים

שיטה משופרת לבידוד אתרי מגע מיטוכונדריאליים

ניצול מתודולוגיות משולב להגדיר את התפקיד של משלוח ממברנה פלזמה במהלך אקסון מסעף ו העצבית המורפוגנזה

גבוהה פרופיל Proteome Synaptic החלטה כמותי של אזורים במוח העכבר לאחר למידה אפליה שמיעתית