מחקר זה קיבל השראה מעבודתו של לוין ואח &#39;. , אשר תיאר שיטה זו ניסיוני וסיפק תיאור מקיף של פיתוח כלי הדם ב Xenopus laevis. אנו מודים לחברי המעבדה שלנו על הקלט שלהם. מחקר זה נתמך על ידי יוזמת המחקר המובילה של Yonsei University for Future of 2015 (2015-22- 0095) ותוכנית פיתוח הטכנולוגיה הביו-רפואית של הקרן הלאומית למחקר (NRF) הממומנת על ידי משרד המדע, ICT &amp; תכנון עתידי ( NRF-2013M3A9D5072551)

<ol>
	<li>Herbert, S. P., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+control+of+endothelial+cell+behaviour+during+blood+vessel+morphogenesis.">Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (9), 551-564 (2011).</li><li>Augustin, H. G., Koh, G. Y., Thurston, G., Alitalo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+vascular+morphogenesis+and+homeostasis+through+the+angiopoietin-Tie+system.">Control of vascular morphogenesis and homeostasis through the angiopoietin-Tie system.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (3), 165-177 (2009).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arteries+and+veins:+making+a+difference+with+zebrafish.">Arteries and veins: making a difference with zebrafish.</a> Nat Rev Genet. 3 (9), 674-682 (2002).</li><li>Levine, A. J., Munoz-Sanjuan, I., Bell, E., North, A. J., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+endothelial+cells+allows+in+vivo,+continuous+characterization+of+the+vascular+development+of+Xenopus+laevis.">Fluorescent labeling of endothelial cells allows in vivo, continuous characterization of the vascular development of Xenopus laevis.</a> Dev Biol. 254 (1), 50-67 (2003).</li><li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+Mediates+Ca2+-Dependent+Inhibition+of+Tie2+Signaling+and+Acts+as+a+Developmental+Brake+During+Embryonic+Angiogenesis.">Calmodulin Mediates Ca2+-Dependent Inhibition of Tie2 Signaling and Acts as a Developmental Brake During Embryonic Angiogenesis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (7), 1406-1416 (2016).</li><li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell-stage+Xenopus+embryo.">Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo.</a> Dev Biol. 122 (2), 300-319 (1987).</li><li>Elliott, K. L., Houston, D. W., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+Xenopus+laevis+tissues+to+determine+the+ability+of+motor+neurons+to+acquire+a+novel+target.">Transplantation of Xenopus laevis tissues to determine the ability of motor neurons to acquire a novel target.</a> PLoS One. 8 (2), 55541 (2013).</li><li>Grainger, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+tropicalis+as+a+model+organism+for+genetics+and+genomics:+past,+present,+and+future.">Xenopus tropicalis as a model organism for genetics and genomics: past, present, and future.</a> Methods Mol Biol. 917, 3-15 (2012).</li><li>Weisgraber, K. H., Innerarity, T. L., Mahley, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+lysine+residues+of+plasma+lipoproteins+in+high+affinity+binding+to+cell+surface+receptors+on+human+fibroblasts.">Role of lysine residues of plasma lipoproteins in high affinity binding to cell surface receptors on human fibroblasts.</a> J Biol Chem. 253 (24), 9053-9062 (1978).</li><li>Showell, C., Conlon, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg+collection+and+in+vitro+fertilization+of+the+western+clawed+frog+Xenopus+tropicalis.">Egg collection and in vitro fertilization of the western clawed frog Xenopus tropicalis.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009 (9), 5293 (2009).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1956).</li><li>Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Neurite+Tracer:+open+source+software+for+reconstruction,+visualization+and+analysis+of+neuronal+processes.">Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes.</a> Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).</li><li>Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-autonomous+TrkB+signaling+in+presynaptic+retinal+ganglion+cells+mediates+axon+arbor+growth+and+synapse+maturation+during+the+establishment+of+retinotectal+synaptic+connectivity.">Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity.</a> J Neurosci. 27 (10), 2444-2456 (2007).</li><li>Cha, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionarily+repurposed+networks+reveal+the+well-known+antifungal+drug+thiabendazole+to+be+a+novel+vascular+disrupting+agent.">Evolutionarily repurposed networks reveal the well-known antifungal drug thiabendazole to be a novel vascular disrupting agent.</a> PLoS Biol. 10 (8), 1001379 (2012).</li><li>Ny, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+Xenopus+laevis+reporter+model+to+study+lymphangiogenesis.">A transgenic Xenopus laevis reporter model to study lymphangiogenesis.</a> Biol Open. 2 (9), 882-890 (2013).</li><li>Bussmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arteries+provide+essential+guidance+cues+for+lymphatic+endothelial+cells+in+the+zebrafish+trunk.">Arteries provide essential guidance cues for lymphatic endothelial cells in the zebrafish trunk.</a> Development. 137 (16), 2653-2657 (2010).</li><li>Li, X. M., Hu, Z., Jorgenson, M. L., Slayton, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+levels+of+acetylated+low-density+lipoprotein+uptake+and+low+tyrosine+kinase+with+immunoglobulin+and+epidermal+growth+factor+homology+domains-2+(Tie2)+promoter+activity+distinguish+sinusoids+from+other+vessel+types+in+murine+bone+marrow.">High levels of acetylated low-density lipoprotein uptake and low tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domains-2 (Tie2) promoter activity distinguish sinusoids from other vessel types in murine bone marrow.</a> Circulation. 120 (19), 1910-1918 (2009).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול שהוצג כאן פותח לראשונה על ידי עלי H. Brivanlou ועמיתיו לחקור אירועים התפתחותיים במהלך היווצרות כלי הדם ב Xenopus laevis 4 , אבל, כפי שמוצג בכתב יד זה, זה יכול להיות מיושם על בעלי חיים קטנים אחרים. הזרקת דיו לתוך הלב הוא פשוט לבצע, ואת הרשת כלי הדם כולו יכול להיות צילמו תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי פלואורסצנטי, כמו גם מיקרוסקופ confocal. אם הצבע מוזרק ללב במהלך פיתוח כלי שיט, הדינמיקה של כלי השיט ואת הסתעפות יכול להיות צילמו בזמן אמת 4 . באמצעות הרשת הוורידית מוגדרת היטב, במיוחד ה- PCV ו רוב ISVs, מקרין את ההשפעות של הפרעות גנטיות או סביבתיים על אנגיוגנזה ניתן להעריך באופן כמותי. השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה הוא הזרקת DiI-ACLDL (שלב 4). אנו מספקים דוגמאות לזריקות מוצלחות ולא מוצלחות ( Fi3). עוברים מוזרק בהצלחה צריך להיות מוקרן תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כמתואר בשלב 4.3. אם PCV אינו גלוי 30 דקות לאחר ההזרקה, לא מספיק DiI-AcLDL הוזרק ( איור 3 ג ). עוברים מוזרקים בהצלחה עשוי להיות הרדים מוזרק שוב. במקרים מסוימים, DiI-AcLDL עשוי להיות מוזרק לתוך מיקום שגוי, ובמקרה זה איברים אחרים יפורטו ( איור 3D ). מחק עוברי מוזרקים שגוי. כלי הדם של העובר מוזרק בהצלחה יהיה גלוי זמן קצר לאחר ההזרקה, ואת הקרינה נמשכת כמה שעות. לכן, אם ההזרקה מבוצעת לפני היווצרות של ISVs, הפיתוח שלהם יכול להיות צילמו בעובר חי, מתן כלי רב עוצמה כדי לחקור את הפיתוח של מערכת הלב וכלי הדם בזמן אמת ב vivo 4 . כמו קסנופוס שימש בהצלחה כמודל למסך כלי הדם ד14 , הגישה הניסויית המתוארת כאן עשויה להיות משולבת עם ניסויים הפרעה פרמקולוגית ומשמשת פלטפורמת הקרנה כדי למצוא תרופות המעצימות או מעכבות אנגיוגנזה. כלי הדם יכולים להיות דמיינו על ידי כלים גנטיים, כמו גם על ידי צבע מבוססי שיטות תיוג המתואר כאן. לדוגמה, מהונדס Xenopus 15 או דג הזברה 16 המבטאים חלבונים הקרינה תחת שליטה מסוגים ספציפיים סוג תא לאפשר הדמיה חיה של דם כלי הלימפה, וזה אפשרי אפילו להפלות עורקים מורידי 16 . למרות גישות גנטיות עדיפות וליצור יעילות תיוג עקבית יותר, שיטות מבוססות צבע הם נגישים בקלות על רוב המעבדות ללא גישה אלה בעלי חיים מהונדסים גנטית. ב Xenopus , זלוף transcardial של תוצאות DII-ACLDL בתיוג של רוב התאים האנדותל 4 , העורקים והוורידים אינם ניתנים להבדיל בתמונות הקרינה. למרבה הפלא, עגבניות lectin-fluorescein סלקטיבית תוויות העורקים בעכברים, וכאשר שיתוף הזריקו עם DiI-AcLDL, העורקים והורידים ניתן להפלות 17 . למרות היישום לא נבדק ברקמות אחרות או בעלי חיים, זה מספק כיוון מבטיח לחקור את התפתחות דינמית של העורקים והורידים Xenopus .

Vasculogenesis, היווצרות של כלי דם חדשים תאים אנדותל שנולדו לאחרונה, אנגיוגנזה, היווצרות של כלים חדשים מן הכלים הקיימים מראש, הם שני תהליכים שונים המעצבים את כלי הדם עובריים 1 . כל dysregulation בתהליכים אלה גורמת למחלות לב שונות וחריגות מבניות של כלי שיט. יתר על כן, הגידול קשורה לצמיחה כלי בלתי מבוקרת. ככזה, מנגנונים מולקולריים שבבסיס וסקולוגנזה ואנגיוגנזה הם נושא לחקירה אינטנסיבית 2 . Xenopus דג הזברה הם מודלים חוליות אטרקטיבי עבור vasculogenesis ומחקרים אנגיוגנזה, מכמה סיבות. ראשית, העוברים שלהם קטנים; לכן, קל יחסית לדמיין את כלי הדם כולו. שנית, התפתחות עובריים היא מהירה; זה לוקח רק כמה ימים על כל כלי הדם לפתח, שבמהלכן vascul המתפתח<html> בבית ניתן לדמות. שלישית, התערבויות גנטיות פרמקולוגיות לפני ובמהלך היווצרות כלי הם קלים לביצוע, כגון באמצעות microinjection של antisense morpholino נוקליאוטידים (MO) לתוך העובר המתפתח או באמצעות יישום אמבטיה של תרופות 3 , 4 , 5 . היתרון הייחודי של Xenopus על דג הזברה היא כי מניפולציות אמבריולוגיות ניתן לבצע כי Xenopus עוקב clevages holoblastic סטריאוטיפיים ואת מפת הגורל עובריים מוגדר היטב 6 . לדוגמה, ניתן ליצור עובר שבו צד אחד לרוחב רק מניפולציה גנטית על ידי הזרקת מו antisense לתא אחד בשלב שני תא. ניתן גם להשתיל את הלימבורד הלב מעובר אחד לאחר כדי לקבוע אם הגן מפעיל את תפקודו על ידי מנגנון פנימי או מהותי-תאהתחת = &quot;xref&quot;&gt; 7. למרות טכניקות אלו פותחו בעיקר Xenopus laevis , שהוא allotetraploid ולכן אינו אידיאלי עבור מחקרים גנטיים, הם יכולים להיות מיושמים ישירות Xenopus tropicalis , מינים דיפלואידי קרובים 8 . אחת הדרכים לדמיין את כלי הדם בעובר Xenopus לחיות היא להזריק צבע פלואורסצנטי לתווית את כלי הדם. Acetylated צפיפות נמוכה lipoprotein (AcLDL) שכותרתו עם מולקולת פלורסנט כגון DiI הוא בדיקה מאוד שימושי. שלא כמו lDL unacetylated, AcldL אינו קשור לקולטן LDL 9 אבל הוא endocytosed על ידי מקרופאגים ותאי אנדותל. הזרקת DiI-ACLDL אל הלב של חיה תוצאות חיה תיוג פלורסנט ספציפיים של תאים אנדותל, ואת כלי הדם כולו יכול להיות צילמו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי בעוברים חיים או קבוע 4 . הנה, אנחנו presEnt מפורט פרוטוקולים להדמיה וכימות של כלי הדם באמצעות DiI-AcLDL ב xenopus tropicalis ( איור 1 ). אנו מספקים נקודות מעשיות מרכזיות, עם דוגמאות של ניסויים מוצלחים ולא מוצלחים. בנוסף, אנו מספקים שיטה פשוטה לניתוח כמותי של המורכבות של כלי הדם, אשר עשוי להיות שימושי בהערכת ההשפעות של גורמים גנטיים וסביבתיים על עיצוב של רשת כלי הדם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="539">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">35mm Petri dish</td>
			<td style="width:113px;">SPL</td>
			<td style="width:93px;">10035</td>
			<td style="width:180px;">Sylgard mold frame</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">60mm Petri dish</td>
			<td style="width:113px;">SPL</td>
			<td style="width:93px;">10060</td>
			<td>Embryo raising tray</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Borosilicate Glass</td>
			<td style="width:113px;">Sutter instrument</td>
			<td style="width:93px;">B100-50-10</td>
			<td>Needle for injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">BSA</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">A3059-10G</td>
			<td>Coating reagent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">CaCl2</td>
			<td style="width:113px;">D.S.P.GR Reagent</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>0.1X MBS component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Coverslip</td>
			<td style="width:113px;">Superior</td>
			<td style="width:93px;">HSU-0111520</td>
			<td>For confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">DiI-AcLDL</td>
			<td style="width:113px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:93px;">L3484</td>
			<td>Vessel staining solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">FBS</td>
			<td style="width:113px;">Hyclone</td>
			<td style="width:93px;">SH.30919.02</td>
			<td>For storage of testis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Fiber Optical Illuminator</td>
			<td style="width:113px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:93px;">Z-LITE-Z</td>
			<td>Light</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Ficoll</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">F4375</td>
			<td>Injection buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td style="width:113px;">Sutter instrument</td>
			<td style="width:93px;">P-97</td>
			<td>Injection needle puller</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Forcep</td>
			<td style="width:113px;">Fine Science Tool</td>
			<td style="width:93px;">11255-20</td>
			<td style="width:180px;">For embryo hatching and 
			needle tip cutting</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Glass Bottom dish</td>
			<td style="width:113px;">SPL</td>
			<td style="width:93px;">100350</td>
			<td>For confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">hCG</td>
			<td style="width:113px;">MNS Korea</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>For priming of frogs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">HEPES</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">H3375</td>
			<td>Buffering agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Incubator</td>
			<td style="width:113px;">Lab. Companion</td>
			<td style="width:93px;">ILP-02</td>
			<td>For raising embryos</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">KCl</td>
			<td style="width:113px;">DAEJUNG</td>
			<td style="width:93px;">6566-4400</td>
			<td>MBS component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">L15 medium</td>
			<td style="width:113px;">Gibco</td>
			<td style="width:93px;">11415-114</td>
			<td>For storage of testis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">L-cysteine</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">168149-100G</td>
			<td>De-jellying reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">MgSO4</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">M7506</td>
			<td>MBS component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Microtube</td>
			<td style="width:113px;">Axygen</td>
			<td style="width:93px;">MCT-175-C-S</td>
			<td>For storage of testis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">MS222</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">E10521</td>
			<td>Anesthetic powder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">NaCl</td>
			<td style="width:113px;">DAEJUNG</td>
			<td style="width:93px;">7647-14-5</td>
			<td>MBS component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">NaOH</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">S-0899</td>
			<td>pH adjusting reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">P6148</td>
			<td>Fixatives</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">PBS</td>
			<td style="width:113px;">BIOSESANG</td>
			<td style="width:93px;">P2007</td>
			<td>Buffer for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">pH paper</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">P4536-100EA</td>
			<td>For confirming pH</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">PICO-LITER INJECTOR</td>
			<td style="width:113px;">Waner instruments</td>
			<td style="width:93px;">PLI-100A</td>
			<td>For injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Pin</td>
			<td style="width:113px;">Pinservice</td>
			<td style="width:93px;">26002-10</td>
			<td>For incision</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Pinholder</td>
			<td style="width:113px;">Scitech Korea</td>
			<td style="width:93px;">26016-12</td>
			<td>For incision</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Precision Stereo Zoom Binocular Microscope</td>
			<td style="width:113px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:93px;">PZMIII</td>
			<td>For visual screening</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:153px;">Standard Manual Control Micromanipulator&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Waner instruments</td>
			<td style="width:93px;">W4 64-0056</td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">SYLGARD 184 Kit</td>
			<td style="width:113px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>For DiI injection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Transfer pipette</td>
			<td style="width:113px;">Korea Ace Scientific Co.</td>
			<td style="width:93px;">YM.B78-400</td>
			<td>For eggs and 
			embryo collection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and quantitative analysis of embryonic angiogenesis in xenopus tropicalis

כלי הדם מספקים חמצן וחומרים מזינים בכל הגוף, ויצירת רשת כלי הדם נמצאת תחת שליטה התפתחותית הדוקה. הדמיה יעילה של vivo של כלי הדם ואת כימות אמין של המורכבות שלהם הם המפתח להבנת ביולוגיה ומחלות של הרשת כלי הדם. כאן, אנו מספקים שיטה מפורטת לדמיין כלי דם עם צבע פלורסנט זמין מסחרית, פלזמה אנושית acetylated צפיפות נמוכה lipoprotein DiI מורכבים (DiI-AcLDL), וכמות המורכבות שלהם tropis Xenopus . כלי דם יכול להיות מתויג על ידי הזרקת פשוטה של ​​DiI-AcLDL לתוך הלב פועם של העובר, וכלי הדם העובר כולו יכול להיות צילמו עוברי לחיות או קבוע. בשילוב עם הפרעות גנטיות על ידי המיקרו-זרקור הממוקד של חומצות גרעין ו / או יישום אמבט של ריאגנטים פרמקולוגיים, תפקידים של גן או של מסלול איתות על התפתחות כלי הדם יכולים להיות inveStigated בתוך שבוע מבלי להזדקק חיות מתוחכמות מהונדסים גנטית. בגלל מערכת ורידים מוגדרת היטב של קסנופוס ואת אנגיוגנזה סטריאוטיפית שלה, הנבטה של ​​כלי קיים מראש, מורכבות כלי ניתן לכמת ביעילות לאחר ניסויים ההפרעה. זה פרוטוקול פשוט יחסית צריך לשמש כלי נגיש בקלות בתחומים מגוונים של מחקר לב וכלי דם.

ציר הזמן של ניסויים (תרשימים 1 ו -2) זמן קצר לאחר ההפריה, ממוקד microinjection יכול להתבצע כדי לווסת ביטוי גנים. לדוגמה, antisense MO אשר נקשר ספציפית קודון חניכה של mRNA Tie2 אנדוגני יכול להיות מוזרק, מעכב את התרגום של mRNA היעד Tie2 ידי מכשול סטרי. מו יכול להיות מצומדות כדי פלואורסצין עבור הקרנה חזותית קלה של עוברי מוזרק בהצלחה. לחלופין, mRNA נותב ( למשל, קידוד mRNA קידוד EGFP) ניתן שיתוף מוזרק עם MO. בנוסף, תרופות ניתן לטפל על ידי יישום אמבטיה לאחר הבקיעה (שלב tailbud מוקדם, סביב NF שלב 26). ממיסים את התרופה 0.1x MBS ולהוסיף אותו העוברים. לטיפול מוקדם יותר, עוברי יכול להיות משוחרר מן הקרומים עם זוג מלקחיים. DiI-AcLDL יכול להיות מוזרק ללב סביב שלב 33/34 לחקור את הדינמיקה של כלי כליAtion, אבל בדרך כלל אנחנו מזריקים בשלב 37/38 או מאוחר יותר ( איור 2 , אזורים צבעוניים). דוגמאות אופייניות לזריקות מוצלחות ולא מוצלחות (שלב 4.3) (איור 3) הדמיה סטריאוסקופית מתאימה להקרנה חזותית. אם כמות מספקת של DiI-AcLDL מוזרק לתוך הלב, ה- PCV צריך להיות גלוי מיד תחת stereoscope פלואורסצנטי ( איור 3 א ו 3 ב ). עוברים הזרקת מספיק או לא מזוהים קל לזהות ( איור 3 ג ו -3 D ). עוברים עם כמות מספקת של DiI-AcLDL ( איור 3 ג ) ניתן להזריק שוב עם צבע זהה עד כלי נראים בבירור. התמונה הזריקו בהצלחה עוברי תחת מיקרוסקופ confocal, חי או לאחר קיבוע. פיתוח פוסטריםאו הווריד הקרדינלי (PCV) והורידים האינטרסומיים (ISV) ה- PCV משתרע בכיוון הזווית אל הזנב, ותוסף זה מסתיים סביב שלב 37/38. ISVs יוצאים dorsally מן PCV בגל הקדמי אל האחורי. גל זה של הקמת ISV מתחיל בשלב 36 ומסתיים סביב שלב 40/41; ISVs ממשיכים לגדול ולהיות מסועפת קלות עד שלב 43 ( איור 3 א ו 3 ב ). Tie2 איתות שולט התפתחותי ISV הסתעפות (איור 4) PCV ו- ISVs לגדול דפוס סטריאוטיפי, ואת הפיתוח שלהם תחת שליטה הדוקה ( איור 4 א ). ניתן לתאר את התהוות של ה- ISV מה- PCV כאנגיוגנזה, ולכן הוא מודל שימושי לבדיקת מנגנונים מולקולריים שבבסיס אנגיוגנזה. אנו מציגים את התוצאה של המחקר הנוכחי שלנו showiNg כי אותות התפתחותיים לעכב Tie2 איתות ב ISVs להגביל את הסתעפות שלהם 5 . את מציאה של Tie2 איתות על ידי antisense MO מקטין את אורך ומורכבות של ISVs (איור 4 ב), וביטוי צורה אקטיבית מכוננת של Tie2 (caTie2) גורם מוגזם ISV הסתעפות ( איור 4 ג ). כימות המורכבות של ISV (איור 5) בנוסף לאורכים ולסניפים של ספקי שירותי האינטרנט, ניתן לחשב את &quot;מדד המורכבות הוורידית&quot; (VCI) כדי להעריך את המורכבות שלהם ( איור 5 א ). אימצנו את &quot;מדד המורכבות&quot; שפותח על ידי כהן-קורי ועמיתיו, אשר נועד לכמת את המורכבות של נוירונים אקסונליים או דנדריטים סוכות 13 . במדד זה, עובר עם סניפים גבוה יותר מקבל ציון גבוה יותר מאשר עובר עם אותו מספר של סובין סה&quot;כChes אבל עם יותר נמוך סדר סניפים. לכן, VCI גבוה יותר עולה כי עובר זה יש רשת ורידית מורכבת יותר. &quot;פשוט neurite נותב&quot; היא תוכנה שימושית כדי לעקוב אחר סדר ואורך של סניפים בודדים. זה גם אפשרי ליצור &quot;נתיבים שניתנו&quot;, אשר היא דרך שימושית כדי לדמיין את האדריכלות הכוללת של כלי הדם ( איורים 5B-5D , לוחות ימין). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55652/55652fig1.jpg" /> איור 1: ציר הזמן של הניסויים. ביום ההפריה, morpholinos (MO), DNA, RNA, או חלבון יכול להיות מוזרק ביצים מופרות בשלב NF 1 (st1) או 2 (st2). אם מוזרק רק לתוך אחד blastomere ב st2, מגיב מוזרק ישפיע רק צד אחד צדדי. הצד uninjected יכול לשמש כבקרה. Co- להזריק נותב ( למשל, EGFP mRNA) כדי לזהות את הצד מוזרק. ביום השני, אהשלב tailbud rly (~ st24) עוברים ניתן לטפל עם ריאגנטים פרמקולוגיים על ידי יישום אמבטיה. הלב נראה בבירור ביום השלישי. DiI-AcLDL ניתן להזריק ללב וכלי הדם ניתן הדמיה זמן קצר לאחר ההזרקה. השתמש st33-37 עוברים לתדמית הדינמיקה של צמיחה כלי או עוברי st42 לתמונה כלי מפותח במלואו. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55652/55652fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55652/55652fig2.jpg" /> איור 2: מיקום של הזרקת DiI-ACLDL ב st42. לרוחב ( AB ) ו הגחון ( CD ) תצוגות של שלב 42 העובר. הלב הוא בצבע ורוד ב AC , בתמונות שצולמו Xenbase (www.xenbase.org). תמונות סטריאוסקופיות נציג מוצגים A , <strOng&gt; B &#39;, ו- D. עבור הזרקת, לנקב את העור מעל הלב ( C , מוצק החץ), לבצע חתך ליניארי, ולפתוח את העור לרוחב לחשוף את הלב (חצים אדומים). לאחר ביצוע החתך, הלב יהיה להבחין בבירור להזרקת ( D &#39; ). סולם ברים = 200 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55652/55652fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55652/55652fig3.jpg" /> איור 3: התוצאות הצפויות (תמונות סטריאוסקופיות). תמונות הקרינה נציג מן שלב 37/38 ( א ) ו שלב 42 ( ב ) עוברים. בצד שמאל של העוברים מוצגים. הווריד הקרדינלי אחורי (PCV) משתרע על פני הזנב, שממנו נייחים הוורידים האינטרסומיסטים (ISVs) בסניף dorsally ב- wav מקורי ל- to-caudalה. רק רכבי ISV מקורי נראים בשלב 37/38 ( A ), ורוב ISVs נוצרו על ידי שלב 42 ( B ). אם כמות לא מספקת של DiI-AcLDL מוזרק, ה- PCV לא יהיה גלוי לעין, גם לאחר 30 דקות ( C ). במקרה זה, יותר DiI-AcLDL יכול להיות מוזרק. אם DiI-AcLDL מוזרק בטעות לאיברים אחרים ( D ), מחק את העוברים. סולם בר = 500 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55652/55652fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55652/55652fig4.jpg" /> איור 4: ההשפעות של איתות Tie2 על פיתוח ISV. ביטוי Tie2 הגן הופל על ידי הזרקת blastomere של חסימת תרגום antisense morpholino oligonucleotides (Tie2MO). שליטה morpholino (CoMO) יש משקל מולקולרי זהה, אבל האם nלכוון כל גן ב- Xenopus tropicalis . MRNA-cododively פעיל Tie2 מוטציה (caTie2) היה שיתוף מוזרק כדי להציל את הפנוטיפ Tie2 מציאה. בניגוד לשליטה ( A ), הזריקה TTie2MO הובילה לירידה דרמטית באורך ומספר ISVs ( B ). פנוטיפ זה חולץ על ידי CATie2, אשר הראה ISVs עם ענפים בטחונות שופע ( C ). המורכבות של ISVs באזורים המצוין על ידי תיבות מקווקו כחול הוא לכמת באיור 5. קנה מידה בר = 200 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55652/55652fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/55652/55652fig5.jpg" /> איור 5: כימות המורכבות של הווריד. ( א ) המורכבות של ISV יכול להיות מיוצג על ידי מדד המורכבות הווריד (VCI).( BD ) VCIs חושבו מן העוברים שמוצג באיור 4. קנה מידה בר = 200 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55652/55652fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis at JoVE.com

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

פרוטוקול זה מדגים שיטה מבוססת הקרינה לדמיין את כלי הדם וכדי לכמת את המורכבות שלה tropis Xenopus . כלי הדם ניתן הדמיה דקות לאחר הזרקת צבע פלואורסצנטי לתוך הלב הפועם של עובר לאחר מניפולציות גנטיות ו / או תרופתי ללמוד התפתחות הלב וכלי הדם in vivo .

ויזואליזציה וניתוח כמותי של אנגיוגנזה עובריים ב<em&gt; Xenopus טרופי</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

visualization-quantitative-analysis-embryonic-angiogenesis-xenopus

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

8.3K Views.  Yonsei University College of Medicine.  פרוטוקול זה מדגים שיטה מבוססת הקרינה לדמיין את כלי הדם וכדי לכמת את המורכבות שלה tropis Xenopus . כלי הדם ניתן הדמיה דקות לאחר הזרקת צבע פלואורסצנטי לתוך הלב הפועם של עובר לאחר מניפולציות גנטיות ו / או תרופתי ללמוד התפתחות הלב וכלי הדם in vivo

Video: Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

ומניפולציה<em&gt; במבחנה</em&gt; ההבשלה של<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; ביציות, ואחריו הזרקת Intracytoplasmic זרע, לחקר התפתחות העוברית

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated discs, and costameres requires the coordinated assembly of multiple components in time and space. Disruption in assembly of these components leads to developmental heart defects. Immunofluorescent staining techniques are used commonly in cultured cardiomyocytes to probe myofibril maturation, but this ex vivo approach is limited by the extent to which myocytes will fully differentiate in culture, lack of normal in vivo mechanical inputs, and absence of endocardial cues. Application of immunofluorescence techniques to the study of developing mouse heart is desirable but more technically challenging, and methods often lack sufficient sensitivity and resolution to visualize sarcomeres in the early stages of heart development. Here, we describe a robust and reproducible method to co-immunostain multiple proteins or to co-visualize a fluorescent protein with immunofluorescent staining in the embryonic mouse heart and use this method to analyze developing myofibrils, intercalated discs, and costameres. This method can be further applied to assess cardiomyocyte structural changes caused by mutations that lead to developmental heart defects.

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

ניתוח של Cardiomyocyte פיתוח באמצעות Immunofluorescence בלב העכבר עוברי

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. Patterning of the Meckel&#39;s cartilage, a first pharyngeal arch derivative, involves the migration of cranial neural crest (CNC) cells and the progressive partitioning, proliferation and organization of differentiated chondrocytes. Several studies have described CNC migration during lower jaw&#160;morphogenesis, but the details of how the chondrocytes achieve organization in the growth and extension of Meckel&#8217;s cartilage remains unclear. The sox10 restricted and chemically induced Cre recombinase-mediated recombination generates permutations of distinct fluorescent proteins (RFP, YFP and CFP), thereby creating a multi-spectral labeling of progenitor cells and their progeny, reflecting distinct clonal populations. Using confocal time-lapse photography, it is possible to observe the chondrocytes behavior during the development of the zebrafish Meckel&#8217;s cartilage.
Multispectral cell labeling enables scientists to demonstrate extension of the Meckel&#8217;s chondrocytes.&#160;During extension phase of the Meckel&#8217;s cartilage, which prefigures the mandible, chondrocytes intercalate to effect extension as they stack in an organized single-cell layered row. Failure of this organized intercalating process to mediate cell extension provides the cellular mechanistic explanation for hypoplastic mandible that we observe in mandibular malformations.

Cell organization of craniofacial bones has long been hypothesized but never directly visualized. Multi-spectral cell labeling and in vivo live imaging allows visualization of dynamic cell behavior in zebrafish lower jaw. Here, we detail the protocol to manipulate Zebrabow transgenic fish and directly observe cell intercalation and morphological changes of chondrocytes in the Meckel&#8217;s cartilage.

ויזואליזציה של הכונדרוציטים עיבור וכיוונית למניעת הפצת נשק באמצעות ניתוח תא משובט Zebrabow בסחוס של העוברית מקל

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

באמצעות ניתוח של Confocal<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; לחקירת מאפננים של עירובים מורפוגן Wnt וששש

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

כמו תא גזע<em&gt; Xenopus</em&gt; Explants העובריים לחקר תכונות המוקדמות עצבי התפתחותית<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Transcriptome Profiling של<em&gt; In-Vivo</em&gt; עוברי אדם שור הופק באמצעות פלטפורמת microarray שני צבעים

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח<em&gt; Xenopus</em&gt; כליה

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

ניתוח של כלי דם כליליים ב הותרו עוברי לבבות

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early embryonic development, kinase activity is highly dynamic and widespread across the embryo. Pharmacological and genetic approaches are commonly used to probe kinase activities. Unfortunately, it is challenging to achieve superior spatial and temporal resolution using these strategies. Furthermore, it is not feasible to control the kinase activity in a reversible fashion in live cells and multicellular organisms. Such a limitation remains a bottleneck for achieving a quantitative understanding of kinase activity during development and differentiation. This work presents an optogenetic strategy that takes advantage of a bicistronic system containing photoactivatable proteins Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) and the N-terminal domain of cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix (CIBN). Reversible activation of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway is achieved through light-mediated protein translocation in live cells. This approach can be applied to mammalian cell cultures and live vertebrate embryos. This bicistronic system can be generalized to control the activity of other kinases with similar activation mechanisms and can be applied to other model systems.

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

This protocol describes an optogenetic strategy to modulate mitogen-activated protein kinase (MAPK) activity during cell differentiation and Xenopus embryonic development. This method allows for the reversible activation of the MAPK signaling pathway in mammalian cell culture and in multicellular live organisms, like Xenopus embryos, with high spatial and temporal resolution.

אור בתיווך אפנון הפוך של מיטוגן המופעל חלבון קינאז נתיב במהלך הבחנה Cell ו<em&gt; קסנופוס</em&gt; התפתחות עובריים

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

ניתוח כמותי Immunofluorescence כולה-הר של אוכלוסיות לב ב העכבר עוברי

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...