Este estudo foi inspirado no trabalho de Levine et al. , Que descreveu este método experimental e forneceu uma descrição abrangente do desenvolvimento vascular em Xenopus laevis. Agradecemos aos membros do nosso laboratório por sua contribuição. Este estudo foi apoiado pela Universidade de Yonsei Iniciativa de Investigação Futuro de 2015 (2015-22-0095) eo Programa de Desenvolvimento de Tecnologia Biológica e Médica da Fundação Nacional de Pesquisa (NRF) financiado pelo Ministério da Ciência, TIC e Planeamento Futuro NRF-2013M3A9D5072551)

Todos os experimentos obedeceram a protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Faculdade de Medicina da Universidade de Yonsei. 1. Preparação de Xenopus tropicalis Embryos NOTA: Os embriões de Xenopus tropicalis foram produzidos como descrito anteriormente 10 , com ligeira modificação. Os embriões de Xenopus tropicalis foram encenados de acordo com as tabelas de Nieuwkoop e Faber 11 . <ol><li> Indução da ovulação <ol><li> Para pré-primário, injetar gonadotropina coriônica humana (hCG) no saco linfático dorsal de um par de rãs (um macho e uma fêmea) no dia anterior ao dia do acasalamento. Injectar 20 unidades por rã fêmea e 10 unidades por macho. Casa um macho e uma fêmea no mesmo tanque durante a noite (por mais de 18 h). </li><li> Para iniciar, no dia seguinte, injetar 200 unidades de hCG para a fêmea pré-preparada e 100 unidades de hCG para o pré-fermentadomasculino; A fêmea iniciada começará a pôr ovos em aproximadamente 3 h e continuará a fazê-lo durante todo o dia. Manter o par macho e fêmea juntos para acasalamento natural ou em tanques separados para fertilização in vitro (passo 1.2). </li></ol></li><li> Fertilização NOTA: Os ovos podem ser fertilizados por acasalamento natural ou fertilização in vitro . No acasalamento natural, os ovos são fertilizados como eles são colocados, e, portanto, o momento da fertilização não pode ser controlada. Alternativamente, uma rã fêmea preparada pode ser alojada num tanque separado e os ovos não fertilizados podem ser recolhidos para fertilização in vitro , o que gera centenas de embriões fertilizados ao mesmo tempo. A última abordagem é útil quando a microinjecção dirigida a blastómeros será realizada antes da marcação do vaso. Nesta abordagem, no entanto, um macho é sacrificado. <ol><li> Acasalamento natural <ol><li> Deixe o par preparado fêmea e macho no mesmo tanque. O macho fecho a fLevando à fertilização imediata dos ovos postos. Recolher os ovos com uma pipeta de vidro ou plástico e transferi-los para uma placa de Petri. Para evitar que os ovos fiquem presos à pipeta, revestir a superfície interna da pipeta com 0,5% de albumina de soro bovino (BSA). </li></ol></li><li> Fertilização in vitro (FIV) <ol><li> Separar o macho aprisionado do macho após a iniciação. A fêmea começará a pôr os ovos espontaneamente em aproximadamente 3 h. Transferir alguns ovos colocados usando uma pipeta revestida com BSA para uma placa de Petri e verificar a sua qualidade sob um microscópio. Se os ovos saudáveis ​​(pigmento claro, elástico em forma de bola) foram colocados, prepare-se para dissecar os testículos do macho preparado. </li><li> Faça 0,4% de metanossulfonato de Tricaine (MS222) para a eutanásia e injete 300 μL no saco linfático dorsal do macho preparado. Em aproximadamente 10 min, o macho perderá seu senso de equilíbrio e permanecerá à tona; Confirmar que o macho é eutanizado por beliscar uma perna traseira com umaPar de fórceps rombos e observando nenhuma resposta. </li><li> Dissecar os dois testículos, limpá-los rapidamente batendo-os em papel sem fiapos e transferi-los para um microtubo contendo 1 mL de 60% de Leibovitz&#39;s L-15 Medium (60%) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS); Um procedimento detalhado é descrito em outra parte 10 . </li><li> Mergulhe suavemente os testículos com um pilão para extrair o esperma. Nesta concentração ( isto é, 2 testículos em 1 mL de FBS a 10% em 60% de L-15), algumas gotas da solução de testículo (0,1 mL) podem fertilizar cerca de 300 ovos. O esperma restante pode ser armazenado a 4 ° C em um tubo hermeticamente fechado e usado para FIV no dia seguinte. </li><li> Esprema os ovos da fêmea em uma pequena placa de Petri. Segure a parte superior da fêmea de cabeça para baixo na palma da mão e coloque o indicador entre as patas traseiras. Espalhe as patas traseiras com o dedo indicador e a outra mão para expor a cloaca. Toque a cloaca para a placa de Petri. CasacoEle prato de Petri com 0,5% de BSA para distribuir uniformemente os ovos como uma monocamada durante a FIV. </li><li> Adicionar algumas gotas (0,1 mL) de espermatozóide contendo L-15 meio para os ovos. Para fertilização síncrona, mexa suavemente a solução de esperma através do prato. Após 4 min à temperatura ambiente, encher a placa de Petri com 0,01x de solução salina de Barth modificada (MBS), incubar durante 10 min e substituir a solução por 0,1 x MBS. Os ovos fertilizados sofrerão a primeira clivagem em aproximadamente 1 h à temperatura ambiente. 1x MBS é NaCl 88 mM, KCl 1 mM, NaHCO3 2,5 mM, HEPES 5 mM, MgSO4 1 mM e CaCl2 0,7 mM, pH 7,5. </li></ol></li></ol></li><li> (Opcional) Injecï¿½o de oligonucleï¿½idos (MOs) e / ou ARNm morfolino anti-sentido <ol><li> Para investigar o efeito de um gene de interesse na formação de vasos, efectuar a microinjecção de MO e / ou mRNAs anti-sentido. </li><li> Para tais experiï¿½cias, desengorduram os ovos com 2% de L-cisteï¿½a em 1x MBS (pH 7,5-7,8).Substituir 0,1x MBS no prato contendo os embriões fertilizados com 2% de L-cisteína em 1x MBS. Agitar suavemente o prato para misturar a solução. NOTA: Geralmente leva cerca de 5 min para que os embriões sejam desjelados. Durante esta etapa, monitorar os ovos com freqüência para garantir que eles não estão sobre-expostos à solução. Se os ovos são sobre-expostos, eles vão perder elasticidade e tornar-se achatado, o que irá causar desenvolvimento aberrante e letalidade. </li><li> Lavar os ovos de gelatina cinco vezes com 0,1 x MBS. Realizar a microinjeção em Ficoll 4% dissolvido em 0,1x MBS. Tipicamente, injectar 4 ng de MO e 600 pg de mRNA por blastómero no estádio de duas células. Injetar em uma célula para manipular a expressão gênica em apenas um lado do embrião. Use o lado não injetado do mesmo embrião como um controle. </li><li> Como outro controlo para a especificidade da manipulação de genes, injetar a mesma quantidade de um controlo MO (CoMO) ou ARNm de controlo ( eg, mARN de beta-galactosidase). CoMO deve ter o mesmo mOlecular como o MO específico do gene e não deve alvejar nenhum gene no genoma de Xenopus . Para visualização fácil do lado injetado, use MO marcado com fluoresceína ou co-injeção de um marcador ( eg, EGFP mRNA). </li><li> Deixar os embriões injetados em Ficoll 4% por 2 h e, em seguida, transferi-los para uma nova placa de Petri 60 mm preenchido com 0.1x MBS. </li></ol></li><li> Elevação <ol><li> Levantar os embriões a 23 ° C. Embora a velocidade de desenvolvimento possa ser abrandada ou acelerada usando temperaturas abaixo ou acima de 23 ° C, respectivamente (intervalo: 16-26 ° C), recomenda-se elevá-los a 23 ° C. </li></ol></li><li> (Opcional) Tratamento com reagentes farmacológicos <ol><li> Para manipulações farmacológicas, administrar medicamentos aos embriões em desenvolvimento por aplicação de banho. </li></ol></li></ol> 2. Preparação de Injecção de DiI-AcLDL <ol><li> Faça uma pipeta de vidro afilada usando um micr padrãoOpipette puller. Coloque um tubo de vidro de borossilicato no extrator de micropipeta e use as seguintes configurações: pressão, 200; Calor, 30; Puxar, 30; Velocidade, 120; Tempo, 200. </li><li> Armazenar a solução-mãe DiI-AcLDL a 4 ° C. Tome a parte clara superior da solução para injeção, mas não as partículas precipitadas no fundo do tubo. Qualquer detrito na pipeta de vidro irá perturbar a ejecção adequada da solução. </li><li> Encher a pipeta de vidro preparada com uma quantidade adequada de solução DiI-AcLDL (~ 5 μL) usando um microcarregador. </li><li> Retirar a ponta da pipeta de vidro pouco a pouco usando um fino par de pinças (número 55). Configure o sistema de injeção controlado por pressão para que aproximadamente 5 nL de solução seja ejetado de cada vez; 50-60 nL de solução DiI-AcLDL é suficiente para manchar os vasos de um embrião. </li><li> Não deixe a pipeta carregada com DiI-AcLDL no ar por um longo período de tempo para evitar a secagem. Manter a ponta da pipeta submersa em MS a 0,04%222 em solução de MBS a 0,1X. Antes de injectá-lo no embrião (passo 4.2.1), verifique se a mesma quantidade de corante é ejectada. </li></ol> 3. Configuração da Injeção <ol><li> Molde Sylgard <ol><li> Para preparar um pequeno molde de Sylgard, misture a base de Sylgard e o agente de cura com uma razão de peso de 10 para 1. Encha aproximadamente metade de uma pequena placa de Petri (placa de 35 mm ou 60 mm) com esta solução mista e deixe-a solidificar durante aproximadamente 48 h à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Anestesia <ol><li> Utilizar 0,04% de MS222 em 1x MBS (pH 7,5-8,0) para anestesia. Quando é necessária anestesia prolongada ( por exemplo, durante a imagiologia ao vivo), use MS222 a 0,04% em 0,1x MBS para reduzir o desequilíbrio osmótico. Para ajustar o pH, adicione algumas gotas de NaOH (~ 20 μL) e verifique o pH usando papel pH. </li><li> Espere até que os embriões transferidos parar de se mover. Toque as barbatanas dorsais dos embriões e verifique se eles respondem para confirmarNestesia. </li></ol></li><li> Posicionamento de embriões para injeção <ol><li> Recorte a superfície do molde Sylgard endurecido com uma lâmina fina e afiada. Faça um recuo côncavo em forma de V para colocar os embriões (ver Figura 2D ). Coloque um embrião anestesiado, lado ventral para cima, de forma ligeiramente oblíqua (aproximadamente 30 °) ( Figura 2D ). </li><li> Encha o molde com solução MS222 e coloque os embriões no molde. </li></ol></li></ol> 4. Injecção DiI-AcLDL <ol><li> Incisão da pele sobre o coração <ol><li> Preparar dois pinos (Minutiens, 0,10 mm) para cortar a pele sobre o coração. Aperte firmemente cada pino em um porta-pinos; O coração deve ser facilmente identificável à medida que pulsa ( Figura 2A-2C , rosa). </li><li> Perfure a pele de um embrião com um alfinete. Insira o pino através do orifício no espaço entre o coração ea pele ( Figura 2C </strOng&gt;, seta sólida). Não perfure o coração. Posicione a parte inserida deste pino na região onde a incisão será feita. </li><li> Faça uma incisão linear esfregando suavemente o outro pino segurado fora da pele contra o pino inserido. Gentilmente alargar esta incisão com dois pinos, expondo o coração ( Figura 2B &#39; e 2D&#39; , seta). A pipeta carregada com DiI-AcLDL pode agora aproximar-se directamente do coração ( Figura 2D &#39; ). </li></ol></li><li> Injeção <ol><li> Insira a ponta da pipeta de vidro carregada no coração e injete 50-60 nL de solução DiI-AcLDL em aproximadamente 10 pulsos de ejeção. Não injetar uma quantidade excessiva de solução, pois faz com que o coração se rompa. Verifique se o coração continua a bater após a injeção. Após cada injeção, verifique se a mesma quantidade de DiI-AcLDL é ejetada; Caso contrário, a ponta da pipeta pode ser bloqueada (ver passo 2.5). </li></ol></li><li><stroNg&gt; Recuperação e rastreio visual <ol><li> Transfira os embriões injetados para uma nova placa de Petri cheia de 0,1x MBS para recuperação. Após 5-10 min, os girinos devem recuperar a consciência e começar a se mover. Neste momento, os vasos marcados podem ser visualizados. Recomenda-se a visualização visual de embriões marcados com sucesso sob um microscópio de fluorescência ( Figura 3A e 3B ). Se uma quantidade insuficiente de DiI-AcLDL é injetada em um embrião, ela pode ser injetada novamente ( Figura 3C ). </li><li> Descarte os girinos que têm outros órgãos rotulados ( Figura 3D ). Continue até obter o número necessário de embriões marcados com êxito. </li></ol></li><li> (Opcional) Fixação dos embriões <ol><li> Para uma imagem mais completa dos vasos sanguíneos, use microscopia confocal; Pode ser mais fácil fixar os embriões marcados para microscopia confocal. Primeiramente, anestesiar os embriões marcados em MS222 a 0,04% em 1x MBS (pH 7,5-8,0) e depois fixa-os em paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato 1X (PBS) durante 1 h à temperatura ambiente. Embriões fixos podem ser armazenados por vários dias a 4 ° C; Proteger as amostras injectadas da luz para evitar o foto-branqueamento da DiI. </li></ol></li></ol> 5. Imagem de Di-AcLDL <ol><li> Imagem estereoscópica <ol><li> Tomar fotografias sob microscópio estereoscópico de fluorescência ( Figura 3 ) para avaliar a morfologia geral da vasculatura. </li><li> Derreta 1% de agarose em 1x PBS para embriões fixos ou em 1x MBS para imagens ao vivo. Derrame a agarose derretida em uma placa de Petri e espere até solidificar. Faça um recuo raso na superfície do gel de agarose que irá encaixar o embrião a ser visualizado quando deitado em seu lado lateral. Encha o prato com tampão (solução MS222 para embriões anestesiados ou 1x PBS para embriões fixos). </li></ol></li><li> Microscopia de fluorescência (Rhodamine filter seT) <ol><li> Como DiI é um corante verde-excitado e emissor vermelho, imagem usando um conjunto de filtros padrão para rodamina ou fluoróforos relacionados espectralmente (excitação máxima a 554 nm e emissão a 571 nm). Colocar os embriões injetados nas cavidades no molde de agarose e tirar fotografias ( Figura 3 ). </li></ol></li><li> Microscopia confocal NOTA: Para uma análise mais detalhada da arquitetura vascular, use microscopia confocal. <ol><li> Se estiver usando um microscópio invertido, posicione os embriões num prato de fundo de vidro. Adicionar algumas gotas de 1x PBS e imobilizá-los, colocando um cobertor no topo. Remova o excesso de PBS. Se os embriões vivos forem fotografados, use embriões anestesiados e use 0,015% MS222 em 0,1x MBS em vez de PBS. </li><li> Para imagens de baixa ampliação, use um objetivo de 4X a 10X para localizar a área de interesse; A parte rostral da veia cardinal posterior (PCV) é uma região útil para investigar a angiogênese do desenvolvimento (Figura 4,Caixas). <ol><li> Use um ajuste de aquisição para um fluoróforo de emissão vermelha (tal como Rhodamine). </li><li> Faça imagens z-empilhadas por imagem da metade lateral de um embrião. Primeiro, focalize o PCV no lado lateral perto do objetivo e, em seguida, defina o limite inferior do foco na posição onde os vasos mais próximos do objetivo estão em foco. Defina o limite superior na posição em que a parte mediana do PCV que está sendo fotografado pode ser focalizada. Imagem toda esta metade lateral do embrião. Use um software que armazena metadados nas configurações de aquisição, como escalas x, y e z, uma vez que são necessários para calcular os comprimentos do vaso. </li><li> Se necessário, use o modo de varredura de telha para imagem toda a vasculatura de um embrião. Empiricamente determinar o número de telhas horizontais e verticais. </li></ol></li><li> Para imagens de alta ampliação, siga os procedimentos acima para a imagem da parte rostral do PCV e 4 rostral mais veias intersomitic (ISVs) ( Figura 4 ,Caixa tracejada). Ajuste o número de pilhas (z-stack) e tiles (tile scan) apropriadamente. </li></ol></li></ol> 6. Quantificação de vasos marcados com DI NOTA: Os recipientes Di-rotulados podem ser rastreados manualmente ou usando software. Usamos o &quot;Simple neurite tracer&quot;, um plugin ImageJ (NIH) gratuito, que permite o rastreamento semi-automático de estruturas semelhantes a tubos, como vasos sanguíneos e neurites 12 . Usando este software livre, os seguintes parâmetros podem ser calculados. Um procedimento detalhado para o uso deste software é descrito em outro lugar (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer) 12 . Abaixo, usamos exemplos da vasculatura de embriões em que a sinalização de Tie2 é inibida ou aumentada ( Figura 4A-4C ) 5 . A exposição de embriões injectados Tie2MO anti-sentido reduz a angiogénese e reduz os ISVs ( Figura 4B ), enquanto que a co-injecção de Tie2 constitutivamente activoMRNA mutante (mRNA caTie2) sobre-resgata este fenótipo, resultando em exuberantes ramos ISV ( Figura 4C ). <ol><li> Comprimentos ISV <ol><li> Usando o traçador de neurite simples, calcule o comprimento de cada vaso traçado. Calcule os comprimentos dos 4 ISVs mais rostral. </li></ol></li><li> Filiais de ISV NOTA: Em embriões de tipo selvagem, apenas alguns ramos curtos brotam do rostral, a maioria dos ISVs no estágio 42. <ol><li> No traçador de neurite simples, rastrear esses pequenos vasos após fazer o ISV de onde eles originam o ramo primário. Calcule os seguintes parâmetros desses ramos originários dos ISVs. </li><li> Número total de filial <ol><li> Uma vez que todos os ISVs e os ramos associados sejam rastreados, calcule o número total de ramos ( Figura 5B-5D ). </li></ol></li><li> Ordem de filial <ol><li> Como simples neurite traçador registra a ordem de cada ramo ( Figura 5A ), calculatE o número de agências para cada ordem. A maioria dos vasos em embriões de tipo selvagem deve ser ramos primários ( ie, ISVs). </li></ol></li><li> Índice de complexidade veia (VCI) <ol><li> Como VCI é um parâmetro útil para a complexidade do vaso, o que dá mais peso aos ramos de ordem superior, calcule o VCI para cada embrião usando a fórmula na Figura 5A . Por exemplo, os embriões injectados com Tie2MO têm uma VCI inferior em comparação com o controlo ( Figura 5B e 5C ) e os embriões injectados com mRNA caTie2 têm uma VCI mais elevada ( Figura 5D ). </li></ol></li></ol></li></ol>

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Os autores não têm nada a revelar.

O protocolo apresentado aqui foi desenvolvido pela primeira vez por Ali H. Brivanlou e colegas para investigar eventos de desenvolvimento durante a formação vascular em Xenopus laevis 4 , mas, como mostrado neste manuscrito, pode ser aplicado a outros pequenos animais. Injecção de corante no coração é simples de realizar, e toda a rede vascular pode ser visualizada sob um microscópio de dissecção de fluorescência, bem como um microscópio confocal. Se o corante é injetado no ...

A vasculogênese, a formação de novos vasos sanguíneos a partir de células endoteliais recém-nascidas ea angiogênese, a formação de novos vasos de vasos pré-existentes, são dois processos distintos que moldam a vasculatura embrionária 1 . Qualquer desregulação nestes processos resulta em várias doenças cardíacas e anormalidades estruturais dos vasos. Além disso, o crescimento tumoral está associado com o crescimento descontrolado do vaso. Como tal, os mecanismos moleculares subjacentes à vasculogênese e à angiogênese são objeto de intensa investigação 2 . Xenopus e zebrafish são modelos de vertebrados atraentes para estudos de vasculogênese e angiogênese, por várias razões. Primeiro, seus embriões são pequenos; Portanto, é relativamente fácil imaginar toda a vasculatura. Em segundo lugar, o desenvolvimento embrionário é rápido; Leva apenas um par de dias para toda a vasculatura desenvolver, durante o qual o desenvolvimento vascular<html> Pode ser visualizada. Em terceiro lugar, as intervenções genéticas e farmacológicas antes e durante a formação do vaso são fáceis de realizar, como por meio da microinjeção de morfolino nucleótidos antisentido (MOs) no embrião em desenvolvimento ou através da aplicação do banho de fármacos 3 , 4 , 5 . A vantagem única de Xenopus sobre o peixe-zebra é que as manipulações embriológicas podem ser realizadas porque Xenopus segue clivagens holoblásticas estereotipadas eo mapa de destino embrionário é bem definido 6 . Por exemplo, é possível gerar um embrião em que apenas um lado lateral é geneticamente manipulado por injecção de um MO anti-sentido a uma célula no estádio de duas células. É também possível transplantar o primórdio cardíaco de um embrião para outro para determinar se o gene exerce a sua função por um mecanismo intrínseco ou -extrínseco da célulaAss = &quot;xref&quot;&gt; 7. Embora essas técnicas tenham sido desenvolvidas principalmente em Xenopus laevis , que é alotetraplóide e, portanto, não é ideal para estudos genéticos, elas podem ser aplicadas diretamente a Xenopus tropicalis , uma espécie diploide estreitamente relacionada 8 . Uma forma de visualizar a vasculatura num embrião vivo de Xenopus é injectar um corante fluorescente para marcar os vasos sanguíneos. A lipoproteína de baixa densidade acetilada (AcLDL) marcada com uma molécula fluorescente tal como DiI é uma sonda muito útil. Ao contrário da LDL não acetilada, a AcLDL não se liga ao receptor LDL 9, mas é endocitados por macrófagos e células endoteliais. A injecção de DiI-AcLDL no coração de um animal vivo resulta na marcação fluorescente específica das células endoteliais, e toda a vasculatura pode ser visualizada por microscopia de fluorescência em embriões vivos ou fixos 4 . Aqui, nós presProtocolos detalhados para a visualização e quantificação de vasos sanguíneos usando DiI-AcLDL em Xenopus tropicalis ( Figura 1 ). Fornecemos pontos-chave práticos, com exemplos de experiências bem sucedidas e mal sucedidas. Além disso, fornecemos um método direto para a análise quantitativa da complexidade vascular, que pode ser útil na avaliação dos efeitos de fatores genéticos e ambientais na formação da rede vascular.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="539">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">35mm Petri dish</td>
			<td style="width:113px;">SPL</td>
			<td style="width:93px;">10035</td>
			<td style="width:180px;">Sylgard mold frame</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">60mm Petri dish</td>
			<td style="width:113px;">SPL</td>
			<td style="width:93px;">10060</td>
			<td>Embryo raising tray</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Borosilicate Glass</td>
			<td style="width:113px;">Sutter instrument</td>
			<td style="width:93px;">B100-50-10</td>
			<td>Needle for injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">BSA</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">A3059-10G</td>
			<td>Coating reagent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">CaCl2</td>
			<td style="width:113px;">D.S.P.GR Reagent</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>0.1X MBS component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Coverslip</td>
			<td style="width:113px;">Superior</td>
			<td style="width:93px;">HSU-0111520</td>
			<td>For confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">DiI-AcLDL</td>
			<td style="width:113px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:93px;">L3484</td>
			<td>Vessel staining solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">FBS</td>
			<td style="width:113px;">Hyclone</td>
			<td style="width:93px;">SH.30919.02</td>
			<td>For storage of testis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Fiber Optical Illuminator</td>
			<td style="width:113px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:93px;">Z-LITE-Z</td>
			<td>Light</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Ficoll</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">F4375</td>
			<td>Injection buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td style="width:113px;">Sutter instrument</td>
			<td style="width:93px;">P-97</td>
			<td>Injection needle puller</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Forcep</td>
			<td style="width:113px;">Fine Science Tool</td>
			<td style="width:93px;">11255-20</td>
			<td style="width:180px;">For embryo hatching and 
			needle tip cutting</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Glass Bottom dish</td>
			<td style="width:113px;">SPL</td>
			<td style="width:93px;">100350</td>
			<td>For confocal imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">hCG</td>
			<td style="width:113px;">MNS Korea</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>For priming of frogs</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">HEPES</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">H3375</td>
			<td>Buffering agent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Incubator</td>
			<td style="width:113px;">Lab. Companion</td>
			<td style="width:93px;">ILP-02</td>
			<td>For raising embryos</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">KCl</td>
			<td style="width:113px;">DAEJUNG</td>
			<td style="width:93px;">6566-4400</td>
			<td>MBS component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">L15 medium</td>
			<td style="width:113px;">Gibco</td>
			<td style="width:93px;">11415-114</td>
			<td>For storage of testis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">L-cysteine</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">168149-100G</td>
			<td>De-jellying reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">MgSO4</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">M7506</td>
			<td>MBS component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Microtube</td>
			<td style="width:113px;">Axygen</td>
			<td style="width:93px;">MCT-175-C-S</td>
			<td>For storage of testis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">MS222</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">E10521</td>
			<td>Anesthetic powder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">NaCl</td>
			<td style="width:113px;">DAEJUNG</td>
			<td style="width:93px;">7647-14-5</td>
			<td>MBS component</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">NaOH</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">S-0899</td>
			<td>pH adjusting reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">P6148</td>
			<td>Fixatives</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">PBS</td>
			<td style="width:113px;">BIOSESANG</td>
			<td style="width:93px;">P2007</td>
			<td>Buffer for imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">pH paper</td>
			<td style="width:113px;">Sigma</td>
			<td style="width:93px;">P4536-100EA</td>
			<td>For confirming pH</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">PICO-LITER INJECTOR</td>
			<td style="width:113px;">Waner instruments</td>
			<td style="width:93px;">PLI-100A</td>
			<td>For injection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Pin</td>
			<td style="width:113px;">Pinservice</td>
			<td style="width:93px;">26002-10</td>
			<td>For incision</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">Pinholder</td>
			<td style="width:113px;">Scitech Korea</td>
			<td style="width:93px;">26016-12</td>
			<td>For incision</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Precision Stereo Zoom Binocular Microscope</td>
			<td style="width:113px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:93px;">PZMIII</td>
			<td>For visual screening</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:153px;">Standard Manual Control Micromanipulator&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Waner instruments</td>
			<td style="width:93px;">W4 64-0056</td>
			<td>For microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:153px;">SYLGARD 184 Kit</td>
			<td style="width:113px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:93px;"></td>
			<td>For DiI injection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:153px;">Transfer pipette</td>
			<td style="width:113px;">Korea Ace Scientific Co.</td>
			<td style="width:93px;">YM.B78-400</td>
			<td>For eggs and 
			embryo collection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and quantitative analysis of embryonic angiogenesis in xenopus tropicalis

Os vasos sanguíneos fornecem oxigênio e nutrientes em todo o corpo, ea formação da rede vascular está sob controle de desenvolvimento apertado. A eficiente visualização in vivo dos vasos sanguíneos e a quantificação fiável da sua complexidade são fundamentais para a compreensão da biologia e da doença da rede vascular. Aqui, nós fornecemos um método detalhado para visualizar vasos sanguíneos com um corante fluorescente comercialmente disponível, complexo DiI de lipoproteína de baixa densidade acetilada no plasma humano (DiI-AcLDL) e para quantificar sua complexidade em Xenopus tropicalis . Os vasos sanguíneos podem ser marcados por uma simples injeção de DiI-AcLDL no coração batendo de um embrião, e os vasos sanguíneos em todo o embrião podem ser visualizados em embriões vivos ou fixos. Combinado com a perturbaï¿½o genï¿½ica pela microinjecï¿½o direccionada de ï¿½idos nucleicos e / ou a aplicaï¿½o em banho de reagentes farmacolï¿½icos, as funï¿½es de um gene ou de uma via de sinalizaï¿½o no desenvolvimento vascular podem ser inveStigated dentro de uma semana sem recorrer a sofisticados animais geneticamente modificados. Devido ao sistema venoso bem definido de Xenopus e sua angiogênese estereotipada, o surgimento de vasos pré-existentes, complexidade vascular pode ser quantificado eficientemente após experimentos de perturbação. Este protocolo relativamente simples deve servir como uma ferramenta facilmente acessível em diversos campos da investigação cardiovascular.

Cronologia dos experimentos (Figuras 1 e 2) Logo após a fecundação, a microinjecção direccionada pode ser realizada para modular a expressão do gene. Por exemplo, um MO anti-sentido que se liga especificamente ao codão de iniciação do ARNm de Tie2 endógeno pode ser injectado, inibindo a tradução do mRNA alvo de Tie2 por impedimento estérico. Um MO pode ser conjugado com fluoresceína para o rastreio visual fácil de ...

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Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Este protocolo demonstra um método baseado em fluorescência para visualizar a vasculatura e quantificar sua complexidade em Xenopus tropicalis . Os vasos sanguíneos podem ser visualizados minutos após a injecção de um corante fluorescente no coração batendo de um embrião após manipulações genéticas e / ou farmacológicas para estudar o desenvolvimento cardiovascular in vivo .

Visualização e Análise Quantitativa da Angiogênese Embrionária<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

visualization-quantitative-analysis-embryonic-angiogenesis-xenopus

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

8.3K visualizações.  Yonsei University College of Medicine.  Este protocolo demonstra um método baseado em fluorescência para visualizar a vasculatura e quantificar sua complexidade em Xenopus tropicalis . Os vasos sanguíneos podem ser visualizados minutos após a injecção de um corante fluorescente no coração batendo de um embrião após manipulações genéticas e / ou farmacológicas para estudar o desenvolvimento cardiovascular in vivo . 

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Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

Manipulação e<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturação<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Oócitos, seguido de injeção intracitoplasmática de espermatozóide, para estudar o desenvolvimento embrionário

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Biologia do Desenvolvimento

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated discs, and costameres requires the coordinated assembly of multiple components in time and space. Disruption in assembly of these components leads to developmental heart defects. Immunofluorescent staining techniques are used commonly in cultured cardiomyocytes to probe myofibril maturation, but this ex vivo approach is limited by the extent to which myocytes will fully differentiate in culture, lack of normal in vivo mechanical inputs, and absence of endocardial cues. Application of immunofluorescence techniques to the study of developing mouse heart is desirable but more technically challenging, and methods often lack sufficient sensitivity and resolution to visualize sarcomeres in the early stages of heart development. Here, we describe a robust and reproducible method to co-immunostain multiple proteins or to co-visualize a fluorescent protein with immunofluorescent staining in the embryonic mouse heart and use this method to analyze developing myofibrils, intercalated discs, and costameres. This method can be further applied to assess cardiomyocyte structural changes caused by mutations that lead to developmental heart defects.

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

Análise do Cardiomyocyte Desenvolvimento utilizando imunofluorescência em Embryonic Coração do rato

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. Patterning of the Meckel&#39;s cartilage, a first pharyngeal arch derivative, involves the migration of cranial neural crest (CNC) cells and the progressive partitioning, proliferation and organization of differentiated chondrocytes. Several studies have described CNC migration during lower jaw&#160;morphogenesis, but the details of how the chondrocytes achieve organization in the growth and extension of Meckel&#8217;s cartilage remains unclear. The sox10 restricted and chemically induced Cre recombinase-mediated recombination generates permutations of distinct fluorescent proteins (RFP, YFP and CFP), thereby creating a multi-spectral labeling of progenitor cells and their progeny, reflecting distinct clonal populations. Using confocal time-lapse photography, it is possible to observe the chondrocytes behavior during the development of the zebrafish Meckel&#8217;s cartilage.
Multispectral cell labeling enables scientists to demonstrate extension of the Meckel&#8217;s chondrocytes.&#160;During extension phase of the Meckel&#8217;s cartilage, which prefigures the mandible, chondrocytes intercalate to effect extension as they stack in an organized single-cell layered row. Failure of this organized intercalating process to mediate cell extension provides the cellular mechanistic explanation for hypoplastic mandible that we observe in mandibular malformations.

Cell organization of craniofacial bones has long been hypothesized but never directly visualized. Multi-spectral cell labeling and in vivo live imaging allows visualization of dynamic cell behavior in zebrafish lower jaw. Here, we detail the protocol to manipulate Zebrabow transgenic fish and directly observe cell intercalation and morphological changes of chondrocytes in the Meckel&#8217;s cartilage.

Visualização de condrócitos Intercalation e Direcional Proliferação via Zebrabow Análise celular clonal na cartilagem de Meckel o Embryonic

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

Utilizando Análise de confocal<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Para Investigar moduladores de Wnt e Shh morfogénio gradientes

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Stem Cell-like<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionárias explantes Estudar características Neural desenvolvimento precoce<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Transcriptoma Profiling de<em&gt; In-Vivo</em&gt; embriões produzidos pré-implantação dos bovinos por meio de duas cores Plataforma Microarray

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Técnica ao Target microinjeção para o desenvolvimento<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

Análise de vasos coronarianos nos corações embrionárias Cancelado

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early embryonic development, kinase activity is highly dynamic and widespread across the embryo. Pharmacological and genetic approaches are commonly used to probe kinase activities. Unfortunately, it is challenging to achieve superior spatial and temporal resolution using these strategies. Furthermore, it is not feasible to control the kinase activity in a reversible fashion in live cells and multicellular organisms. Such a limitation remains a bottleneck for achieving a quantitative understanding of kinase activity during development and differentiation. This work presents an optogenetic strategy that takes advantage of a bicistronic system containing photoactivatable proteins Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) and the N-terminal domain of cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix (CIBN). Reversible activation of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway is achieved through light-mediated protein translocation in live cells. This approach can be applied to mammalian cell cultures and live vertebrate embryos. This bicistronic system can be generalized to control the activity of other kinases with similar activation mechanisms and can be applied to other model systems.

Light-mediated Reversible Modulation of the Mitogen-activated Protein Kinase Pathway during Cell Differentiation and Xenopus Embryonic Development

This protocol describes an optogenetic strategy to modulate mitogen-activated protein kinase (MAPK) activity during cell differentiation and Xenopus embryonic development. This method allows for the reversible activation of the MAPK signaling pathway in mammalian cell culture and in multicellular live organisms, like Xenopus embryos, with high spatial and temporal resolution.

Modulação Reversível Mediada por Luz do Caminho Protein Quinaso Ativado por Mitogênio durante a Diferenciação Celular e Xenopus Desenvolvimento embrionário

Kinase activity is crucial for a plethora of cellular functions, including cell proliferation, differentiation, migration, and apoptosis. During early ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development and organogenesis are two areas of research that have benefitted greatly from these advances, due to the high quality of data that can be obtained directly from imaging pre-implantation embryos or ex vivo organs. While pre-implantation embryos have yielded data with especially high spatial resolution, later stages have been less amenable to three-dimensional reconstruction. Obtaining high-quality 3D or volumetric data for known embryonic structures in combination with fate mapping or genetic lineage tracing will allow for a more comprehensive analysis of the morphogenetic events taking place during embryogenesis.
This protocol describes a whole-mount immunofluorescence approach that allows for the labeling, visualization, and quantification of progenitor cell populations within the developing cardiac crescent, a key structure formed during heart development. The approach is designed in such a way that both cell- and tissue-level information can be obtained. Using confocal microscopy and image processing, this protocol allows for three-dimensional spatial reconstruction of the cardiac crescent, thereby providing the ability to analyze the localization and organization of specific progenitor populations during this critical phase of heart development. Importantly, the use of reference antibodies allows for successive masking of the cardiac crescent and subsequent quantitative measurements of areas within the crescent. This protocol will not only enable a detailed examination of early heart development, but with adaptations should be applicable to most organ systems in the gastrula to early somite stage mouse embryo.

Here, we describe a protocol for whole mount immunofluorescence and image-based quantitative volumetric analysis of early stage mouse embryos. We present this technique as a powerful approach to qualitatively and quantitatively assess cardiac structures during development, and propose that it may be widely adaptable to other organ systems.

Análise quantitativa da imunofluorescência toda a montagem das populações do Progenitor cardíaca em embriões de rato

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...