This work was supported by National Institutes of Health Grant 5-P20GM103629 to WLM and the Tulane Center for Aging. We would like to thank Matthew Nice for his help with editing the protocol text.

כל הניסויים בבעלי חיים ואת ההליכים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת טוליין ועדת שימוש (IACUC). 1. הגדרת הליך כירורגי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכשירי חיטוי, ציוד כירורגי, ואספקת התרבות לפני הניתוח. חומרי מתכלים כירורגיים לכל חולדה כוללים: 1 וילון, 1 וילון עם חור חתוך מראש (0.5 x 1.5 ב) במרכז, פדי גזה, ו -1 underpad סופג. מכשירי ניתוח כוללים: 1 אזמל עם להב מספר 10, 2 זוגות של פינצטה, וזוג מספריים בסדר. אספקת תרבות כוללת: 1 וילון, 1 פינצטה, ומכין מוסיף 6-גם צלחת עם מסנני פוליקרבונט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר פלטפורמת פרספקס, במה כירורגי ומרחב המעבדתיים כירורגית עם אתנול 70%. שמור על הבמה כירורגי בקערה סטרילי עד השימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור הבמה כירורגי באמצעות קידוח של כ 2 ב -1 ב חור במרכז של צלחת תרבות 100 מ&quot;מ. לאחר מכן, השתמש נייר זכוכית כדי להחליקכל קצוות חדים ולהוסיף שכבה של דבק סיליקון אל הקצוות של החור כדי ליצור משטח מוגבה עבור הרקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לעצב את הבמה כירורגי באמצעות תוכנת CAD ולהפוך ידי הדפסת 3-D (איור 1). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים underpad סופג סטרילית ושכב פלטפורמה פרספקס על גבי זה. מניח את הווילון, ללא חור חתוך מראש, על משטח לוהט ליד underpad סופג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוספט שנאגר תמיסת מלח סטרילית טרום חם (PBS), מדיה מלוחה עד 37 מעלות צלזיוס. מדיה פלייס PBS במנות תרבות נפרדת על גבי כרית חימום ו מלוחים ומכניסים צינור חרוטי 50 מ&quot;ל ליד ההתקנה כירורגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כל החבילות נפתחות לפני תחילת הניתוח כדי להבטיח טיפול סטרילי של כל החומרים. רשימה מלאה של הכלים הנפוצים המשמשים בהליך זה מפורט טבלת חומרים וכלים כירורגיים ספציפיים. </li></ol> 2. Mesenterקציר רקמות y <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש חולדות Wistar זכר בוגר (350 ± 25 גרם; 6 - 8 שבועות של גיל). זנים אחרים וגילים של חולדות ניתן להחליף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים חולדה באמצעות זריקה תוך שרירית של קטמין (80 מ&quot;ג / ק&quot;ג משקל גוף) ו xylazine (8 מ&quot;ג / ק&quot;ג משקל גוף). אשר את החולדה היא בהרדמה ידי צובט בין האצבעות כדי לבדוק לתגובה רפלקס; שם צריך להיות אף אחד. שיכוך כאבים מנעו עבור הליך מסוף זה לא הכרחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את אזור הבטן ולהסיר שיער הנותרים באמצעות קרם להסרת שיער. נגב עור הבטן פעמיים עם אלכוהול איזופרופיל 70% ואחריו יוד povidone. עבור המגבונים שהמנתח צריך להתחיל במרכז של האתר כירורגית ולעבור מחוץ לאזור המוכן באופן מעגלי שלא חופף באזורים קרצפו בעבר עם אותה פיסת גזה סטרילי או מקלון צמר גפן סטרילי. ואז להעביר חית התקנת ניתוח סטרילי ולמקם גבי plat פרספקסטופס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סכין אזמל, לבצע 0.75 ב - 1.25 ב חתך במעיים החל מיום 1 ב מתחת עצם החזה. היזהר שלא לנקב את המעי או לפדר (1 שכבת העור, 1 שכבה של רקמת חיבור, ו -1 שכבת השריר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח וילון עם חור חתוך מראש על החתך ומניח במה כירורגי סטרילי על גבי הווילון. ודא מיישרת הפתיחה עם החתך. השתמש applicators כותנה שקצו סטרילי לאתר ולשלוף את המעי דרך הפתח הבמה כירורגי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך 6 - 8 חלונות mesenteric באמצעות לבמה בעזרת אזניים, ולהיזהר לא לגעת חלונות (איור 1). רקמות בדרך כלל נקצרות מאזור המעי של המעי הדק מתחיל ליד cecum. שמור חשוף רקמות לחות עם מלח סטרילית חימם לפי הצורך באמצעות מזרק סטרילי לטפטף הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברוש באמצעות הזרקת intracardiac של נתרן pentobarbital (0.2 מ&quot;ל לכל חולדה). לפני ההסרה ליחלונות senteric, להבטיח העכברוש הוא מורדם על ידי מישוש הלב; לא אמור להיות שום דופק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר רקמות לפדר רצויות באמצעות פינצטה לתפוס את כרית השומן ומספריים בסדר לחתוך את החלון. השאר גבול של שומן (2 מ&quot;מ) סביב החלון. לשטוף רקמות פעם חימם PBS סטרילי ופעם התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור מעי exteriorized אל חלל הבטן ולהיפטר מן החי על פי הנחיות מוסדיות. </li></ol> 3. תרבות רקמות לפדר ללימודים זמן לשגות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אספקת העברת תרבות autoclaved (ראה סעיף 1.1) ורקמות כדי ברדס זרימה למינרית סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בפינצטה כדי להעביר את כל רקמות על גבי קרום מסנן פוליקרבונט. רקמות תפוס על ידי כרית שומן כדי למנוע נזק בכלי הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות להפיץ את הרקמות באמצעות כרית השומן, נזהר שלא לגעת החלון. הפוך את הכנס עם רקמה לתוך החלק התחתון של צלחת 6-היטב ומכסים 3 מ&quot;ל של התקשורת (איור 1 </stרונג&gt;). תקשורת אופיינית בשימוש לצורך הליך זה כוללת מדיה Essential Minimum (ממ) עם 1% פניצילין סטרפטומיצין (PenStrep) ו -10% עובריים שור סרום (FBS). מדיה זו יכולה להיות מלווה סרומים אחרים ו / או גורמי גדילה כדי לעורר אנגיוגנזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 3.2 - 3.3 כל רקמות ותרבות בתנאי חממה סטנדרטיות (5% CO 2, 37 מעלות צלזיוס) במשך עד 5 ימים. </li></ol> 4. זמן לשגות הדמיה של רקמות לפדר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום ההדמיה, להשלים את התקשורת בכל טוב עם מצומדות BSI-לקטיני דגירה בתנאי תרבות סטנדרטיים למשך 30 דקות. לשטוף רקמות פעמים עם תקשורת לקטינים ללא. BSI-לקטינים הכתם יישאר גלוי על הרקמה לפדר עד 3 ימים בתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את הצלחת על במת מיקרוסקופ. זיהוי כלי הדם הלימפה מבוסס על מבנה המורפולוגיה שלהם ברשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר אזור רשת רצוי על כל רקמות לקחת תמונות. כדאי לשים לב במיוחד ההדמיהמיקום מנת להבטיח את אותה באזור יהיה בשבי עבור תמונות עוקבות. אם באמצעות במה ממונעת, לתעד את הקואורדינטות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור רקמות אל האינקובטור ולהמשיך תרבות עד לנקודת הסיום הרצויה. חזור על צעדי 4.1 - 4.3 דרוש תלוי בנקודות זמן ניסוי רצויות. </li></ol> 5. רקמות immunolabeling <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיוג BSI-לקטינים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הרקמות למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס 1:40 לקטינים FITC- מצומדות בתקשורת (פתרון נוגדנים 2.5 מ&quot;ל לכל היטב צלחת 6-באר) ואחריו שני שטיפות עם התקשורת. עבור שטיפות, להוסיף מדיה ומיד להחליף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיוג Live / Dead <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה רקמות במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 1: 500 homodimer-1 ethidium 2 מ&quot;מ ו 1: AM calcein 500 1 מ&quot;מ בתקשורת (פתרון נוגדנים 2.5 מ&quot;ל לכל היטב צלחת 6-באר) ואחריו שני שטיפות עם התקשורת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> BSI-לקטינים / תיוג NG2 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמות מורח על מיקרוסקופ החליקודואר (1 - 2 רקמות / שקופית) ולאפשר לו להתייבש. הסר עודף שומן עם אזמל ידי לחיצה איתנה מטה שיחתוך את השומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן רקמות מתנול קר במשך 30 דקות ב -20 מעלות צלזיוס. לשטוף רקמות עם PBS (3 x 10 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיוג נוגדן ראשוני דגירה רקמות 1 שעות בטמפרטורת החדר עם 1: נוגדן 100 ארנב polyclonal NG2 ו -5% בסרום עז נורמלי (NGS). לשטוף רקמות עם PBS (3 x 10 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיוג נוגדנים משני דגירה רקמות 1 שעות בטמפרטורת החדר עם 1: 100 נוגדן נגד ארנב עז Cy2 מצומדות (GAR-Cy2) ו -5% NGS. לשטוף רקמות עם PBS (3 x 10 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הרקמות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר 1:40 לקטינים FITC- מצומדות ב PBS ואחריו שני שטיפות עם PBS. עבור שטיפות, להוסיף PBS ומיד להחליף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעגן את השקופיות, לכסות רקמות עם 50:50 PBS פתרון גליצרול coverslip מקום על גבי. חותם את הקצוות שקופית באמצעות לק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> LYVE-1 / תיוג PECAM<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים רקמות על שקופיות מיקרוסקופ (1 - 2 רקמות / שקופית) ולאפשר לו להתייבש. הסר עודף שומן עם אזמל ידי לחיצה איתנה מטה שיחתוך את השומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן רקמות מתנול קר במשך 30 דקות ב -20 מעלות צלזיוס. לשטוף רקמות עם saponin PBS + 0.1% (3 x 10 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיוג נוגדן ראשוני דגירה רקמות 1 שעות בטמפרטורת החדר עם 1: 200 עכבר נוגדנים CD31 biotinylated חד שבטיים ו 1: 100 ארנב polyclonal נוגדן LYVE-1 ב PBS + 0.1% saponin + 2% אלבומין בסרום שור (BSA) + 5% NGS . לשטוף רקמות עם saponin PBS + 0.1% (3 x 10 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיוג נוגדנים משני, דגירה רקמות 1 שעות בטמפרטורת החדר עם 1: 500 נוגדן streptavidin CY3 מצומדות ו 1: 100-Cy2 GAR ב PBS + 0.1% saponin + 2% BSA + 5% NGS. לשטוף רקמות עם saponin PBS + 0.1% (3 x 10 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להרכיב שקופיות, רקמות כיסוי עם 50:50 PBS פתרון גליצרול במקום coverslip על גבי. חותם את הקצוות שקופית באמצעות לק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> BrdU / BSI-לקטינים תיוג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​BrdU למדיה ולהחליף התקשורת רקמות עם פתרון BrdU. דגירה של 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים רקמות על שקופיות מיקרוסקופ (1 - 2 רקמות / שקופית) ולאפשר לו להתייבש. הסר עודף שומן עם אזמל ידי לחיצה איתנה מטה שיחתוך את השומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן רקמות מתנול קר במשך 30 דקות ב -20 מעלות צלזיוס. לשטוף רקמות עם PBS (3 x 10 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגל DNA רקמה 2 M HCl עבור h 1 ב 37 מעלות צלזיוס. לשטוף רקמות saponin PBS + 0.1% (3 x 10 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיוג נוגדן ראשוני, דגירה רקמות 1 שעות בטמפרטורת החדר עם 1: 100 העכבר חד שבטיים אנטי BrdU ב PBS + 0.1% saponin + 2% BSA + 5% NGS. לשטוף רקמות עם saponin PBS + 0.1% (3 x 10 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיוג נוגדנים משני, דגירה רקמות 1 שעות בטמפרטורת החדר עם 1: 100 עיזים אנטי עכבר נוגדנים Cy3 מצומדות (GAM-Cy3) ב- PBS + 0.1% saponin + 2% BSA + 5% NGS. לשטוף רקמות עם saponin PBS + 0.1% (3 x 10 דקות). </li><li&gt; דגירה רקמות במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר 1:40 לקטינים FITC- מצומדות ב PBS ואחריו שני שטיפות עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להרכיב שקופיות, רקמות כיסוי עם 50:50 PBS פתרון גליצרול coverslip מקום על גבי. חותם את הקצוות שקופית באמצעות לק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> BSI-לקטינים / תיוג CD11b <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים רקמות על שקופיות מיקרוסקופ (1 - 2 רקמות / שקופית) ולאפשר לו להתייבש. הסר עודף שומן עם אזמל ידי לחיצה איתנה מטה שיחתוך את השומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן רקמות מתנול קר במשך 30 דקות ב -20 מעלות צלזיוס. לשטוף רקמות עם saponin PBS + 0.1% (3 x 10 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיוג נוגדן ראשוני דגירה רקמות 1 שעות בטמפרטורת החדר עם 1: 100 CD11b אנטי עכברוש העכבר ב PBS + 0.1% saponin + 2% BSA + 5% NGS. לשטוף רקמות עם saponin PBS + 0.1% (3 x 10 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיוג נוגדנים משני דגירה רקמות 1 שעות בטמפרטורת החדר עם 1: 100 GAM-Cy3 ב PBS + 0.1% saponin + 2% BSA + 5% NGS. לשטוף רקמות עם PBSעלייה של 0.1% saponin (3 x 10 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הרקמות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר 1:40 לקטינים FITC- מצומדות ב PBS ואחריו שני שטיפות עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להרכיב שקופיות, רקמות כיסוי עם 50:50 PBS פתרון גליצרול coverslip מקום על גבי. חותם את הקצוות שקופית באמצעות לק. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+cancer+and+other+diseases.">Angiogenesis in cancer and other diseases.</a> Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).</li><li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+in+life,+disease+and+medicine.">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).</li><li>Kaunas, R., Kang, H., Bayless, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+Regulation+of+Angiogenic+Sprouting+by+Biochemical+Factors+and+Wall+Shear+Stress.">Synergistic Regulation of Angiogenic Sprouting by Biochemical Factors and Wall Shear Stress.</a> Cell Mol Bioeng. 4 (4), 547-559 (2011).</li><li>Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+the+neonatal+vasculature+and+analysis+of+retinal+angiogenesis+in+mice.">Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice.</a> Nat Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).</li><li>Song, J. W., Munn, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+forces+control+endothelial+sprouting.">Fluid forces control endothelial sprouting.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15342-15347 (2011).</li><li>Chan, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+in+vitro+3D+capillary+beds+by+self-directed+angiogenic+sprouting.">Engineering of in vitro 3D capillary beds by self-directed angiogenic sprouting.</a> PLoS One. 7 (12), e50582 (2012).</li><li>Peirce, S. M., Mac Gabhann, F., Bautch, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+experimental+and+computational+approaches+to+sprouting+angiogenesis.">Integration of experimental and computational approaches to sprouting angiogenesis.</a> Curr Opin Hematol. 19 (3), 184-191 (2012).</li><li>Stapor, P. C., Azimi, M. S., Ahsan, T., Murfee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+angiogenesis+model+for+investigating+multicellular+interactions+across+intact+microvascular+networks.">An angiogenesis model for investigating multicellular interactions across intact microvascular networks.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (2), H235-H245 (2013).</li><li>Azimi, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex+vivo+model+for+anti-angiogenic+drug+testing+on+intact+microvascular+networks.">An ex vivo model for anti-angiogenic drug testing on intact microvascular networks.</a> PLoS One. 10 (3), e0119227 (2015).</li><li>Nicosia, R. F., Ottinetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+microvessels+in+serum-free+matrix+culture+of+rat+aorta.+A+quantitative+assay+of+angiogenesis+in+vitro.">Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro.</a> Lab Invest. 63 (1), 115-122 (1990).</li><li>Hutter-Schmid, B., Kniewallner, K. M., Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures+as+a+model+to+study+angiogenesis+of+brain+vessels.">Organotypic brain slice cultures as a model to study angiogenesis of brain vessels.</a> Front Cell Dev Biol. 3, 52 (2015).</li><li>Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+retinal+explant+cultures+to+study+ex+vivo+tip+endothelial+cell+responses.">Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses.</a> Nat Protoc. 5 (10), 1659-1665 (2010).</li><li>Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+imaging+of+retinal+angiogenesis+reveals+decreased+development+and+progression+of+neovascular+sprouting+by+anecortave+desacetate.">Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2347-2355 (2010).</li><li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+models+of+angiogenesis.">In vivo models of angiogenesis.</a> J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).</li><li>Kelly-Goss, M. R., Sweat, R. S., Azimi, M. S., Murfee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+islands+during+microvascular+regression+and+regrowth+in+adult+networks.">Vascular islands during microvascular regression and regrowth in adult networks.</a> Front Physiol. 4, 108 (2013).</li><li>Kelly-Goss, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+along+vascular+islands+during+microvascular+network+growth.">Cell proliferation along vascular islands during microvascular network growth.</a> BMC Physiol. 12, 7 (2012).</li><li>Skalak, T. C., Price, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+mechanical+stresses+in+microvascular+remodeling.">The role of mechanical stresses in microvascular remodeling.</a> Microcirculation. 3 (2), 143-165 (1996).</li><li>Kadohama, T., Nishimura, K., Hoshino, Y., Sasajima, T., Sumpio, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+different+types+of+fluid+shear+stress+on+endothelial+cell+proliferation+and+survival.">Effects of different types of fluid shear stress on endothelial cell proliferation and survival.</a> J Cell Physiol. 212 (1), 244-251 (2007).</li><li>Milkiewicz, M., Brown, M. D., Egginton, S., Hudlicka, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+shear+stress,+angiogenesis,+and+VEGF+in+skeletal+muscles+in+vivo.">Association between shear stress, angiogenesis, and VEGF in skeletal muscles in vivo.</a> Microcirculation. 8 (4), 229-241 (2001).</li><li>Corliss, B. A., Azimi, M. S., Munson, J. M., Peirce, S. M., Murfee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages:+An+Inflammatory+Link+Between+Angiogenesis+and+Lymphangiogenesis.">Macrophages: An Inflammatory Link Between Angiogenesis and Lymphangiogenesis.</a> Microcirculation. 23 (2), 95-121 (2016).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

<html> פרוטוקול זה מתעד שיטה לשימוש במודל תרבות עכברוש לפדר ככלי vivo לשעבר הדמיה זמן לשגות של צמיחה רשת כלי הדם. עבודה קודמת שנערכו במעבדה שלנו הקימה את השימוש במודל שלנו עבור 1) אנגיוגנזה 8, 2) lymphangiogenesis 8, 3) אינטראקציות תא pericyte-אנדותל 8, ו -4) תרופה אנטי-אנגיוגנזה בדיקות 9. יכולת הדמית רקמות לפדר עכברוש תרבותיים בנקודות זמן מרובות מציעה assay כמוני להערכת תגובות צמיחת רקמות ספציפיות ואת המעקב של אינטראקציות תאי תאים במהלך גירויי angiogenic שונים. הריבוי המוגבר של תאי אנדותל במהלך אנגיוגנזה ואת הנוכחות של pericytes עולה בקנה אחד עם המחקרים הקודמים שלנו 8 ולאמת את האינטראקציות הדינמיות בין סוגי תאים מרובים במהלך אנגיוגנזה ברקמות mesenteric החולדה תרבותיות. = ילדה &quot;jove_content&quot;&gt; לעומת דגמים בתרבית רקמה נפוצים במערכות תרבית תאים במבחנה, מודל תרבות העכברוש לפדר הוא ייחודי, משום צמיחה מתרחשת בתוך רשת כלי דם ללא פגע, אמיתית. שקול בניגוד assay את טבעת אבי העורקים, אשר הוקמה על מנת ללמוד הנבטה angiogenic מפלחים אבי העורקים בתוך ג&#39;ל קולגן 10. בעוד הנבטה בטבעת אב העורקים כרוכים סוגי תאים מרובים, ניבט נימים לצמוח מתוך המגזרים הניכרים של אב העורקים, וזה מאוד שונה תרחיש vivo. המודל הפרוס המוח הוא עוד מודל vivo לשעבר, אבל הוא בטל של כלי הלימפה. יתר על כן, המודל הפרוס המוח לא הוכח להיות מסוגל הזמן לשגות הדמיה לפני ואחרי גירוי angiogenic 11. מודל אחר vivo לשעבר כי כבר הציג לאחרונה הוא מודל תרבות הרשתית. היתרון של מודל הרשתית הוא אנגיוגנזה מתרחשת בין microvascu ללא פגערשתות Lar בתוך הרקמה 12, 13. בדגמים אלה, זני עכברי GFP מהונדס יכולים לשמש כדי להיות מסוגל להתבונן נימי הנבטה לאורך זמן, אך למרבה הצער, לפדר העכבר הוא avascular 14, ומבטל את החילוף לפדר עכברי GFP-מהונדס עבור לפדר עכברוש, מנוצל כמו במודל שלנו. יתר על כן, אנו מראים כי תיוג לקטינים פשוט של רקמות לפדר עכברוש התרבות מספיק כדי לקבוע צמיחת רשת בנקודות זמן שונה בהשוואה האחרת לשעבר מודלי vivo, המודל שלנו מאפשר תצפית סימולטני של שני דם ותאי אנדותל הלימפה. BSI-לקטינים שמשו במאמר זה לדמיין רשתות כלי דם וכדי לזהות תגובות angiogenic. לקטינים הוא מבנה חלבון שקושר גליקופרוטאינים על תאי האנדותל נבחר עבור פרוטוקול זה בגלל זמן הדגירה הקצר שלה לעומת antib אנדותלסמני ody. לקטינים הם זולים יותר מאשר נוגדנים והיא אינה דורשת תיקון; זה גם יכול להיות מעורב בקלות בתקשורת התרבות והחליף עם תקשורת טריה לאחר תום תקופת דגירה. בעוד מחקרים עתידיים נדרשים על מנת להבהיר את ההשפעות האפשריות של טכניקת תיוג לקטינים על תהליך angiogenic, תוצאות הנציג שלנו (איור 4) מראות כי אנגיוגנזה חזק ניתן מושרה ואת העבודה קודמת -9 מלמדת כי אנגיוגנזה ברשתות שכותרתו לקטינים יכולה להיות מעוכבת באמצעות מיקוד פקטור (vascular endothelial growth VEGF). סמנים נוגדן יכול לשמש פוטנציאל כגישה תיוג חלופי כאשר יש צורך סמנים ספציפיים יותר, או כאשר יש צורך לחקור סוגי תאים אחרים שנמצאים ברשתות כלי הדם כגון תאי שריר חלק, pericytes, והעצבים. שיטת פוטנציאל נוספת תאים חזותיים תהיה transfection גן. היתרון של שימוש במודל לפדר עכברוש זמן לשגות כבר מסומן בתוצאות נציג בפרוטוקול זה. ההשוואה של תמונות לפני ואחרי הטיפול מפחית בעיות של השתנות המשפיעים ניתוח סטטיסטי לזווג שאינם. את התגובה החיסונית הספציפית explant נעה בין 20% ל -233% עלייה בצפיפות כלי דם מ -40% ל -3,500 עליית% בצפיפות ניבטת. הסיבות הספציפיות וריאציה זו אינן ידועות, אבל מדידת צמיחה באותה הרקמה לאורך הזמן להציג את היכולת לאשר תגובות רקמות ספציפיות. ניתוח השוואתי של תמונות בנקודות זמן שונות במהלך צמיחת כלי דם מאפשר גם מעקב בתאי האנדותל. לדוגמא, המעבדה שלנו זיהתה אי וסקולרית כמגזרי תא האנדותל בקרבת רשתות כלי דם מנותקת מרשתות סמוכות 15, 16. כדי לאשר האיים האלה להתחבר רשתות הסמוכיםk בתגובה לגירויי angiogenic, מודל תרבות העכברוש לפדר היה בשימוש. כפי שניתן לראות בתרשים 5, איים וסקולרית אותרו לאחר גירוי רקמות עם בסיסי פיברובלסטים Growth Factor (bFGF) או VEGF בתוספת מטסיות Growth Factor (PDGF). גם הראינו תוצאות דומות בסרום גירוי פוסט (מידע לא מוצג כאן). לאחר הגירוי של אנגיוגנזה, האיים וסקולרית במקור המנותק ניתן למצוא מחוברים לרשתות סמוכות. יישומים אפשריים אחרים של מודל תרבות העכברוש לפדר יכולים למנף את היכולת לחקור את יחסי הגומלין בין הלימפה וכלי דם ותאי האנדותל שלהם ואת המעקב של גורל תא ביניים. זמן לשגות תמונות של אותן רשתות כלי הדם לפני ואחרי גירוי עם סרום 10% במודל זה סיפק דוגמאות פוטנציאל הלימפה אל הדם שילוב כלי (איור 6). לפני גירוי, לימפטי Vess דםאלס נבדל המבוסס על מורפולוגיה כלי. לאחר גירוי, הלימפה לעומת זהות כלי דם הפכה פחות ברורה. פוטנציאל אינטראקציות תא הלימפה / דם האנדותל נתמך על ידי תצפית של PECAM + / LYVE-1- תאי דם האנדותל חיבור עם PECAM + / LYVE-1 + בתאי האנדותל הלימפה (מידע לא מוצג כאן). תצפיות אלו תומכים בשימוש במודל תרבות עכברוש לפדר על חקירת פלסטיות תא האנדותל הלימפה / דם. איור 6 א מדגיש גם את התיוג לקטינים של תאי ביניים נראים לעין. בעוד תיוג זו אינה עולה בקנה אחד והטרוגניות מרקמות לרקמות, היא עושה להדגיש את נוכחותם של תאים תושב רקמות אנדוגני. תיוג CD11b של רקמות תרבותיות (איור 7) עולה כי תאי ביניים לקטינים-חיוביות הללו יכולים להיות א-סט משנה של מקרופאגים. לאור ההתעניינות המתעוררים מעורב מקרופאג ב אנגיוגנזה 20, חוזק נוסף שלהמודל יכול להיות השימוש בו כדי לעקוב אחר הדינמיקה מקרופאג לאורך זמן. בדומה מודלי vivo לשעבר אחרים, מגבלה נוכחית של לימוד אנגיוגנזה במודל תרבות העכברוש לפדר היא חוסר זרימת דם. מאמץ הגזירה הנגרמת על ידי זרימת דם הוכח לשחק תפקיד במורפולוגיה ובחלוקה של תאים האנדותל וכן אנגיוגנזה 17, 18, 19. לקבלת תוצאות הנציג מוצגות באיור 4, עדר מאמץ גזירה כי בו בלבד היה מספיק כדי לגרום לתגובת angiogenic ברשתות התרבותיות. עם זאת, אנו יודעים כי על פי הפרסום הראשוני שלנו המאפיין את מודל תרבות העכברוש לפדר 8, כי סיבות תוספי תקשורת גדלו אנגיוגנזה מול תקשורת לבד. מחקרים עתידיים חשובים להכניס זרימה בתוך רשתות כלי דם התרבותיות ללא ספק יש צורך יותר מקרוב לחקות אתבתרחיש vivo. גישות פוטנציאל תזרים שילוב עשויות לכלול cannulation של arterioles האכלת רשת או אפילו cannulation של עורקים במעלה נוסף בתוך גבול השומן של חלונות mesenteric. עם זאת, למרות חוסר הזרימה, את הכדאיות של סוגי תאים מרובים, החזקת הדם ורשתות כלי דם הלימפה, ובחלוקה של תאים במהלך אנגיוגנזה תומכת הרמה המוגברת ביחס של מודל תרבות העכברוש לפדר מורכבות בהשוואה לתא מבוססים במודלים חוץ גופייה. לסיכום, פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה, לשחזור vivo לשעבר הדמיה תגובות angiogenic ברשתות כלי הדם ללא פגע. שיטה כזו מציעה אלטרנטיבת התא המבוססת במודלים במבחנה להערכת דינמיקת תא angiogenic במקומות ספציפיים בתוך סביבת רשת. השיטה גם מציעה כלי רומן לחקירת אנגיוגנזה, lymphangiogenesis ודם / הלימפה mis-להגנינג בו זמנית.

צמיחת שיפוץ רשת כלי דם הם מכנים משותפים לתפקוד רקמות, ריפוי פצעים, ו פתולוגיות מרובות תהליך מפתח הוא אנגיוגנזה, כהגדרתו הצמיחה של כלי דם חדשים קיימים 1, 2. עבור הנדסת רקמות כלי דם חדש או בעיצוב טיפולים מבוססים angiogenic, הבנת חשיבות הדינמיקה הסלולר המעורבת אנגיוגנזה הוא קריטי. עם זאת, תהליך זה הוא מורכב. זה יכול להשתנות במקומות ספציפיים בתוך רשת כלי דם וכרוך סוגי תאים מרובים (כלומר תאי אנדותל, תאי שריר חלק, pericytes, מקרופאגים, תאי גזע) ומערכות מרובות (רשתות לימפטי רשתות עצביות). למרות מודלים במבחנה תרמו מאוד כדי לבדוק את הקשר בין תאים שונים המעורבים אנגיוגנזה 3, הרלוונטי הפיזיולוגית שלהם יכול להתערער בשל thei<html> r מורכבות מוגבלות ואת העובדה שהם מקרוב אינם משקפים תרחיש vivo. כדי להתגבר על המגבלות האלה, מערכות תרבות תלת מימדי 3, לשעבר vivo מודלים רקמות 4, מערכות microfluidic 5, 6, ו מודלים חישוביים 7 פותחו שהונהגה בשנים האחרונות. עם זאת, יש עדיין צורך מודל עם יכולת הזמן לשגות לחקור אנגיוגנזה ברשתות פגעו כלי דם vivo לשעבר. הקמת מודלים חדשים זמן לשגות ללימודי אנגיוגנזה עם כי רמת המורכבות תספק כלי רב ערך כדי להבין את המנגנונים המסדירים אנגיוגנזה לשפר טיפולים. מודל פוטנציאלי המאפשר חקירת vivo לשעבר של אנגיוגנזה ברחבי רשת כלי דם ללא פגע הוא מודל התרבות לפדר עכברוש&gt; 8. בשנים אחרונה עבודה, אנחנו הוכחנו כי דם ורשתות כלי דם הלימפה להישאר קיימא אחרי התרבות. יתרה מכך, מודל תרבות העכברוש לפדר יכול לשמש כדי לחקור אינטראקציות תא פונקציונליות-אנדותל pericyte, דם וקשרי תא האנדותל הלימפה, הזמן לשגות הדמיה. מטרת מאמר זה היא לספק פרוטוקול שלנו שיטת הדמיה זמן לשגות. תוצאות הנציג שלנו לתעד את סוגי התאים המרובים שנותרו קיימא לאחר הגירוי של אנגיוגנזה עם סרום ולהציע דוגמאות לשימוש בשיטה זו לכימות תגובות angiogenic רקמות ספציפיות, כמו גם מחקרי מעקב תא האנדותל.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="679">
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:165px;">Drape</td>
			<td style="width:183px;">Cardinal Health</td>
			<td style="width:132px;">4012</td>
			<td style="width:199px;">12&#8221;x12&#8221; Bio-Shield Regular Sterilization Wraps</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;">Scalpel Handle</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-9843</td>
			<td style="width:199px;">Scalpel Handle, #3; Solid; 4&#34; Length</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile Surgical Blade</td>
			<td>Cincinnati Surgical</td>
			<td>0110</td>
			<td>Stainless Steel; Size 10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Culture Dish (60mm)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>130181</td>
			<td>10/Sleeve</td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:165px;">Graefe Forcep (curved tweezers)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5135</td>
			<td style="width:199px;">Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8mm Tip Width; 4&#34; Length</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:165px;">Graefe Forcep (straight tweezers)</td>
			<td>Roboz Surgical Instrument</td>
			<td>RS-5130</td>
			<td style="width:199px;">Micro Dissecting Forceps; Serrated, Straight; 0.8mm Tip Width; 4&#34; Length</td>
		</tr>
		<tr height="86">
			<td height="86" style="height:86px;width:165px;">Noyes Micro Scissor</td>
			<td style="width:183px;">Roboz Surgical Instrument</td>
			<td style="width:132px;">RS-5677</td>
			<td style="width:199px;">Noyes Micro Dissecting Spring Scissors; 
			Straight, Sharp-Blunt Points; 13mm Cutting Edge; 0.25mm Tip Width, 4 1/2&#34; Overall Length</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Gauze Pads</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>13-761-52</td>
			<td style="width:199px;">Non-Sterile Cotton Gauze Sponges; 4&#34;x4&#34; 12-Ply</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Cotton-Tippled Applicators</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>23-400-124</td>
			<td style="width:199px;">6&#34; Length; Wooden Shaft; Single Use Only</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;">6-Well Plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-49</td>
			<td style="width:199px;">Flat Bottom with Low Evaporation Lid; Polystyrene; Non-Pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile Syring 5ml</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-829-45</td>
			<td>Luer-Lok Tip</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Sterile Bowl</td>
			<td>Medical Action Industries Inc.</td>
			<td>01232</td>
			<td style="width:199px;">32 oz. Peel Pouch; Blue; Sterile Single Use</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:165px;">6-Well Plate Inserts (CellCrown Inserts)</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>Z681792-3EA</td>
			<td>6-Well Plate Inserts; Non-Sterile</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:165px;">Polycarbonate Filter Membrane</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>TMTP04700</td>
			<td style="width:199px;">Isopore Membrane Filter; Polycarbonate; Hydrophilic; 5.0&#160;&#181;m, 47&#160;mm, White Plain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;">Beuthanasia</td>
			<td style="width:183px;">Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Ordered from MWI Veterinary Supply)</td>
			<td>MWI #: 011168</td>
			<td style="width:199px;">Active Ingredient: Per 100mL, 390 mg pentobarbital sodium, 50mg phenytoin sodium&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;">Ketamine</td>
			<td style="width:183px;">Fort Dodge Animal Health (Ordered from MWI Veterinary Supply)</td>
			<td>MWI #: 000680</td>
			<td>Kateset 100 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Xylazine</td>
			<td style="width:183px;">LLOYD. Inc. (Ordered from MWI Veterinary Supply)</td>
			<td>MWI #: 000680</td>
			<td>Anased 100 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Saline</td>
			<td style="width:183px;">Baxter</td>
			<td>2F7122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11095080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PenStrep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>001-000-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Saponin&#160;</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S7900-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Isopropyl Alcohol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Povidone-Iodine</td>
			<td>Operand</td>
			<td>82-226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Hydrochloric Acid</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>320331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:165px;">FITC-conjugated Lectin</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>L9381-2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:165px;">Anti-NG2 Chondroitin Sulfate Proteoglycan Antibody</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>AB5320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PECAM (CD31) Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LYVE-1 Antibody</td>
			<td>AngioBio Co.</td>
			<td>11-034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Anti-Rabbit Cy2-conjugated Antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-585-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Anti-Mouse Cy3-conjugated Antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-227-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin Cy3-conjugated Antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>016-160-084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Goat Serum&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-Bromo-2&#39;-Deoxyuridine</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>B5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:165px;">Monoclonal Mouse Anti-Bromodeoxyuridine&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; Clone Bu20a</td>
			<td>Dako</td>
			<td style="width:132px;">M074401-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Anti-Rat CD11b&#160;</td>
			<td>AbD Serotec</td>
			<td>MCA275R</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo method for time-lapse imaging of cultured rat mesenteric microvascular networks

אנגיוגנזה, כהגדרתו צמיחה של כלי דם חדשים מכלי קיימים, כרוך לתאי אנדותל, pericytes, ותאי שריר חלק, תאי מערכת החיסון, ואת התיאום עם כלי הלימפה והעצבים. המולטי-התא, אינטראקציות רבות מערכתיות מחייבות חקירת אנגיוגנזה בסביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. וכך, בעוד השימוש במודלים תרבית תאים במבחנה סיפקו תובנות מכניסטית, ביקורת נפוצה היא כי הם לא לשחזר את המורכבות הקשורה רשת כלי הדם. מטרת פרוטוקול זה היא להדגים את היכולת לערוך השוואות זמן לשגות של רשתות כלי הדם ללא פגע לפני ואחרי גירוי אנגיוגנזה ברקמות לפדר עכברוש תרבותי. רקמות בתרבית מכילות רשתות כלי דם מקיים ההיררכיה שלהם. תיוג immunohistochemical מאשרת את נוכחותו של תאי אנדותל, תאי שריר חלק, pericytes, כלי הדם וכלי הלימפה. בddition, תיוג רקמות עם BSI-לקטינים מאפשר השוואת הזמן לשגות של אזורי רשת המקומיים לפני ואחרי הגירוי גורם בסרום או צמיחה מאופיינת הנבטה וצפיפות כלי נימים מוגברות. לשם השוואה למודלי תרבית תאים נפוצים, שיטה זו מספקת כלי ללימודי שושלת תא האנדותל וערכת תרופת angiogenic רקמות ספציפית ברשתות כלי דם רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית.

לאחר 3 ימים בתרבות, רקמות תויגו עם ערכת cytotoxicity חי / מת הכדאיות / כדי להוכיח את הכדאיות של microvasculature במודל תרבות עכברוש לפדר (איור 2 א). רוב התאים הנמצאים לפדר נשארים קיימא בתרבות שבה תאי אנדותל זוהה על סמך המיקום שלהם במגזרי כלי דם. התפשטות תאים האנדותל גם אושרה על ידי תיוג לקטינים / BrdU (איור 2 ד). תא שריר חלק ונוכחות pericyte לאורך כלי אושרה עם תיוג NG2 (איור 2 ב). תיוג עבור LYVE1 ו PECAM זיהה הסתעפות לימפטי כלי דם דם רשתות ואשר את מתוחזק הלימפה לעומת פנוטיפ תאי דם האנדותל (איור 2 ג). התכונה זמן לשגות של מודל זה נוצל על ידי תיוג microvaרשתות scular עם-לקטינים BSI בנקודות זמן שונות הדמיה באותו אזור בתוך הרשת לאורך זמן; יכולת זו היא בעל ערך במיוחד עבור חוקרת תגובות angiogenic רקמות ספציפיות. התוספת של תקשורת עם סרום 10% הגררה גם תגובה angiogenic חזקה לאחר 3 ימים של גירוי. בנוסף, מקטעי כלי חדשים וכרוב נימים זוהו על ידי ביום 5 של גירוי (איור 3). שיטת הדמית הזמן לשגות מותר עבור השוואת כמותית של אזורי רשת לפני ואחרי הגירוי (איור 4). לצורך המחקר נציג זה, אשר מאשש תוצאות הניסויים עד כה 9, מספר כלי השיט ליחידת שטח וסקולרית ומספר נבטים נימי ליחידת שטח וסקולרית כומתו מתמונה 4X אחד לכל רקמה. כלי מגזרי דם הוגדרו כמגזרי תא האנדותל דם לקטינים חיוביים נוכחיים בין שתי נקודות סניף וכרוב נימים הוגדרו עיוור הסתיים<html> קטעים שמקורם כלי המארח. זמן לשגות השוואה של אזורי רשת מופעלת גם מעקב של מגזרי תא האנדותל (איור 5) וזיהוי של דם / כלי הלימפה mis-דפוסים (איור 6). תיוג של רקמות בתרבית למשך לקטינים ו CD11b בנוסף אישר את נוכחותו של מקרופאגים תושב ביניים (איור 7) ברשתות שיפוץ. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55183/55183fig1.jpg" /> איור 1. חלונות Mesenteric אותרו על ידי תלישה המעי הדק דרך הבמה כירורגי. השלב כירורגית תוכנן על ידי הדפסת 3-D. החור הסגלגל במרכז הוא כ 2 ב -1 ב (א). חלונות mesenteric היו אז פרושים על גבי להכניס קרום, ואת הכנס היה הפוך והכניס באר (B). סרגל קנה מידה = 2 ס&quot;מ.ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55183/55183fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55183/55183fig2.jpg" /> איור 2. כלי דם להישאר קיימא במודל תרבות עכברוש לפדר. Assay חי / מת שבוצע לאחר התרבות הראה יחס גבוה של תאי חיים (ירוק) כדי תאים מתים (אדום) במיוחד לאורך כלי הדם (A). רקמות לפדר תויגו עם לקטינים ואנטי NG2, לזהות pericytes (אדום) לצד כלי שיט (ירוק) וכדי לוודא כי סוגים שונים של תאי נוכחים ברקמות-תרבות פוסט (B). רקמות גם תויגו נגד PECAM / LYVE-1 לזהות הדם (אדום) כלי מ הלימפה (ירוק) כלי (C). כדי לחקור אם תאי כלי הדם עוברים התפשטות בתרבות, רקמות לפדר תויגו עם לקטינים / אנטי BrdU<html> . על מגזרי נימים שכותרתו עם לקטינים (ירוק), מספר תאים אושרו להיות שגשוג (אדום) (D). ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55183/55183fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55183/55183fig3.jpg" /> איור 3. הדמיה זמן לשגות של לפדר עכברוש מאפשר התבוננות שיפוץ כלי הדם במהלך התרבות. תגובת angiogenic חזקה נצפתה לאחר 3 (ב) ו -5 ימים (C) של תרבות עם גירוי סרום 10%. ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55183/55183fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> קבצים / ftp_upload / 55,183 / 55183fig4.jpg &quot;/&gt; רשתות כלי הדם איור 4. במודל תרבות עכברוש לפדר הם צילמו לפני ואחרי אנגיוגנזה. השוואה באותה הרשת שכותרתו עם לקטינים ביום 0 ויום 3 (A, B) גירוי פוסט עם סרום 10% מזהה כלי חדש. לקטינים גם תוויות אוכלוסייה של תאי ביניים לא מזוהים. כימות צפיפות כלי (C, D) ומספר נבטים נימי ליחידת שטח וסקולרית (E, F) אישר גידול בשני הערכים של כל רקמות. C, E) לפני (יום 0) ואחרי (יום 3 השוואות) לכל רקמה. D, F) השוואה בין יום 0 ויום 3 ממוצעים באמצעות מבחן t מזווג אישר הבדל משמעותי הן את המספר הממוצע של מגזרים כלי (p &lt;0.0001) ואת המספר הממוצע של נבטים (p &lt;0.00001) ליחידת שטח וסקולרית . ברים לבנים מייצגים יום 0, ו פסים שחורים מייצגים יום 3. Values הם ממוצעים ± SEM. לניתוח נציג זה, 13 רקמות נבצרו 2 חולדות. ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55183/55183fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/55183/55183fig5.jpg" /> איור 5. מודל תרבות העכברוש לפדר יכול לשמש לחקירת גורלו אי וסקולרית ושילוב לתוך רשתות סמוכות. באמצעות הדמיה זמן לשגות, איים וסקולרית, מוגדר כמגזרים אנדותל מנותקים, זוהו ביום 0 וחיבורם לרשת הסמוכים אושרה על ידי גירוי 3 ביום שלאחר angiogenic. רקמות לפדר היו מגורה עם bFGF (A, B) ו VEGF / PDFG-BB (C, D). חיצי הולו להראות קטעים מנותקים ביום 0 וחצים מוצקים מייצגים קשר האי אל הרשתותk. ראשי חץ להצביע על המיקום של חיבורים בין אי וסקולרית והרשת הסמוכה. ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55183/55183fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/55183/55183fig6.jpg" /> תמונות איור 6. זמן לשגות להדגים את היכולת להתבונן דפוסים הלימפה וכלי דם. ניתן להבחין כלי הלימפה (יב) מ arterioles (א) ו- venules (נ) המבוסס על מורפולוגיה תיוג על 0 יום (א). ביום 5 גירוי פוסט עם סרום 10%, מורפולוגיה הלימפה אבדה וכלי נראה שלב עם כלי הדם הסמוכים angiogenic (B). ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55183/55183fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גדול</a>גרסה של נתון זה. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/55183/55183fig7.jpg" /> המקרופאגים איור 7. להישאר בהווה ברקמות mesenteric החולדה תרבותיות. שיתוף תיוג של רקמות לקטינים / CD11b בתרבית למשך 3 ימים עם 10% בסרום מראה כי תאי ביניים חיוביים לקטינים הם קבוצת משנה של מקרופאגים. (א) תמונה מייצגת של תיוג BSI-לקטינים. (ב) תיוג CD11b באותו שדה הראייה. (ג) תמונה הממוזגת. החיצים לזהות דוגמאות של שיתוף תיוג. ברים בקנה מידה = 100 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55183/55183fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks at JoVE.com

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.

<em&gt; Ex Vivo</em&gt; שיטת הדמיה זמן לשגות של רשתות כלי הדם Mesenteric עכברוש מתורבתות

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

an-ex-vivo-method-for-time-lapse-imaging-cultured-rat-mesenteric

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

6.8K Views.  Tulane University. Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis. 

Video: An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

לכידת תיקון רקמות דג הזברה זחלים עם הזמן לשגות Brightfield stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

ניתוח<em&gt; In vivo</em&gt; נדידת תאים באמצעות השתלות תא והדמיה זמן לשגות עוברי דג הזברה

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

ניתוח של פיתוח כליה דג הזברה עם זמן לשגות הדמיה באמצעות מיקרוסקופ לנתח מצויד עבור חתך אופטי

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of morphogenetic events, such as gastrulation2, neurulation3-5, somitogenesis6, heart bending7,8, and brain formation9-13, during early embryogenesis. Key to understanding morphogenetic processes is to follow them dynamically by time-lapse imaging. The acquisition of time-lapse movies of chick embryogenesis ex ovo has been limited either to short time windows or to the need for an incubator to control temperature and humidity around the embryo14. Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for high-resolution time-lapse imaging using transmitted light microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique (EC-culture)1 and allows for the culturing of chick embryos without the need for a climate chamber. The embryo is sandwiched between two identical filter paper carriers and is kept fully submerged in a simple, temperature-controlled medium covered by a layer of light mineral oil. Starting from the primitive streak stage (Hamburger-Hamilton stage 5, HH5)15 up to at least the 28-somite stage (HH16)15, embryos can be cultured with either their ventral or dorsal side up. This allows the acquisition of time-lapse movies covering about 30 hr of embryonic development. Representative time-lapse frames and movies are shown. Embryos are compared morphologically to an embryo cultured in the standard EC-culture.
The submerged filter paper sandwich provides a stable environment to study early dorsal and ventral morphogenetic processes. It also allows for live fluorescence imaging and micromanipulations, such as microsurgery, bead implantation, microinjection, gene silencing, and electroporation, and has a strong potential to be combined with immersion objectives for laser-based imaging (including light-sheet microscopy).

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

כריך נייר מסנן מתחת למים במשך לטווח ארוך<em&gt; אקס אובו</em&gt; זמן לשגות הדמיה של מוקדם צ&#39;יק עובר

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

פוטון רב זמן לשגות הדמיה כדי להמחיש את התפתחות בזמן אמת: ויזואליזציה של העברת תאי הרכס העצבי עוברי דג זברה

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic age-related macular degeneration (AMD) which represents 90% of the cases. Therapies are needed to slow or retard the development of geographic atrophy (GA), and understanding Bruch&#39;s membrane pathology is part of this process. Alterations in human Bruch&#39;s membrane precede the progression of AMD by contributing to the damage of retinal pigment epithelial (RPE) cells. Given the lack of sufficient animal models to study AMD, ex vivo models of aged human Bruch&#39;s membrane serve as a useful tool to study the behavior of RPE cells from immortalized and primary cell lines as well as RPE lines derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs). Here, we present a detailed method that allows one to determine the effects of RPE cell behavior seeded on harvested human Bruch&#39;s membrane explants from human donors, including attachment, apoptosis and proliferation, ability to phagocytize photoreceptor outer segments, establishment of polarity, and gene expression. This assay provides an ex vivo model of aged Bruch&#39;s membrane to assess the functional characteristics of RPE cells when seeded on aged/compromised extracellular matrix.

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

The goal of this protocol is to demonstrate the culturing of retinal pigment epithelial (RPE) cells on aged and/or diseased human Bruch&#39;s membrane. This method is suitable to study RPE cell behavior on a compromised extracellular matrix.

Culturing תאי אפיתל הפיגמנט ברשתית על מודל לשעבר Vivo של הממברנה של ברוך בן אנוש

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by Sertoli cell junctions at the blood-testis barrier (BTB), which is the tightest tissue barrier in the mammalian body and segregates the seminiferous epithelium into two compartments, a basal and an adluminal. The BTB creates a unique microenvironment for germ cells in meiosis I/II and for the development of postmeiotic spermatids into spermatozoa via spermiogenesis. Here, we describe a reliable assay to monitor BTB integrity of mouse testis in vivo. An intact BTB blocks the diffusion of FITC-conjugated inulin from the basal to the apical compartment of the seminiferous tubules. This technique is suitable for studying gene candidates, viruses, or environmental toxicants that may affect BTB function or integrity, with an easy procedure and a minimal requirement of surgical skills compared to alternative methods.

An In Vivo Method to Study Mouse Blood-Testis Barrier Integrity

Here, we present a protocol to assess the blood-testis barrier integrity by injecting inulin-FITC into testes. This is an efficient in vivo method to study blood-testis barrier integrity that can be compromised by genetic and environmental elements.

שיטת In Vivo ללמוד העכבר דם Testis מכשול שלמות

Spermatogenesis is the development of spermatogonia into mature spermatozoa in the seminiferous tubules of the testis. This process is supported by ...

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ellipsoid shape during development. This developmental process is called oogenesis and is crucial to generating functional mature eggs to secure the next fly generation. For these reasons, egg chambers have served as an ideal and relevant model to understand animal organ development.
Several in vitro culturing protocols have been developed, but there are several disadvantages to these protocols. One involves the application of various covers that exert an artificial pressure on the imaged egg chambers in order to immobilize them and to increase the imaged acquisition plane of the circumferential surface of the analyzed egg chambers. Such an approach may negatively influence the behavior of the thin actomyosin machinery that generates the power to rotate egg chambers around their longer axis.
Thus, to overcome this limitation, we culture Drosophila egg chambers freely in the media in order to reliably analyze actomyosin machinery along the circumference of egg chambers. In the first part of the protocol, we provide a manual detailing how to analyze the actomyosin machinery in a limited acquisition plane at the local cellular scale (up to 15 cells). In the second part of the protocol, we provide users with a new Fiji-based plugin that allows the simple extraction of a defined thin layer of the egg chambers&#8217; circumferential surface. The following protocol then describes how to analyze actomyosin signals at the tissue scale (&#62;50 cells). Finally, we pinpoint the limitations of these approaches at both the local cellular and tissue scales and discuss its potential future development and possible applications.

Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers

This protocol provides a Fiji-based, user-friendly methodology along with straightforward instructions explaining how to reliably analyze actomyosin behavior in individual cells and curved epithelial tissues. No programming skills are required to follow the tutorial; all steps are performed in a semi-interactive manner using the graphical user interface of Fiji and associated plugins.

ניתוח של Actomyosin בסולמות הסלולר והרקמה המקומית באמצעות הזמן- סרטים פקיעה של מתורבת ביצת ביצה צ'יימברס

Drosophila immature eggs are called egg chambers, and their structure resembles primitive organs that undergo morphological changes from a round to an ...

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An assay is described here to perfuse an isolated rat placenta and evaluate the maternal-to-fetal translocation of xenobiotics ex vivo. In addition, the evaluation of physiological processes such as fluid flow to the fetus and placental metabolism may be conducted with this methodology. This technique is suitable for evaluating maternal-to-fetal kinetics of pharmaceutical candidates or environmental contaminants. In contrast to current alternative approaches, this methodology allows the evaluation of the isolated maternal-fetal vasculature, with the systemic neural or immune involvement removed, allowing any observed changes in physiological function to be attributable to local factors within the isolated tissue.

Here is presented a protocol of ex vivo maternal-fetal vascular perfusion to enable the administration of a test article into maternal vasculature and to evaluate placental transfer of xenobiotic particles or pharmacological agents in addition to alterations in placental physiology.

לשעבר Vivo Perfusion של השליה מכרסם

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

שיטת הרכבה שכבתית עבור מיקרוסקופ זמן מורחב מיקרוסקופיה של כל העוברים דגים

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...