המחברים מודים תמיכה כספית ממענק ZonMW-Vici 918.11.635 (הולנד). המחברים מבקשים להודות חנות כלי של אמסטרדם Vrije Universiteit לעצות מעשיות שלהם לייצור הרכיבים להתקנה Jarno Voortman של Carl Zeiss הולנד עבור עצות מועילות על מיקרוסקופיה. Marjolein Blaauboer היה תמיכה גדולה עוד להתייחס באופן ביקורתי על מספר טיוטות של כתב היד.

כל הפרוצדורות בוצעו בהתאם ניסויי הולנד על בעלי חי חוק. הערה: שיטת כריך נייר הסינון השקועה היא שונה מ -1. 1. הכנת מסנן שקוע סנדוויץ נייר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pannett-קומפטון (PC) -saline 27,28 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין פתרונות מניות (1 ליטר של ultrapure H 2 O, 121 גרם של NaCl, 15.5 גרם של KCl, 10.42 גר &#39;CaCl 2 · H 2 O, ו -12.7 גרם של MgCl 2 · 6H 2 O) ו- B (1 ליטר של ultrapure H 2 O, 2.365 גרם של Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, ו 0.188 גרם של 2 לאא PO 4 · 2H 2 O) בבקבוקים 1-L נקי. ולאחסן אותם ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 ליטר של מלוחים PC ידי ערבוב 900 מ&quot;ל של ultrapure H 2 O עם 40 מ&quot;ל של פתרון המניות ו -60 מ&quot;ל של B פתרון המניות (לפי סדר זה, כדי למנוע משקעים). כן fr PC-מלוח הטריפתרונות המניות אום א &#39;וב&#39; כל שבוע. הערה: פתרונות מניות יכולים להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים. מעוקר ו / או הוספת אנטיביוטיקה או antimycotics אינה נחוצה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של ביצי תרנגולת מופרות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חממה humidified, מטילים את הביצים בצד שלהם דגירה אותם על 37.5 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים לגיל הרצוי. הערה: חנות ללא ביצים יותר משבועיים (רצוי 12 - 15 ° C) לפני הניסוי, כמו hatchability יקטן באופן משמעותי </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספקי נייר סינון (מותאם מ 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם זמין, להשתמש במכונת חיתוך ליזר לחתוך ספקי נייר פילטר בצורת שעון חול מנייר סינון עבה (28 מ&quot;מ x 22 מ&quot;מ). להתחדד רוחב באמצע מ -22 מ&quot;מ עד 10.4 מ&quot;מ. לגזור צמצם אליפטי מרכזי (10.6 מ&quot;מ x 5.5 מ&quot;מ), עם הציר כבר המקבילי חוקי האליפסה לצד הגדול של מוביל נייר סינון (איור 1-M). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, להכין שבלונה מקרטון עם הממדים הנכונים ולהעביר מתאר שלה וכי של הצמצם המרכזי נייר סינון עבה בעפרון. לגזור מוביל נייר סינון באמצעות מספריים בסדר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך שתי נושאות נייר סינון זהות עבור כל עובר להיות explanted. כן ספקי נייר סינון נוספים כגיבוי למקרה עובר הולך לאיבוד במהלך explanting. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמבטית בקרת טמפרטורת שמן (ביום של הניסוי) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את כוס בקרת הטמפרטורה במרכז של XY-הבמה הממונע של המיקרוסקופ זום זקוף ולחבר את הכוס אל בקר הטמפרטורה שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים ארבע טבעות נירוסטה גדול (30 מ&quot;מ קוטר חיצוני, 4 מ&quot;מ גובה, 1.5 עובי דופן מ&quot;מ) לתוך צלחת 6 ס&quot;מ פטרי לפעול כמו משקולות במקום צלחת באמצע כוס בקרת טמפרטורה. הערה: צלחת פטרי זה רק משמש כמציין מיקום להתאים את leve שמןl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את כוס בקרת טמפרטורה עם 130 מ&quot;ל של שמן מינרלי אור. התאם את מפלס השמן במידת הצורך, כך שהוא יסתיים כ -3 מ&quot;מ מתחת לקצה העליון של המנה 6 ס&quot;מ פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים את המאפה 6 ס&quot;מ פטרי מקנקן בקרת טמפרטורה ולהגדיר את הטמפרטורה ל 40 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol> 2. הפקת סנדוויץ נייר סינון שקוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני תרבות (ביום של הניסוי) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 30 מ&quot;ל של תמיסת מלח PC (כפי שהוכנו בצעדים 1.1.1 1.1.2) לתוך צינור צנטריפוגות 50 מ&quot;ל. הכן צינור צנטריפוגות אחד 50 מ&quot;ל מלא 30 מ&quot;ל של תמיסת מלח מחשב לכל שני עוברים להיות explanted. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לפצח ביצה הלא מודגרות לתוך צלחת 10 ס&quot;מ פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר חלבון רזה על ידי העברת פיפטה העברת פלסטיק לאורך הקירות של צלחת פטרי ולהכניס פנימה את החלבון דק. אסוף 30 מ&quot;ל חלבון רזה צינור צנטריפוגות 50 מ&quot;ל לכל שני עוברים להיות explanted. הקפד לקבל רק את tין חלבון. הערה: בדרך כלל 3 - 4 ביצים לאפשר את המסיק של כ -30 מ&quot;ל של חלבון רזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 20 מ&quot;ל של חלבון רזה לתוך כל-מלוחים PC מלא 50 מ&quot;ל צינור צנטריפוגות (כפי מוכן בשלב 2.1.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את-מלוחים PC עם חלבון רזה על ידי היפוך בעדינות את הצינורות מספר פעמים. תן לו להתיישב במשך כמה דקות ולבדוק אם התערובת, שנקראה בינוני תרבות מכאן ואילך, ברורה. אם מדיום התרבות אינו ברור, להכין PC-מלוח טרי מפתרון המניות ולמסוק חלבון רזה טרי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח שתי טבעות נירוסטה קטנות (20 מ&quot;מ קוטר חיצוני, 4 מ&quot;מ גובה, עובי דופן 1.5 מ&quot;מ, 6.5 פער מ&quot;מ הטבעת) רחוק ככל האפשר בצלחת פטרי 6 סנטימטרי פלסטיק טריה ולמלא אותו עם 22 מיליליטר של תרבות בינוני (כפי שהוכנו בצעדים 1.4.1 כדי 1.4.4) בעזרת פיפטה פלסטיק 25 מ&quot;ל (איור 1-H). ודא כי הפסולת שהצטברו על גבי המדיום נשאר בצינור צנטריפוגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר o פסולתr בועות מהמדיום בעזרת פיפטה העברת פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא צלחת 10 ס&quot;מ פטרי עם 75 מ&quot;ל של תמיסת מלח PC (לשמש בשלב 2.15). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ביצה מן החממה ולתת לו לנוח על הספסל על צידו דקות 1 לתת העובר לבוא העליון של החלמון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לסדוק את הביצה לתוך צלחת פטרי (איור 1-A). משרה את הקצה של פיסת נייר טישו משובח החלבון העבה ומרכז את blastoderm ידי משייכת, במידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ביותר של החלבון הדק בעובי מצלחת פטרי בעזרת פיפטה פלסטיק העברה (עם הקצה לחתוך כדי להקל על הספיגה של החלבון העבה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור חלון החלבון העבה סביב העובר על ידי מוחה את החלבון העבה בעדינות עם פיסת נייר טישו, מתרחק מהמרכז (איור 1-B). למנוע את נייר האריזה מן נלוות קרום vitelline. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פינצטה, בזהירות למקם נשאית נייר סינון על Viteקרום lline סביב העובר, עם ציר כבר המקבילי הצמצם אליפטי לציר האחורי-הקדמי של העובר (איור 1-C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצבוט קצה אחד של מספריים לציפורניים דרך הממברנה vitelline הקרובה למוביל נייר הסינון לחתוך במהירות ברחבי מוביל נייר סינון כולה (איור 1-D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פינצטה, הרם את המוביל נייר סינון מן החלמון הקבלה בכיוון אלכסוני לציר הקדמי, האחורי של העובר (איור 1-E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובבו את הספק נייר סינון סביב להיות בצד הגחון של העובר על גבי להשקיע אותה-מלוחים PC. לטבול מוביל נייר הסינון לאורך הציר הקדמי, אחורי של העובר בכיוון אלכסוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היפטר כל החלמון עדיין מחוברת הממברנה vitelline ואת blastoderm ידי שטיפתו בעדינות עם מי מלח מחשב מפני פיפטה פלסטיק העברה. שמור את המכלול המוביל נייר סינון שקוע בכלפעמים LL (איור 1-F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר המוביל נייר סינון מן-המלוח PC לאורך הציר הקדמי, אחורי של העובר בכיוון אלכסוני ו להיפטר הנוזל העודף בטופחו הקצה המוביל נייר הסינון על ממחטת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק את נייר הסינון אופקי, עם הצד הגחוני של העובר פונה כלפי מעלה, ומניח אחר המובילים נייר פילטר על גבי הראשון, באמצעות זוג נוסף של פינצטה. הפתחים שלהם צריכים להתאים בדיוק, ובכך רבדה העובר בין שתי השכבות של נייר סינון (איור 1-G). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להטביע את הכריך המוביל נייר סינון לתוך מדיום התרבות בכיוון אלכסוני לאורך ציר ה- הקדמי, האחורי של העובר. מניח אותו באזור מחלק את המרחב בין שתי טבעות הפלדה (איור 1-H). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את כריך נייר פילטר על ידי הצבת שתי טבעות פלדה יותר על גבי שני אחרים, ולוודא כי הצמצם עם הדוארmbryo השרידים שנתגלו לחלוטין (איור 1-I). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הרמה הבינונית לוודא כי spacer העליון רק הוא שקוע בתוך המדיום. במידת הצורך, להוסיף או להסיר כמויות קטנות של המדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות במקום צלחת פטרי במרכז באמבטיה שמן בקרת טמפרטורה ולייצב את המנה רוחבית על ידי הצבת שלוש טבעות נירוסטה גדול (30 מ&quot;מ קוטר חיצוני, 4 מ&quot;מ גובה, 1.5 עובי דופן מ&quot;מ) לצד המנה בשמן . ודא כי טבעות פלדה לגעת בדפנות של המנה (איור 1-J). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט פיפטה כ -6 מ&quot;ל של שמן מינרלי אור על גבי המדיום עם טפטפת העברת פלסטיק, כך המדיום מכוסה שכבה רציפה של שמן מינרלי (איור 1-K). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את רכישת זמן לשגות. הערה: הדמיה העוברים כמו פנורמות אופקיות של חמש תמונות תת חופפים (אריחים) מאפשרת הדמיה מפורטת (אובייקטיבית 5X), עם overvi כלליEW של מורפולוגיה 29-30. במרווחי הדמיה בין 3 ל 10 דק &#39;לאפשר המעקב המפורט של מורפולוגיים משנה 31, ורכישת Z- ערימות קטנות (חמישה עד שבעה מטוסים שונים, תוך שמירת מרחק של 30 מיקרומטר) מפצים על הרבה של עיבוי המפנה של העובר 30 . ניתן לבחור Z-מטוסים עם הניגוד הגבוה ביותר לפני עיבוד נוסף 32 של מסגרות יחידה לתוך סרטי הזמן לשגות (ראה סעיף נציג תוצאות לקבלת מידע מפורט על רכישת תמונה). </li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54636/54636fig1.jpg" /> איור 1: הגדרת סנדוויץ נייר סינון השקוע. (א) ביצה סדוקה לתוך צלחת פטרי. (ב) רוב החלבון באש ובמים יוסרו צלחת פטרי עם טפטף פלסטיק העברה (לא מוצג). לאחר מכן, חלון החלבון העבה הוא יצרסביב העובר על ידי מוחה את החלבון העבה בעדינות עם נייר טישו. (C) מנשא נייר הסינון ממוקם סביב blastoderm על גבי החלמון. (ד) המוביל נייר המסנן להתנתק מן הקרום vitelline שמסביב (E) הוסרו מהחלק העליון של החלמון. (ו) חלמון הנותרים הוא נשטף בזהירות באמבט PC-מלוח. (ז) עובר הוא דחוק עם מנשא נייר סינון זהה שני. (ע) כריך נייר פילטר טבול בתוך המדיום ואת מיקומו על שתי טבעות נירוסטה מתכת פלדה (הגבי פונה העובר או בצד הגחון למעלה). (אני) שתי טבעות לייצב את הכריך מלמעלה. (י) את צלחת פטרי שמכילה את העובר מועבר אמבט שמנים עם בקרת טמפרטורה. טבעות פלדת אל-חלד לייצב את צלחת פטרי רוחבית. (יא) בינוני התרבות מכוסה בשכבה של שמן מינרלי.(L) סכמטי של הכריך המסנן השקוע. (M) מידות של ספקי נייר פילטר המשמשים את כריך נייר פילטר השקוע. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54636/54636fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<ol>
	<li>Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+chick+whole-embryo+culture+using+a+filter+paper+carrier.">Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier.</a> Dev. Dyn. 220 (3), 284-289 (2001).</li><li>Rozbicki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-II-mediated+cell+shape+changes+and+cell+intercalation+contribute+to+primitive+streak+formation.">Myosin-II-mediated cell shape changes and cell intercalation contribute to primitive streak formation.</a> Nat. Cell Biol. 17 (4), 397-408 (2015).</li><li>Smith, J. L., Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurulation:+Coming+to+closure.">Neurulation: Coming to closure.</a> Trends Neurosci. 20 (97), 510-517 (1997).</li><li>Schoenwolf, G. C., Sheard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+and+bending+of+the+avian+neural+plate+as+analysed+with+a+fluorescent-histochemical+marker.">Shaping and bending of the avian neural plate as analysed with a fluorescent-histochemical marker.</a> Development. 105 (1), 17-25 (1989).</li><li>Colas, J. F., Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+cellular+and+molecular+understanding+of+neurulation.">Towards a cellular and molecular understanding of neurulation.</a> Dev. Dyn. 221 (2), 117-145 (2001).</li><li>Pourqui&#233;, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chick+embryo:+a+leading+model+in+somitogenesis+studies.">The chick embryo: a leading model in somitogenesis studies.</a> Mech. Dev. 121 (9), 1069-1079 (2004).</li><li>Maenner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+looping+in+the+chick+embryo:+A+morphological+review+with+special+reference+to+terminological+and+biomechanical+aspects+of+the+looping+process.">Cardiac looping in the chick embryo: A morphological review with special reference to terminological and biomechanical aspects of the looping process.</a> Anat. Rec. 259 (3), 248-262 (2000).</li><li>Wittig, J. G., M&#252;nsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Early+Stages+of+Heart+Development+Insights+from+Chicken+Embryos.">The Early Stages of Heart Development Insights from Chicken Embryos.</a> J. Cardiovasc. Dev. Dis. 3 (2), (2016).</li><li>Layer, P. G., Alber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+of+chick+brain+vesicles+as+revealed+by+peanut+agglutinin+and+cholinesterases.">Patterning of chick brain vesicles as revealed by peanut agglutinin and cholinesterases.</a> Development. 109 (3), 613-624 (1990).</li><li>Nakamura, H., Nakano, K. E., Igawa, H. H., Takagi, S., Fujisawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+and+rigidity+of+differentiation+of+brain+vesicles+studied+in+quail-chick+chimeras.">Plasticity and rigidity of differentiation of brain vesicles studied in quail-chick chimeras.</a> Cell Differ. 19 (3), 187-193 (1986).</li><li>Garcia-Lopez, R., Pombero, A., Martinez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+map+of+the+chick+embryo+neural+tube.">Fate map of the chick embryo neural tube.</a> Dev. Growth Differ. 51 (3), 145-165 (2009).</li><li>Andermatt, I., Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi-based+gene+silencing+in+chicken+brain+development.">RNAi-based gene silencing in chicken brain development.</a> Methods Mol. Biol. 1082, 253-266 (2014).</li><li>Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shell-less+culture+of+the+chick+embryo+as+a+model+system+in+the+study+of+developmental+neurobiology.">Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology.</a> Neuroanatomy. 3 (1), 8-11 (2004).</li><li>Endo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+embryo+culture+and+electroporation.">Chick embryo culture and electroporation.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. , Unit 19.15 (2012).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Ovo+Live+Imaging+of+Avian+Embryos.">In Ovo Live Imaging of Avian Embryos.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010 (6), (2010).</li><li>Borwompinyo, S., Brake, J., Mozdziak, P. E., Petitte, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+chicken+embryos+in+surrogate+eggshells.">Culture of chicken embryos in surrogate eggshells.</a> Poult Sci. 84 (9), 1477-1482 (2005).</li><li>Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex-ovo+Chicken+Embryo+Culture+System+Suitable+for+Imaging+and+Microsurgery+Applications.">An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications.</a> J. Vis. Exp. (44), e2154 (2010).</li><li>Auerbach, R., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+procedure+for+the+long-term+cultivation+of+chicken+embryos.">A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos.</a> Dev. Biol. 41 (2), 391-394 (1974).</li><li>New, D. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Technique+for+the+Cultivation+of+the+Chick+Embryo+in+vitro.">A New Technique for the Cultivation of the Chick Embryo in vitro.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 3 (4), 320-331 (1955).</li><li>Stern, C. D., Bachvarova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+chick+embryos+in+vitro.">Early chick embryos in vitro.</a> Int. J. Dev. Biol. 41 (2), 379-387 (1997).</li><li>Nagai, H., Lin, M. C., Sheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+cornish+pasty+method+for+ex+ovo+culture+of+the+chick+embryo.">A modified cornish pasty method for ex ovo culture of the chick embryo.</a> Genesis. 49 (1), 46-52 (2011).</li><li>Connolly, D., McNaugbton, L. A., Krumlauf, R., Cooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+in+vitro+development+of+the+chick+embryo+using+roller-tube+culture.">Improved in vitro development of the chick embryo using roller-tube culture.</a> Trends Genet. 11 (7), 259-260 (1995).</li><li>Rupp, P. A., Rongish, B. J., Czirok, A., Little, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+avian+embryos+for+time-lapse+imaging.">Culturing of avian embryos for time-lapse imaging.</a> Biotechniques. 34 (2), 274-278 (2003).</li><li>Martins, G. G., Rifes, P., Ama&#226;ndio, R., Rodrigues, G., Palmeirim, I., Thorsteinsd&#243;ttir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+3D+cell+rearrangements+guided+by+a+fibronectin+matrix+underlie+somitogenesis.">Dynamic 3D cell rearrangements guided by a fibronectin matrix underlie somitogenesis.</a> PLoS One. 4 (10), e7429 (2009).</li><li>Nagai, H., Sezaki, M., Nakamura, H., Sheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+the+limits+of+avian+embryo+culture+with+the+modified+Cornish+pasty+and+whole-embryo+transplantation+methods.">Extending the limits of avian embryo culture with the modified Cornish pasty and whole-embryo transplantation methods.</a> Methods. 66 (3), 441-446 (2014).</li><li>Pannett, C., Compton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cultivation+of+Tissues+in+Saline+Embryonic+Juice.">The Cultivation of Tissues in Saline Embryonic Juice.</a> Lancet. 203 (5243), 381-384 (1924).</li><li>Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+temporally+controlled+electroporation+of+early+chick+embryos.">Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos.</a> Nat. Protoc. 3 (3), 419-426 (2008).</li><li>. GmbH ZEN 2 - (blue edition) - Software Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.unige.ch/medecine/bioimaging/files/3914/3765/2064/ZEN_2_blue_edition_-_Software_Guide.pdf">https://www.unige.ch/medecine/bioimaging/files/3914/3765/2064/ZEN_2_blue_edition_-_Software_Guide.pdf</a> (2014)</li><li>Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Avian+Embryos.">Culture of Avian Embryos.</a> Dev. Biol. Protoc. Vol. I. 135, 31-38 (2000).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

כתוצאת גרסה חדשה של תרבות 1 והמבוססת EC, כריך נייר פילטר השקוע מקל על רכישת סרטי brightfield ו הזמן לשגות darkfield לטווח ארוך של האקס עובר אפרוח מוקדם אובו ידי ביצוע חממה בטמפרטורה ו-לחות מבוקרות סביב המיקרוסקופ אפשר לוותר עליהן. במקום להיות מתורבת על התחתונה חצי מוצקה אגר-חלבון, העוברים מוחזקים שקועים לחלוטין בתוך מדיום תרבות פשוט המורכבת-מלוח PC ו חלבון רזה. אידוי איבוד חום הם מזעריים על ידי שכבה של שמן מינרלים צפה על גבי המדיום לתרבות. עובר יכול להיות מתורבת בקלות, או הגבו או למעלה בצד גחון, ללא הבדלים גלויים באיכות. כפי שניתן לראות כאן, עוברים את הכריך נייר פילטר שקוע נגישים להתערבויות מיקרו, כמו יישום של חרוזים ספוג מורפוגן. יישומים עתידיים כוללים דימות פלואורסצנטי חיים, microinjections ו electroporation, ואת גן השתקה לאמאnipulate וללמוד מגוון רחב של אירועים המוךפו&quot;גנטי שהולכים במהלך הגחון (למשל, לב somitogenesis מוקדם) ועל גב (למשל, gastrulation מאוחר, סגירת צינור עצבית, והמוח מוקדם) פיתוח. טיפול תרופתי תלוי זמן אינו ריאלי אם צלחת פטרי המכילה את כריך נייר פילטר מוחלפת בתא זלוף, המאפשר החלפת בינוני התרבות מתחת לשכבת שמן מינרלים. כריך נייר פילטר השקוע יפתח פוטנציאל ההדמיה המלא שלה בשילוב עם הדמיה מבוססת ליזר (כוללים מיקרוסקופ אור גיליון) ויעדי טבילה. כמה קשיים עם הכנת כריך נייר פילטר השקוע יטופלו בפסקאות הבאות. למרות שזה דורש כמות של אימון מתונה בלבד להעביר עובר מן החלמון לתוך כריך נייר פילטר, כמה צעדים עדיין יכולים להשפיע על האיכות עובר באופן משמעותי בתרבות. לפני מוביל נייר סינון הואהניח על החלמון, קרום vitelline סביב העובר צריך להיות משוחרר מכל חלבון עבה. רק אז יהיה הקשר בין נייר הסינון ואת קרום vitelline להיות חזק מספיק כדי לעמוד הכביסה ב-מלוח PC. העיתון המסנן נושא את העובר צריך לחצות את הממשק הנוזל / אוויר כמה שפחות כדי למזער את המתח על ממברנות. לאחר שהובא אל-מלוח PC לשטיפה, המוביל נייר הסינון כולה צריך להישאר שקוע לחלוטין בכל העת. השעה באמבטית PC-מלוח חייבת להיות מוגבלת לכ 30 - 60 שניות, כמו קרום vitelline יתחיל שחרור מעיתון הסינון. ובכל זאת, ניקוי של העובר צריך להיות מוצא להורג באופן יסודי ביותר, כמו שאריות חלמון יהיה מאוחר לטשטש את התצוגה של העובר. במהלך הכביסה, לא להצביע הנחל מן פיפטה העברת ישירות על העובר, אבל תמיד רדיאלית ממנו. לאחר הסרת העובר מן-המלוח PC, הקפד להחזיק את נייר הסינון אופקי כדי למזערמתח על ממברנות העובריים. לאחר מכן, לייצב את העובר עם מוביל נייר הסינון השני. ברגע מוביל נייר הסינון השני מושם, להימנע מיצירת מתח לרוחב, אשר יכול להעביר את נושאי נייר סינון ביחס לזה ולקרוע את הקרומים העובריים. כאשר כריך נייר הסינון מובא לתוך מדיום התרבות, הוא צריך גם לחצות את ממשק האוויר / נוזל רק פעם אחת כדי למזער מתח על ממברנות. הזוג השני של טבעות נירוסטה המשמשות לייצב את כריך נייר פילטר מלמעלה צריך להיות ממוקם מאוד לאט לאט ובלי שום לחץ לצמצם דחיסה של הקרומים העובריים. קרעים קטנים של האזור opaca של העובר בדרך כלל לרפא במהלך השעה הראשונה של תרבות, אבל עובר פגום יכול ותמיד צריך להיות מוחלף על ידי מדגם חדש לפני שכבת שמן הוא pipetted על גבי המדיום לתרבות. כדי לקלוט תמונה של עובר כולו או דגימות מרובות עבור ברזולוציה גבוהה זמן לשגות סרטים, המיקרופוןroscope חייב להיות מצויד XY-הבמה ממונע, שבשליטת תוכנת מיקרוסקופ. זה הוא בעל חשיבות מכרעת כדי לקבל את מהלך XY הבמה עם מהירות מינימאלית, כדי למנוע פגיעה את העוברים ואת המערבולות במדיום התרבות והשמן, אשר יקטינו את איכות התמונה. לרכישה בסרטי הזמן לשגות שהוצגו כאן, xy-הבמה הממונע עבר עם מהירות של כ 1.75 מ&quot;מ / sec. בעתיד, הדמיה יכולה להשתפר עוד יותר על ידי ההעברה הראשונה בשלב למיקום הרצוי והרכישה את התמונה לאחר תקופת מנוחה קצרה לתת תנודות מערבולות להתפוגג. כהגבלה, משתמשים פוטנציאליים צריכים להיות מודעים של מרחק העבודה הארוך יחסית (כ 1 סנטימטר) דרושי שיטת התרבות הזאת אם מיקרוסקופ זקוף ללא מטרות טבילה משמש. תוצאות מרחק עבודה זו מהשכבה של בינוניות של שמן מינרלי על גבי העובר. בצלחת 6 ס&quot;מ פטרי, שכבת שמן יש thicknesים של כ 1 - 1.5 מ&quot;מ, ואת העובר הוא שקוע כ 4 מ&quot;מ עמוק בתוך המדיום לתרבות. תלוי בקוטר של המטרה, בקצה העליון של המנה 6 ס&quot;מ פטרי יכול גם להגביל את הגישה העובר. זה אפשר לעקוף באמצעות מנה גדולה יותר. מרחק העבודה מלמעלה יכול להיות מופחת מעט על ידי מזעור העוביים של השכבות הנוזלות. בנוסף, מרחק העבודה מלמטה יכול להיות ממוזער על ידי הביא את העובר בהמשך לחלק התחתון של צלחת פטרי הקטנת העובי של חלון הזכוכית של הכוס המחוממת. בעוד פרוטוקול מותאם לעבודה עם מיקרוסקופ זום מרחק עבודה ארוך, זקוף, זה יכול להיות מצויד מיקרוסקופ הפוכה גם כן. משתמשים עתידיים צריכים לזכור כי השריית העובר עמוקה מדי במדיום התרבות עלולה להוביל O 2 -diffusion בעיות, למרות מציעים ניסויים ראשוניים כי דיפוזיה מוגבלת לא נראית להיות probלם, כל עוד העובר מוקף מאגר מספיק גדול של מדיום תרבות נייר הסינון הדחוק לא נלחץ אל החלק התחתון של צלחת פטרי. מגבלה נוספת היא בקרת הטמפרטורה. על ידי התאמת הטמפרטורה של הבקר עבור הכוס המחוממת ל -40 מעלות צלזיוס, הטמפרטורה בטווח הבינוני equilibrates 37.5 ° C ברחבי עובר כאשר המדיום מכוסה שמן מינרלים. זה מראה כי כמה אנרגיה הולכת לאיבוד בין החלק התחתון של הכוס, שבו גופי החימום ואת חיישן הטמפרטורה ממוקמות, ואת המיקום של העוברים. בקרת הטמפרטורה יכולה להיות מותאמת על ידי העברת חיישן הפיזור מחדש של גופי החימום.

העובר בשלב ריתק אדם מאז תחילת ההיסטוריה. איך המבנה והמורפולוגיה של עובר להתפתח בצורה של זמן ומרחב מוגדר היטב כל כך? העובר החומוס הפך לאחד הדגמים בעלי החיים בעלי חוליות הקלסיים עבור עובר מכמה סיבות: זה זמין בקלות, זול, שקוף בשלביה הראשונים, ונגיש מניפולציות ניסיון, כפי שהוא מתפתח מחוץ אמא. יתר על כן, יש לו גיאומטריה שטוחה כמעט במהלך אירועי המוךפו&quot;גנטי שהולכים מוקדם, כגון לב היווצרות המוח, gastrulation, neurulation, ו somitogenesis 15. ניתן להבין בצורה הטובה ביותר תהליכים המוךפו&quot;גנטי שהולכים אם הם נלמדים באופן דינמי, כגון באמצעות רכישת זמן לשגות תמונות. העובר חומוס ניתן דמיינו ב אובו 16 אבל עם נגישות נמוכה מניפולציות ניסיוני וראות מוגבלת הדמיה מיקרוסקופ אור ההולכה. לכן, לנתקטכניקות אל הוצעו על מנת אובו לשעבר חומוס עוברים תרבות, גם במערכות תרבות חלמון כולה 13,17 - 19 או תרבויות explant 1,20 - 23. במערכות תרבות חלמון כולו, העובר נשאר על גבי החלמון שלם, ואת התוכן כולו של הביצה מועברת למיכל אחר לאינקובטורים. מיכל זה יכול להיות מעטפת ביצית פונדקאית 17, בצלחת פטרי 19, או ערסל עשוי בניילון נצמד 13,18. עוברים בתרבויות חלמון כולו באופן אידיאלי יכול להיות מתורבת עד הבקיעה והם נגישים micromanipulations. שיטות אלה יעילות במיוחד ללימוד פיתוח של עוברים לאחר תחילתו של מחזור הדם (דבר המגדיל את הניגוד), בעוד עוברי הצעיר להישאר קשה לדמיין. עוברי מוקדם אלה יכולים להיות צילמו הכי טוב אם הם נכרת מן החלמון מתורבת כמו explants במבחנה. Explants הם נגישים בקלות עבור הניסוימניפולציות אל ודורשים פחות מקום עבור culturing. במשך שנים רבות, טכניקת החלוץ ידי דניס החדש ב -1955 הווריאציות שלה היו סטנדרטי זהב של שיטות תרבות explant עבור עבר חומוס, ובכך להפוך את העובר נגיש עבור מיקרוסקופיה זמן לשגות והתערבויות microsurgical 20,21. למרות ההצלחה הגדולה שלו, הטכניקה החדשה היא יחסית תובענית זמן רב. Blastoderm לעתים קרובות מנתק כאשר קרום vitelline, נושאת את blastoderm, נמתח סביב טבעת זכוכית כדי להשיג את המתח הנכון 1. יתר על כן, העובר יכול להיות מתורבת רק עם למעלה בצד הגחון שלה. הנציבות האירופיות התרבות (מוקדם צ&#39;יק), טכניקה חדשה יותר פותחה על ידי צ&#39;פמן Collignon 1, עוקפת את המתיחה של קרום vitelline באמצעות הספק נייר פילטר עם צמצם מרכזי. העיתון המסנן מייחס את קרום vitelline, ובכך שמירת המתח הטבעי שלה, והיא מקיפה את העובר כמו מסגרת תמונה 1.הם עוברים בתרבית על התחתונה אגרה-חלבון, בדרך כלל עם למעלה בצד הגחון שלהם. Culturing כלפי מעלה הגבי נראה אפשרי רק עבור העוברים HH8 15 ומעלה. קבוצות רבות יש להתאים את הספק נייר סינון לצרכים שלהם, כגון על ידי החלפת התחתונה אגר-חלבון עם תמיכה מסיבים תפר כירורגי 24 או קולגן מצופה קרום 25. לעתים קרובות, עוברים תרבותי עם הטכניקה החדשה או עם תרבות EC נחשפים, עם הגב שלהם או משטח הגחון לאוויר כדי להקל דיפוזיה חמצן 1,20. יש תרבויות explant אלה כדי להישמר באווירה humidified כדי למנוע אידוי של המדיום וכדי למנוע את העובר מפני התייבשות. זו מושגת על ידי דוגר את המנה עם תרבות explant בצלחת פטרי גדולה המכילה רקמות לחלחו נייר 1. רכישת זמן לשגות תמונות של עוברים אלה דורש גם את השימוש של חממה אקלים מבוקר סביב המיקרוסקופ כולו או מזגature שבשליטת מיכל עם מכסה מחומם כדי למנוע התעבות של נתיב האור 14. עם זאת, עוברים חומוס יכול גם לפתח לשעבר אובו שקוע לחלוטין במדיום תרבות כמו תרבויות נייר פילטר 25, בסנדוויץ &#39;בין שכבה של שמן מינרלי כבד חלבון ב adaptions של הטכניקה החדשה 2,21, או כמו explants blastoderm מקופל &quot;קורניש בצקי תרבות &quot;23,26, ללא מגע ישיר עם האוויר. כריך נייר פילטר השקוע הוא גרסה חדשה של הטכניקה המובילה נייר סינון. על ידי שילוב של ידע מוקדם על culturing עובר חומוס אובו לשעבר, זה הופך את חממת האקלים מבוקרת ואת המכסה המחומם אפשר לוותר עליהן. העובר הוא דחוק בין שתי נושאות נייר סינון זהה (בחיתוך ליזר) 24 ותרבותי שקוע לחלוטין בתוך מדיום תרבות פשוטה (Pannett-קומפטון מלוח 27,28 ו חלבון רזה לייחס 3: 2) ב בטמפרטורה המבוקרת מכיליםאה. שכבת שמן מינרלי אור צף על גבי המדיום מונעת 2,21 אידוי וממזער אובדן חום לסביבה. תחתית המכל יש חלון זכוכית, ואת ההתקנה כולה מתבצעת על מיקרוסקופ זום מרחק עבודה ארוכה זקוף. התקנה זו מאפשרת רכישת סרטים זמן לשגות brightfield ו darkfield ברזולוציה גבוהה של כ -30 שעות של ההתפתחות העוברית, החל משלב פס פרימיטיבי מוקדם לשלב 28-somite (שווה ערך ל המבורגר המילטון בשלבים 5 עד 16, HH5-16 15). עוברים יכול להיות מתורבת באותה מידה עם למעלה בצד הגחון או הגב שלהם. לכן, עוברים נגישים תצפית ומניפולציה של הגחון (למשל, לב מוקדם 7,8 ו somitogenesis 6) ו הגבי (למשל, בסוף gastrulation 2, סגירת הצינור העצבי 3 - 5, ובתחילת המוח 9 - 13) פיתוח. את p כריך נייר סינון שקועrovides סביבה פשוטה ויציבה עבור המיקרו-כירורגיה, השתלת חרוז, microinjection, להשתקת גנים, ומחקרים electroporation. פוטנציאל הדמיה שלה יכול להיות דחף הרבה יותר על ידי שימוש הדמיה מבוססי לייזר (כולל מיקרוסקופ אור גליון) ויעדים טבילה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Milli-Q&#160;Reference Water Purification System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Z00QSV0WW&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duran&#160;laboratory bottles, with caps, 1L</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Duran</td>
			<td>Z305200-10EA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1064041000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1049361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 H2O</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1023821000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H2O</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>13152-1KG-D&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4.2H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1065801000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.2H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1063420250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman&#160;qualitative filter paper, Grade 595</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10311611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser cutting machine MLS-90120-C130, CO2-laser, 130W, wavelength 10.6 &#181;m</td>
			<td>Micro Lasersystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tork Extra Soft Facial Tissues</td>
			<td>Tork</td>
			<td>140280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex gloves</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z645613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EMDAMED</td>
			<td>EMDA 300.131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z350613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>VWR</td>
			<td>WITG5.480.003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>accu-jet pro Pipette Controller</td>
			<td>BrandTech Scientific</td>
			<td>26332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological plastic pipettes, 25mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS4251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic document sleeves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator - Incubator mod. Cip Cip 40</td>
			<td>Fiem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized chicken eggs (Gallus gallus)</td>
			<td>Drost BV (Loosdrecht, NL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm Petri dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml Centrifuge tubes , Greiner centrifuge tubes&#160; or Cellstar tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel rings, custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large rings, 30 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small rings, 20 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness, 6.5 mm gap in the ring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Dumont #5, Inox</td>
			<td>Fine Science Tools , F.S.T.</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine, really sharp scissors for cutting filter paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3516&#160;Sigma-Aldrich Mineral Oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS Number&#160;8042-47-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar bottoms for EC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539&#160;SIGMA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653&#160;SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbead implantation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead Sampler Kit III (45 &#181;m beads were used)</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>16905-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accupuncture needles: type J, No.02, 0.12x30mm</td>
			<td>SEIRIN</td>
			<td>&#160;type J, No.02, 0.12x30mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTD Temperature Sensor with M4 Threaded Housing RTD-850M</td>
			<td>Omega</td>
			<td>RTD-850M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hermetically Sealed RTD Sensors HSRTD-3-100-A-3M</td>
			<td>Omega</td>
			<td>HSRTD-3-100-A-1M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermistor and RTD Extension Wire EXTT-3CU-26S-50</td>
			<td>Omega</td>
			<td>EXTT-3CU-26S-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Pin Mini Connectors for Thermocouples, 3-Wire RTD&#39;s and Thermistors MTP-U-M</td>
			<td>Omega</td>
			<td>MTP-U-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters KHLV-103/(10)-P</td>
			<td>Omega</td>
			<td>KHLV-103/(10)-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature/Process Controller CNi16D24-C4EIT-DC</td>
			<td>Omega</td>
			<td>CNi16D24-C4EIT-DC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-made aluminium beaker, isolated with polyacetal (drawings see sheet 2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Zoom.V16 with ApoTome.2 ZEN</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>495010-0009-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective PlanNeoFluar Z 1.0x/0.25 FWD 56mm</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435281-9100-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Rotary Control MARC</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435604-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transillumination top 450 mot</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435500-9000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized measuring stage S 150x100 mot; CAN (D)</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435465-9020-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insert plate S, glass 237x157x3mm (D)</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435465-9053-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller EMS 3</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435610-9010-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>System Control Panel SYCOP 3</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435611-9010-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu ORCA Flash 4.0 camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-22CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy High-End Workstation Xeon Quad-Core mulitlingual</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>490004-0025-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Language Package Windows 7 x64 Ultimate English US</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410373-0200-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCD TFT Monitor HP ZR2440w 24&#34;</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410350-2403-000</td>
			<td>not available anymore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN pro 2012 Hardware License key</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410135-1002-120</td>
			<td>not available anymore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Software Driver Hamamatsu Cameras Hardware License Key</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410136-1045-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN module Z Stack</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410136-0030-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Module Tiles/ Positions</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410136-1025-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Module Time Lapse</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410136-1031-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Module Experiment Designer</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410136-1022-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Desk 2012 Hardware License Key</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410135-1004-120</td>
			<td>not available anymore</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a submerged filter paper sandwich for long-term ex ovo time-lapse imaging of early chick embryos

בשל זמינותו, בעלות נמוכה, גיאומטריה שטוחה, ושקיפות, לשעבר אובו עובר אפרוח הפכה מודל בעלי חיים בעלי חוליות גדול לחקר אירועי המוךפו&quot;גנטי שהולכים, כגון gastrulation 2, neurulation 3 - 5, somitogenesis 6, לב כיפוף 7, היווצרות 8, והמוח 9 - 13, במהלך העובר מוקדם. מפתח להבנת תהליכים המוךפו&quot;גנטי שהולך הוא לעקוב אחריהם באופן דינמי על ידי זמן לשגות הדמיה. רכישת זמן לשגות סרטים של אובו לשעבר חומוס העובר הוגבלה או חלונות זמן קצרות או על הצורך באינקובטור לשלוט בטמפרטורה ולחה סביב העובר 14. כאן, אנו מציגים טכניקה חדשה כדי חומוס התרבות עוברת אובו לשעבר הדמיה ברזולוציה גבוהה זמן לשגות באמצעות מיקרוסקופ אור מועבר. כריך נייר פילטר השקוע הנו נגזר של techn נייר המוביל והמבוסס המסנןique (תרבות EC) 1 ומאפשר של עוברים חומוס ללא צורך בתא האקלים. העובר הוא דחוק בין שתי נושאות בנייר זהה מסנן והוא כל זמן שקוע לחלוטין בתווך פשוט, בקרת טמפרטורה מכוסית בשכבה של שמן מינרלי אור. החל משלב פס פרימיטיבי (המבורגר, המילטון בשלב 5, HH5) 15 עד לפחות בשלב 28-somite (HH16) 15, עוברים יכול להיות מתורבת עם עד משני הצדדים הגחון או הגב שלהם. זה מאפשר רכישת זמן לשגות סרטים ומכסים כ 30 שעות של התפתחות עוברית. מסגרות זמן לשגות סרטים נציג מוצגים. עובר מושווים מורפולוגית לעובר בתרבית EC-התרבות הסטנדרטית. כריך נייר פילטר השקוע מספק סביבה יציבה ללמוד הגבו מוקדם ותהליכים המוךפו&quot;גנטי שהולכים גחון. זה גם מאפשר דימות פלואורסצנטי חיים micromanipulations, כגון המיקרו-כירורגיה, שד חרוזlantation, microinjection, להשתקת גנים, ואת electroporation, ויש לו פוטנציאל חזק כדי להיות משולב עם מטרות טבילה הדמיה מבוססי לייזר (כולל מיקרוסקופ אור גיליון).

Watch this Scientific Journal Video about A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos at JoVE.com

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

כריך נייר מסנן מתחת למים במשך לטווח ארוך<em&gt; אקס אובו</em&gt; זמן לשגות הדמיה של מוקדם צ&#39;יק עובר

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

a-submerged-filter-paper-sandwich-for-long-term-ex-ovo-time-lapse

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

22.1K Views.  MOVE Research Institute Amsterdam.   

Video: A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

העברה יעילה ג&#39;ין בצ&#39;יק הרשתיות לסלולריים יסודי לימודי תרבות:<em&gt; אקס-אוב</em&gt; גישת Electroporation

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

מותאם באופן מיטבי<em&gt; Ex-אובו</em&gt; Culturing של Chick עוברים לשלבים מתקדמים של פיתוח

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

ניתוח<em&gt; In vivo</em&gt; נדידת תאים באמצעות השתלות תא והדמיה זמן לשגות עוברי דג הזברה

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune cells, and the coordination with lymphatic vessels and nerves. The multi-cell, multi-system interactions necessitate the investigation of angiogenesis in a physiologically relevant environment. Thus, while the use of in vitro cell-culture models have provided mechanistic insights, a common critique is that they do not recapitulate the complexity associated with a microvascular network. The objective of this protocol is to demonstrate the ability to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks before and after angiogenesis stimulation in cultured rat mesentery tissues. Cultured tissues contain microvascular networks that maintain their hierarchy. Immunohistochemical labeling confirms the presence of endothelial cells, smooth muscle cells, pericytes, blood vessels and lymphatic vessels. In addition, labeling tissues with BSI-lectin enables time-lapse comparison of local network regions before and after serum or growth factor stimulation characterized by increased capillary sprouting and vessel density. In comparison to common cell culture models, this method provides a tool for endothelial cell lineage studies and tissue specific angiogenic drug evaluation in physiologically relevant microvascular networks.

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.

<em&gt; Ex Vivo</em&gt; שיטת הדמיה זמן לשגות של רשתות כלי הדם Mesenteric עכברוש מתורבתות

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

שיטת הרכבה צדדית עבור Long Term הדמיה של פיתוח דג זברה

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and subcellular processes, high resolution time-lapse microscopy strategies that preserve physiological conditions are required. Plant tissues must have adequate nutrient and water supply with sustained gaseous exchange but, when submerged and immobilized under a coverslip, they are particularly susceptible to anoxia. One strategy that has been successfully employed is the use of a perfusion system to maintain a constant supply of oxygen and nutrients. However, such arrangements can be complicated, cumbersome, and require specialized equipment. Presented here is an alternative strategy for a simple imaging system using perfluorodecalin as an immersion medium. This system is easy to set up, requires minimal equipment, and is easily mounted on a microscope stage, allowing several imaging chambers to be set up and imaged in parallel. In this system, lateral root growth rates are indistinguishable from growth rates under standard conditions on agar plates for the first two days, and lateral root growth continues at reduced rates for at least another day. Plant tissues are supplied with nutrients via an agar slab that can be used also to administer a range of pharmacological compounds. The system was established to monitor lateral root development but is readily adaptable to image other plant organs such as hypocotyls and primary roots.

Presented here is a simple technique for high-resolution confocal time-lapse imaging of root and hypocotyl development for up to 3 days using high numerical-aperture objectives and perfluorodecalin as an immersion medium.

חדר פשוט עבור לטווח ארוך הדמיה confocal של שורש ו היפוקוטיל פיתוח

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

הדמיה לטווח ארוך בשידור חי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; דיסק העין

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

פוטון רב זמן לשגות הדמיה כדי להמחיש את התפתחות בזמן אמת: ויזואליזציה של העברת תאי הרכס העצבי עוברי דג זברה

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

שיטת הרכבה שכבתית עבור מיקרוסקופ זמן מורחב מיקרוסקופיה של כל העוברים דגים

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

מדמיין את המוח המתפתח בחיים דגים באמצעות הברקשת וזמן-הדמיה קונמיקוד

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...