Name: xenopus oocytes: optimized methods for microinjection, removal of follicular cell layers, and fast solution changes in electrophysiological experiments
Uploaded: 2016-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments at JoV

This work was supported by the Swiss National Science Foundation grant 315230_156929/1. M.C.M. is a recipient of a fellowship (Beca Chile Postdoctorado from CONICYT, Ministerio de Educacion, Chile).

ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המקומית של קנטון ברן Kantonstierarzt, Kantonaler Veterinärdienst ברן (BE85 / 15). 1. הכנת Xenopus ביציות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על צפרדעים (laevis Xenopus) על אור 12 שעות / 12 שעות / חושך מחזור במים כי נשמר בקפדנות על 20 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את האונות של השחלות צפרדעים נקבה 9. הערה: הסרת האונות היא גירוי להתחדשות, ולעתים קרובות את איכות הביציות משפרת עם ניתוח. הביצית מכוסית שכבת vitelline, שכבה של תאי זקיק, ורקמות חיבור המכילים את כלי דם 21. המבנה כולו שמכונה &quot;זקיק&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את האונות של השחלות כי הם ארוזים בצפיפות עם הזקיקים המכילים את הביציות ב (MBS) המלוח 7 של בארת סטרילי השלימו עם פניצילין סטרפטומיצין (88 mM NaCl, KCl 1 מ&quot;מ, 2.4 מ&quot;מ<html> 3 NaHCO, 0.82 מ&quot;מ 4 MgSO, 0.41 מ&quot;מ 2 CaCl, 0.33 מ&quot;מ Ca (NO 3) 2, 10 מ&quot;מ 4- (2-hydroxyethyl) חומצה -1-piperazineethanesulfonic; HEPES (7.5 pH, NaOH), 100 מיקרוגרם / פניצילין מ&quot;ל, 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב יחיד-אאוט V-VI 21 זקיקים. החזק את אונת השחלה עם מלקחיים. מנמיך את לולאת הפלטינה (איור 1) על הזקיקים ולמשוך את הלולאה בעדינות כדי לשבש את רקמת חיבור המכילה את הזקיק מרקמת השחלה. הערה: שלב V-VI 21 זקיקי מאופיינים גודלם (1.0 - 1.2 מ&quot;מ קוטר) ועל ידי ניגודיות טובה בין האונה חיה פיגמנט כהה בחצי הכדור צמחיים צהבהב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבר זקיקים בריאים למראה בלבד (כלומר לחלוטין כדורים עם פיגמנטציה ללא פגע) לצלחת 35 מ&quot;מ קוטר פטרי באמצעות פיפטה פסטר מפלסטיק (לגזור הגב בקוטר פתיחה של 1.5 מ&quot;מ). </li></ol>&quot;Jove_title&quot;&gt; 2. Microinjection של mRNA לתוך הציטופלסמה הערה: מערכת microinjection שתוארה כאן נגזרה שדיווח על ידי Kressmann ו Birnstiel 22. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן cRNAs מן cDNAs בהתאמה קידוד עבור יחידות המשנה של GABA α 4 β 2 δ קולט ידי שעתוק במבחנה, התוספת של פולי (א +) זנב, וכימות RNA על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה 23. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן טפטפות microinjection מתוך נימי זכוכית בורוסיליקט (1.0 מ&quot;מ קוטר חיצוני (OD), קוטר פנימי 0.58 מ&quot;מ (ID), 100 מ&quot;מ אורך) באמצעות חולץ micropipette. לשבור את קצות נימי הזכוכית תחת מיקרוסקופ באמצעות micromanipulator ו microfilament ליצור בקוטר טיפ של 12 - 15 מיקרומטר עם קצה משופע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשאים למלא את טפטפות microinjection עם שמן פרפין באמצעות מזרק 10 מ&quot;ל, ואז עגנו פיפטה microinjection גבי micr מהרכבהמנגנון oinjection (איור 2). הערה: מנגנון ההזרקה ההידראולי מהרכבת השמן מורכב מנוע גריל נשלט על ידי מתג דוושת רגל. מתג נוסף משנה את מצב המפנה של המנוע. מנוע זה מניע בורג מיקרומטר (0.5 מ&quot;מ / בתורו) שמקדם או חזר בו הבוכנה של מזרק זכוכית 10 μL. הזריקה היא במהירות של כ -3 סל&quot;ד ו תפנית 0.5 מקביל הזרקת 50 NL לתוך זקיק. הטיפ של המזרק מחובר צינורות polytetrafluoroethylene בעובי דופן כי הוא עצמו קשור מחט הזריקה ידי פיסה מאוד קצרה של צינורות Tygon. נימי ההזרקה מוחזק על ידי צ&#39;אק תרגיל כי הוא נשלט על ידי micromanipulator. המערכת כולה מלאה שמן פרפין. כל בועות אוויר יש להימנע, כפי שהם יפגעו במערכת ההזרקה. ההתקנה מוארת עם מקור אור קר. סטראו נדרשת שליטה אופטית. זקיקים הם דמיינו תחת אור קר עם stereomicroscope (בהגדלה 40X). ביצועים של התקנת ההזרקה הוא נבדק על ידי ההזרקה של רדיואקטיבי לתוך ביציות Xenopus. נפח של 45 - 55 nL צריך להיות מועבר לכל זריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה עם קצה פלסטיק סטרילית, לבדוק את ההתקנה על ידי נחת טיפה של מים סטריליים על החלק הפנימי הנקי של תרמופלסטיים לחות עמידה (2 X 2 סנטימטר). לטבול את קצה פיפטה זריקה לתוך אגל זה, ולאחר מכן להפעיל את המנוע כדי לחזור בו הבוכנה (לחץ שלילי בתוך פיפטה הזרקה). הערה: המים צריכים להיכנס פיפטה ויוצרים ממשק גלוי עם שמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחזור בו קצה פיפטה מן האגל ולהפעיל לחץ חיובי לחלק הפנימי של פיפטה ההזרקה. אגל מים צריך טופס על קצה פיפטה ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היכון הזרקת הזקיקים ידי הזדנבות אותם עם הקטבים הצמחיים מצביעים כלפי מעלה אל הסדקים של רשת ניילון (G: 0.8 מ&quot;מ) מודבקים לתחתית של Peצלחת תלת (60 מ&quot;מ) מכוסה MBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על 2 μL של mRNA בעזרת פיפטה עם קצה פלסטיק סטרילי אל תוך הפנים הנקיים של תרמופלסטיים. קח את ה- mRNA לתוך פיפטה ההזרקה ידי הפעלת לחץ שלילי על הצד הפנימי של פיפטה ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את פיפטה הזרקת מעל זקיק הפרט באמצעות micromanipulator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את מחט הזריקה לתוך במרכז המוט הצמחי ולהזריק 50 NL של mRNA בקצב זרימה של 0.6 μL / דקה על ידי הפעלת לחץ חיובי לחלק הפנימי של פיפטה. מתן 5 - 10 שניות לפני הסרת טיפ הזרקת פיפטה מן הזקיק להימנע בריחת mRNA. הערה: mRNA צריך להיות מוזרק לתוך צמחיים (צהבהב) מוט כדי למנוע הזרקת לתוך הגרעין, הנמצא בחצי הכדור החי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את זקיקי מוזרק אל צלחת פטרי חדש (35 מ&quot;מ) מלאים 2 מ&quot;ל של MBS. מניח את הצלחת לתוך מקרר יין נקבע על 18 מעלות צלזיוס. דגירת זקיקי המוזרק עבור 1 -7 ד לפני ההקלטה, תלוי מיהו של החלבון הביע לאחרונה. </li></ol> 3. שלילה של הזקיקים (איור 3) הערה: כפי שצוין לעיל, הביצית המכוסית בשכבת vitelline, תאי זקיק, ורקמות חיבור, אשר מכילה את כלי דם 24, שמכונה &quot;זקיק&quot;. כל השכבות למעט שכבת vitelline, המספקת יציבות מכאנית ללא במניעת כניסתם של פתרונות אל פני התא, יש להסיר לפני ניסויי אלקטרו. הזקיק ללא שכבות תאים המקיפים בעבר זכה לכינוי ביצית &quot;ערומים&quot; 25. שלב זה מבוצע בדרך כלל באותו היום כמו ניסויי אלקטרו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת עשר מוזרק זקיקי לצינור זכוכית בורוסיליקט המכיל 0.5 מ&quot;ל של MBS, 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​collagenase, ו 0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​מעכב טריפסין. לטבול את הצינורית באמבט מים שמרו על 36 מעלות צלזיוס. דגירהזקיקים במשך 20 דקות ולנער את הצינורות מדי פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטף את הזקיקים באמצעות העברה צינור שני המכיל 1 מיליליטר של MBS ב RT. השאירו אותם בצינור למשך כ -10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את הזקיקים לצינור שלישי המכיל 0.5 מיליליטר של MBS המרוכז כפליים המכיל 4 מ&quot;מ אתילן גליקול-bis (2-aminoethylether) - N, N, N &#39;, N&#39;- חומצת tetraacetic (EGTA), דגירה אותם במשך 4 דקות ב RT. לנער את הצינור מעת לעת. הערה: הפתרון היפרטוני (MBS המרוכז כפליים) משמשת כדי לגרום להתכווצות של הביציות בתוך שכבות תאי זקיק, ובכך ניתוק שכבות תאי זקיקים מן הביצית; EGTA מתווסף לעכב פעילות collagenase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטף את הזקיקים באמצעות העברה צינור שני המכיל 1 מיליליטר של MBS ב RT. השאירו אותם בצינור למשך כ -10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ביציות כדי בצלחת פטרי (35 מ&quot;מ קוטר) המכיל 2 מ&quot;ל של MBS. תחת סטראו, להפריד את המעטפות החיצוניות מן הזקיקים ידידוחף את ביצית העירום פשוט משם באמצעות לולאת הפלטינה. ההערה: המעטפות החיצוניות של הביציות מקלות היטב את מנת התרבות ניתן להפריד בקלות מן הביציות. ביציות יש מי ספונטניים לאבד המעטפות החיצוניות שלהם יהיה התאוששו כמו ביציות ערומות. הליך זה התוצאה הוא הכנה יציב יחסית שמחזיק את המראה הכדורית של הביציות. </li></ol> 4. שינוי פתרון מהיר סביב הביצית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעו ניסוי מהדק מתח, כמתואר 9,26. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה את הפתרון של מערכת זלוף הניזונים הכביד על ידי סיבוב המתגים זלוף כמתחייב הניסוי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל הפתרון זלוף ב -6 mL / min דרך נימי זכוכית בקוטר פנימי של 1.35 מ&quot;מ, הפה של אשר ממוקם כ -0.4 מ&quot;מ מפני השטח של הביצית, כדי לאפשר שינויים מהירים בריכוז אגוניסט סביב הביצית. הערה: שיעור השינוי כבר בעבר אומדןד 70% בפחות מ -0.5 שניות 27. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Gurdon, J. B., Lane, C. D., Woodland, H. R., Marbaix, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+frog+eggs+and+oocytes+for+the+study+of+messenger+RNA+and+its+translation+in+living+cells.">Use of frog eggs and oocytes for the study of messenger RNA and its translation in living cells.</a> Nature. 233 (5316), 177-182 (1971).</li><li>Soreq, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biosynthesis+of+biologically+active+proteins+in+mRNA-microinjected+Xenopus+oocytes.">The biosynthesis of biologically active proteins in mRNA-microinjected Xenopus oocytes.</a> CRC Crit Rev Biochem. 18 (3), 199-238 (1985).</li><li>Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Xenopus+oocytes+for+the+functional+expression+of+plasma+membrane+proteins.">Use of Xenopus oocytes for the functional expression of plasma membrane proteins.</a> J Membr Biol. 117 (3), 201-221 (1990).</li><li>Dascal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+Xenopus+oocytes+for+the+study+of+ion+channels.">The use of Xenopus oocytes for the study of ion channels.</a> CRC Crit Rev Biochem. 22 (4), 317-387 (1987).</li><li>Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+single+sodium+channels+translated+by+Xenopus+oocytes+after+injection+with+messenger+ribonucleic+acid.">Properties of single sodium channels translated by Xenopus oocytes after injection with messenger ribonucleic acid.</a> J Physiol. 386, 73-90 (1987).</li><li>Sigel, E., Minier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+oocyte:+system+for+the+study+of+functional+expression+and+modulation+of+proteins.">The Xenopus oocyte: system for the study of functional expression and modulation of proteins.</a> Mol Nutr Food Res. 49 (3), 228-234 (2005).</li><li>Colman, A., Hames, B. D., Higgins, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+exogenous+DNA+in+Xenopus+oocytes.">Expression of exogenous DNA in Xenopus oocytes.</a> Transcription and Translation'A Practical Approach. , 49-69 (1984).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defolliculation+of+Xenopus+oocytes.">Defolliculation of Xenopus oocytes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (12), 1377-1379 (2010).</li><li>Smart, T. G., Krishek, B. J., Boulton, A. A., Baker, ., Wolfgang, W. a. l. z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+oocyte+microinjection+and+ion-channel+expression.">Xenopus oocyte microinjection and ion-channel expression.</a> Patch-Clamp Applications and Protocols. , 259-305 (1995).</li><li>Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+sites+involved+in+modulation+of+the+GABA+receptor+channel+by+the+intravenous+anesthetics+propofol,+etomidate+and+pentobarbital.">Functional sites involved in modulation of the GABA receptor channel by the intravenous anesthetics propofol, etomidate and pentobarbital.</a> Neuropharmacology. 105, 207-214 (2016).</li><li>Maldifassi, M. C., Baur, R., Pierce, D., Nourmahnad, A., Forman, S. A., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+positive+allosteric+modulators+of+GABAA+receptors+with+anesthetic+activity.">Novel positive allosteric modulators of GABAA receptors with anesthetic activity.</a> Sci Rep. 6, 25943 (2016).</li><li>Wongsamitkul, N., Baur, R., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+understanding+functional+properties+and+subunit+arrangement+of+&#945;4&#946;2&#948;+GABAA+receptors.">Towards understanding functional properties and subunit arrangement of &#945;4&#946;2&#948; GABAA receptors.</a> J Biol Chem. 291 (35), 18474-18483 (2016).</li><li>Burgunder, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chloride+channel+mutations+leading+to+mild+myotonia+among+Chinese.">Novel chloride channel mutations leading to mild myotonia among Chinese.</a> Neuromuscul Disord. 18 (8), 633-640 (2008).</li><li>Steinmann, M. E., Gonzalez-Salgado, A., Butikofer, P., Maser, P., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+heteromeric+potassium+channel+involved+in+the+modulation+of+the+plasma+membrane+potential+is+essential+for+the+survival+of+African+trypanosomes.">A heteromeric potassium channel involved in the modulation of the plasma membrane potential is essential for the survival of African trypanosomes.</a> FASEB J. 29 (8), 3228-3237 (2015).</li><li>Gonzalez-Salgado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=myo-Inositol+uptake+is+essential+for+bulk+inositol+phospholipid+but+not+glycosylphosphatidylinositol+synthesis+in+Trypanosoma+brucei.">myo-Inositol uptake is essential for bulk inositol phospholipid but not glycosylphosphatidylinositol synthesis in Trypanosoma brucei.</a> J Biol Chem. 287 (16), 13313-13323 (2012).</li><li>Gonzalez-Salgado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+brucei+Bloodstream+Forms+Depend+upon+Uptake+of+myo-Inositol+for+Golgi+Complex+Phosphatidylinositol+Synthesis+and+Normal+Cell+Growth.">Trypanosoma brucei Bloodstream Forms Depend upon Uptake of myo-Inositol for Golgi Complex Phosphatidylinositol Synthesis and Normal Cell Growth.</a> Eukaryot Cell. 14 (6), 616-624 (2015).</li><li>Wu, M., Gerhart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raising+Xenopus+in+the+laboratory.">Raising Xenopus in the laboratory.</a> Methods Cell Biol. 36, 3-18 (1991).</li><li>Gurdon, J. B., Wilt, F. H., Wessels, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+clawed+frogs.">American clawed frogs.</a> Methods in developmental biology. , 75-84 (1967).</li><li>Elsner, H. A., Honck, H. H., Willmann, F., Kreienkamp, H. J., Iglauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poor+quality+of+oocytes+from+Xenopus+laevis+used+in+laboratory+experiments:+prevention+by+use+of+antiseptic+surgical+technique+and+antibiotic+supplementation.">Poor quality of oocytes from Xenopus laevis used in laboratory experiments: prevention by use of antiseptic surgical technique and antibiotic supplementation.</a> Comp Med. 50 (2), 206-211 (2000).</li><li>Green, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+oogenesis+in+the+South+African+clawed+frog+(Xenopus+laevis).">Factors affecting oogenesis in the South African clawed frog (Xenopus laevis).</a> Comp Med. 52 (4), 307-312 (2002).</li><li>Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis+in+Xenopus+laevis+(Daudin).+I.+Stages+of+oocyte+development+in+laboratory+maintained+animals.">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals.</a> J Morphol. 136 (2), 153-179 (1972).</li><li>Kressmann, A., Celis, J. E., Grassmann, A., Loyter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birnstiel+M.L.+Surrogate+genetics.">Birnstiel M.L. Surrogate genetics.</a> Transfer of Cell Constituents into Eucaryotic Cells. , 388-407 (1980).</li><li>Middendorp, S. J., Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+modulation+of+synaptic+and+extrasynaptic+GABAA+receptors+by+an+antagonist+of+the+high+affinity+benzodiazepine+binding+site.">Positive modulation of synaptic and extrasynaptic GABAA receptors by an antagonist of the high affinity benzodiazepine binding site.</a> Neuropharmacology. 95, 459-467 (2015).</li><li>Dumont, J. N., Brummett, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis+in+Xenopus+laevis+(Daudin).+V.+Relationships+between+developing+oocytes+and+their+investing+follicular+tissues.">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). V. Relationships between developing oocytes and their investing follicular tissues.</a> J Morphol. 155 (1), 73-97 (1978).</li><li>Dascal, N., Landau, E. M., Lass, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+oocyte+resting+potential,+muscarinic+responses+and+the+role+of+calcium+and+guanosine+3',5'-cyclic+monophosphate.">Xenopus oocyte resting potential, muscarinic responses and the role of calcium and guanosine 3',5'-cyclic monophosphate.</a> J Physiol. 352, 551-574 (1984).</li><li>Buckingham, S. D., Pym, L., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocytes+as+an+expression+system+for+studying+receptor/channel+targets+of+drugs+and+pesticides.">Oocytes as an expression system for studying receptor/channel targets of drugs and pesticides.</a> Methods Mol Biol. 322, 331-345 (2006).</li><li>Sigel, E., Baur, R., Trube, G., M&#246;hler, H., Malherbe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+subunit+combination+of+rat+brain+GABAA+receptors+on+channel+function.">The effect of subunit combination of rat brain GABAA receptors on channel function.</a> Neuron. 5, 703-711 (1990).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

השיטות המתוארות במאמר זה לסטות אלה המשמשים באופן מסורתי 7-9. זהו תקן לחשוף את האונות של השחלה כדי טיפול collagenase 1 עד 2 h 8; לבודד ביציות ניזוק, חשופה; ולהזריק אותם עם ה- mRNA באמצעות התקני הזרקה מסחריים. הליך קלסי זו כולל את החסרונות הבאים: 1) ביציות צפויות להינזק על ידי החשיפה הארוכה לריכוזים גבוהים של collagenase. 2) ביציות הערומים היציבות חייבות להיות מאוחסנות עד הניסוי. 3) ביציות ערומים נוטות יותר לסבול במהלך microinjection מ זקיקים. מכשירי הזרקת מסחרי להשתמש בקוטר גדול (כ -20 מיקרומטר) מחטי הזרקה, צפוי להביא לשיעור גבוה יחסית של נזק. היתרונות של ההליך המשופר המתוארים כאן הם כדלקמן: חשיפת collagenase מוגבלת ל -20 דקות, ביציות ערומות לא צריכות להיות מאוחסנות, ואת בקוטר טיפ הקטן של טפטפות (כ 12 - 15 מיקרומטר) המשמש microinjectiעל אינו דורש מראש &quot;defolliculation&quot; של הזקיקים עבור הזרקת mRNA. השלב הקריטי אחת הוא שטמפרטורת דגירת זקיק בתמיסת collagenase צריכה להיות מותאם בקפידה ל -36 מעלות צלזיוס, לא תעלה על זה. לשינויים פתרון בניסויים אלקטרו, לעתים קרובות הפתרון בתא המדידה משתנה, אשר לוקח כמות משמעותית של זמן, בהתאם לגודל של החדר ואת שיעור זלוף. באמצעות נימי זלוף נמנע מכך. החיסרון העיקרי של הביטוי של תעלות יונים ב ביציות Xenopus הוא הגודל הענק שלהם. בקרת מתח מהר יותר מאשר על 2 ms קשה, מהר מאוד (&lt;0.5 ימים) שינויי פתרון ודורשים תהליכים משוכללים. יתר על כן, חומרים הידרופובי מאוד יכול להיות כמעט כבול באופן בלתי הפיך על חלמון ביצה של הביצית. השיטות שתוארו כאן אפשרו לנו לחקורבאופן חוסך זמן המאפיינים התפקודיים של קולטני גאבא רקומביננטי, האפנון שלהם על ידי תרכובות סינטטיות וחומרי צמח, ההסדר למקטע שלהם, ואת המיקום של אתרי קישור תרופה קולטנים של רכב למקטע שונה. השיטות שתוארו כאן הן מתאים הביטוי של חלבון כלשהו של בחירת ביצית Xenopus. השיטה פשוטה מאוד לשינויי פתרון מהירים של המדיום סביב הביצית ניתן להחיל המחקר של כל ערוץ יון מגודר ליגנד או ספק.

ביציות Xenopus נמצאים בשימוש נרחב כמערכת ביטוי (הפניות 2 - 3, והפניות בו). הם מסוגלים להרכיב כראוי לשלב חלבוני multisubunit פעילים מבחינה תפקודית לתוך ממברנות הפלזמה שלהם. באמצעות מערכת זו, ניתן לחקור חלבונים בממברנה תפקודי לבד או בשילוב עם חלבונים אחרים, כדי ללמוד את המאפיינים של מוטציה, כימרי, או חלבונים בשרשור, ו להקרין תרופות פוטנציאליות. יתרונות שימוש ביציות פני מערכות ביטוי Heterologous אחרות נמנו טיפול פשוט של התאים הענקים, השיעור הגבוה של תאי מבטאי מידע גנטי זר, השליטה הפשוטה של ​​הסביבה של הביצית באמצעות זלוף אמבטיה, ואת השליטה על פוטנציאל הממברנה . החיסרון של מערכת ביטוי זה הוא התנודתיות העונתית שנצפתה במעבדות רבות 17-20. הסיבה וריאציה זורחוק מלהיות ברור. בנוסף, איכות ביציות הוא נצפה לעיתים קרובות כדי להשתנות מאוד. שיטות מסורתיות 7-9 כללו את הבידוד של אונות שחלה, החשיפה של אונות שחלה כדי collagenase עבור כמה שעות, הבחירה של ביציות ערומות, ואת microinjection הביצית. כאן, מספר החלופי, הנהלים מהר מדווח כי אפשר לנו לעבוד עם מערכת ביטוי זה במשך יותר מ -30 שנה ללא וריאציה עונתיות וריאציה מעט באיכות ביצית. השיטות לשנות ולשפר אותו מתואר כאן עבור הבידוד של ביציות, microinjection עם קרנה, והסרה של שכבות תאי זקיקים ניתן להשתמש על מנת לתת ביטוי לכל חלבון רצוי, לפי בחירה, ביצית Xenopus. השיטה פשוטה מאוד לשינויי פתרון מהירים של המדיום סביב הביצית ניתן להחיל המחקר של כל ערוץ יון מגודר ליגנד של נישאים.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71380</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P-9541</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M-1880</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>223560</td><td></td></tr><tr><td>Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-148</td><td>100 &amp;mu;g penicillin/mL and 100 &amp;mu;g streptomycin/mL</td></tr><tr><td>Platinum wire loop</td><td>home-made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Zeitz-Instruments GmBH</td><td>DMZ</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton syringe&amp;nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>80300</td><td>10 &amp;mu;L, Type 701N</td></tr><tr><td>Thick walled polytetrafluoroethylene tubing</td><td>Labmarket GmBH</td><td></td><td>1.0 mm OD&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Paraffin oil</td><td>Sigma</td><td>18512</td><td></td></tr><tr><td>Nylon net, G: 0.8 mm&amp;nbsp;</td><td>ZBF Z&amp;uuml;richer Beuteltuchfabrik AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass tube&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>99445-12</td><td>PYREX</td></tr><tr><td>Collagenase NB Standard Grade</td><td>SERVA</td><td>17454</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin inhibitor type I-S</td><td>Sigma</td><td>T-9003</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3389</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>Jencons (Scientific ) LTD.</td><td>H15/10</td><td>1.35 ID mm (for perfusion), alternative company: Harvard Apparatus Limited</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary</td><td>Harvard Apparatus Limited</td><td>30-0019</td><td>1.0 OD x&amp;nbsp; 0.58 ID x 100 Length mm (for microinjection)&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus Limited</td><td>30-0044</td><td>1.2 OD x 0.69 ID x 100 Length mm (for two-electrode voltage clamp)</td></tr><tr><td>&amp;gamma;-Aminobutyric acid (GABA)</td><td>Sigma</td><td>A2129</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;alpha;,21-Dihydroxy-5&amp;alpha;-pregnan-20-one (THDOC)</td><td>Sigma</td><td>P2016</td><td></td></tr><tr><td>grill motor</td><td>Faulhaber&amp;nbsp;</td><td></td><td>DC micromotor Type 2230 with gear Type 22/2</td></tr><tr><td>micrometer screw</td><td>Kiener-Wittlin</td><td>10400</td><td>TESA, AR 02.11201</td></tr><tr><td>Sterile plastic transfer pipettes</td><td>Saint-Amand&amp;nbsp; Mfg.</td><td>222-20S</td><td></td></tr></tbody></table>

xenopus oocytes: optimized methods for microinjection, removal of follicular cell layers, and fast solution changes in electrophysiological experiments

הביצית Xenopus כמערכת ביטוי Heterologous עבור חלבונים, תוארה לראשונה על ידי ואח Gurdon. 1 ו כבר בשימוש נרחב מאז גילויו (הפניות 2 - 3, והפניות בו). מאפיין זה הופך את הביצית אטרקטיבית לביטוי ערוץ הזר הוא שפע העניים של תעלות יונים אנדוגני 4. מערכת ביטוי זה הוכיח עצמו שימושי לאפיון של חלבונים רבים, ביניהם תעלות יונים מגודרת ליגנד. הביטוי של קולטנים של GABA ב ביציות Xenopus והאפיון הפונקציונלי שלהם מתואר כאן, כולל הבידוד של ביציות, microinjections עם קרנה, הסרת שכבות תאי זקיקים, ושינויי פתרון מהירים בניסויי אלקטרו. הנהלים היו אופטימיזציה במעבדה זו 5,6 ו לסטות אלה בשימוש שגרתי 7-9. באופן מסורתי, ביציות ערומים ערוכותעם טיפול collagenase ממושך של אונות שחלה ב RT, וביציות הערומים האלה microinjected עם mRNA. באמצעות שיטות אופטימיזציה, חלבונים בממברנה מגוונים הובעו ולמד עם מערכת זו, כגון קולטנים של GABA רקומביננטי 10-12, תעלות כלוריד רקומביננטי אנושי 13, תעלות אשלגן Trypanosome 14, ו טרנספורטר מיו -inositol 15, 16. השיטות המפורטות כאן ניתן להחיל את הביטוי של חלבון כלשהו של בחירה ב ביציות Xenopus, ושינוי הפתרון המהיר שניתן להשתמש בם כדי ללמוד תעלות יונים ליגנד מגודרת אחרות.

ביציות Xenopus נבחרו באופן מכני באמצעות לולאה פלטינה (איור 1). הביציות היו microinjected עם mRNA הקידוד ל GABA A יחידות משנה קולטן אלפא 4, בטא 2, δ, 0.5: 0.5: 2.5 fmol / ביצית (איור 2). אחרי 4 ד, שכבות תאי זקיקים הוסרו (איור 3). ביציות מתח היו מהודקים שני ב -80 mV וחשוף ריכוז גדל והולך של חומצה γ-aminobutyric (GABA) בנוכחות של 1 מיקרומטר 3α, 21-dihydroxy-5α-pregnan-20-אחד (THDOC), אפנן allosteric חיובית חזקה של הקולטן GABA A. איור 4 א מראה עקבות נוכחיות מקוריות חריגות ניסוי כזה. איור 4B מראה משרעת הנוכחי עורר תלוי ריכוזי GABA. זה מאפשר קביעת רגישות שילוב למקטע זו כלפי GABA. העקומות הבודדות היומצויד ו טופל כדי שאני מקסימום ובהמשך בממוצע. המשוואה המשמש היה I (ג) = אני מקסימום / (1+ (50 EC / ג) n), כאשר c הוא ריכוז של GABA, EC 50 ריכוז GABA (בנוכחות 1 THDOC מיקרומטר) לעורר וחצי משרעת הנוכחית -maximal, אני המקסימום הוא משרעת הנוכחי המקסימאלי, אני הוא משרעת הנוכחי, ו- n הוא מקדם היל. הנציבות האירופית 50 של GABA α 4 β 2 δ קולט הסתכם 0.41 ± 0.12 מיקרומטר, ו n היה 0.76 ± 0.04. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55034/55034fig1.jpg" /> איור 1: Loop פלטינום. לולאת חוט פלטינה שצוינה בשלב פרוטוקול 1.4. הפלטינה היא מתכת שניתן לכופף מבלי לייצר שבבים, וזה לא מקל<html> לחומר ביולוגי. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55034/55034fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55034/55034fig2.jpg" /> איור 2: מכשירי Microinjection homebuilt. המנגנון מתואר בשלב פרוטוקול 2., מנוע גריל; ב, בורג מיקרומטר; ג, באביב בין מזרק הבוכנה; מזרק זכוכית ד, 10 μL; דואר, עב-קירות צינורות polytetrafluoroethylene; f, צ&#39;אק מקדח יד; g, פיפטה הזרקה; h, סטראו; ואני, שליטה מוטורית. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55034/55034fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> FO: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55034/55034fig3.jpg" /> Scheme איור 3. הצגת Defolliculation של ביצית. ביציות מודגרת ראשונות פתרון collagenase באמבט מים ב 36 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. ביציות נשטפים אז בתווך בארת שונה. צעד הדגירה הסופי נמצא פתרון EGTA היפרטוני ב RT במשך 4 דקות. כתוצאה מכך, רקמת חיבור ואת תאי הזקיק יוסרו לפנות את מקומו לטובת הביצית הערומה. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55034/55034fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55034/55034fig4.jpg" /> עקבות איור 4. נוכחיים מניסוי המתח קלאמפ דו האלקטרודה. א, עקבות נוכחיות מעקום בתגובת ריכוז ה- GABA presence של 1 מיקרומטר THDOC המתקבל הביצית Xenopus המבטא את GABA α 4 β 2 δ קולט. הברים מציינים את פרק הזמן של זלוף GABA / 1 מיקרומטר THDOC. ריכוזים גוברים של GABA הוחלו על הביציות, ואת אמפליטודות הנוכחית המקבילה נקבעה. ריכוזי GABA מסומנים מעל הסורגים. B, עקומות תגובת ריכוז ממוצעות של GABA α 4 β 2 δ קולט. עקומות פרט היו ראשונים מנורמלים משרעת הנוכחי המקסימאלי המצוידת ובהמשך היו ממוצעים. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD, n = 3. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55034/55034fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments at JoV

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.

Xenopus ביציות: שיטות אופטימיזציה עבור Microinjection, הסרת שכבות ניידות זקיקים, ושינויי פתרון מהירים בניסויי אלקטרו

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

xenopus-oocytes-optimized-methods-for-microinjection-removal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

20.1K Views.  University of Bern. Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented. 

Video: Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

ומניפולציה<em&gt; במבחנה</em&gt; ההבשלה של<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; ביציות, ואחריו הזרקת Intracytoplasmic זרע, לחקר התפתחות העוברית

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Developmental Biology

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

באמצעות ניתוח של Confocal<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; לחקירת מאפננים של עירובים מורפוגן Wnt וששש

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where real-time measurements of fluorescence and currents simultaneously report on local rearrangements and global function, respectively1. While high-resolution structural techniques such as cryo-electron microscopy or X-ray crystallography provide static images of the proteins of interest, VCF provides dynamic structural data that allows us to link the structural rearrangements (fluorescence) to dynamic functional data (electrophysiology). Until recently, the thiol-reactive chemistry used for site-directed fluorescent labeling of the proteins restricted the scope of the approach because all accessible cysteines, including endogenous ones, will be labeled. It was thus required to construct proteins free of endogenous cysteines. Labeling was also restricted to sites accessible from the extracellular side. This changed with the use of Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) to specifically incorporate a small fluorescent probe in response to stop codon suppression using an orthogonal tRNA and tRNA synthetase pair2. The VCF improvement only requires a two-step injection procedure of DNA injection (tRNA/synthetase pair) followed by RNA/fUAA co-injection. Now, labelling both intracellular and buried sites is possible, and the use of VCF has expanded significantly. The VCF technique thereby becomes attractive for studying a wide range of proteins and &#8211; more importantly &#8211; allows investigating numerous cytosolic regulatory mechanisms.

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

This article describes an enhancement of conventional Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) where Fluorescent Unnatural Amino Acids (fUAA) are used instead of maleimide dyes, to probe structural rearrangements in ion channels. The procedure includes Xenopus oocyte DNA injection, RNA/fUAA coinjection, and simultaneous current and fluorescence measurements.

מתח הידוק פלואומטריה ב<em&gt; קסנופוס</em&gt; ביציות באמצעות חומצות אמינו פלואורסצנטי לא טבעי

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

Biochemistry

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinjection של ביציות Xenopus Laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

הדמיה ב-RNA לוקליזציה Xenopus ביציות

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

הפריה של Xenopus ביציות באמצעות שיטת העברה מארח

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

הביצית Microinjection עכבר, הבשלה ו Ploidy הערכה

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Microtransplantation of Synaptic Membranes to Reactivate Human Synaptic Receptors for Functional Studies

Excitatory and inhibitory ionotropic receptors are the major gates of ion fluxes that determine the activity of synapses during physiological neuronal communication. Therefore, alterations in their abundance, function, and relationships with other synaptic elements have been observed as a major correlate of alterations in brain function and cognitive impairment in neurodegenerative diseases and mental disorders. Understanding how the function of excitatory and inhibitory synaptic receptors is altered by disease is of critical importance for the development of effective therapies. To gain disease-relevant information, it is important to record the electrical activity of neurotransmitter receptors that remain functional in the diseased human brain. So far this is the closest approach to assess pathological alterations in receptors' function. In this work, a methodology is presented to perform microtransplantation of synaptic membranes, which consists of reactivating synaptic membranes from snap frozen human brain tissue containing human receptors, by its injection and posterior fusion into the membrane of Xenopus laevis oocytes. The protocol also provides the methodological strategy to obtain consistent and reliable responses of &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) and &#947;-aminobutyric acid (GABA) receptors, as well as novel detailed methods that are used for normalization and rigorous data analysis.

The protocol demonstrates that by performing microtransplantation of synaptic membranes into Xenopus laevis oocytes, it is possible to record consistent and reliable responses of &#945;-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid and &#947;-aminobutyric acid receptors.

מיקרו-טרנספלנטציה של ממברנות סינפטיות להפעלה מחדש של קולטנים סינפטיים אנושיים למחקרים פונקציונליים

Excitatory and inhibitory ionotropic receptors are the major gates of ion fluxes that determine the activity of synapses during physiological neuronal ...

Neuroscience

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis כמודל לזיהוי תרגום ירידת ערך

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

Xenopus ביציות: שיטות אופטימיזציה עבור Microinjection, הסרת שכבות ניידות זקיקים, ושינויי פתרון מהירים בניסויי אלקטרו

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ומניפולציה

באמצעות ניתוח של Confocal

מתח הידוק פלואומטריה ב