This work was supported by the Swiss National Science Foundation grant 315230_156929/1. M.C.M. is a recipient of a fellowship (Beca Chile Postdoctorado from CONICYT, Ministerio de Educacion, Chile).

Los experimentos con animales han sido aprobados por el comité local del cantón de Berna Kantonstierarzt, Kantonaler Veterinärdienst Berna (BE85 / 15). 1. Preparación de Xenopus Los ovocitos <ol><li> Mantener ranas (Xenopus laevis) en un 12 h / 12 h luz / oscuridad ciclo en el agua que está estrictamente mantuvo a 20 ° C. </li><li> Retire los lóbulos de los ovarios de las ranas hembra 9. NOTA: La eliminación de los lóbulos es un estímulo para la regeneración, y con frecuencia la calidad de los ovocitos mejora con la cirugía. El ovocito está cubierta por una capa vitelina, una capa de células del folículo, y el tejido conectivo que contiene los vasos sanguíneos 21. Toda la estructura se denomina &quot;folículo.&quot; </li><li> Coloque los lóbulos de los ovarios que están muy cargado de los folículos que contienen los ovocitos en estériles de Barth Saline 7 (MBS) suplementado con penicilina y estreptomicina (NaCl 88 mM, KCl 1, 2,4 mMDe NaHCO3, 0,82 mM MgSO 4, 0,41 mM CaCl 2 mM, Ca 0,33 (NO 3) 2, 10 mM ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico; HEPES (pH 7,5, NaOH), 100 mg / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina). </li><li> Single-a cabo la etapa V-VI 21 folículos. Mantenga el lóbulo ovario con fórceps. Bajar el asa de platino (Figura 1) a través de los folículos y retirar suavemente el bucle de perturbar el tejido conectivo que contiene el folículo del tejido de ovario. NOTA: Etapa V-VI 21 folículos se caracterizan por su tamaño (1,0 a 1,2 mm de diámetro) y por el buen contraste entre el hemisferio animales pigmentada oscura y el hemisferio vegetal amarillento. </li><li> Transferencia sólo folículos de aspecto saludable (es decir perfectamente esféricas y con pigmentación intacto) a un diámetro del plato Petri 35 mm por medio de una pipeta de plástico Pasteur (cortar la parte posterior a un diámetro de abertura de 1,5 mm). </li></ol> Nota: El sistema de microinyección se describe aquí se deriva de la reportada por Kressmann y Birnstiel 22. <ol><li> Preparar ARNc de los respectivos ADNc que codifican las subunidades de la α 4 β 2 δ receptor GABA A por transcripción in vitro, la adición de un poli (A +) de la cola, y la cuantificación del ARN por electroforesis en gel de 23. </li><li> Preparar pipetas de microinyección de los capilares de borosilicato de vidrio (1,0 mm de diámetro exterior (OD), 0,58 mm de diámetro interior (ID), 100 mm de longitud), utilizando un extractor de micropipeta. Romper las puntas de los capilares de vidrio con un microscopio utilizando un micromanipulador y microfilamentos para crear un diámetro de punta de 12 - 15 micras con una punta biselada. </li><li> Rellene las pipetas de microinyección con aceite de parafina utilizando una jeringa de 10 ml, y luego montar la pipeta de microinyección en un micr de construcción caseraoinjection aparato (Figura 2). NOTA: El aparato de inyección de aceite hidráulico de construcción casera consiste en un motor parrilla controlado por un interruptor de pedal. Un interruptor adicional cambia el modo de giro del motor. Este motor acciona un tornillo micrométrico (0,5 mm / vuelta) que avanza o se retrae el émbolo de una jeringa de vidrio de 10 mL. La inyección es a una velocidad de alrededor de 3 rpm y un giro de 0,5 corresponde a una inyección de 50 nL en un folículo. La punta de la jeringa está conectado a un tubo de paredes gruesas de politetrafluoroetileno que está a su vez conectado a la aguja de inyección por una pieza muy corto de tubo Tygon. El capilar de inyección se lleva a cabo por un portabrocas que está controlada por un micromanipulador. Todo el sistema se llena con aceite de parafina. Cualquier burbuja de aire debe evitarse, ya que poner en peligro el sistema de inyección. La configuración se ilumina con una fuente de luz fría. Se requiere un microscopio estereoscópico para el control óptico. Los folículos se visualizaron bajo luz fría con un stereomicroscope (40 aumentos). El rendimiento de la configuración de la inyección se prueba por la inyección de un trazador radioactivo en oocitos de Xenopus. Un volumen de 45 - 55 nL debe ser entregado por inyección. </li><li> Con una pipeta con una punta de plástico estéril, probar la configuración mediante la colocación de una gota de agua estéril en el interior limpio de un termoplástico resistente a la humedad (2 x 2 cm). Sumergir la punta de la pipeta de inyección en esta gotita, y luego girar el motor para retraer el émbolo (presión negativa dentro de la pipeta de inyección). NOTA: El agua debe entrar en la pipeta y formar una interfaz visible con el aceite. </li><li> Retraer la punta de la pipeta de la gotita y aplicar presión positiva en el interior de la pipeta de inyección. Una gota de agua debe formar en la punta de la pipeta de inyección. </li><li> Prepararse para la inyección de los folículos por alineándolos con los polos vegetales apuntando hacia arriba en los intersticios de una malla de nylon (G: 0,8 mm) pegados a la parte inferior de un Peplato de tri (60 mm) cubierta con MBS. </li><li> Prescindir de 2 l de ARNm utilizando una pipeta con una punta de plástico estéril en el interior limpio de un termoplástico. Tome el mRNA arriba en la pipeta de inyección mediante la aplicación de presión negativa en el interior de la pipeta de inyección. </li><li> Coloque la pipeta de inyección más de un folículo individual utilizando el micromanipulador. </li><li> Insertar la aguja de inyección en el centro de la polo vegetal e inyectar 50 nL de mRNA a un caudal de 0,6 l / min mediante la aplicación de presión positiva en el interior de la pipeta. Esperar 5 - 10 s antes de retirar la punta de la pipeta de inyección del folículo para evitar ARNm de escape. NOTA: El ARNm se debe inyectar en el polo vegetal (amarillenta) para evitar la inyección en el núcleo, que se encuentra en el hemisferio animal. </li><li> La transferencia de los folículos inyectados a una nueva placa de Petri (35 mm) llena con 2 ml de MBS. Coloque el plato en un enfriador de vino establecido a 18 ° C. Incubar los folículos inyectados por 1 -7 d antes de la grabación, dependiendo de la identidad de la nueva proteína expresada. </li></ol> 3. Decapado de los folículos (Figura 3) NOTA: Como se mencionó anteriormente, el ovocito cubierta por una capa vitelina, las células del folículo, y el tejido conectivo, que contiene los vasos sanguíneos 24, que se conoce como un &quot;folículo.&quot; Todas las capas excepto para la capa vitelina, que proporciona estabilidad mecánica sin impedir el acceso de las soluciones a la superficie celular, se deben quitar antes de los experimentos electrofisiológicos. El folículo sin las capas de células que rodean previamente se ha denominado un ovocito &quot;denudada&quot; 25. Este paso se realiza generalmente en el mismo día de los experimentos electrofisiológicos. <ol><li> Transferencia diez inyecta folículos a un tubo de vidrio de borosilicato que contiene 0,5 ml de MBS, 1 mg / ml de colagenasa y 0,1 mg / ml de inhibidor de tripsina. Sumergir el tubo en un baño de agua a 36 ° C. incubar lafolículos durante 20 minutos y agitar los tubos de vez en cuando. </li><li> Enjuagar los folículos mediante la transferencia a un segundo tubo que contiene 1 ml de MBS a TA. Dejarlos en el tubo durante unos 10 s. </li><li> La transferencia de los folículos a un tercer tubo que contiene 0,5 ml de MBS doblemente concentradas que contienen 4 mM etilenglicol-bis (2-aminoetiléter) - N, N, N &#39;, N&#39;-ácido tetraacético (EGTA), y se incuba durante 4 min a RT. Agitar el tubo de vez en cuando. NOTA: La solución hipertónica (MBS doblemente concentrados) se utiliza para inducir la contracción de los ovocitos dentro de las capas de células del folículo, separando de esta forma las capas de células foliculares de la ovocito; se añade EGTA para inhibir la actividad de la colagenasa. </li><li> Enjuagar los folículos mediante la transferencia a un segundo tubo que contiene 1 ml de MBS a TA. Dejarlos en el tubo durante unos 10 s. </li><li> La transferencia de los ovocitos a una placa de Petri (35 mm de diámetro) que contiene 2 ml de MBS. Bajo un microscopio estereoscópico, separar los sobres exteriores de los folículos porsimplemente empujando el oocito desnudo de distancia utilizando el asa de platino. NOTA: Los sobres exteriores de los ovocitos se adhieren firmemente a la placa de cultivo y se pueden separar fácilmente de los ovocitos. Algunos ovocitos perderán de forma espontánea sus sobres externos y serán recuperados como desprovistas de ovocitos. Este procedimiento resulta en una preparación relativamente estable que mantiene la apariencia esférica de los ovocitos. </li></ol> 4. Cambio rápido de soluciones en todo el ovocito <ol><li> Realizar un experimento de fijación de voltaje, como se describe a 9,26. </li><li> Cambie la solución del sistema de perfusión por gravedad girando los conmutadores de perfusión como se requiere por el experimento. <ol><li> Aplicar la solución de perfusión en 6 ml / min a través de un capilar de vidrio con un diámetro interior de 1,35 mm, la boca del que se coloca alrededor de 0,4 mm de la superficie del ovocito, para permitir cambios rápidos en la concentración de agonista alrededor del oocito. NOTA: La tasa de cambio ha sido previamente estimadod como 70% en menos de 0,5 s 27. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Gurdon, J. B., Lane, C. D., Woodland, H. R., Marbaix, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+frog+eggs+and+oocytes+for+the+study+of+messenger+RNA+and+its+translation+in+living+cells.">Use of frog eggs and oocytes for the study of messenger RNA and its translation in living cells.</a> Nature. 233 (5316), 177-182 (1971).</li><li>Soreq, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biosynthesis+of+biologically+active+proteins+in+mRNA-microinjected+Xenopus+oocytes.">The biosynthesis of biologically active proteins in mRNA-microinjected Xenopus oocytes.</a> CRC Crit Rev Biochem. 18 (3), 199-238 (1985).</li><li>Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Xenopus+oocytes+for+the+functional+expression+of+plasma+membrane+proteins.">Use of Xenopus oocytes for the functional expression of plasma membrane proteins.</a> J Membr Biol. 117 (3), 201-221 (1990).</li><li>Dascal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+Xenopus+oocytes+for+the+study+of+ion+channels.">The use of Xenopus oocytes for the study of ion channels.</a> CRC Crit Rev Biochem. 22 (4), 317-387 (1987).</li><li>Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+single+sodium+channels+translated+by+Xenopus+oocytes+after+injection+with+messenger+ribonucleic+acid.">Properties of single sodium channels translated by Xenopus oocytes after injection with messenger ribonucleic acid.</a> J Physiol. 386, 73-90 (1987).</li><li>Sigel, E., Minier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+oocyte:+system+for+the+study+of+functional+expression+and+modulation+of+proteins.">The Xenopus oocyte: system for the study of functional expression and modulation of proteins.</a> Mol Nutr Food Res. 49 (3), 228-234 (2005).</li><li>Colman, A., Hames, B. D., Higgins, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+exogenous+DNA+in+Xenopus+oocytes.">Expression of exogenous DNA in Xenopus oocytes.</a> Transcription and Translation'A Practical Approach. , 49-69 (1984).</li><li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defolliculation+of+Xenopus+oocytes.">Defolliculation of Xenopus oocytes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (12), 1377-1379 (2010).</li><li>Smart, T. G., Krishek, B. J., Boulton, A. A., Baker, ., Wolfgang, W. a. l. z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+oocyte+microinjection+and+ion-channel+expression.">Xenopus oocyte microinjection and ion-channel expression.</a> Patch-Clamp Applications and Protocols. , 259-305 (1995).</li><li>Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+sites+involved+in+modulation+of+the+GABA+receptor+channel+by+the+intravenous+anesthetics+propofol,+etomidate+and+pentobarbital.">Functional sites involved in modulation of the GABA receptor channel by the intravenous anesthetics propofol, etomidate and pentobarbital.</a> Neuropharmacology. 105, 207-214 (2016).</li><li>Maldifassi, M. C., Baur, R., Pierce, D., Nourmahnad, A., Forman, S. A., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+positive+allosteric+modulators+of+GABAA+receptors+with+anesthetic+activity.">Novel positive allosteric modulators of GABAA receptors with anesthetic activity.</a> Sci Rep. 6, 25943 (2016).</li><li>Wongsamitkul, N., Baur, R., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+understanding+functional+properties+and+subunit+arrangement+of+&#945;4&#946;2&#948;+GABAA+receptors.">Towards understanding functional properties and subunit arrangement of &#945;4&#946;2&#948; GABAA receptors.</a> J Biol Chem. 291 (35), 18474-18483 (2016).</li><li>Burgunder, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chloride+channel+mutations+leading+to+mild+myotonia+among+Chinese.">Novel chloride channel mutations leading to mild myotonia among Chinese.</a> Neuromuscul Disord. 18 (8), 633-640 (2008).</li><li>Steinmann, M. E., Gonzalez-Salgado, A., Butikofer, P., Maser, P., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+heteromeric+potassium+channel+involved+in+the+modulation+of+the+plasma+membrane+potential+is+essential+for+the+survival+of+African+trypanosomes.">A heteromeric potassium channel involved in the modulation of the plasma membrane potential is essential for the survival of African trypanosomes.</a> FASEB J. 29 (8), 3228-3237 (2015).</li><li>Gonzalez-Salgado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=myo-Inositol+uptake+is+essential+for+bulk+inositol+phospholipid+but+not+glycosylphosphatidylinositol+synthesis+in+Trypanosoma+brucei.">myo-Inositol uptake is essential for bulk inositol phospholipid but not glycosylphosphatidylinositol synthesis in Trypanosoma brucei.</a> J Biol Chem. 287 (16), 13313-13323 (2012).</li><li>Gonzalez-Salgado, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+brucei+Bloodstream+Forms+Depend+upon+Uptake+of+myo-Inositol+for+Golgi+Complex+Phosphatidylinositol+Synthesis+and+Normal+Cell+Growth.">Trypanosoma brucei Bloodstream Forms Depend upon Uptake of myo-Inositol for Golgi Complex Phosphatidylinositol Synthesis and Normal Cell Growth.</a> Eukaryot Cell. 14 (6), 616-624 (2015).</li><li>Wu, M., Gerhart, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raising+Xenopus+in+the+laboratory.">Raising Xenopus in the laboratory.</a> Methods Cell Biol. 36, 3-18 (1991).</li><li>Gurdon, J. B., Wilt, F. H., Wessels, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+clawed+frogs.">American clawed frogs.</a> Methods in developmental biology. , 75-84 (1967).</li><li>Elsner, H. A., Honck, H. H., Willmann, F., Kreienkamp, H. J., Iglauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poor+quality+of+oocytes+from+Xenopus+laevis+used+in+laboratory+experiments:+prevention+by+use+of+antiseptic+surgical+technique+and+antibiotic+supplementation.">Poor quality of oocytes from Xenopus laevis used in laboratory experiments: prevention by use of antiseptic surgical technique and antibiotic supplementation.</a> Comp Med. 50 (2), 206-211 (2000).</li><li>Green, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+oogenesis+in+the+South+African+clawed+frog+(Xenopus+laevis).">Factors affecting oogenesis in the South African clawed frog (Xenopus laevis).</a> Comp Med. 52 (4), 307-312 (2002).</li><li>Dumont, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis+in+Xenopus+laevis+(Daudin).+I.+Stages+of+oocyte+development+in+laboratory+maintained+animals.">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals.</a> J Morphol. 136 (2), 153-179 (1972).</li><li>Kressmann, A., Celis, J. E., Grassmann, A., Loyter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Birnstiel+M.L.+Surrogate+genetics.">Birnstiel M.L. Surrogate genetics.</a> Transfer of Cell Constituents into Eucaryotic Cells. , 388-407 (1980).</li><li>Middendorp, S. J., Maldifassi, M. C., Baur, R., Sigel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+modulation+of+synaptic+and+extrasynaptic+GABAA+receptors+by+an+antagonist+of+the+high+affinity+benzodiazepine+binding+site.">Positive modulation of synaptic and extrasynaptic GABAA receptors by an antagonist of the high affinity benzodiazepine binding site.</a> Neuropharmacology. 95, 459-467 (2015).</li><li>Dumont, J. N., Brummett, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oogenesis+in+Xenopus+laevis+(Daudin).+V.+Relationships+between+developing+oocytes+and+their+investing+follicular+tissues.">Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). V. Relationships between developing oocytes and their investing follicular tissues.</a> J Morphol. 155 (1), 73-97 (1978).</li><li>Dascal, N., Landau, E. M., Lass, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+oocyte+resting+potential,+muscarinic+responses+and+the+role+of+calcium+and+guanosine+3',5'-cyclic+monophosphate.">Xenopus oocyte resting potential, muscarinic responses and the role of calcium and guanosine 3',5'-cyclic monophosphate.</a> J Physiol. 352, 551-574 (1984).</li><li>Buckingham, S. D., Pym, L., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocytes+as+an+expression+system+for+studying+receptor/channel+targets+of+drugs+and+pesticides.">Oocytes as an expression system for studying receptor/channel targets of drugs and pesticides.</a> Methods Mol Biol. 322, 331-345 (2006).</li><li>Sigel, E., Baur, R., Trube, G., M&#246;hler, H., Malherbe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+subunit+combination+of+rat+brain+GABAA+receptors+on+channel+function.">The effect of subunit combination of rat brain GABAA receptors on channel function.</a> Neuron. 5, 703-711 (1990).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Los métodos descritos en este artículo se desvían de los utilizados tradicionalmente 7-9. Es estándar para exponer los lóbulos del ovario a un tratamiento de colagenasa 1-2 h 8; aislar, desprovistas de ovocitos en buen estado; e inyectarlos con ARNm utilizando dispositivos de inyección comerciales. Este procedimiento clásico tiene los siguientes inconvenientes: 1) Los ovocitos son susceptibles de ser dañados por la exposición prolongada a altas concentraciones de colagenasa. 2) Los ovocitos denudados inestables deben ser almacenados hasta que el experimento. 3) los ovocitos denudados son más propensos a sufrir durante la microinyección de los folículos. dispositivos de inyección comerciales utilizan de gran diámetro (aproximadamente 20 micras) agujas de inyección, probable que resulte en una tasa relativamente alta de daño. Las ventajas del procedimiento mejorado descrito aquí son las siguientes: la exposición a la colagenasa se limita a 20 min, desprovistas de ovocitos no tienen que ser almacenados, y el pequeño diámetro de la punta de las pipetas (alrededor de 12 - 15 m) se utiliza para microinjectien no requiere previa &quot;defolliculation&quot; de los folículos para la inyección de ARNm. El paso crítico único es que la temperatura del folículo incubación en solución de colagenasa se debe ajustar cuidadosamente a 36 ° C y no debe excederlo. Para cambios de soluciones en experimentos electrofisiológicos, muy a menudo se cambia la solución en la cámara de medición, que tiene una cantidad sustancial de tiempo, dependiendo del tamaño de la cámara y la velocidad de perfusión. Usando el capilar de perfusión evitado este. El principal inconveniente de la expresión de canales iónicos en oocitos de Xenopus es su tamaño gigante. El control de tensión más rápido que alrededor de 2 ms es difícil, y muy rápido (&lt;0,5 s) solución cambia requieren procedimientos elaborados. Por otra parte, las sustancias fuertemente hidrófobos pueden ser casi irreversiblemente unido a la yema de huevo del ovocito. Los métodos descritos aquí nos han permitido investigarde una manera de ahorro de tiempo las propiedades funcionales de los receptores de GABA A recombinantes, su modulación por compuestos sintéticos y sustancias vegetales, su disposición subunidad, y la ubicación de los sitios de unión de fármacos en los receptores de diferente composición de la subunidad. Los métodos descritos aquí son adecuados para la expresión de una proteína de elección en el oocito de Xenopus. El método muy simple para cambios rápidos de solución del medio alrededor del ovocito puede aplicarse al estudio de cualquier canal iónicos activados por ligando o portador.

Oocitos de Xenopus se usan ampliamente como un sistema de expresión (Referencias 2 - 3, y las referencias en él). Ellos son capaces de montar y de incorporar proteínas de múltiples subunidades funcionalmente activas en sus membranas plasmáticas correctamente. El uso de este sistema, es posible investigar funcionalmente proteínas de membrana solos o en combinación con otras proteínas, con el fin de estudiar las propiedades de, o proteínas quiméricas concatenados mutados, y a la pantalla de fármacos potenciales. Ventajas del uso de oocitos sobre otros sistemas de expresión heterólogos incluyen el manejo sencillo de las células gigantes, la alta proporción de células que expresan la información genética extranjera, el simple control del entorno de los ovocitos mediante perfusión del baño, y el control del potencial de membrana . El inconveniente de este sistema de expresión es la variación estacional observada en muchos laboratorios 17-20. La razón de esta variaciónestá lejos de ser clara. Además, la calidad de los ovocitos se observa a menudo para variar fuertemente. Los métodos tradicionales 7-9 han incluido el aislamiento de lóbulos de ovario, la exposición de los lóbulos de ovario a la colagenasa para algunos h, la selección de desprovistas de ovocitos, y la microinyección de ovocitos. A continuación, se presentan una serie de procedimientos alternativos y rápidos que han permitido trabajar con este sistema de expresión durante más de 30 años sin variación estacional y la poca variación en la calidad de los ovocitos. Los métodos modificados y mejorados descritos aquí para el aislamiento de ovocitos, microinyección con cRNA, y la eliminación de las capas de células foliculares se pueden utilizar para la expresión de cualquier proteína de elección en el oocito de Xenopus. El método muy simple para cambios rápidos de solución del medio alrededor del ovocito puede aplicarse al estudio de cualquier canal iónicos activados por ligando y de portadores.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1467">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">NaCl</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">71380</td>
			<td style="width:428px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">P-9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgSO4&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">M-1880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:663px;">CaCl2&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">223560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:663px;">Ca(NO3)2&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">C1396</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">HEPES</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">Penicilin/streptomycin</td>
			<td style="width:240px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;">15140-148</td>
			<td>100 &#956;g penicillin/ml and 100 &#956;g streptomycin/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">Platinum wire loop</td>
			<td style="width:240px;">home-made</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette puller</td>
			<td style="width:240px;">Zeitz-Instruments GmBH</td>
			<td style="width:136px;">DMZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hamilton syringe&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Hamilton</td>
			<td style="width:136px;">80300</td>
			<td>10 &#956;l, Type 701N</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thick walled polytetrafluoroethylene tubing</td>
			<td style="width:240px;">Labmarket GmBH</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>1.0 mm OD&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">Paraffin oil</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">18512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">Nylon net, gauge 0.8 mm&#160;</td>
			<td style="width:240px;">ZBF Z&#252;richer Beuteltuchfabrik AG</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">Borosilicate glass tube&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Corning</td>
			<td style="width:136px;">99445-12</td>
			<td>PYREX</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">Collagenase NB Standard Grade</td>
			<td style="width:240px;">SERVA</td>
			<td style="width:136px;">17454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin inhibitor type I-S</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">T-9003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">EGTA</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">E3389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">Glass capillary</td>
			<td style="width:240px;">Jencons (Scientific ) LTD.</td>
			<td style="width:136px;">H15/10</td>
			<td>1.35 ID mm (for perfusion), alternative company: Harvard Apparatus Limited</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillary</td>
			<td style="width:240px;">Harvard Apparatus Limited</td>
			<td style="width:136px;">30-0019</td>
			<td>1.0 OD X&#160; 0.58 ID X 100 Length mm (for microinjection)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass capillary&#160;</td>
			<td style="width:240px;">Harvard Apparatus Limited</td>
			<td style="width:136px;">30-0044</td>
			<td>1.2 OD X 0.69 ID X 100 Length mm (for two-electrode voltage clamp)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">&#947;-Aminobutyric acid (GABA)</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">A2129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">3&#945;,21-Dihydroxy-5&#945;-pregnan-20-one (THDOC)</td>
			<td style="width:240px;">Sigma</td>
			<td style="width:136px;">P2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">grill motor</td>
			<td style="width:240px;">Faulhaber&#160;</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td>DC micromotor Type 2230 with gear Type 22/2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">micrometer screw</td>
			<td style="width:240px;">Kiener-Wittlin</td>
			<td style="width:136px;">10400</td>
			<td>TESA, AR 02.11201</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:663px;">Sterile plastic transfer pipettes</td>
			<td style="width:240px;">Saint-Amand&#160; Mfg.</td>
			<td style="width:136px;">222-20S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

xenopus oocytes: optimized methods for microinjection, removal of follicular cell layers, and fast solution changes in electrophysiological experiments

El ovocito Xenopus como un sistema de expresión heteróloga para las proteínas, fue descrito por primera vez por Gurdon et al. 1 y ha sido ampliamente utilizado desde su descubrimiento (Referencias 2 - 3, y sus referencias). Una característica que hace que el ovocito atractivo para la expresión del canal exterior es el pobre abundancia de canales iónicos endógenos 4. Este sistema de expresión ha demostrado ser útil para la caracterización de muchas proteínas, entre ellas los canales iónicos activados por ligando. La expresión de los receptores GABA A en oocitos de Xenopus y su caracterización funcional se describe aquí, incluyendo el aislamiento de ovocitos, microinyecciones con cRNA, la eliminación de capas de células foliculares, y cambios rápidos en solución experimentos electrofisiológicos. Los procedimientos fueron optimizados en este laboratorio 5,6 y se desvían de las que se usan rutinariamente 7-9. Tradicionalmente, desprovistas de ovocitos se preparancon un tratamiento prolongado de la colagenasa de los lóbulos de ovario a TA, y estas desprovistas de ovocitos se microinyectan con mRNA. Utilizando los métodos optimizados, diversas proteínas de membrana se han expresado y estudiado con este sistema, tales como los receptores recombinantes GABA A, 10-12 humanos recombinantes canales de cloruro, canales de potasio 13 tripanosoma 14, y un transportador de myo -inositol 15, 16. Los métodos detallados aquí pueden ser aplicados a la expresión de cualquier proteína de elección en oocitos de Xenopus, y el cambio de solución rápida se pueden utilizar para estudiar otros canales iónicos activados por ligando.

Oocitos de Xenopus fueron escogidos mecánicamente a cabo utilizando un asa de platino (Figura 1). Los oocitos se microinyectaron con mRNA que codifica para el receptor de GABA A subunidades alfa 4, ß 2, δ, 0,5: 0,5: 2,5 fmol / ovocito (Figura 2). Después de 4 días, las capas de células foliculares se eliminaron (Figura 3). Los oocitos se sujetan voltaje a -80 mV y se expusieron a concentraciones crecientes de ácido γ-aminobutírico (GABA) en presencia de 1 mM 3α, 21-dihidroxi-5α-pregnan-20-ona (THDOC), un modulador alostérico positivo potente de el receptor GABA A. La figura 4A muestra trazas de corriente originales grabadas en un experimento de este tipo. La Figura 4B muestra la amplitud de corriente suscitó en función de las concentraciones de GABA. Esto permite la determinación de la sensibilidad de esta combinación de subunidades hacia GABA. Las curvas individuales eranamueblada y estandarizado a lo máximo y, posteriormente, en promedio. La ecuación utilizada fue I (c) = / (1+ (CE 50 / c) n), donde c es la concentración de GABA, EC 50 la concentración de GABA (en presencia de 1 THDOC M) la obtención de un medio I max amplitud de la corriente -maximal, I max es la amplitud de la corriente máxima, I es la amplitud de la corriente, y n es el coeficiente de Hill. La CE 50 de la α 4 β 2 δ receptor GABA A ascendió a 0,41 ± 0,12 m, y n fue de 0,76 ± 0,04. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55034/55034fig1.jpg" /> Figura 1: Platino Loop. El bucle de alambre de platino menciona en el paso 1.4 del protocolo. El platino es un metal que se puede doblar sin producir astillas, y que no se pegueal material biológico. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55034/55034fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55034/55034fig2.jpg" /> Figura 2: Aparato de construcción casera microinyección. El aparato se describe en el paso 2. protocolo de un motor de la parrilla; b, tornillo micrométrico; c, primavera entre la jeringa y el émbolo; d, 10 l jeringa de vidrio; e, de pared gruesa tubo de politetrafluoroetileno; f, parte del mandril; g, pipeta de inyección; h, microscopio estereoscópico; y yo, el control motor. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55034/55034fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 3. Esquema que muestra la Defolliculation de un ovocito. Los ovocitos se incuban primero en una solución de colagenasa en un baño de agua a 36 ° C durante 20 min. Los ovocitos se lavan luego en un medio de Barth modificada. El paso de incubación final es en una solución hipertónica EGTA a TA durante 4 min. Como resultado, el tejido conectivo y las células del folículo se eliminan para dar paso a la ovocito denudada. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55034/55034fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55034/55034fig4.jpg" /> Figura 4. Gráficos de corriente de un voltaje de dos electrodos abrazadera experimento. UN, Gráficos de corriente de una curva de respuesta a la concentración de GABA en las prescia de 1 THDOC M obtenido a partir de un oocito de Xenopus que expresa el GABA α 4 β 2 δ Un receptor. Las barras indican el período de tiempo de GABA / 1 M THDOC perfusión. El aumento de las concentraciones de GABA se aplicaron a la ovocitos, y se determinaron las amplitudes de corriente correspondientes. las concentraciones de GABA se indican encima de las barras. B, Las curvas de respuesta de concentración promediados de la GABA α 4 β 2 δ Un receptor. curvas individuales fueron los primeros normalizado a la amplitud de la corriente máxima equipada y posteriormente se promediaron. Los datos se muestran como media ± SD, n = 3. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55034/55034fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments at JoV

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented.

Los oocitos de Xenopus: Métodos optimizados para la microinyección, la eliminación de las capas de células foliculares y Cambios solución rápida en experimentos electrofisiológicos

The Xenopus oocyte as a heterologous expression system for proteins, was first described by Gurdon et al.1 and has been widely used since its discovery ...

xenopus-oocytes-optimized-methods-for-microinjection-removal

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

20.0K vistas.  University of Bern. Optimized procedures for the isolation of single follicles, cytoplasmic RNA microinjections, the removal of surrounding cell layers, and protein expression in Xenopus oocytes are described. In addition, a simple method for fast solution changes in electrophysiological experiments with ligand-gated ion channels is presented. 

Video: Xenopus Oocytes: Optimized Methods for Microinjection, Removal of Follicular Cell Layers, and Fast Solution Changes in Electrophysiological Experiments

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying development, differentiation and aging are epigenetic rather than genetic processes. The reversibility of these processes opens exciting perspectives in basic research, and in the more distant future, in regenerative medicine. In the mouse, embryonic stem cells can be derived from cloned preimplantation stage embryos. Such embryonic stem cells have the ability to give rise to all cell types of the adult organism. Importantly, these cells are genetically identical to the donor. If applicable to human, this would allow the derivation of stem cells from a patient. These cells could then be differentiated into the affected cell type of the patient and studied in vitro, or used to replace the damaged or missing cells. The study of nuclear transfer in the mouse remains important as it can inform us about the principles of nuclear reprogramming. This movie and the accompanying protocol are intended to help learning nuclear transfer in the mouse, a method initially developed in the group of Prof. Yanagimachi (WAKAYAMA et al. 1998).

This movie and the protocol are intended to help learning nuclear transfer.

Transferencia nuclear en ovocitos de ratón

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying ...

Investigación

Biología

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Parche de grabación Clamp de canales iónicos expresados ​​en ovocitos de Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

Métodos de una sola molécula para vigilar los cambios en las propiedades elásticas bicapa

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic transport. Because of its large nucleus and high density of nuclear pore complexes (NPCs), nuclear transport can be easily visualized in the Xenopus oocyte. Much insight into the mechanisms of nuclear import and export has been gained through use of this system (reviewed by Pant&eacute;, 2006). In addition, we have used microinjection of Xenopus oocytes to dissect the nuclear import pathways of several viruses that replicate in the host nucleus. 
Here we demonstrate the cytoplasmic microinjection of Xenopus oocytes with a nuclear import substrate. We also show preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning EM, including dissection, dehydration, and embedding of the oocytes into an epoxy embedding resin. Finally, we provide representative results for oocytes that have been microinjected with the capsid of the baculovirus Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) or the parvovirus Minute Virus of Mice (MVM), and discuss potential applications of the technique.

Here we demonstrate cytoplasmic microinjection of Xenopus laevis oocytes with a nuclear import substrate, as well as preparation of the injected oocytes for visualization by thin-sectioning electron microscopy.

Microinyección de oocitos de Xenopus laevis

Microinjection of Xenopus laevis oocytes followed by thin-sectioning electron microscopy (EM) is an excellent system for studying nucleocytoplasmic ...

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity. Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to spatially restrict gene expression of Vg1 protein. Tight control of Vg1 distribution in this manner is required for proper germ layer specification in the developing embryo. RNA sequence elements in the 3' UTR of the mRNA, the Vg1 localization element (VLE) are required and sufficient to direct transport. To study the recognition and transport of Vg1 mRNA in vivo, we have developed an imaging technique that allows extensive analysis of trans-factor directed transport mechanisms via a simple visual readout. 
To visualize RNA localization, we synthesize fluorescently labeled VLE RNA and microinject this transcript into individual oocytes. After oocyte culture to allow transport of the injected RNA, oocytes are fixed and dehydrated prior to imaging by confocal microscopy. Visualization of mRNA localization patterns provides a readout for monitoring the complete pathway of RNA transport and for identifying roles in directing RNA transport for cis-acting elements within the transcript and trans-acting factors that bind to the VLE (Lewis et al., 2008, Messitt et al., 2008). We have extended this technique through co-localization with additional RNAs and proteins (Gagnon and Mowry, 2009, Messitt et al., 2008), and in combination with disruption of motor proteins and the cytoskeleton (Messitt et al., 2008) to probe mechanisms underlying mRNA localization.

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualization of in vivo RNA transport is accomplished by microinjection of fluorescently labeled RNA transcripts into Xenopus oocytes, followed by confocal microscopy.

Visualizar la localización del ARN en Xenopus Los ovocitos

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to generate maternal-effect mutant animals. Additionally, many of the techniques to overexpress or inhibit gene function in organisms such as Xenopus and zebrafish fail to sufficiently target critical maternal signaling pathways, such as Wnt signaling. In Xenopus, manipulating gene function in cultured oocytes and subsequently fertilizing them can ameliorate these problems to some extent. Oocytes are manually defolliculated from donor ovary tissue, injected or treated in culture as desired, and then stimulated with progesterone to induce maturation. Next, the oocytes are introduced into the body cavity of an ovulating host female frog, whereupon they will be translocated through the host's oviduct and acquire modifications and jelly coats necessary for fertilization. The resulting embryos can then be raised to the desired stage and analyzed for the effects of any experimental perturbations. This host-transfer method has been highly effective in uncovering basic mechanisms of early development and allows a wide range of experimental possibilities not available in any other vertebrate model organism.

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Procedure for fertilizing Xenopus oocytes by the host transfer method.

La fertilización de Oocitos de Xenopus Utilizando el método de transferencia de acogida

Studying the contribution of maternally inherited molecules to vertebrate early development is often hampered by the time and expense necessary to ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados ​​en Xenopus Ovocitos

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

La activación de la apoptosis mediante microinyección citoplasmática del citocromo C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Optimizado manchas y Proliferación métodos de modelización para la vigilancia del uso de tintes División Celular Celulares de seguimiento

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

TRPV4 (Transient Receptor Potentials, vanilloid family, type 4) is widely expressed in vertebrate tissues and is activated by several stimuli, including by mechanical forces. Certain TRPV4 mutations cause complex hereditary bone or neuronal pathologies in human. Wild-type or mutant TRPV4 transgenes are commonly expressed in cultured mammalian cells and examined by Fura-2 fluorometry and by electrodes. In terms of the mechanism of mechanosensitivity and the molecular bases of the diseases, the current literature is confusing and controversial. To complement existing methods, we describe two additional methods to examine the molecular properties of TRPV4. (1) Rat TRPV4 and an aequorin transgene are transformed into budding yeast. A hypo-osmtic shock of the transformant population yields a luminometric signal due to the combination of aequorin with Ca2+, released through the TRPV4 channel. Here TRPV4 is isolated from its usual mammalian partner proteins and reveals its own mechanosensitivity. (2) cRNA of TRPV4 is injected into Xenopus oocytes. After a suitable period of incubation, the macroscopic TRPV4 current is examined with a two-electrode voltage clamp. The current rise upon removal of inert osmoticum from the oocyte bath is indicative of mechanosensitivity. The microAmpere (10-6 to 10-4 A) currents from oocytes are much larger than the subnano- to nanoAmpere (10-10 to 10-9 A) currents from cultured cells, yielding clearer quantifications and more confident assessments. Microscopic currents reflecting the activities of individual channel proteins can also be directly registered under a patch clamp, in on-cell or excised mode. The same oocyte provides multiple patch samples, allowing better data replication. Suctions applied to the patches can activate TRPV4 to directly assess mechanosensitivity. These methods should also be useful in the study of other types of TRP channels.

Yeast Luminometric and Xenopus Oocyte Electrophysiological Examinations of the Molecular Mechanosensitivity of TRPV4

To complement commonly used methods to study TRPV4&#8217;s, two methods are described: Its mechanosensitivity can be studied by Ca2+-aequorin luminometry in transgenic yeast upon hypo-osmotic challenge. It can also be examined in TRPV4-RNA injected Xenopus oocytes by whole-cell two-electrode voltage clamp or patch clamp in on-cell or excised mode.

Luminométricos levadura y<em&gt; Xenopus</em&gt; ovocitos electrofisiológicos Exámenes del mecanosensibilidad Molecular de TRPV4

TRPV4 (Transient Receptor Potentials, vanilloid family, type 4) is widely expressed in vertebrate tissues and is activated by several stimuli, including ...