著者はZonMW-VICIグラント918.11.635（オランダ）からの財政支援を認めます。著者は彼らの実用的な提案をし、顕微鏡上で有益な助言のためのセットアップコンポーネントとカールツァイスオランダのヤルノVoortmanを製造するためのVrijeはUniversiteitアムステルダムの工具店に感謝したいと思います。マリョレインBlaauboerは批判的に原稿のいくつかの草稿にコメントで大きなサポートでした。

全ての実験手順は、動物の法律上のオランダの実験に従って行いました。 注：浸漬濾紙サンドイッチ法は1から変更されています。 1.水中フィルターペーパーサンドイッチ準備<ol><li> Pannett-コンプトン（PC）-saline 27,28 <ol><li>ストック溶液を（超純粋H 2 Oの1 L、塩化ナトリウム、塩化カリウム、 塩化カルシウムの10.42グラムの15.5グラムの121グラム・H 2 O、およびMgCl 2の12.7グラム・6H 2 O）を準備し、Bの（1 L超純H 2 O、2.365グラムのNa 2 HPO 4・2H 2 O、およびのNaH 2 PO 4の0.188グラム・2H 2 O）きれいな1-Lボトルインチ4℃で保管してください。 </li><li> （沈殿を避けるために、この順序で）のストック溶液Bの40原液Aのmlを、60 mlの超純粋H 2 O 900 mlと混合することによってPC-食塩水1リットルを調製。 PC-生理食塩水たてのFRを準備オム原液A及びB毎週。 注：ストック溶液は、数ヶ月間、4℃で保存することができます。オートクレーブ処理および/または抗生物質または抗真菌剤を添加することは必要ありません。 </li></ol></li><li>ニワトリ受精卵のインキュベーション<ol><li>加湿インキュベーターでは、彼らの側に卵を産むし、それらが所望の年齢に達するまで、37.5℃でそれらをインキュベートします。 注：もはや2週間以上ストアの卵（好ましくは12時 - 15°C）、実験前に、孵化率が大幅に低下するように</li></ol></li><li>濾紙担体（1から適応） <ol><li>可能な場合は、厚手の濾紙（28ミリメートル×22 mm）のからの砂時計状のろ紙キャリアを切断するためにレーザ切断機を使用しています。 10.4ミリメートルに22ミリメートルから中央に幅を先細り。フィルターペーパーキャリアの大きい側に楕円向いパラレル（ 図1-Mの長軸と、中央の楕円形の開口部（X 5.5ミリメートル10.6ミリメートル）を切り出します）。 <ol><li>必要に応じて、正しい寸法で段ボール原紙を準備し、鉛筆を使用して、厚手のろ過紙にその概要と中央開口部のそれを転送します。細かいハサミを使用して、ろ紙のキャリアを切り出します。 </li></ol></li><li>各胚を外植するための2つの同一のろ紙キャリアをカットします。胚が外植中に紛失した場合のバックアップとして余分なろ紙キャリアを準備します。 </li></ol></li><li> （実験の日に）温度制御油浴<ol><li>直立ズーム顕微鏡の電動式XYステージの中央に温度制御されたビーカーを置き、その温度コントローラにビーカーを接続します。 </li><li>重みとして作用し、温度制御されたビーカーの中央に皿を置くを6 cmのペトリ皿に四大ステンレス鋼リング（30 mmの外径、高さ4mmの1.5ミリメートルの壁の厚さ）を置きます。 注：このペトリ皿は、ちょうどオイルLEVEを調整するためのプレースホルダとして機能しますリットル。 </li><li>軽鉱物油の130ミリリットルと温度制御ビーカーを埋めます。必要であれば、それは約3ミリメートル6センチメートルペトリ皿の上縁の下に終了するようにオイルレベルを調整します。 </li><li>温度制御されたビーカーから6センチメートルペトリ皿を取り外し、40℃に温度を設定。 </li></ol></li></ol> 2.水中フィルターペーパーサンドイッチ生産<ol><li> （実験の日に）培地<ol><li> 50mlの遠心分離チューブに（ステップ1.1.2に1.1.1で調製した）PC-の生理食塩水30ミリリットルを注ぎます。すべての2胚を外植するために、PC-の生理食塩水30ミリリットルを入れた1 50ml遠心チューブを準備します。 </li><li>慎重に10センチメートルペトリ皿に非インキュベートした卵を割ます。 </li><li>ペトリ皿の壁に沿ってプラスチック製のトランスファーピペットを移動させ、薄い卵白に吸引して薄い卵白を収穫。各2胚を外植するために50ミリリットルの遠心管に30ミリリットルに薄い卵白を収集します。唯一のトンを取得することを確認します卵白ヒン。 注：通常3から4卵は薄い卵白の約30ミリリットルの収穫を可能にします。 </li><li> （ステップ2.1.1で調製した）すべてのPC-生理食塩水に薄い卵白の20ミリリットルを入れ、50 ml遠心チューブを満たしました。 </li><li>静かにチューブを数回反転させて薄い卵白を搭載したPC-生理食塩水を混ぜます。それは数分のために解決し、ここ以降から培養液と呼ばれる混合物は、明確であるかどうかを確認してみましょう。培地は明確ではない場合は、原液と収穫新鮮な薄い卵白から新鮮なPC-生理食塩水を準備します。 </li></ol></li><li>新鮮に6cmのプラスチックシャーレにできるだけ離れ二つの小さなステンレス鋼リング（20ミリメートル外径、高さ4ミリメートル、1.5ミリメートルの壁の厚さ、リング内の6.5ミリメートルのギャップ）を配置し、文化の22ミリリットルでそれを埋めます培地25ミリリットルのプラスチックピペット（ 図1-H）を使用して（ステップ1.4.4に1.4.1で調製しました）。媒体上に蓄積された残骸は遠心管に残っていることを確認してください。 </li><li>任意の破片Oを削除しますrはプラスチックトランスファーピペットを用いて培地から気泡。 </li><li> PC-生理食塩水75mlで10センチメートルペトリ皿を埋める（ステップ2.15で使用されます）。 </li><li>インキュベーターから卵を取り出して、それが胚は卵黄の一番上に来るようにする1分間の側のベンチに置いても。 </li><li>慎重にペトリ皿（ 図1-A）に卵を割ます。濃厚卵白における微細組織の一枚の紙の端を浸し、必要に応じて、引っ張ることにより、胚盤葉を中央に配置します。 </li><li> （濃厚卵白の取り込みを容易にするために、カットオフチップを備えた）プラスチック製トランスファーピペットを用いて、ペトリ皿から薄いと濃厚卵白の大部分を削除してください。 </li><li>静かに、ティッシュペーパーの切れ端で濃厚卵白を払拭センター（ 図1-B）から離れて移動することにより、胚の周りの濃厚卵白中のウィンドウを作成します。卵黄膜に付着するティッシュペーパーを防ぎます。 </li><li>ピンセットを使用して、慎重にヴィーテの濾紙担体を配置胚（ 図1-C）の前後軸に楕円開口平行の長軸と胚の周りLLINE膜、。 </li><li>フィルターペーパーキャリアに近く、すぐに全体のフィルターペーパーキャリア（ 図1-D）の周りにカット卵黄膜を介して爪はさみ1先端をつまんで。 </li><li>ピンセットを用いて、胚（ 図1-E）の前後軸に対して斜め平行な方向に離れて卵黄からフィルターペーパーキャリアを持ち上げます。 </li><li>上胚の腹側を持っており、PC-生理食塩水でそれを沈めるために周りろ紙キャリアをオンにします。斜め方向の胚の前後軸に沿ったフィルターペーパーキャリアを浸し。 </li><li>すべての卵黄を取り除くにはまだ静かにプラスチック製トランスファーピペットからPC-生理食塩水でそれをフラッシュすることによって卵黄膜と胚盤​​葉を添付しました。で水没フィルターペーパーキャリアの全体を保ちますLL時間（ 図1-F）。 </li><li>斜め方向に胚の前後軸に沿ってPC-生理食塩水からフィルターペーパーキャリアを外し、ティッシュペーパー上にフィルターペーパーキャリアの端を軽くたたくことにより、余分な液体を取り除きます。 </li><li>上向き胚の腹側と、水平に濾紙を保持し、最初の上に別のフィルターペーパーキャリアを置き、ピンセットの第二の対を使用して。その開口部は、それによってろ紙の2層（ 図1-G）との間の胚を挟んで、正確に一致する必要があります。 </li><li>直ちに胚の前後軸に沿って斜め方向に培地中に濾紙担体サンドイッチを水没。 2スチールリング（ 図1-H）との間のスペースにまたがる領域に配置します。 </li><li>確認しながら、他の二つの上にさらに2つの鋼製リングを配置することにより、ろ紙サンドイッチを修正し、その電子を持つ開口mbryoは完全に覆われていない（ 図1-I）のまま。 </li><li>中レベルをチェックし、上部スペーサはちょうど媒体中に沈められていることを確認してください。必要に応じて、培地の少量を追加または削除。 </li><li>慎重に温度制御されたオイルバスの中央に、ペトリ皿に置き、油中皿に次の3つの大きいステンレス鋼リング（30 mmの外径、高さ4mmの1.5ミリメートルの壁の厚さ）を配置することにより皿を横方向に安定させます。 （ 図1-J）のスチールリングは皿の側面に触れていることを確認してください。 </li><li>媒体は鉱油の連続的な層（ 図1-K）で覆われるようにゆっくりと、プラスチック製のトランスファーピペットで培地の上に光鉱油約6ミリリットルピペット。 </li><li>タイムラプス買収を設定します。 注：5重複サブ画像（タイル）の水平方向のパノラマのような胚のイメージングは​​、一般的なoverviで、詳細なイメージング（5X目標を）ことができます形態29から30のEW。 3と10分の間に撮像間隔は、形態学的変化31の詳細な追跡を可能にし、小のzスタック（30μmの距離で5〜7個の異なる面）の取得は、胚30の肥厚と旋回の多くを補償します。最も高いコントラストを有するZ-平面は（画像取得の詳細については、代表的な結果のセクションを参照してください）タイムラプスムービーに単一フレームをさらに処理32の前に選択することができます。 </li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54636/54636fig1.jpg" /> 図1：水中フィルターペーパーサンドイッチを設定します。 （A）卵をペトリ皿中に割れています。 （B）の厚さと薄い卵白の大部分は、プラスチック製トランスファーピペット（図示せず）を有するペトリ皿から除去されます。その後、濃厚卵白中のウィンドウが作成されますそっとティッシュペーパーで濃厚卵白を拭き取ることによって胚のラウンド。 （C）濾紙担体は卵黄の上に胚盤葉の周りに配置されています。 （D）濾紙担体は卵黄の頂部から除去周囲の卵黄膜と、（E）から切り離されています。 （F）残りの卵黄は、慎重にPC-生理食塩浴で洗い流されます。 （G）胚は、第二の同一の濾紙担体とに挟まれています。 （H）濾紙サンドイッチを培地中に浸漬し、二つの金属ステンレス鋼リング（胚対向背又は腹側を上）に配置されています。 （I）二つのリングがトップからサンドイッチを安定させます。 （J）胚を含むペトリ皿を、温度制御されたオイルバスに転送されます。ステンレス製リングは、横方向にペトリ皿を安定させます。 （K）培地を鉱油の層で覆われています。（L）水没フィルターサンドイッチの概略図。 （M）浸漬濾紙サンドイッチに使用される濾紙担体の寸法。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54636/54636fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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	<li>Chapman, S. C., Collignon, J., Schoenwolf, G. C., Lumsden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+chick+whole-embryo+culture+using+a+filter+paper+carrier.">Improved method for chick whole-embryo culture using a filter paper carrier.</a> Dev. Dyn. 220 (3), 284-289 (2001).</li><li>Rozbicki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-II-mediated+cell+shape+changes+and+cell+intercalation+contribute+to+primitive+streak+formation.">Myosin-II-mediated cell shape changes and cell intercalation contribute to primitive streak formation.</a> Nat. Cell Biol. 17 (4), 397-408 (2015).</li><li>Smith, J. L., Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurulation:+Coming+to+closure.">Neurulation: Coming to closure.</a> Trends Neurosci. 20 (97), 510-517 (1997).</li><li>Schoenwolf, G. C., Sheard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+and+bending+of+the+avian+neural+plate+as+analysed+with+a+fluorescent-histochemical+marker.">Shaping and bending of the avian neural plate as analysed with a fluorescent-histochemical marker.</a> Development. 105 (1), 17-25 (1989).</li><li>Colas, J. F., Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+cellular+and+molecular+understanding+of+neurulation.">Towards a cellular and molecular understanding of neurulation.</a> Dev. Dyn. 221 (2), 117-145 (2001).</li><li>Pourqui&#233;, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chick+embryo:+a+leading+model+in+somitogenesis+studies.">The chick embryo: a leading model in somitogenesis studies.</a> Mech. Dev. 121 (9), 1069-1079 (2004).</li><li>Maenner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+looping+in+the+chick+embryo:+A+morphological+review+with+special+reference+to+terminological+and+biomechanical+aspects+of+the+looping+process.">Cardiac looping in the chick embryo: A morphological review with special reference to terminological and biomechanical aspects of the looping process.</a> Anat. Rec. 259 (3), 248-262 (2000).</li><li>Wittig, J. G., M&#252;nsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Early+Stages+of+Heart+Development+Insights+from+Chicken+Embryos.">The Early Stages of Heart Development Insights from Chicken Embryos.</a> J. Cardiovasc. Dev. Dis. 3 (2), (2016).</li><li>Layer, P. G., Alber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+of+chick+brain+vesicles+as+revealed+by+peanut+agglutinin+and+cholinesterases.">Patterning of chick brain vesicles as revealed by peanut agglutinin and cholinesterases.</a> Development. 109 (3), 613-624 (1990).</li><li>Nakamura, H., Nakano, K. E., Igawa, H. H., Takagi, S., Fujisawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+and+rigidity+of+differentiation+of+brain+vesicles+studied+in+quail-chick+chimeras.">Plasticity and rigidity of differentiation of brain vesicles studied in quail-chick chimeras.</a> Cell Differ. 19 (3), 187-193 (1986).</li><li>Garcia-Lopez, R., Pombero, A., Martinez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+map+of+the+chick+embryo+neural+tube.">Fate map of the chick embryo neural tube.</a> Dev. Growth Differ. 51 (3), 145-165 (2009).</li><li>Andermatt, I., Stoeckli, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi-based+gene+silencing+in+chicken+brain+development.">RNAi-based gene silencing in chicken brain development.</a> Methods Mol. Biol. 1082, 253-266 (2014).</li><li>Tufan, A. C., Akdogan, I., Adiguzel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shell-less+culture+of+the+chick+embryo+as+a+model+system+in+the+study+of+developmental+neurobiology.">Shell-less culture of the chick embryo as a model system in the study of developmental neurobiology.</a> Neuroanatomy. 3 (1), 8-11 (2004).</li><li>Endo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chick+embryo+culture+and+electroporation.">Chick embryo culture and electroporation.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. , Unit 19.15 (2012).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Ovo+Live+Imaging+of+Avian+Embryos.">In Ovo Live Imaging of Avian Embryos.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2010 (6), (2010).</li><li>Borwompinyo, S., Brake, J., Mozdziak, P. E., Petitte, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+chicken+embryos+in+surrogate+eggshells.">Culture of chicken embryos in surrogate eggshells.</a> Poult Sci. 84 (9), 1477-1482 (2005).</li><li>Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ex-ovo+Chicken+Embryo+Culture+System+Suitable+for+Imaging+and+Microsurgery+Applications.">An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications.</a> J. Vis. Exp. (44), e2154 (2010).</li><li>Auerbach, R., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+procedure+for+the+long-term+cultivation+of+chicken+embryos.">A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos.</a> Dev. Biol. 41 (2), 391-394 (1974).</li><li>New, D. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Technique+for+the+Cultivation+of+the+Chick+Embryo+in+vitro.">A New Technique for the Cultivation of the Chick Embryo in vitro.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 3 (4), 320-331 (1955).</li><li>Stern, C. D., Bachvarova, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+chick+embryos+in+vitro.">Early chick embryos in vitro.</a> Int. J. Dev. Biol. 41 (2), 379-387 (1997).</li><li>Nagai, H., Lin, M. C., Sheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+cornish+pasty+method+for+ex+ovo+culture+of+the+chick+embryo.">A modified cornish pasty method for ex ovo culture of the chick embryo.</a> Genesis. 49 (1), 46-52 (2011).</li><li>Connolly, D., McNaugbton, L. A., Krumlauf, R., Cooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+in+vitro+development+of+the+chick+embryo+using+roller-tube+culture.">Improved in vitro development of the chick embryo using roller-tube culture.</a> Trends Genet. 11 (7), 259-260 (1995).</li><li>Rupp, P. A., Rongish, B. J., Czirok, A., Little, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+avian+embryos+for+time-lapse+imaging.">Culturing of avian embryos for time-lapse imaging.</a> Biotechniques. 34 (2), 274-278 (2003).</li><li>Martins, G. G., Rifes, P., Ama&#226;ndio, R., Rodrigues, G., Palmeirim, I., Thorsteinsd&#243;ttir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+3D+cell+rearrangements+guided+by+a+fibronectin+matrix+underlie+somitogenesis.">Dynamic 3D cell rearrangements guided by a fibronectin matrix underlie somitogenesis.</a> PLoS One. 4 (10), e7429 (2009).</li><li>Nagai, H., Sezaki, M., Nakamura, H., Sheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extending+the+limits+of+avian+embryo+culture+with+the+modified+Cornish+pasty+and+whole-embryo+transplantation+methods.">Extending the limits of avian embryo culture with the modified Cornish pasty and whole-embryo transplantation methods.</a> Methods. 66 (3), 441-446 (2014).</li><li>Pannett, C., Compton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cultivation+of+Tissues+in+Saline+Embryonic+Juice.">The Cultivation of Tissues in Saline Embryonic Juice.</a> Lancet. 203 (5243), 381-384 (1924).</li><li>Voiculescu, O., Papanayotou, C., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+and+temporally+controlled+electroporation+of+early+chick+embryos.">Spatially and temporally controlled electroporation of early chick embryos.</a> Nat. Protoc. 3 (3), 419-426 (2008).</li><li>. GmbH ZEN 2 - (blue edition) - Software Guide Available from: <a target="_blank" href="https://www.unige.ch/medecine/bioimaging/files/3914/3765/2064/ZEN_2_blue_edition_-_Software_Guide.pdf">https://www.unige.ch/medecine/bioimaging/files/3914/3765/2064/ZEN_2_blue_edition_-_Software_Guide.pdf</a> (2014)</li><li>Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Avian+Embryos.">Culture of Avian Embryos.</a> Dev. Biol. Protoc. Vol. I. 135, 31-38 (2000).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

十分に確立されたEC文化1の新しい亜種としては、水没ろ紙サンドイッチは、周りの温度と湿度が管理されたインキュベータを行うことによってニワトリ初期胚の元、卵の長期明と暗視野タイムラプスムービーの取得を容易に不要顕微鏡。むしろ半固体寒天卵白底に培養されているよりも、胚は完全にPC-生理食塩水と薄い卵白からなる単純な培養液中に沈め保持されます。蒸発熱損失は、培養培地の上に浮遊ミネラルオイルの層によって最小化されます。胚は、品質に見える違いなしに、簡単に背や腹側を上にいずれかを培養することができます。ここに示されているように、水没ろ紙サンドイッチ中の胚はモルフォゲン浸したビーズのアプリケーションのように、顕微介入にアクセスできます。将来のアプリケーションは、ミリアンペアにライブ蛍光イメージング、マイクロインジェクションおよびエレクトロポレーション、および遺伝子サイレンシングを含みますnipulateとは腹側（ 例えば、初期の心と体節形成）と背側（ 例えば、後期原腸形成、神経管閉鎖、及び早期の脳）開発中に形態形成のイベントの広い範囲を勉強しています。濾紙サンドイッチを含むペトリ皿を鉱油層の下の培地の交換を可能にする、灌流チャンバーで置換される場合、時間依存性の薬物治療が可能です。水没ろ紙サンドイッチは、レーザベース（光シート顕微鏡を含む）イメージングと液浸対物レンズとの組み合わせで、完全なイメージングの可能性を開発します。 水没ろ紙サンドイッチの準備といくつかの困難が、以下の段落で対処されることになります。それはろ紙サンドイッチに卵黄から胚を転送するために、トレーニングの唯一の適度な量を必要とするが、いくつかのステップは、依然として大幅に培養中の胚の品質に影響を与えることができます。濾紙担体である前卵黄の上に置き、胚の周りの卵黄膜は、任意の濃厚卵白から解放する必要があります。その場合にのみ、ろ紙と卵黄膜との間の接続は、PC-生理食塩水での洗浄に耐えるのに十分強力になります。できるだけ液体/空気界面を横切るべき胚を運ぶ濾紙、膜の張力を最小化します。洗浄のためのPC-生理食塩水に持ち込まれると、全体のろ紙キャリアは完全にすべての回で沈め滞在する必要があります。卵黄膜がろ紙から解放開始されますように、60秒 - PC - 生理食塩水浴中の時間は約30に制限しなければなりません。卵黄残党が後胚のビューを不明瞭になりますように、まだ、胚の洗浄は、非常に徹底的に実行する必要があります。洗濯時には、常に半径方向に離れてから胚に直接転送ピペットからのストリームを指していませんが、決して。 PC-生理食塩水から胚を除去した後、最小化するために水平にろ紙を保持するようにしてください胚性膜上の緊張。そして、第2濾紙担体と胚を安定化させます。第濾紙キャリアが配置されると、互いに対して濾紙キャリアをシフトし、胚の膜を引き裂く可能性のある横方向の張力を作成しません。濾紙サンドイッチを培地になると、それはまた、膜の張力を最小にするために、一度だけ、空気/液体界面を横切る必要があります。上部から濾紙サンドイッチを安定化するために使用されるステンレス鋼リングの第二の対は、非常にゆっくりと胚膜の圧縮を最小限にするために任意の圧力なしで配置されるべきです。胚の暗域の小さな破裂は通常、培養の最初の時間の間に治癒するが、油層を培地の上にピペットで添加される前に、損傷を受けた胚は、常に新しいサンプルに置き換えてくださいすることができます。 画像への全体胚または高解像度タイムラプスムービーのための複数のサンプル、マイクroscopeは、顕微鏡ソフトウェアによって制御、電動式XYステージを装備する必要があります。これは、画像品質を低下させる培地と油中の胚および乱流への損傷を回避するために最小限の速度でXYステージの動きを持っている非常に重要です。ここで提示タイムラプス動画の取得のために、電動XYステージは、約1.75ミリメートル/秒の速度で移動しました。将来的には、イメージングは​​、第一希望の位置にステージを移動し、振動や乱流が消えるようにする短い休止期間後の画像を取得することによって改善することができます。 液浸対物レンズのない正立顕微鏡を使用している場合の制限として、潜在的なユーザーは、この培養方法のために必要な比較的長い作動距離（約1cm）に注意する必要があります。胚の上に媒体の層から、ミネラルオイルのこの作動距離をもたらします。 6センチメートルシャーレでは、油層はthicknesを持っています約1秒 - 2.4 mmであり、胚培養培地中の深い約4mmに沈められます。目的の直径に応じて、6センチメートルペトリ皿の上縁も、胚へのアクセスを制限することができます。これは、より大きな皿を使用することによって回避することができました。 頂部から作動距離はわずかに液体層の厚さを最小化することによって減少させることができます。また、下から作動距離がさらに下ペトリ皿の底に胚をもたらし、加熱ビーカーのガラス窓の厚さを減少させることによって最小化することができます。プロトコルは直立長い作動距離のズーム顕微鏡で動作するように最適化されたが、それは同様に倒立顕微鏡に取り付けることができました。予備実験は、限られた拡散がPROBように見えるしないことを示唆しているものの、今後のユーザーは、培養液中にあまり深く胚を浸漬すると、O 2型拡散問題につながる可能性があるということを覚えておいてくださいLEMは、限り胚を培養培地とに挟まれた濾紙の十分に大きな貯水池に囲まれるようにペトリ皿の底に押されていません。 別の制限は、温度制御です。 40℃に加熱したビーカーのためのコントローラの温度を調整することで、媒体の温度は、媒体は、ミネラルオイルで被覆されている胚の周りに37.5℃に平衡化。これは、一部のエネルギーは、加熱要素と温度センサが配置されているビーカーの底部、及び胚の位置との間で失われていることを示しています。温度制御は、センサを再配置し、加熱要素を再分配することによって最適化することができます。

胚は、歴史の初めから人を魅了しています。どのように胚の構造および形態は、明確に定義された時間的、空間的な方法で開発するのですか？ニワトリ胚は、いくつかの理由のために、胚発生のための古典的な脊椎動物のモデルの一つとなっている：それは母親の外に展開するように、それは、簡単に、入手可能な安価な、その初期の段階では透明、および実験操作のためにアクセス可能です。また、それは、心臓や脳の形成、原腸形成、神経胚形成、および体節形成15早けれ形態形成のイベント、中にはほぼフラットな形状を有します。 彼らはそのようなタイムラプス画像の取得を通るように、動的に検討されている場合、形態形成のプロセスは、最もよく理解することができます。ニワトリ胚は、卵 16 ではなく、実験操作や透過光顕微鏡イメージングのための限られた視界の貧アクセシビリティ可視化することができます。したがって、切断19または外植片培養1,20として- - 23らの技術は13,17全体卵黄培養系のいずれかで、 元のOVO培養ニワトリ胚に提案されています。全卵黄培養系では、胚は、無傷の卵黄の上に残り、卵の全体の内容は、インキュベーションのために別の容器に移されます。このコンテナは、代理卵殻17、ペトリ皿19、またはプラスチック製のラップラップ13,18製ハンモックすることができます。全体卵黄培養中の胚は、理想的には孵化し、micromanipulationsにアクセス可能になるまで培養することができます。若い胚を視覚化するのは難しいままでこれらの技術は、（コントラストを増大させる）、血液循環の開始後の胚の発達を研究するために特に有用です。彼らは卵黄から切り出し、 インビトロ外植片として培養されている場合は、これらの初期胚は、最良の画像化することができます。外植片は、実験のために簡単にアクセスできますアル操作および培養のためのより少ないスペースを必要とします。長年にわたり、1955年にデニス新によって開拓された技術とそのバリエーションは、それによってタイムラプス顕微鏡および顕微介入20,21のための胚がアクセスできるよう、ニワトリ胚のための移植片培養法の黄金の基準でした。その偉大な成功にもかかわらず、新規の技術は、比較的厳しいと時間がかかります。胚盤葉を運ぶ卵黄膜は、適切なテンション1を達成するためにガラスリングに張架されたときに胚盤葉は頻繁に切り離します。さらに、胚は、その腹側を上にして培養することができます。 EC（初期チック）文化、チャップマンとコリニョン1によって開発されたより最近の技術は、中央の開口部とフィルターペーパーキャリアを使用して、卵黄膜の延伸を回避します。濾紙によりその自然の張力を維持し、卵黄膜に付着し、画像フレーム1のような胚を取り囲みます。胚では通常、腹側を上にして、寒天、卵白底に培養されます。背側を上に培養することはHH8 15歳以上で胚のためにのみ可能と思われます。多くのグループが、このような外科手術用縫合糸の繊維24またはコラーゲン被覆膜25からなる支持体と寒天卵白底を交換するなど、ニーズにろ紙キャリアを適応しています。多くの場合、新規の技術を持つまたはEC文化を用いて培養した胚は、酸素拡散1,20を容易にするために、空気中に自分の背や腹面で、露出しています。これらの外植片培養物は、培地の蒸発を回避し、乾燥から胚を防ぐために、加湿雰囲気中で維持されなければなりません。これは、湿ったティッシュペーパー1を含むより大きなペトリ皿に外植片培養物を皿をインキュベートすることによって達成されます。これらの胚のタイムラプス画像の取得は、全体顕微鏡や気性の周りの気候制御インキュベーターの使用のいずれかが必要ature-制御された光路14に結露を防止するために加熱された蓋付き容器。完全に、ろ紙培養25として培養液中に沈め新の技術2,21のadaptionsで重鉱物油と卵白の層の間に挟まれた、または「コーニッシュペースト状文化で折り畳まれた胚盤葉外植片としてOVOしかし、ニワトリ胚は、また元に開発することができます「23,26、空気との直接接触なし。 浸漬濾紙サンドイッチを濾紙キャリア技術の新たな変異体です。 元オボひよこの胚を培養することで、以前の知識を組み合わせることで、気候制御インキュベーターと加熱蓋不要になります。胚は、二つの同一の（レーザーカット）との間に挟まれている、完全に単純な培地（Pannett-コンプトン生理食塩水27,28および3の薄い卵白：2の比率）に沈めろ紙キャリア24と培養含まれて制御された温度でえー。媒体の上に浮遊軽質鉱油の層を蒸着2,21を防止し、環境への熱損失を最小限に抑えます。容器の底部は、ガラス窓を有し、全体のセットアップは、直立長作動距離のズーム顕微鏡で行われます。ハンバーガー・ハミルトンこの設定は28体節期に早期原始線条段階に至るまで、胚発生の約30時間の高解像度明と暗視野タイムラプスムービーの取得を可能にする（等価は16、HH5-16に5段）15。胚は、彼らの腹や背側を上にして同様に良好に培養することができます。 （ - 5、および初期の脳の9から13 例えば、後期原腸陥入2、神経管閉鎖3）開発したがって、胚を観察し、腹側（ 例えば、初期の心臓7,8および体節形成6）と背側の操作にアクセスできます。水没ろ紙サンドイッチPマイクロサージェリー、ビーズ移植、マイクロインジェクション、遺伝子サイレンシング、およびエレクトロポレーションの研究のためのシンプルで安定した環境をrovides。そのイメージング電位と液浸対物レンズ（光シート顕微鏡を含む）レーザーベースのイメージングを使用して、はるかにさらに押し込むことができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Milli-Q&#160;Reference Water Purification System</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>Z00QSV0WW&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duran&#160;laboratory bottles, with caps, 1L</td>
			<td>Sigma-Aldrich/Duran</td>
			<td>Z305200-10EA&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution A</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1064041000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1049361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2 H2O</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1023821000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H2O</td>
			<td>Merck/Sigma-Aldrich</td>
			<td>13152-1KG-D&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution B</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4.2H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1065801000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.2H2O</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1063420250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman&#160;qualitative filter paper, Grade 595</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10311611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser cutting machine MLS-90120-C130, CO2-laser, 130W, wavelength 10.6 &#181;m</td>
			<td>Micro Lasersystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tork Extra Soft Facial Tissues</td>
			<td>Tork</td>
			<td>140280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex gloves</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z645613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EMDAMED</td>
			<td>EMDA 300.131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z350613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>VWR</td>
			<td>WITG5.480.003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>accu-jet pro Pipette Controller</td>
			<td>BrandTech Scientific</td>
			<td>26332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological plastic pipettes, 25mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS4251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic document sleeves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator - Incubator mod. Cip Cip 40</td>
			<td>Fiem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized chicken eggs (Gallus gallus)</td>
			<td>Drost BV (Loosdrecht, NL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 cm Petri dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50ml Centrifuge tubes , Greiner centrifuge tubes&#160; or Cellstar tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>greiner bio-one</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel rings, custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large rings, 30 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small rings, 20 mm outer diameter, 4 mm in height, 1.5 mm wall thickness, 6.5 mm gap in the ring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps, Dumont #5, Inox</td>
			<td>Fine Science Tools , F.S.T.</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine, really sharp scissors for cutting filter paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M3516&#160;Sigma-Aldrich Mineral Oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CAS Number&#160;8042-47-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar bottoms for EC culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539&#160;SIGMA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653&#160;SIGMA-ALDRICH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbead implantation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead Sampler Kit III (45 &#181;m beads were used)</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>16905-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accupuncture needles: type J, No.02, 0.12x30mm</td>
			<td>SEIRIN</td>
			<td>&#160;type J, No.02, 0.12x30mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controlled beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RTD Temperature Sensor with M4 Threaded Housing RTD-850M</td>
			<td>Omega</td>
			<td>RTD-850M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hermetically Sealed RTD Sensors HSRTD-3-100-A-3M</td>
			<td>Omega</td>
			<td>HSRTD-3-100-A-1M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermistor and RTD Extension Wire EXTT-3CU-26S-50</td>
			<td>Omega</td>
			<td>EXTT-3CU-26S-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Pin Mini Connectors for Thermocouples, 3-Wire RTD&#39;s and Thermistors MTP-U-M</td>
			<td>Omega</td>
			<td>MTP-U-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton (Polyimide Film) Insulated Flexible Heaters KHLV-103/(10)-P</td>
			<td>Omega</td>
			<td>KHLV-103/(10)-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature/Process Controller CNi16D24-C4EIT-DC</td>
			<td>Omega</td>
			<td>CNi16D24-C4EIT-DC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-made aluminium beaker, isolated with polyacetal (drawings see sheet 2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Zoom.V16 with ApoTome.2 ZEN</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>495010-0009-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective PlanNeoFluar Z 1.0x/0.25 FWD 56mm</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435281-9100-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Rotary Control MARC</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435604-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transillumination top 450 mot</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435500-9000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized measuring stage S 150x100 mot; CAN (D)</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435465-9020-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insert plate S, glass 237x157x3mm (D)</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435465-9053-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controller EMS 3</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435610-9010-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>System Control Panel SYCOP 3</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>435611-9010-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu ORCA Flash 4.0 camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-22CU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy High-End Workstation Xeon Quad-Core mulitlingual</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>490004-0025-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Language Package Windows 7 x64 Ultimate English US</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410373-0200-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCD TFT Monitor HP ZR2440w 24&#34;</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410350-2403-000</td>
			<td>not available anymore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN pro 2012 Hardware License key</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410135-1002-120</td>
			<td>not available anymore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Software Driver Hamamatsu Cameras Hardware License Key</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410136-1045-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN module Z Stack</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410136-0030-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Module Tiles/ Positions</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410136-1025-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Module Time Lapse</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410136-1031-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Module Experiment Designer</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410136-1022-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Desk 2012 Hardware License Key</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td>410135-1004-120</td>
			<td>not available anymore</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a submerged filter paper sandwich for long-term ex ovo time-lapse imaging of early chick embryos

5、体節形成6、7を曲げ心、 - 、その可用性、低コスト、フラット形状、および透明性に、ニワトリ胚、卵の元には 、原腸陥入2、神経胚形成3のような形態形成のイベント、の研究のための主要な脊椎動物のモデルとなっています初期胚形成の間に13、 - 8、および脳の形成9。形態形成のプロセスを理解する鍵は、タイムラプスイメージングによって動的に従うことです。ひよこ胚発生の元と、卵のタイムラプスムービーの買収は、短い時間のウィンドウにまたは胚14の周囲の温度と湿度を制御するために、インキュベーターの必要性にも限定されています。ここで、我々は文化のひよこに新しい手法を提示すると、透過光顕微鏡を用いた高解像度タイムラプスイメージングのための元、卵を胚。水没ろ紙サンドイッチは、十分に確立されたフィルターペーパーキャリアのTECHNの変形でありますiQue（EC-文化）1と気候室を必要とせずにニワトリ胚の培養を可能にします。胚は、2つの同一のろ紙キャリアとの間に挟まれている、完全に軽質鉱油の層で覆われた単純な、温度制御媒体に浸漬維持されます。少なくとも28体節期（HH16）15まで原始線条段階（ハンバーガー・ハミルトンステージ5、HH5）15から出発し、胚はどちらか自分の腹や背側を上にして培養することができます。これは、胚発生の約30時間をカバーするタイムラプスムービーの取得を可能にします。代表タイムラプスフレームとムービーが示されています。胚は、標準のEC培養で培養した胚に形態学的に比較されます。 水没ろ紙サンドイッチは、早期背側と腹側の形態形成過程を研究するための安定した環境を提供します。それはまた、顕微手術、ビーズIMPとして、ライブ蛍光イメージングとmicromanipulationsを可能にしますlantation、マイクロインジェクション、遺伝子サイレンシング、およびエレクトロポレーション（光シート顕微鏡を含む）レーザーベースのイメージングのための液浸対物レンズと結合する強い可能性を有します。

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A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Here, we present a new technique to culture chick embryos ex ovo for time-lapse imaging using transmitted light and fluorescence microscopy. The submerged filter paper sandwich is a variant of the well-established filter paper carrier technique1 that allows for the culturing of chick embryos fully-submerged in a liquid culture medium.

長期用水中フィルターペーパーサンドイッチ<em&gt;例OVO</emニワトリ初期胚の&gt;タイムラプスイメージング

Due to its availability, low cost, flat geometry, and transparency, the ex ovo chick embryo has become a major vertebrate animal model for the study of ...

a-submerged-filter-paper-sandwich-for-long-term-ex-ovo-time-lapse

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

22.1K ビュー.  MOVE Research Institute Amsterdam.   

ビデオ: A Submerged Filter Paper Sandwich for Long-term Ex Ovo Time-lapse Imaging of Early Chick Embryos

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

初代細胞培養研究のためのひよこ網膜における効率的な遺伝子導入：<em&gt;元オボ</em&gt;エレクトロポレーションアプローチ

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

発生生物学

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos model organisms, such as the chicken, are often used. The chicken is an excellent model organism due to its low cost and minimal maintenance, however they present observational challenges because they are enclosed in an opaque eggshell. In order to properly view the embryo as it develops, the shell must be windowed or removed. Both windowing and ex ovo techniques have been developed to assist researchers in the study of embryonic development. However, each of the methods has limitations and challenges. Here, we present a simple, optimized ex ovo culture technique for chicken embryos that enables the observation of embryonic development from stage HH 19 into late stages of development (HH 40), when many organs have developed. This technique is easy to adopt in both undergraduate classes and more advanced research laboratories where embryo manipulations are conducted.

Optimized Ex-ovo Culturing of Chick Embryos to Advanced Stages of Development

Viewing and accessing the chicken embryo during development can be challenging. We have developed an ex ovo method that is simple, cost effective, and can easily be used in a classroom or research setting. This method provides access to the embryo into late stages of embryonic development (HH 40).

最適化された<em&gt;元OVO</em&gt;開発の進んだ段階にニワトリ胚の培養

Research in anatomy, embryology, and developmental biology has largely relied on the use of model organisms. In order to study development in live embryos ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

分析<em&gt;インビボ</emゼブラフィッシュ胚における細胞移植とタイムラプスイメージングを使用して&gt;細胞移動

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune cells, and the coordination with lymphatic vessels and nerves. The multi-cell, multi-system interactions necessitate the investigation of angiogenesis in a physiologically relevant environment. Thus, while the use of in vitro cell-culture models have provided mechanistic insights, a common critique is that they do not recapitulate the complexity associated with a microvascular network. The objective of this protocol is to demonstrate the ability to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks before and after angiogenesis stimulation in cultured rat mesentery tissues. Cultured tissues contain microvascular networks that maintain their hierarchy. Immunohistochemical labeling confirms the presence of endothelial cells, smooth muscle cells, pericytes, blood vessels and lymphatic vessels. In addition, labeling tissues with BSI-lectin enables time-lapse comparison of local network regions before and after serum or growth factor stimulation characterized by increased capillary sprouting and vessel density. In comparison to common cell culture models, this method provides a tool for endothelial cell lineage studies and tissue specific angiogenic drug evaluation in physiologically relevant microvascular networks.

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogenesis involves multi-cell, multi-system interactions that need to be investigated in a physiologically relevant environment. The objective of this study is to demonstrate the ability of the rat mesentery culture model to make time-lapse comparisons of intact microvascular networks during angiogenesis.

アン<em&gt; ex vivoで</em&gt;メソッド培養ラット腸間膜微小血管ネットワークのタイムラプスイメージングのための

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. In particular, posterior body elongation is an essential process in embryonic development by which multiple tissue deformations act together to direct the formation of a large part of the body axis. In order to observe this process by long-term time-lapse imaging it is necessary to utilize a mounting technique that allows sufficient support to maintain samples in the correct orientation during transfer to the microscope and acquisition. In addition, the mounting must also provide sufficient freedom of movement for the outgrowth of the posterior body region without affecting its normal development. Finally, there must be a certain degree in versatility of the mounting method to allow imaging on diverse imaging set-ups. Here, we present a mounting technique for imaging the development of posterior body elongation in the zebrafish D. rerio. This technique involves mounting embryos such that the head and yolk sac regions are almost entirely included in agarose, while leaving out the posterior body region to elongate and develop normally. We will show how this can be adapted for upright, inverted and vertical light-sheet microscopy set-ups. While this protocol focuses on mounting embryos for imaging for the posterior body, it could easily be adapted for the live imaging of multiple aspects of zebrafish development.

Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.

ゼブラフィッシュの開発の長期イメージングのための多彩な取り付け方法

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and subcellular processes, high resolution time-lapse microscopy strategies that preserve physiological conditions are required. Plant tissues must have adequate nutrient and water supply with sustained gaseous exchange but, when submerged and immobilized under a coverslip, they are particularly susceptible to anoxia. One strategy that has been successfully employed is the use of a perfusion system to maintain a constant supply of oxygen and nutrients. However, such arrangements can be complicated, cumbersome, and require specialized equipment. Presented here is an alternative strategy for a simple imaging system using perfluorodecalin as an immersion medium. This system is easy to set up, requires minimal equipment, and is easily mounted on a microscope stage, allowing several imaging chambers to be set up and imaged in parallel. In this system, lateral root growth rates are indistinguishable from growth rates under standard conditions on agar plates for the first two days, and lateral root growth continues at reduced rates for at least another day. Plant tissues are supplied with nutrients via an agar slab that can be used also to administer a range of pharmacological compounds. The system was established to monitor lateral root development but is readily adaptable to image other plant organs such as hypocotyls and primary roots.

Presented here is a simple technique for high-resolution confocal time-lapse imaging of root and hypocotyl development for up to 3 days using high numerical-aperture objectives and perfluorodecalin as an immersion medium.

根および胚軸発達の長期共焦点イメージングのための単純なチャンバー

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

長期のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アイディスク

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to numerous cell types throughout the body. Understanding the biology of the neural crest has been limited, reflecting a lack of genetically tractable models that can be studied in vivo and in real-time. Zebrafish is a particularly important developmental model for studying migratory cell populations, such as the neural crest. To examine neural crest migration into the developing eye, a combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time videos of the developing eye in transgenic zebrafish embryos, namely Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP), as sox10 and foxd3 have been shown in numerous animal models to regulate early neural crest differentiation and likely represent markers for neural crest cells. Multi-photon time-lapse imaging was used to discern the behavior and migratory patterns of two neural crest cell populations contributing to early eye development. This protocol provides information for generating time-lapse videos during zebrafish neural crest migration, as an example, and can be further applied to visualize the early development of many structures in the zebrafish and other model organisms.

A combination of the advanced optical techniques of laser scanning microscopy with long wavelength multi-photon fluorescence excitation was implemented to capture high-resolution, three-dimensional, real-time imaging of neural crest migration in Tg(sox10:EGFP) and Tg(foxd3:GFP) zebrafish embryos.

リアルタイムで開発を可視化する多光子タイムラプス イメージング: ゼブラフィッシュ胚の神経堤細胞の可視化

Congenital eye and craniofacial anomalies reflect disruptions in the neural crest, a transient population of migratory stem cells that give rise to ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues or cells. A difficulty with imaging whole embryo development is that zebrafish embryos grow substantially in length. When mounted as regularly done in 0.3-1% low melt agarose, the agarose imposes growth restriction, leading to distortions in the soft embryo body. Yet, to perform confocal time-lapse microscopy, the embryo must be immobilized. This article describes a layered mounting method for zebrafish embryos that restrict the motility of the embryos while allowing for the unrestricted growth. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations. To demonstrate the usability of this method, whole embryo vascular, neuronal and muscle development was imaged in transgenic fish for 55 consecutive hours. This mounting method can be used for easy, low-cost imaging of whole zebrafish embryos using inverted microscopes without requirements of molds or special equipment.

This article describes a method to mount fragile zebrafish embryos for extended time-lapse confocal microscopy. This low-cost method is easy to perform using regular glass-bottom microscopy dishes for imaging on any inverted microscope. The mounting is performed in layers of agarose at different concentrations.

ゼブラフィッシュ胚全体の延長タイムラプス共焦点顕微鏡法の層状取り付け法

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Brainbowとタイムラプス共焦点イメージングを用いた生きているゼブラフィッシュの発達脳の可視化

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...