עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר של משרד החינוך הגרמני הפדרלי לחקר ומחקר (BMBF) (מענק # 13GW0043C) וכן משרד אירופי של מחקר ופיתוח חלל (EOARD, מענק # FA9550-15-1-0443)

1. תרבות תא RPE <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של תאים RPE מעיניים חזירי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג עיניים טריות מחורצות טרי מבית המטבחיים המקומי. שמור אותם מגניב (4 ° C) בסביבה חשוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר רקמות תאיים עם מספריים להשרות את העיניים בתמיסה חיטוי במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העיניים במי מלח פוספט מעוקרים ללא סידן ומגנזיום (PBS (-)) עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל, לחדור את sclera על 5 מ&quot;מ האחורי אל ליבת הקרום. משמרים את החלק הקדמי של העין על ידי חיתוך במספריים לכל אורך הדרך, במקביל לאיבר הקרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החלק הקדמי של העין ( כלומר, הקרנית ואת העדשה) ואת זגוגית. הוסף 1 מ&quot;ל של PBS (-) בעדינות להסיר את הרשתית העצבית. הערה: זה &quot;כוס העין&quot;, המורכב sclera, choroid, ו RPE, מוכן כעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מראש חימם (37 מעלות צלזיוס) 0.25% טריפסין ב PBS (-) על כוס העין. התאם את עוצמת הקול כך כ 80% של כוס העין מלא פתרון זה טריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את כוס העין עם פתרון טריפסין 5% CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כוס העין מן האינקובטור ולהחליף את הפתרון טריפסין 0.25% עם פתרון PBS (-) עם 0.05% טריפסין + 0.2% ethylenediaminetetraetetic מלח טטרסודיום (EDTA · 4N). דגירה את כוס העין באינקובטור במשך 45 דקות. הערה: לאחר 45 דקות, תאי RPE יהיה גם מחובר רק רופף קרום של ברוץ או כבר מנותקים וצפים פתרון טריפסין-EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים RPE ידי pipetting עדין. לאסוף את התאים ואת הפתרון בצינור חרוטי מלא 10 מ&quot;ל של המדיום תרבות (DMEM גלוקוז גבוהה עם L- גלוטמין), כולל 10% בסרום חזיר, אנטיביוטיקה / antimycotic, pyruvate נתרן (1 מ&quot;מ). הערה: הסרום עשוי לנטרל את ההשפעה של טריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגהההשעיה תא ב XG 400 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ולהוסיף 10 מ&quot;ל של מדיום טרי. צנטריפוגה שוב תחת אותם תנאים במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ולהוסיף בינוני חדש, כך ריכוז התא תוצאות 5 x 10 5 תאים / מ&quot;ל ​​(שנקבע על ידי ספירת התאים באמצעות hemocytometer). מערבבים היטב על ידי pipetting עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפיץ את ההשעיה התא בצלחות תרבות התא. השתמש 3 מ&quot;ל לכל צלחת 60 מ&quot;מ קוטר התרבות. הערה: תרבות זו נקראת מעבר אפס (P0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על התאים 5% CO 2 באינקובטור ב 37 ° C. שנה חצי בינוני מותנה בינוני טרי מדי יום שני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Subculture (שלב 1.2) אם הוא הופך להיות confluent. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תת התרבות של התרבות התא RPE <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיום תרבות לשטוף את התאים פעמיים עם PBS (-). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם PBS (-) פתרון עם 0.05% טריפסין + 0.2% EDTA אניNa 5% CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את תאים RPE ידי pipetting עדין ולאסוף את ההשעיה התא בצינור חרוטי מלא 10 מ&quot;ל של המדיום תרבות, כולל 10% בסרום חזיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה התא ב XG 400 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ולהוסיף בינוני תרבות חדשה, מה שהופך את ריכוז התא 5 x 10 5 תאים / מ&quot;ל ​​(שנקבע על ידי ספירת מספר התא עם hemocytometer). להפיץ את התאים חדשים 60 מ&quot;מ קוטר מנות התרבות, כמתואר בשלב 1.1.13. הערה: תרבות התא הוא עכשיו מעבר 1 (P1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר confluency הוא הגיע, תת תרבות P1 ל P2, תוך שימוש באותו הליך המתואר צעדים 1.2.1-1.2.5. מן התרבות P2, זרע התאים על מנות תרבות קטנות יותר (30 מ&quot;מ קוטר פנימי) במקום 60 מ&quot;מ קוטר מנות תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הניסויים, השתמש P2 או תרבויות P3. </li></ol></li></ol> 2. ת&#39;ולהקרנת לייזר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקמת תחנת ההקרנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבור מכשיר הליום תוליום (1.94 מיקרומטר, טווח כוח: 0-20 W) כדי 0.22-NA, 365 מיקרומטר סיבי קוטר הליבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכני לתקן את קצה סיב הזרוע המתכת כי הוא קבוע אופקית אל עמדת מתכת אנכית של תחנת הקרנה. מניחים את ההודעה אנכי כך קצה סיבי הלייזר נמצא מעל צלחת חמה שעליו צלחת התרבות התא הוא להיות ממוקם במהלך הקרנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח נייר לבן על צלחת חם ולהפוך את הקורה מכוון על (λ = 635 ננומטר, מקסימום = 1 mW, קוטר ברמת נייר ≈ 30 מ&quot;מ). סמן את היקף הקורה מכוונת על הנייר הלבן, כך המיקום שבו צלחת התרבות היא להיות ממוקם במהלך הקרנה ידוע. הערה: המטוס z של קצה סיב ניתן לשינוי. ללא כל אופטיקה הדמיה נוספת, קוטר נקודה לייזר על המטוס התרבות תאים, להציב 12 ס&quot;מ מתחת קצה סיב, אני<html> S על 30 מ&quot;מ, אשר כמעט שווה את הקוטר הפנימי של צלחת תרבות התא. ציור סכמטי של ההתקנה מוצג באיור 1 . </li></ol></li></ol><img alt="איור 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54326/54326fig1.jpg" /> איור 1: תמונה סכמטית של תחנת הלייזר תוליום לייזר. צלחת תרבות מונחת על צלחת החימום. התאים ממוקמים 12 ס&quot;מ מתחת עצה סיבי הליום תוליום כך גודל הקרן הוא כמעט זהה לקוטר הפנימי של צלחת תרבות (כ 30 מ&quot;מ). הלייזר הקרנה לייזר נשלטת על ידי שבשגרה זמן בשליטה של ​​פלטפורמת עיצוב מערכת בהתאמה אישית. יש לקבוע את הגדרת הכוח לפני הפעלת תוכנית ההקרנה. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54326/54326fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <ol </html style=";text-align:right;direction:rtl">Start = &quot;2&quot;&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקרנה בלייזר של תרבות התא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 שעה לפני הקרנה, להחליף את המדיום התרבות לחלוטין עם 1.2 מ&quot;ל של המדיום הטרי. הערה: זהו שלב קריטי ויש לעקוב אחריו בקפידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את תחנת ההקרנה ( כלומר, את הצלחת החמה ואת ההודעה שבה כדי לתקן את סיבי הלייזר) על ספסל נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את צלחת התרבות התא מן החממה ומניחים אותו על המיקום מסומן על צלחת חמה (שלב 2.1.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללבוש משקפי מגן. הפעל את הלייזר תוליום. הגדר את העוצמה הרצויה במכשיר הלייזר (מתכוונן מ - 20 - 20 W). הפעל את הפליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל פלטפורמת תכנון מערכת השולטת על קרינה בלייזר ופרוטוקול תזמון (קובץ משלים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר הנחת צלחת התרבות על צלחת חם, לחץ על &quot;זמן חימום מראש&quot; כדי להפעיל את הטיימר עבור 140 s (&quot;זמן חימום מראש 1&quot;); זה ישמור על הטמפרטורה בינוני בינוני ב 37 ° C לפני הקרנה. הערה: לאחר 140 שניות, צליל ביפ יופעל, והקוצב הבא (&quot;זמן החימום המוקדם&quot;) יתחיל לספור באופן אוטומטי 8 שניות. במהלך 8 זה, הבוחן עשוי לפתוח את צלחת התרבות. לאחר 148 של חימום מראש, 10-s הקרנה בלייזר ארוך על התרבות התא יתבצע באופן אוטומטי. במקרה חירום, הצייד את מכשיר הלייזר בלחיצת עצירה כדי לעצור את הלייזר באופן מיידי. זהו שלב קריטי חייב להיות אחריו בהחלט. נקודה מיוחדת של זהירות מתייחסת לפתיחת הכיסוי של המנה בדיוק לפני ההקרנה, בתחילת זמן 8 חימום מראש. פתיחת המכסה עלולה להתקרר מהר מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הקרנה, מיד במקום לכסות בחזרה על צלחת התרבות, לעזוב את צלחת תרבות על צלחת חמה במשך 7 שניות נוספות, ומניחים אותו בחזרה 5% CO 2 באינקובטור ב 37 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידת התפלגות הטמפרטורה ברמה תאית (כיול טמפרטורה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך חורים קטנים (כ 300 מיקרומטר בקוטר) קרוב לתחתית על ארבעה צדדים (כל 90 מעלות) של צלחת 30 מ&quot;מ קוטר תרבות (ללא תאים); להשתמש קצה מחט (20G) מחומם עם מבער Bunsen. חותם את החורים עם סרט בידוד חשמלי מבחוץ ולעשות חור קטן עם מחט בסדר כך שרק תרמי קנס (200 מיקרומטר בקוטר) ניתן להכניס דרך חור זה בתנאים אטום למים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלק החיצוני של צלחת בתחתית התרבות, לצייר 2 בקוטר אנכי ולהגדיר את נקודת המעבר ( כלומר, במרכז הצד התחתון) כמו קואורדינטות אפס (0). סמן כל 3 מ&quot;מ רדיאלי החוצה את המנה ( כלומר, 0, 3, 6, 9, 12, ו -15 מ&quot;מ) בכל כיוון לאורך השורות ( איור 2 , נקודות כחולות); מספר הנקודות צריך להיות 21 בסך הכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים את צלחת תרבות התא עם 1.2 מ&quot;ל של המדיום תרבות חדשה. מניחים את התרבות dIsh על צלחת חמה על 37 מעלות צלזיוס, הכנס תרמית בסדר (200 מיקרומטר בקוטר) לתוך החור בצד, ומניחים קצה רגיש שלה על מיקום מסומן להימדד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללבוש משקפי מגן. הפעל את הלייזר תוליום באופן ידני להגדיר את הכוח (בין 0 ל 20 W, ב 0.1-W במרווחים) של לייזר לתכנן. הערה: עבור כיול טמפרטורה, מדידות עם הספק במרווחים של 3W צריך להיות מספיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את פלטפורמת תכנון המערכת ולחץ על הלחצן &quot;התחל טמפ. רכישה&quot; (קובץ משלים) כדי להתחיל את מדידת הטמפרטורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את הנוהל כמו בשלב 2.2.6. הערה: תוכנית הבקרה מודדת את טמפרטורת הצינור המותקן בכל 100 אלפיות השנייה ומראה את התקדמות הטמפרטורה במהלך ההקרנה בממשק הגרפי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פעולות אלה עבור כל 21 נקודות המדידה ובגדרות צריכת חשמל שונות. חזור על התהליך כולו שלוש פעמים עבור כל נקודות עבור כל כוח settinGs כדי להשיג נתונים אמינים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייצוא נתוני טמפרטורה כמו נתוני csv, אשר בסופו של דבר ניתן להמיר לגיליון אלקטרוני. ממוצע הטמפרטורה המקסימלית בסוף הקרנה למדידות בשלושה עותקים בכל נקודה. ממוצע הערכים מנקודות על אותו מעגל (4 נקודות בסך הכל, למעט הנקודה המרכזית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קנו את הטמפרטורה המקסימלית הממוצעת על הגרף, מה שהופך את המרחק ממרכז המנה (מ&quot;מ) כמו ציר x ואת עליית הטמפרטורה (ΔT, C °) כמו ציר y. השתמש בפונקציית ההתאמה של תוכנה מתמטית שתתאים למודל גאוס לנתונים הגולמיים. יצירת הפצה טמפרטורה להתאים גאוס. </li></ol></li></ol><img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54326/54326fig2.jpg" /> איור 2: הנקודות לכיול טמפרטורה בתרבות אחת תא תרבות. נתוני הטמפרטורה נמדדו במרכז ובגיל 5נקודות רדיאלי מעל 4 זוויות שונות (נקודות כחולות). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54326/54326fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 3. הערכות ביולוגיות עבור תגובות תאים לאחר אירי תרמי שונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכה של הכדאיות התא ( כלומר, חיים, אפופטוטיים, מת) בעקבות הגדרות כוח שונות וקביעת סף המוות התא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודות הזמן שצוינו ( כלומר, 3, 24, ו 48 שעות לאחר הקרנה), לשטוף את התאים עם PBS (-) ולהשתמש בערכה זמין מסחרית להעריך כדאיות התא ( כלומר, חיוני, אפופטוטי, מת) פרוטוקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מכתים על ידי הוספת 5 μL של isothiocyanate פלואורסצין (FITC) -annexin V, 5 μL של ethidium homodimer III, ו 5 μL של Hoechst 33342 100 μL של חיץ 1x מחייב (כל ערכתרכיבים). הכן פתרון מכתים מספיק כדי לכסות את התאים. דגירה התאים במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את התרבות התא עם חיץ מחייב פעמיים, להחליף את חיץ מחייב עם PBS (-), ולהגדיר את התרבות על הבמה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את הנתיב האור אל העדשה העין, בחר את 4 &#39;, 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) מסנן, להדליק את האור תאורה, ולמצוא את המטוס ממוקדת עם המטרה 4x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את הנתיב האור אל המצלמה, למצוא את התמונה על מסך המחשב של תוכנת הדמיה מיקרוסקופ, ולהתאים את המיקוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפונקציה תפר ( כלומר, את הפונקציה כדי להקליט מספר תמונות על פני המנה ולאחר מכן ליצור תמונה אחת גדולה) של התוכנה ספציפית מיקרוסקופ כדי לקבל את התמונה הקרינה של צלחת התרבות כולה התא. השתמש 3 ערכות מסנן שונים, DAPI, FITC, ו tetramethylrhodamine (TRITC) לתמונה Hoechst 33342 תאים חיוביים (כל גרעיני התא), FITC-Annexin V-positiתאים ותאים (אפופטוטיים), ותאי ה- ethidium homodimer III חיובי (מת), בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את רדיוס (מ&quot;מ) של המת (ethidium homodimer III חיובי) האזור ואת רדיוס החיצוני / הפנימי של אפופטוטיים (Annexin V חיובי) הלהקה טופס באזור בתרביות תאים מוכתמים. החל רדיוס זה על הפונקציה גאוס מצויד של הפצה הטמפרטורה עבור הגדרת הכוח המקביל. חישוב הטמפרטורה המדויקת בשולי האזור מת או אפופטוטיים כדי להבהיר את טמפרטורות הסף למוות התא שינוי אפופטוטי. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Inagaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+efficacy+of+pure+yellow+(577-nm)+and+810-nm+subthreshold+micropulse+laser+photocoagulation+combined+with+yellow+(561-577-nm)+direct+photocoagulation+for+diabetic+macular+edema.">Comparative efficacy of pure yellow (577-nm) and 810-nm subthreshold micropulse laser photocoagulation combined with yellow (561-577-nm) direct photocoagulation for diabetic macular edema.</a> Jpn J Ophthalmol. 59 (1), 21-28 (2015).</li><li>Roider, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+retina+therapy+(SRT)+for+clinically+significant+diabetic+macular+edema.">Selective retina therapy (SRT) for clinically significant diabetic macular edema.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 248 (9), 1263-1272 (2010).</li><li>Brinkmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+temperature+determination+during+retinal+photocoagulation+on+patients.">Real-time temperature determination during retinal photocoagulation on patients.</a> J Biomed Opt. 17 (6), 061219 (2012).</li><li>Yoshimura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photocoagulated+human+retinal+pigment+epithelial+cells+produce+an+inhibitor+of+vascular+endothelial+cell+proliferation.">Photocoagulated human retinal pigment epithelial cells produce an inhibitor of vascular endothelial cell proliferation.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (8), 1686-1691 (1995).</li><li>Denton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Damage+Thresholds+for+Exposure+to+NIR+and+Blue+Lasers+in+an+In+Vitro+RPE+Cell+System.">Damage Thresholds for Exposure to NIR and Blue Lasers in an In Vitro RPE Cell System.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (7), 3065-3073 (2006).</li><li>Shrestha, R., Choi, T. Y., Chang, W., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-precision+micropipette+sensor+for+cellular-level+real-time+thermal+characterization.">A high-precision micropipette sensor for cellular-level real-time thermal characterization.</a> Sensors (Basel). 11 (9), 8826-8835 (2011).</li><li>Gao, F., Ye, Y., Zhang, Y., Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+bath+hyperthermia+reduces+stemness+of+colon+cancer+cells.">Water bath hyperthermia reduces stemness of colon cancer cells.</a> Clin Biochem. 46 (16-17), 1747-1750 (2013).</li><li>Jansen, E. D., van Leeuwen, T. G., Motamedi, M., Borst, C., Welch, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+dependence+of+the+absorption+coefficient+of+water+for+midinfrared+laser+radiation.">Temperature dependence of the absorption coefficient of water for midinfrared laser radiation.</a> Lasers Surg Med. 14 (3), 258-268 (1994).</li><li>Iwami, H., Pruessner, J., Shiraki, K., Brinkmann, R., Miura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+a+laser-induced+sub-lethal+temperature+rise+on+RPE+cells+from+oxidative+stress.">Protective effect of a laser-induced sub-lethal temperature rise on RPE cells from oxidative stress.</a> Exp Eye Res. 124, 37-47 (2014).</li><li>Denton, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+correlated+microthermography+maps+threshold+temperature+in+laser-induced+damage.">Spatially correlated microthermography maps threshold temperature in laser-induced damage.</a> J Biomed Optics. 16 (3), (2011).</li><li>Morgan, C. M., Schatz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrophic+creep+of+the+retinal+pigment+epithelium+after+focal+macular+photocoagulation.">Atrophic creep of the retinal pigment epithelium after focal macular photocoagulation.</a> Ophthalmology. 96 (1), 96-103 (1989).</li></ol>

למחברים אין מה לגלות.

בהתייחסות לתגובות תאולוגיות ביולוגיות הקשורות לטמפרטורה, לא רק הטמפרטורה, אלא גם משך הזמן של הטמפרטורה המוגברת, היא בעלת חשיבות, שכן רוב התהליכים הביוכימיים תלויים בזמן. במיוחד בתחום של היפרתרמיה המושרה בלייזר ברפואת עיניים, בשל טווח הזמן הקצר - בין אלפיות השנייה לשניות - קשה לחקור תופעות תרמיות תאיות עם בקרת טמפרטורה מדויקת. לכן, תוכנית הקרנה בלייזר מתאים למודל התרבות התא, עם מערכת הפעלה המאפשרת בקרת טמפרטורה קפדנית זמן שליטה. ההערכה הביולוגית של תגובות התא לאחר חשיפה תרמית, כגון ביטוי חלבון או הפרשת, דורש הערכות כמותיות חוזרות ונשנות על מספר מספיק של תאים מושפעים. זה היה מכשול ללימודים באמצעות כתמי לייזר כמה מאות מיקרומטר בקוטר, כמו בטיפולים קליניים. ניתוח כמותי בנקודה אחת לייזר הוא די buארדנסום. במחקר זה נעשו ניסיונות להגשים את הדרישות הללו ככל האפשר. באמצעות 1.94 מיקרומטר אורך גל גל רציף תוליום עם תוכנית בקרת הקרנה, עלייה טמפרטורת הזמן יכול להתנהל בתרבות תאים שלמה בתוך פרק זמן קצר. מאז חלוקת הטמפרטורה עשוי להיות מותאם על ידי שינוי נתיב האור, סוגים שונים של ניסויים הקשורים היפרתרמיה יכול להתבצע באמצעות התקנה זו. המגבלה של הטכניקה המוצגת היא חוסר האפשרות לבצע מדידות טמפרטורה בו זמנית במהלך הקרנה בלייזר של התאים. מאז השימוש בצמדים תרמיים אינו מתאים תרבויות תאים מעוקרים, כיול טמפרטורה חייב להתבצע בנפרד הקרנה תא. בהתחשב בשינויים אפשריים בתפוקת הלייזר, מדידות טמפרטורה בזמן אמת במהלך כל הקרנה בלייזר יהיו אידיאליות להערכה ישירה של תגובות תאמינון תרמי. יתר על כן, התפלגות הטמפרטורה בשימוש כאן נוצר באמצעות אינטרפולציה נתונים המבוססים על מדידות ב 21 נקודות על צלחת תרבות בכמה הגדרות צריכת חשמל שונים. לכן, כדי להתגבר על מגבלות אלה ונקודות קריטיות, היא המטרה שלנו לפתח שיטה חלופית המאפשרת למדידת הטמפרטורה של צלחת תרבות בזמן הקרנת לייזר מתבצע. אנו גם שואפים להשיג את המידע הטמפרטורה מרחבית בבת אחת. הדמיה אינפרא אדום (תרמוגרפיה) היא שיטה אחת אפשרית למדוד את הטמפרטורה במהלך קרינה בלייזר 10 . היתרון הגדול של שיטה זו הוא מדידת הטמפרטורה בזמן אמת ברמה התאית עבור כל הקרנה; התגובות הביולוגיות הבאות תא תמיד יכול להיות בנפרד לעומת ההיסטוריה הטמפרטורה במהלך הקרנה. בהתחשב עלות יעילות ושימושיות, עם זאת, באמצעות תרמוגרפיה עבור ניסויים חימום התא אינו אפשרי עבור כל workatאורי. בשיטה באמצעות לייזר thulium באורך גל של 1.94 מיקרומטר, המים בצלחת תרבות התא מחומם על פני השטח שלו, דיפוזיה תרמית הסעה משמשים לחמם את התאים. גובה המדיום התרבותי בתצורת ההקרנה, עם 1.2 מ&quot;ל של המדיום התרבותי, הוא 935 מיקרומטר במיקום המרכזי (ממדידה קודמת באמצעות טומוגרפיית קוהרנטיות אופטית). רמת הקליטה של ​​הליום תוליום במים גבוהה מאוד (מקדם הקליטה: 127 ס&quot;מ -1 ב 35 ° C), ו 72% של האור נספג ב 100 מיקרומטר הראשון של המדיום התרבות. אין כמעט ספיגה (0.0007%) בעומק של 935 מיקרומטר. חשוב לציין כי אחת הנקודות הקריטיות בפרוטוקול היא להוסיף את אותה כמות של בינוני (1,200 μL) עבור כל הקרנה. שימוש בכמויות שונות של המדיום התרבות עשוי להוביל להבדלים גובה, אשר עלול לגרום להבדלים הטמפרטורה אניNcrease של התאים. הנקודה הקריטית השנייה מתייחסת לעיתוי פתיחת צלחת התרבות. זה חייב להיעשות באותו זמן - במחקר זה, 8 s לפני תחילת ההקרנה, כאשר המערכת משמיעה קול. הבדלים בעיתוי זה עשויים להשתנות את טמפרטורת הבסיס בשל הקירור הנגרם על ידי האוויר הסובב (כ 23 ° C). זה יכול להוביל להבדלים משמעותיים בטמפרטורת לייזר המושרה. עבור כיול טמפרטורה, אותה כמות של מדיום (1.2 מ&quot;ל) ששימש בניסויים שימש למדוד את התפלגות הטמפרטורה בתחתית של מנות תרבות ללא תאים. עם זאת, גובה בינוני עם monolayer התא עשוי להיות שונה מזו ללא תאים, אפילו עם נפח זהה של בינוני הוסיף. המדידה באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטי גילה כי יש הבדל 58 מיקרון במיקום המרכזי בין מנות עם וללא monolayer תא ומחוברות (877 מיקרומטר ללא תאים, לעומתO 935 מיקרומטר עם תאים). הבדל זה הוא פוטנציאלי בשל פעילות נימית של התאים. ההבדל 58 מיקרומטר גובה במיקום המרכזי עלול להיגרם על ידי כ 40 μL של המדיום (נתונים נמדדים). זה היה גם אישר כי הבדל זה גובה לא לגרום הבדלים משמעותיים ב מקס בכל הגדרות החשמל. לפיכך, הגענו למסקנה כי הבדל זה אינו משפיע באופן משמעותי על תוצאות הניתוחים שנעשו במחקר זה. עם זאת, כדי לאסוף מידע טמפרטורה מדויקת יותר, כפי שצוין לעיל, שיטה לכייל את הטמפרטורה באמצעות צלחת תרבות התא המכיל monolayer התא צריך להיות מפותח. יתר על כן, מודלים מתמטיים של דיפוזיה תרמית הסעה במדיום התרבות כולה נדרשת גם. במחקר זה, התאים היו מחוממים עם הפצה טמפרטורה גאוס. ישנן מספר שיטות אפשריות כדי לחמם את המדיום כולו בצורה אחידה לאורך זמן. אחד<html> היא להשתמש במקור לייזר עם מקדם ספיגה נמוך יותר במים. עם זאת, החיסרון הוא, כי במקרה זה, לייזרים חייב להיות בעל כוח גבוה יותר, שכן רק אחוז קטן של האור נספג מעל 0.9 מ&quot;מ. אפשרות נוספת היא דימוי קצה סיב דיסטלי של סיב אופטי multimode המעביר את אור הלייזר לתוך המטוס של צלחת התרבות; את ההגדלה ניתן לבחור באופן שרירותי על ידי אופטיקה. הדגש השני של פרוטוקול זה הוא היכולת לקבוע את טמפרטורת הסף למוות תאים אפופטוזיס באמצעות התמונה ניאון של מכתים הכדאיות ואת חלוקת הטמפרטורה לרוחב. מטרה ארוכת טווח היא לא רק כדי לקבוע את הכדאיות התא, אלא גם כדי להבהיר את טווח הטמפרטורות לתגובות ביולוגיות התא הקשורים לתפקוד התא, כגון ביטוי חלבון התפשטות תאים. קביעת הטמפרטורה סף המוות התא הוא עניין רב לחוקריםבעזרת שיטה זו ניתן לקבוע את הגורמים הקריטיים למוות של תאים, כולל אפופטוזיס.גורמים קריטיים למוות תרמי באמצעות לייזר תרמי עשויים להיקבע לא רק באמצעות ההיסטוריה הטמפרטורה, אלא גם באמצעות הגורמים האנדוגניים ( כלומר גורמים אינטרה / חוץ-תאיים ברמה המולקולרית) .תשובה לשאלות אלו עשויה לסלול את הדרך להבנת מנגנוני מוות של תאים וקינטיקה לאחר חשיפות תרמיות שונות ובפתולוגיות רשתיות שונות, כמו כן, היא יכולה לסייע בהבהרת נושאים קליניים, כגון ההבדל בין הפרט בתגובה לטיפול בלייזר או השתנות בגודל הצלקת לאחר צילום פוטוגרפי של הרשתית, גם כאשר גודל הנקודה ההתחלתית היה כמעט זהה (&quot;זחילה אטרופית&quot;). המטרה הסופית של מחקר זה היא לסייע בפיתוח טיפולי photothermal טמפרטורה מבוקרת של הרשתית. כדי להשיג זאת, במקבילה התקדמות הטכנית של המדידה טמפרטורה 3 , הבהרה נוספת של התנהגות התא RPE לאחר חשיפה תרמית, נקבע באמצעות שיטה זו, יהיה תועלת רבה.

הבנת התגובות הביולוגיות לתאים תלויי טמפרטורה היא בעלת חשיבות רבה לטיפולי היפרתרמיה מוצלחים. לייזר photocagulation לייזר עם לייזר תרמי, המשמשים אופתלמולוגיה, הוא אחד הטיפולים לייזר הוקמה ביותר ברפואה. אור גלוי, בעיקר מ אור ירוק אור צהוב, משמש בטיפול לייזר ברשתית. האור הוא נספג מאוד על ידי מלנין בתאי אפיתל פיגמנט רשתית (RPE) תאים, המהווים את monolayer התא החיצוני של הרשתית. יש לאחרונה התעניינות בקרב רופאים וחוקרים בקרינה תרמית קלה מאוד (photocagulation תת גלוי) כאסטרטגיה טיפולית חדשה עבור סוגים שונים של הפרעות רשתית 1 , 2 . בעקבות מגמה זו, האינטרס שלנו הוא תת חיטה תת תאים RPE תחת בקרת טמפרטורה מדויקת, טכניקה המכונה טמפרטורה מבוקרת פוטותרמית (TC-PTT). אופטו אחרוניםטכנולוגיה אקוסטית של המכון שלנו אפשרה את המדידה בזמן אמת של עליית הטמפרטורה באתרי מוקרן הרשתית. זה מאפשר שליטה על עליית הטמפרטורה במהלך קרינה 3 . עם זאת, מאז היפרתרמיה תת-קטלנית על הרשתית, הנגרמת על ידי חימום תאים RPE תת תת קטלני, לא נחשב בעבר בשל חוסר האפשרות של מדידה ושליטה על הטמפרטורה, תגובות תא תלוי טמפרטורה של תאים RPE בעקבות הקרנה בלייזר תרמי יש נחקרו מעט מאוד עד כה. יתר על כן, לא רק ההבדל הטמפרטורה לא נדונו בפירוט, אלא גם את ההבדל בהתנהגות התא של תאים ששרדו לאחר הקרנה תת קטלני קטלני. לכן, כדי לאסוף ראיות מדעיות על TC-PTT מבוססי טיפולים, אנו שואפים להבהיר את התאים תלויי הטמפרטורה תא RPE התא והמנגנונים שלהם באמצעות setups ניסיוני חוץ גופית . עבור tמטרתו, יש צורך להקים התא חימום המערכת העומדת בתנאים הבאים: 1) אפשרות להגדלת הטמפרטורה מהר, 2) זמן מבוקרים מדויק טמפרטורה, 3) מספר גבוה יחסית של תאים שנבדקו עבור ניסויים ביולוגיים . לגבי שיטת החימום, לייזר קליני, כגון תדר Nd.YAG הכפול תדר (532 ננומטר), הוא למרבה הצער לא מתאים לתא התרבות התא. הסיבה לכך היא מספר מופחת של מלנוזומים בתאי RPE תרבותי. הקליטה של ​​אור הלייזר עשויה להיות בלתי-הומוגנית, ועליית הטמפרטורה ברמת הסלולר משתנה בין ניסויים, גם כאשר מוקרנת עם אותה עוצמת קרינה. מספר מחקרים קודמים דיווחו על שימוש בנייר שחור מתחת לתחתית התבשיל במהלך הקרנה 4 או שימוש במלנוזומים נוספים, כי הם phagocytized על ידי תאים התרבות לפני הניסויים 5 , 6 . הרבה מבמבחנה ביולוגית מחקרים להערכת תגובות התא המושרה היפרתרמיה בוצעו באמצעות צלחת חמה, אמבט מים, או CO 2 חממה עם הגדרת טמפרטורה 7 . שיטות אלה דורשות תקופת חימום ארוכה כי זה לוקח קצת זמן ( כלומר, כמה דקות) כדי להגיע לטמפרטורה הרצויה. יתר על כן, בשיטות אלה, קשה להשיג היסטוריה תרמית מפורט ( כלומר, טמפרטורה כפול זמן) ברמה התאית. יתר על כן, הטמפרטורה בין התאים בעמדות שונות בצלחת תרבות אחת עשויים להשתנות בשל דיפוזיה טמפרטורה משתנה. ברוב המקרים, מידע טמפרטורתי וזמני מרחבי זה במהלך היפרתרמיה לא נלקח בחשבון לצורך ניתוחים ביולוגיים, למרות שתגובת התא הביולוגי עלולה להיות מושפעת בצורה קריטית מהטמפרטורה ומהמשך הזמן של הטמפרטורה המוגברת. כדי להתגבר על בעיות אלה, contiהלייזר גל thulium נוזל שימש כאן כדי לחמם את התאים. קרינת לייזר תוליום (λ = 1.94 מיקרומטר) הוא נספג מאוד על ידי מים 8 , ואת התאים בחלק התחתון של צלחת תרבות הם מגורה תרמית אך ורק באמצעות דיפוזיה תרמית. סיבי הלייזר עם קוטר 365 מיקרומטר מוגדר כ 12 ס&quot;מ מעל צלחת התרבות, ללא כל אופטיקה בין לבין. קוטר קרן הלייזר מפריד כזה שהוא כמעט שווה את הקוטר הפנימי של צלחת תרבות (30 מ&quot;מ) על פני השטח של המדיום תרבות.עם כמות עקבית של המדיום תרבות, אפשר להקרין את התאים עם עליית הטמפרטורה של הדירות גבוהה. הגדרות כוח משתנה מאפשרות הקרנה עם עד 20 ואט, והטמפרטורה בינונית ברמה התאית יכולה להיות מוגברת עד ΔT ≈ 26 ° C ב 10 שניות. על ידי שינוי תנאי הקרנה, ניתן גם לשנות את פרופיל קרן הלייזר כדי לשנות את הטמפרטורה distributiעל בצלחת תרבותית. לדוגמה, ניתן לחקור עם הפצה טמפרטורה כמו גאוס, כמו במחקר הנוכחי, או עם חלוקת טמפרטורה הומוגנית. זה האחרון עשוי להיות מועיל לחקר ההשפעות של התגובות הטמפרטורה תלויי תא יותר ספציפי עבור טמפרטורות קטלניות מתחת לטמפרטורות, אבל לא ללחץ מוות של תאים או תגובות ריפוי הפצע. בסך הכל, קרינה לייזר תוליום עשוי לאפשר את החקירה של סוגים שונים של גורמים ביולוגיים, כגון ביטוי גנים / חלבון, קינטיקה מוות של תאים, התפשטות תאים, ופיתוח פונקציונליות התא, לאחר חשיפות תרמיות שונות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5796-500ML</td>
			<td>Add (2)-(4) before use. Warm in 37&#176;C water bath before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955-100ML</td>
			<td>Containing 10000 units penicillin, 10 mg streptomycin and 25 &#956;g Amphotericin B in 1ml. Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8636-100ML</td>
			<td>Add 5.5 ml in 500 ml medium bottle (1) before use (final concentration: 1 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12736C-500ML</td>
			<td>Add 50 ml in 500 ml medium bottole (1) before use (final: 10%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin from porcine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4799-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>ED-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human VEGF Quantikine ELISA Kit</td>
			<td>R&#38;D System</td>
			<td>DVE00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxiselect Total Glutathione Assay Kit</td>
			<td>Cell Biolabs, Inc</td>
			<td>STA-312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apoptotic/Necrotic/Healthy Cells Detection Kit</td>
			<td>PromoKine</td>
			<td>PK-CA707-30018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thulium laser</td>
			<td>Starmedtec GmbH</td>
			<td>Prototype</td>
			<td>0-20 W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>365 mm core diameter fiber</td>
			<td>LASER COMPONENTS Germany</td>
			<td>CF01493-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocouple</td>
			<td>Omega Engineering Inc</td>
			<td>HYP-0- 33-1-T-G-60-SMPW-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating plate</td>
			<td>MEDAX</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader (spectrofluorometer)</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td>Spectramax M4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell homogenizer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>TissueLyser LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mathematical software program</td>
			<td>The Mathworks. Inc</td>
			<td>MATLAB Release 2015b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>system-design platform</td>
			<td>National Instrument</td>
			<td>Labview</td>
			<td>Laboratory Virtual Instrument Engineering Workbench</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

continuous-wave thulium laser for heating cultured cells to investigate cellular thermal effects

שיטה מקורית לחמם תאים בתרבית באמצעות 1.94 מיקרומטר גל רציף גל tholium להערכה ביולוגית הוא הציג כאן. קרינת לייזר תוליום נקלט מאוד על ידי מים, ואת התאים בחלק התחתון של צלחת התרבות מחוממים באמצעות דיפוזיה תרמית. סיבי לייזר עם קוטר של 365 מיקרומטר מוגדר כ 12 ס&quot;מ מעל צלחת התרבות, ללא כל אופטיקה, כך קוטר קרן הלייזר הוא כמעט שווה את הקוטר הפנימי של צלחת תרבות (30 מ&quot;מ). על ידי שמירה על כמות עקבית של המדיום תרבות בכל ניסוי, אפשר להקרין את התאים עם עלייה בטמפרטורה לשחזור מאוד. כדי לכייל את עליית הטמפרטורה ואת התפוצה שלה בצלחת אחת התא התרבות עבור כל הגדרה כוח, הטמפרטורה נמדדה במהלך 10 s של הקרנה בעמדות שונות ברמה התאית. חלוקת הטמפרטורה יוצגה באמצעות תוכנת גרפיקה מתמטיתתוכנית, ואת התבנית שלה על פני צלחת התרבות היה טופס גאוס. לאחר הקרנת לייזר, ניסויים ביולוגיים שונים יכולים להתבצע על מנת להעריך תגובות תא תלוי טמפרטורה. בכתב היד הזה, מכתים הכדאיות ( כלומר, הבחנה בין תאים חיים, אפופטוטיים, מתים) הוא הציג כדי לסייע לקבוע את טמפרטורות הסף אפופטוזיס התא ומוות לאחר נקודות שונות בזמן. היתרונות של שיטה זו הם דיוק של הטמפרטורה ואת הזמן של חימום, כמו גם יעילות גבוהה שלה תאים חימום בתא שלם תרבות התא. יתר על כן, הוא מאפשר ללמוד עם מגוון רחב של טמפרטורות ומשך זמן, אשר יכול להיות נשלט היטב על ידי מערכת הפעלה ממוחשבת.

חלוקת טמפרטורה לאחר הגדרות צריכת חשמל שונות כל ההתפתחויות טמפרטורה עבור כל הקרנה אחת היו פיקוח בכיול הטמפרטורה. מנתונים אלה, הטמפרטורה המקסימלית בנקודה הנמדדת הושגה ומוגדרת כ- T max (° C). כפי שמוצג בתרשים 3A , התוכנית בוצעה בנקודת זמן כאשר צלחת התרבות הונח על צלחת החימום. לאחר 140 &quot;זמן לחימום מראש 1&quot;, אשר היה צורך ארכיון בטמפרטורה בינונית יציבה על 37 מעלות צלזיוס, העטיפה של צלחת התרבות הוסר במהלך 8 &quot;זמן חימום מראש 2.&quot; בסוף &quot;זמן חימום מראש 2&quot;, פליטת לייזר החלה באופן אוטומטי. עקומה זו היא התקדמות הטמפרטורה נציג עבור הקרנה 10 של. במהלך ההקרנה, הטמפרטורה עלתה, ומיד לאחר פליטת לייזר היהכבוי, הטמפרטורה החלה לרדת. הטמפרטורה המקסימלית במרכז צלחת התרבות הוגדרה במחקר זה כ T מקס (C °). מקס T היה יחסי כוח לייזר ( איור 3 ב ). איור 3C מציג את התפלגות הטמפרטורה המקסימלית עבור כל כוח על פני צלחת התרבות. ההפצות הן בצורת פעמון, כפי שמוצג באיור 3 ג , ומתאימות לתפקוד גאוס על פי הנוסחה הבאה: T (r) = בסיס t + A · <img alt="משוואה" src="/files/ftp_upload/54326/54326eq1.jpg" /> כאשר r, t בסיס , A, ו w לעמוד במרחק מהמרכז (מ&quot;מ), הטמפרטורה הנמוכה ביותר עבור העקומה, משרעת, ואת רוחב העקום, בהתאמה. הפרמטרים (t הבסיס , A, ו- w) של G מצוידעקומה אווסית עבור כל הגדרה כוח, כלומר עבור כל T מקס , מוצגים בטבלה ליד התרשים. <img alt="איור 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54326/54326fig3.jpg" /> איור 3: נתוני כיול טמפרטורה. טמפרטורת התפתחות נציג בעמדה המרכזית לאחר הקרנה יחידה ב -4.9 W (T max = 43 ° C) ( A ), היחס היחסי בין כוח הלייזר לבין Maximal ΔT במיקום המרכזי של תרבות תאים ( B ), ו חלוקת טמפרטורות מעבר לצלחת תרבות לאחר הגדרות כוח שונות (C). (א) התוכנית מבוצעת מנקודת הזמן שבה צלחת התרבות ממוקמת על צלחת החימום. לאחר 140 של &quot;זמן חימום מראש 1&quot;, אשר נדרש ארכיון טמפרטורה בינונית יציבה על 37 מעלות צלזיוס, את הכיסוי של צלחת תרבות מוסר עבור 8-S &quot;זמן חימום מראש2. &quot;בסוף&quot; חימום טרום זמן 2 &quot;, פליטת הלייזר מתחילה באופן אוטומטי, עקומה זו היא התקדמות טמפרטורת נציג במיקום המרכזי במהלך קרינה של 10 שניות ב 4.9 W. במהלך ההקרנה, הטמפרטורה עולה, מיד לאחר פליטת הלייזר מכובה, הטמפרטורה מתחילה לרדת, הטמפרטורה המקסימלית מתקבלת בסוף ההקרנה, המוגדרת במחקר זה כ T מקס (° C). (ב) כוח הלייזר ואת מקסימלית (ΔT max ) הם פרופורציונליים (ג) הפונקציות הגאוסיות המותאמות של התפלגות הטמפרטורה הנמדדת על פני צלחת התרבות הפרמטרים של הפונקציות, שנקבעו עם תוכנה מתמטית, מוצגים בטבלה שבצד התרשים <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54326/54326fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> הכדאיות התא לאחר הקרנה תרמית כפי שמוצג בתרשים 4A , ישנם שלושה דפוסים שונים מכתים המציין כדאיות התא לאחר הקרנת לייזר: 1) לא Annexin V / ethidium homodimer III חיובי ( כלומר, רק לחיות), 2) Annexin V חיובי במרכז ( כלומר, כמעט רק אפופטוזיס מוקדם), 3) ethidium homodimer III חיובי במרכז ( כלומר, תאים מתים) מוקף תאים אפופטוטיים על הגבול בין תאים מתים חיים ( איור 4 ב ). גודלו של אזור מת / אפופטוטי הוא בדרך כלל תלוי T מקס ואת זמן שלאחר קרינה עד 48 שעות לאחר הקרנה. לא ניכר שינוי הכדאיות זוהה התרבויות מוקרן עם מקסימום t ≤43 ° C. שינוי אפופטוטי רק ניתן לצפות בנקודת זמן מוקדמת (3 שעות), ואחריו מאוחר<html> מוות של תאים לאחר הקרנה עם מקסימום T = 47 ° C. מוות מוקדם או מוקדם של התא (עד 3 שעות) נמצא בתרבויות מוקרן עם T מקס ≥ 51 ° C (טבלה 1). <img alt="איור 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54326/54326fig4.jpg" /> איור 4: דפוס של מכתים קביעות לאחר הגדרות כוח שונות (א) ותמונה למופת על שפת המתים ואזור אפופטוטי לאחר Irradiations לייזר קטלני (B). (א) שלוש תבניות של מכתים יכול להתרחש, בהתאם לטמפרטורה. (ב) אזור אפופטוטי (FITC-Annexin V חיובי: ירוק) סביב אזור מת (ethidium homodimer III חיובי: אדום). כל התאים חיוביים עבור Hoechst 33342 (כחול), ואת התאים עם גרעינים כחולים הם תאים חיים. התמונה צולמה 24 שעות לאחר הקרנה ב מקסימום 59 מעלות צלסיוס. בר = 100 מיקרומטר./ אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. &quot;Target =&quot; _ blank &quot; <img alt="שולחן 1" src="/files/ftp_upload/54326/54326tbl1.jpg" /> טבלה 1: נספיין V והאידידיום הומידימר 3 תגובות בטמפרטורות שונות ובזמנים שונים. קביעת טמפרטורת הסף למוות התא רדיוס הממוצע של השטח המת (אדום) והאזור האפופטוטי (ירוק) נמדדו והוחלו על הפונקציה גאוס של חלוקת הטמפרטורה כדי לקבוע את הטמפרטורות שיא הסף למוות תאים אפופטוזיס לאחר 10 של הקרנה. על פי ניתוח זה, הטמפרטורות הממוצעות של סף המוות השלמות של התא 3 שעות, 24 שעות ו -48 שעות לאחר ההקרנה היו 54.0 מעלות צלזיוס, 50.9 מעלות צלזיוס ו- 50.1 מעלות צלזיוס, בהתאמה. הטרש הממוצעטמפרטורה ld לשינוי התא אפופטוטיים היו נמוכים יותר על ידי כ 2 - 3 מעלות צלזיוס, עם טמפרטורות סף במשך 3 שעות, 24 שעות ו 48 שעות ב 51.7 מעלות צלזיוס, 48.0 מעלות צלזיוס, ו 47.0 מעלות צלזיוס, בהתאמה ( איור 5 ). <img alt="איור 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/54326/54326fig5.jpg" /> איור 5: טמפרטורות סף אפופטוזיס ומוות Cell. טמפרטורות הסף הממוצעת למוות התא השלילי (חיובי עבור Hoechst 33342, Annexin V, ואת ethidium homodimer III) ועל אפופטוזיס (חיובי רק עבור Hoechst 33342 ו Annexin V) בנקודות זמן שונות לאחר הקרנה, מחושב על ידי התוצאות של מכתים הקרינה מכתים . <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54326/54326fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Continuous-wave Thulium Laser for Heating Cultured Cells to Investigate Cellular Thermal Effects at JoVE.com

Continuous-wave Thulium Laser for Heating Cultured Cells to Investigate Cellular Thermal Effects

הגדרה ניסיונית מקורי לחימום תאים בצלחת תרבות באמצעות 1.94 מיקרומטר גל רציף הקרנת לייזר מוצג כאן. באמצעות שיטה זו, התגובות הביולוגיות של פיגמנט רשתית אפיתל (RPE) תאים לאחר חשיפות תרמיות שונות ניתן לחקור.

רציף גל תוליום לייזר עבור תאים תאים מתורבת לחקור אפקט תרמי נייד

An original method to heat cultured cells using a 1.94 &#181;m continuous-wave thulium laser for biological assessment is introduced here. Thulium laser ...

continuous-wave-thulium-laser-for-heating-cultured-cells-to

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

7.7K Views.  University of Luebeck.  הגדרה ניסיונית מקורי לחימום תאים בצלחת תרבות באמצעות 1.94 מיקרומטר גל רציף הקרנת לייזר מוצג כאן. באמצעות שיטה זו, התגובות הביולוגיות של פיגמנט רשתית אפיתל (RPE) תאים לאחר חשיפות תרמיות שונות ניתן לחקור. 

Video: Continuous-wave Thulium Laser for Heating Cultured Cells to Investigate Cellular Thermal Effects

Studying the Effects of Matrix Stiffness on Cellular Function using Acrylamide-based Hydrogels

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and cardiovascular disease1-11. Traditional cell biological approaches to studying cellular function involve culturing cells on a rigid substratum (plastic dishes or glass coverslips) which cannot account for the effect of an elastic ECM or the variations in ECM stiffness between tissues. To model in vivo tissue compliance conditions in vitro, we and others use ECM-coated hydrogels. In our laboratory, the hydrogels are based on polyacrylamide which can mimic the range of tissue compliances seen biologically12. "Reactive" cover slips are generated by incubation with NaOH followed by addition of 3-APTMS. Glutaraldehyde is used to cross-link the 3-APTMS and the polyacrylamide gel. A solution of acrylamide (AC), bis-acrylamide (Bis-AC) and ammonium persulfate is used for the polymerization of the hydrogel. N-hydroxysuccinimide (NHS) is incorporated into the AC solution to crosslink ECM protein to the hydrogel. Following polymerization of the hydrogel, the gel surface is coated with an ECM protein of choice such as fibronectin, vitronectin, collagen, etc.
The stiffness of a hydrogel can be determined by rheology or atomic force microscopy (AFM) and adjusted by varying the percentage of AC and/or bis-AC in the solution12. In this manner, substratum stiffness can be matched to the stiffness of biological tissues which can also be quantified using rheology or AFM. Cells can then be seeded on these hydrogels and cultured based upon the experimental conditions required. Imaging of the cells and their recovery for molecular analysis is straightforward. For this article, we define soft substrata as those having elastic moduli (E) &lt;3000 Pascal and stiff substrata/tissues as those with E &gt;20,000 Pascal.

The effect of substrata stiffness on cellular function can be modeled in vitro using polyacrylamide hydrogels of varying compliances.

שיחקרו את ההשפעות של מטריקס נוקשות על פונקציה נייד באמצעות Acrylamide מבוססי הידרוג

Tissue stiffness is an important determinant of cellular function, and changes in tissue stiffness are commonly associated with fibrosis, cancer and ...

Adenovirus-mediated Genetic Removal of Signaling Molecules in Cultured Primary Mouse Embryonic Fibroblasts

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction analysis. One particular method to achieve this conditional deletion is via the use of the Cre-loxP system. This method involves flanking the gene of interest with loxP sites, which are specific recognition sequences for the Cre recombinase protein. Exposure of the so-called floxed (flanked by loxP site) DNA to this enzyme results in a Cre-mediated recombination event at the loxP sites, and subsequent excision of the intervening gene3. Several different methods exist to administer Cre recombinase to the site of interest. In this video, we demonstrate the use of an adenovirus containing the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) obtained from embryos containing a floxed Rac1 allele1. Our rationale for selecting Rac1 MEFs for our experiments is that clear morphological changes can be seen upon deletion of Rac1, due to alterations in the actin cytoskeleton2,5. 72 hours following viral transduction and Cre expression, cells were stained using the actin dye phalloidin and imaged using confocal laser scanning microscopy. It was observed that MEFs which had been exposed to the adeno-Cre virus appeared contracted and elongated in morphology compared to uninfected cells, consistent with previous reports2,5. The adenovirus method of Cre recombinase delivery is advantageous as the adeno-Cre virus is easily available, and gene deletion via Cre in nearly 100% of the cells can be achieved with optimized adenoviral infection.

In this video we use an adenovirus carrying the Cre recombinase gene to infect primary mouse embryonic fibroblasts carrying a floxed Rac1 allele.

Adenovirus בתיווך הסרת גנטית של מולקולות איתות ב Cultured Fibroblasts עכבר ראשיים עובריים

The ability to genetically remove specific components of various cell signalling cascades has been an integral tool in modern signal transduction ...

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, normal development or changes in environmental conditions2-5. Understanding the cellular signaling pathways that are involved in the response to hypoxia could provide new insight into treatment strategies for diverse human pathologies, from stroke to cancer. This goal has been impeded, at least in part, by technical difficulties associated with controlled hypoxic exposure in genetically amenable model organisms.
The nematode Caenorhabditis elegans is ideally suited as a model organism for the study of hypoxic response, as it is easy to culture and genetically manipulate. Moreover, it is possible to study cellular responses to specific hypoxic O2 concentrations without confounding effects since C. elegans obtain O2 (and other gasses) by diffusion, as opposed to a facilitated respiratory system6. Factors known to be involved in the response to hypoxia are conserved in C. elegans. The actual response to hypoxia depends on the specific concentration of O2 that is available. In C. elegans, exposure to moderate hypoxia elicits a transcriptional response mediated largely by hif-1, the highly-conserved hypoxia-inducible transcription factor6-9. C .elegans embryos require hif-1 to survive in 5,000-20,000 ppm O27,10. Hypoxia is a general term for "less than normal O2". Normoxia (normal O2) can also be difficult to define. We generally consider room air, which is 210,000 ppm O2 to be normoxia. However, it has been shown that C. elegans has a behavioral preference for O2 concentrations from 5-12% (50,000-120,000 ppm O2)11. In larvae and adults, hif-1 acts to prevent hypoxia-induced diapause in 5,000 ppm O212. However, hif-1 does not play a role in the response to lower concentrations of O2 (anoxia, operational definition &lt;10 ppm O2)13. In anoxia, C. elegans enters into a reversible state of suspended animation in which all microscopically observable activity ceases10. The fact that different physiological responses occur in different conditions highlights the importance of having experimental control over the hypoxic concentration of O2.
Here, we present a method for the construction and implementation of environmental chambers that produce reliable and reproducible hypoxic conditions with defined concentrations of O2. The continual flow method ensures rapid equilibration of the chamber and increases the stability of the system. Additionally, the transparency and accessibility of the chambers allow for direct visualization of animals being exposed to hypoxia. We further demonstrate an effective method of harvesting C. elegans samples rapidly after exposure to hypoxia, which is necessary to observe many of the rapidly-reversed changes that occur in hypoxia10,14. This method provides a basic foundation that can be easily modified for individual laboratory needs, including different model systems and a variety of gasses.

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

This paper details how to use continuous-flow hypoxia chambers to generate atmospheres with defined concentrations of O2 to understand biological responses to decreased O2. This system is easy to setup and maintain, and flexible enough to suit a wide range of O2 concentrations and model systems

יצירת סביבות גזיים מוגדרים כדי לחקור את ההשפעות של היפוקסיה על<em&gt; ג elegans</em

Oxygen is essential for all metazoans to survive, with one known exception1. Decreased O2 availability (hypoxia) can arise during states of disease, ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

הכנת כרומוזום מתאים בתרבית

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized microtubules. Organelles move along these processes by microtubule motors. Easy maintenance, high sensitivity to RNAi-mediated protein knock-down and efficient procedure for creating stable cell lines make Drosophila S2 cells an ideal model system to study cargo transport by live imaging. The results obtained with S2 cells can be further applied to a more physiologically relevant system: axonal transport in primary neurons cultured from dissociated Drosophila embryos. Cultured neurons grow long neurites filled with bundled microtubules, very similar to S2 processes. Like in S2 cells, organelles in cultured neurons can be visualized by either organelle-specific fluorescent dyes or by using fluorescent organelle markers encoded by DNA injected into early embryos or expressed in transgenic flies. Therefore, organelle transport can be easily recorded in neurons cultured on glass coverslips using living imaging. Here we describe procedures for culturing and visualizing cargo transport in Drosophila S2 cells and primary neurons. We believe that these protocols make both systems accessible for labs studying cargo transport.

Organelle Transport in Cultured Drosophila Cells: S2 Cell Line and Primary Neurons.

Drosophila S2 cells and cultured neurons are great systems for imaging of motor-driven organelle transport in vivo. Here we describe detailed protocols for culturing both cell types, their imaging and analysis of transport.

אברון תחבורה בתרבית<em&gt; דרוזופילה</em&gt; תאים: תא קו S2 ויסודי נוירונים.

Drosophila S2 cells plated on a coverslip in the presence of any actin-depolymerizing drug form long unbranched processes filled with uniformly polarized ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

הקרנת siRNA לזיהוי יוביקוויטין ורגולטורים מערכת דמויות יוביקוויטין של מסלולים ביולוגיים בתאי יונקים בתרבית

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

כימות של דביקות תא האנדותל<em&gt; במבחנה</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects on the lifespan across species. However, the molecular causes of aging and death remain elusive. To gain a systematic understanding of the molecular mechanisms underlying yeast aging, we need high-throughput methods to measure lifespan and to quantify various cellular and molecular phenotypes in single cells. Previously, we developed microfluidic devices to track budding yeast mother cells throughout their lifespan while flushing away newborn daughter cells. This article presents a method for preparing microfluidic chips and for setting up microfluidic experiments. Multiple channels can be used to simultaneously track cells under different conditions or from different yeast strains. A typical setup can track hundreds of cells per channel and allow for high-resolution microscope imaging throughout the lifespan of the cells. Our method also allows detailed characterization of the lifespan, molecular markers, cell morphology, and the cell cycle dynamics of single cells. In addition, our microfluidic device is able to trap a significant amount of fresh mother cells that can be identified by downstream image analysis, making it possible to measure the lifespan with higher accuracy.

This article presents a protocol optimized for the production of microfluidic chips and the setup of microfluidic experiments to measure the lifespan and cellular phenotypes of single yeast cells.

באמצעות מכשירים microfluidic למדוד פנוטיפים תוחלת החיים סלולר בתאי שמרים ניצני יחיד

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

רציף גל תוליום לייזר עבור תאים תאים מתורבת לחקור אפקט תרמי נייד

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video