We thank Timothy F. Sharbel (IPK Gatersleben) for providing Boechera divaricarpa seeds and Sharon Kessler (University of Oklahoma) for critical reading and proofreading. Work on cell type-specific transcriptome analyses to study gametophyte development and apomixis in UG&#180;s laboratory is supported by the University of Z&#252;rich, by a fellowship of the "Deutsche Forschungsgemeinschaft" and the Marie Curie project IDEAGENA to AS, by grants from the "Staatssekretariat f&#252;r Bildung und Forschung" in the framework of COST action FA0903 (to UG and AS) and the Swiss National Foundation (to UG).

<ol>
	<li>Maheshwari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> An Introduction to the Embryology of Angiosperms. , (1950).</li><li>Willemse, M. T. M., Van Went, J. L., Johri, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+female+gametophyte.">The female gametophyte.</a> Embryology of Angiosperms. , 159-196 (1984).</li><li>Koltunow, A. M., Bicknell, R. A., Chaudhury, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apomixis:+Molecular+strategies+for+the+generation+of+genetically+identical+seeds+without+fertilization.">Apomixis: Molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilization.</a> Plant Physiol. 108, 1345-1352 (1995).</li><li>Vielle-Calzada, J. P., Crane, C., Stelly, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apomixis+-+the+asexual+revolution.">Apomixis - the asexual revolution.</a> Science. 274, 1322-1323 (1996).</li><li>Grossniklaus, U., Koltunow, A., van Lookeren Campagne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+future+for+apomixis.">A bright future for apomixis.</a> Trends Plant Sci. 3, 415-416 (1998).</li><li>Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+germline+formation:+molecular+insights+define+common+concepts+and+illustrate+developmental+flexibility+in+apomictic+and+sexual+reproduction.">Plant germline formation: molecular insights define common concepts and illustrate developmental flexibility in apomictic and sexual reproduction.</a> Development. 142, 229-241 (2015).</li><li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apomictic+and+sexual+germline+development+differ+with+respect+to+cell+cycle,+transcriptional,+hormonal+and+epigenetic+regulation.">Apomictic and sexual germline development differ with respect to cell cycle, transcriptional, hormonal and epigenetic regulation.</a> PLOS GENET. 10, e1004476 (2014).</li><li>Okada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enlarging+cells+initiating+apomixis+in+Hieractium+praealtum+transition+to+an+embryo+sac+program+prior+to+entering+mitosis.">Enlarging cells initiating apomixis in Hieractium praealtum transition to an embryo sac program prior to entering mitosis.</a> Plant Physiol. 163, 216-231 (2013).</li><li>Wuest, S. E., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-assisted+microdissection+applied+to+floral+tissues.">Laser-assisted microdissection applied to floral tissues.</a> Methods Mol Biol. 1110, 329-344 (2014).</li><li>Wuest, S. E., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+expression+profiling+of+rare+cell+types+as+exemplified+by+its+impact+on+our+understanding+of+female+gametophyte+development.">Cell-specific expression profiling of rare cell types as exemplified by its impact on our understanding of female gametophyte development.</a> Curr Opin Plant Biol. 16 (1), 41-49 (2013).</li><li>Wuest, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+female+gametophyte+gene+expression+map+reveals+similarities+between+plant+and+animal+gametes.">Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes.</a> Curr Biol. 20, 1-7 (2010).</li><li>Cai, S., Lashbrook, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+plant+cells+from+tape-transferred+paraffin+sections+promotes+recovery+of+structurally+intact+RNA+for+global+gene+profiling.">Laser capture microdissection of plant cells from tape-transferred paraffin sections promotes recovery of structurally intact RNA for global gene profiling.</a> Plant J. 48 (4), 628-637 (2006).</li><li>Schmidt, A., Wuest, S. E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+the+Arabidopsis+megaspore+mother+cell+uncovers+the+importance+of+RNA+helicases+for+plant+germ+line+development.">Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development.</a> PLOS BIOL. 9, e1001155 (2011).</li><li>Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. C., Barann, M., Rosenstiel, P., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+powerful+method+for+transcriptional+profiling+of+specific+cell+types+in+eukaryotes:+laser-assisted+microdissection+and+RNA+sequencing.">A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing.</a> PLOS ONE. 7, e29685 (2012).</li><li>Mau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+apomicts+trapped+in+the+ecological+niches+of+their+sexual+ancestors.">Hybrid apomicts trapped in the ecological niches of their sexual ancestors.</a> Proc Natl Acad Sci.U S A. 112 (18), 2357-2365 (2015).</li><li>Aliyu, O. M., Seifert, M., Corral, J. M., Fuchs, J., Sharbel, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+variation+in+transcriptionally+active+regions+of+sexual+and+apomictic+Boechera.+demonstrates+independently+derived+apomictic+lineages.">Copy number variation in transcriptionally active regions of sexual and apomictic Boechera. demonstrates independently derived apomictic lineages.</a> Plant Cell. 25 (10), 3808-3823 (2013).</li><li>Corral, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+apomixis-specific+polymorphism+is+correlated+with+exclusive+exonuclease+expression+in+premeiotic+ovules+of+apomictic+boechera+species.">A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species.</a> Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).</li><li>Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Arabidopsis+thaliana.+phloem+RNAs+provides+a+search+criterion+for+phloem-based+transcripts+hidden+in+complex+datasets+of+microarray+experiments.">Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments.</a> Plant J. 55, 746-775 (2008).</li><li>Schmid, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana. , 40-104 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

הפרוטוקול הוא מתאים תאים שונים וסוגי רקמות LAM בשילוב עם transcriptome מנתח ידי microarrays או RNA-seq היא כלי רב ערך כדי לקבל תובנות לתוך דפוסים מסוימים של פעילות גנים ויסות תהליכים התפתחותיים או פיזיולוגיים 7-11,13,14. עם זאת, את התאמתו של שיטה זו עבור כל סוג תא נתון תלויה באופן מכריע בעיות מבניות. התא צריך להיות ברור לעין וקלה לזיהוי חד משמעי בסעיפים היבשים המשמשים LAM. בשנת Boechera divaricarpa, את המורפולוגיה של גמטופיט מאפשר זיהוי קל של תא הביצית (איור 2, איור 3). בסופו של הדבר, את המהירות של בידוד של אוכלוסיית תא ספציפית גם תלויה בתדירות שבה בסוג התא ניתן למצוא בשקופית אחת, כמו החלפת שקופיות וסריקת שקופיות חדשות צעדים גוזלים זמן. בהתחשב בכך תלוי בסוג התא, לפחות 200 - כת תא 250יונים צריכים להיות ונקוו לדגימה, התאמתו של השיטה עבור מערך מחקר מסוים תלויה במידה רבה על דרישות הזמן לצעד LAM. בנוסף, תלוי את המורפולוגיה של הרקמה, זה יכול להיות יתרון מבחינת מבנה כדי להפחית את העובי של החלקים עד 6 מיקרומטר. באופן דומה, ממקטעים עבים של אידיאלי ≥ 8 מיקרומטר בדרך כלל לגרום כמות RNA גבוהה ו- RNA של איכות גבוהה במקצת מאותה הכמות של סעיפי רקמות. בנוסף, התאים של עניין צריכים לפחות בקוטר של 8 - 10 מיקרומטר לעשות בידוד LAM הריאלי. באופן עקרוני, הפרוטוקול המתואר כאן יכול להיות מותאם סוגי תאים ורקמות שונים ממינים קרובים רחוק. עם זאת, איכות RNA יכול להשתנות אפילו בין תאים מסוגים שונים מאותו המין 7,10,13. פרוטוקול זה הותאם מבוסס על סוגי תאים קטנים קריטיים. לכן, זה יכול להיות מיושם כעת על broadeמגוון r של דגימות ללא התאמות נוספות. שינויים קלים של הפרוטוקול אולי בכל זאת יידרשו, תלוי בסוג תא מינים תחת חקירה. מומלץ הראשון להשתמש בשני fixatives החלופי (ראה פרוטוקול 1.1) בעת הגדרת שיטת זן חדש או סוג תא בחינה השוואתית של מורפולוגיה ואיכות RNA. בעיקרון, פרוטוקול יכול להיות מותאם והופיע עם כלי נגינה שונים מתאים microdissection לייזר 9. עם זאת, צריך לציין כי הכלים להשתנות הן כוח לייזר ואת רוחב מינימלי של קרן לייזר כי יכול להיות מיושם, כמו גם את הטכנולוגיה של הדגימה. במיוחד עבור הבידוד של תאים קטנים באזורי רקמות, לייזרים וכתוצאה מכך נתיב ליזר צר מתאימים יותר. קרן הלייזר של המכשיר אנו משתמשים הוא די בסדר (~ 1 מיקרומטר רחב) ומאפשר דיסקציה של תאים קטנים. טכנולוגית הדגימה של איסוף cells על משטח כובע דביק על ידי הדבקת אלקטרוסטטית יתרון במיוחד עבור סוגי תאים קטנים ובידוד סעיפי תא בודדים. זו מקטינה את הסיכון של אובדן מדגם ידי השפעות אלקטרוסטטי. איכות RNA המתקבל היא חשובה עבור ניתוח נוסף תעתיק אחת הנקודות הקריטיות ביותר עבור הכנת ספרייה מוצלחת-Seq RNA הוא איכות RNA. בעוד ספקים כמה ערכות הגברת אופטימיזציה הטכנולוגיה שלהם עבור RNA של שלמות אפילו נמוכה, איכות הנתונים שהתקבלו לאחר ניתוח transcriptome על ידי אחד microarrays או RNA-seq בדרך כלל עולה עם איכות RNA הקלט. שימוש בפרוטוקול הקימו פה, טוב מאוד לשחזור איכות RNA לשלבים התפתחותיים שונים של רקמות הרבייה הנשית ואת germline ב ארבידופסיס Boechera הושג (למשל, איור 4). בעוד השיטה ישימהגם עבור מינים יותר קרובים רחוק (למשל, עגבניות, לא פורסם), זה צריך להילקח בחשבון כי אופטימיזציות או שינויים קטנים עשויה להידרש בהתאם למין, סוג הרקמה, ואף סביבת המעבדה כמו, למשל, לחות גבוהה אולי להתפשר על היושרה RNA במהלך הכנת שקופיות LAM. שלב קריטי במהלך הפרוטוקול הוא ההרכבה של פסי שעווה המחולקים המכילים דגימות על השקופיות. כאן, בפרט הקשר למים הוא שלב קריטי. תוך החלפת מים על ידי EtOH לא תביא לשום שיפור משמעותי של שלמות RNA לאחר בידוד (לא פורסם), החלפת מים על ידי מתנול עושה. עם זאת, מתנול צריכים להיות מטופלים רק מתחת למכסה המנוע כימי בזהירות רבה. בהתאם לסוג המדגם, כחלופה לשימוש במתנול, פעמי הייבוש לאחר הרכבה עם מים, ניתן להפחית עד ~ 2 שעות (ראה 3.3.3.1), וכתוצאה מכך איכות RNA טובה באותה מידה.ביצוע בדיקה כדי לבדוק את איכות RNA מושגת על ידי הרכבה או על מים או מתנול עבור סוג התא ומינים של עניין מומלץ בתחילת פרויקט חדש. LAM היא טכנולוגיה רב עוצמה עבור ניתוח תעתיק לסיכום, יש לנו מותאם בהצלחה ויישם את השילוב של LAM וניתוח transcriptome סוג תא ספציפי על ידי microarrays ו- RNA-Seq לתאים שונים של השושלת germline מינית apomictic ב thaliana ארבידופסיס וב spp Boechera., ובכך מאפשר ניתוחים תעתיק השוואתי (ראה גם איור 5) 7,11,13,14. השיטה המתוארת נושאה מספר היתרונות לעומת טכנולוגיות אחרות המאפשרות ניתוח תעתיק סוג תא ספציפי. חשוב לציין, תלוי מזהים של סוגי תאים או רקמות של עניין בסעיף, זה יכול להיות מיושם על סוגי תאים נדירים של שני מודלומינים שאינם מודל, כגון תאי גמטופיט הנקבה הבוגר Boechera spp., או שזה יכול גם לשמש כדי לבודד תחומים הסלולר, למשל, חצי קוטב של תאים 19. יישומים דומים לא יהיו אפשריים עם שיטות אחרות המבוססות על מיון מופעל ניאון של תאים או גרעינים (FACS / FANS) 10. החיסרון העיקרי של השיטה הוא הדרישה בעניין הזמן. בעוד קיבעון והטבעה ואינה דורשת להאריך הידיים על הזמן והוא יכול היה לעשות בו זמנית עבור כמות גדולה של פרחים, LAM וככזה הוא זמן רב מאוד, לניתוח סוג תא ספציפי, בדרך כלל 3 ימים עד 3 שבועות של LAM (ב -5 שעות בממוצע ליום ב המיקרוסקופ הליזר) צריך להיות מתוכנן. מבחינה זו, כדאי לעשות קצת בדיקות טרום עבור המהירות של בידוד של תאים מהסוג הספציפי המכוון לעצב המחקר כראוי. בנוסף, גם בעת שימוש בפרוטוקול אופטימיזציה זו, ניסויים כדי לבדוק את איכות RNA הם מאוד מחדשמְקוּלָס. לסיכום, LAM הוא כלי רב עצמה עבור ניתוח התעתיק ברזולוציה של סוגי תאים בודדים או אפילו תחומי משנה של תאים, אשר לא ניתן להשיג באמצעות שיטות קיימות חלופיות. מבחינה זו, היא נושאת פוטנציאל אדיר כדי לאפשר ניתוחים, למשל, של תהליכים התפתחותיים, עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה מאוד. זה בא לידי ביטוי על ידי הניתוחים של transcriptomes של תאים בכלל השלבים העיקריים של רבייה מינית apomictic ב ארבידופסיס Boechera 7,11,13,14.

במחקרי תעתיק נעשו ברמת הרקמה, transcriptomes של סוגי תאים מיוחדים אבל נדירים מאוד לעתים קרובות הם רעול פנים על ידי התאים שמסביב שופעים יותר. דוגמא עבור תאים מסוגים אלה מאוד מיוחדים הם התאים של שושלת הרבייה הנשית (germline) בצמחים. Germline הנקבה המצוין בתוך ביציות מתפתחות, המבשרים של זרעים בתוך gynoecium של 1,2 הפרח. תא אמא megaspore (MMC) הוא התא הראשון של germline הנשי. זה עובר המיוזה לגבש הטטרדה של megaspores מופחת. בדרך כלל, רק אחד megaspores אלה שורד ומחלק mitotically ללא cytokinesis, כלומר, בתוך syncytium. mitoses אלה ואחריו cellularization כדי ליצור את גמטופיט הבוגרת, אשר בדרך כלל מורכב מארבעה סוגי תאים: שלושה antipodals, שני תאים synergid, ביצה, והתא המרכזי. תאי הביצה ומרכזיים הם הגמטות נקבה כי לקבל מופרת על ידי שני תאי זרע במהלך douהפריה ble כדי להצמיח את העובר ואת האנדוספרם של 1,2 הזרע המתפתח. ב thaliana ארבידופסיס מערכת מודל המיני, רק ~ 50 זרעים לפתח לכל פרח בעוד כ -50 - 80 זרעים לפתח לכל פרח הסוג הקשור קשר ההדוק Boechera. לפיכך, germline הנשי מורכב רק כמה מאוד סוגי תאים מיוחדים, מה שהופך אותו מודל מצוין ללמוד תהליכים התפתחותיים, כגון תא מפרט והבחנה. יתר על כן, תובנה התהליכים רגולטוריים גן מסדירי רביית צמח יכולות להיות בעל ערך שימושי. בצמחים, הוא רבייה מינית מינית באמצעות זרעים (apomixis) יכולה להתרחש. בעוד רבייה מינית מייצר מגוון גנטי באוכלוסייה, apomixis מוביל להיווצרות של צאצא משובט זהה גנטי לצמח האם. לכן, apomixis יש פוטנציאל גדול עבור יישומי חקלאות וייצור זרע, כמו גנוטיפים אימהי מורכב אפילו יכוללהישמר ללא שינוי במשך כמה דורות 3,4,5. בגלל apomixis אינו מתרחש באופן טבעי בכל מיני יבול עיקריים, ההנדסה של apomixis בגידולים הוא של 3,4,5 עניין רב. עם זאת, המטרה ארוך הטווח הזה קשה להשיג כי הבסיס הגנטי ואת המולקולריים שבבסיס של apomixis אינו מובן בפירוט מספיק 6. כדי לקבל תובנות לתוך הבסיס תעתיק המסדירים רבייה apomictic, פרופיל תעתיק סוג תא ספציפי באמצעות microdissection לייזר בסיוע (LAM) וסדר הדור הבא (NGS) מייצג גישה מאוד חזק 7,8. LAM הוקם הראשון עבור בעלי חיים המחקר הביו-רפואי. בשנים האחרונות LAM גם יושם לביולוגיה צמח 6,9,10. בניגוד לשיטות אחרות המאפשרות אפיון של סוגי תאים ורקמות פרט, LAM אינו מחייב את הדור של קווי סמן 6,9,10. לכן, זה יכול להיות אפליקציהשייקר סוג תא או רקמה שהיא ללא ידע מולקולרי מוקדם. יתרון נוסף של LAM הוא שזה יכול להיות מיושם על כל סוג תא כל עוד התא ניתן להכיר בסעיפים יבשים על בסיס מיקום ו / או תכונות מבניות. יש LAM יתרון הנוסף רקמות קבועות משמשות, אשר מונע שינויים של פרופיל התעתיק במהלך עיבוד. הרקמה של עניין, למשל, רקמת פרחים, הוא קבוע מקבע הלא crosslinking לפני הטבעה ב פרפין. שיבוץ שעוות פרפין ניתן לעשות זאת באופן ידני, לאחר פרוטוקולים הוקמו 9,11. עם זאת, השימוש של מעבד רקמות אוטומטי התייבשות וחדירה עם השעווה בדרך כלל תוצאות שחזור גבוה במונחים של שימור איכות RNA ומורפולוגיה רקמות. האסטרטגיה החלופית הטבעת רקמות שרף גם שמשה בהצלחה עבור ניתוחי סוג תא ספציפי על ידי LAM 8. עם זאת, השימוש של automמעבד רקמות ated מוטבע שעווה מאוד זמן יעיל, כפי שניתן לעבד דגימות רבות בבת אחת המחייב מינימום של הידיים על הזמן. בעוד בדרך כלל ללא אובדן משמעותי של איכות RNA מתרחש במהלך קיבעון והטבעה, הכנת חלקים דקים עם microtome ו, בפרט, גוברת על frameslides המשמש LAM נשארה צעד קריטי לשמירה על איכות RNA. זה כבר ציין בעבר ושימוש מערכת העברת קלטת תואר לגרום איכות RNA טובה יותר בשלב זה 12. עם זאת, זה מוסיף נדבך נוסף גוזל זמן במהלך תקופת ההכנה של השקופיות וגם דורש ציוד מיוחד. פרוטוקול אופטימיזציה המתואר להלן reproducibly מייצרת RNA כי הוא באיכות מספקת עבור פרופיל תעתיק עם GeneCHIPs ואת הדור הבא הרצף (NGS) מתקרב 7,11,13,14. בנוסף, עם מיקרוסקופ microdissection הליזר המשמש, טוהר גבוה של סוגי התאים המבודדים היא תבוסהinely מיוצר 7,11,13,14. סוג Boechera היא מערכת מודל מצוינת לחקר השלבים העיקריים של רביית apomictic. בשנת Boechera, מגוון של הצטרפויות מיניות apomictic שונים זוהה וניתן להשתמש בו עבור השוואתי מנתח 15,16,17. בהשוואת transcriptomes סוג תא ספציפי של תאים מן germline נקבה מן ארבידופסיס מינית apomictic Boechera, זיהינו גנים ושבילים באים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי, ובכך לזהות היבטים חדשים של תהליכים רגולטוריים המסדירים apomixis 7. בנוסף, מחקר זה אימת את התאמתו של LAM עבור תעתיק סוג תא ספציפי מנתח של סוגי תאים קטנים ונדירים. אנחנו כבר השתמשנו בפרוטוקול זה לניתוח של תאים מסוגים שונים במגוון של מיני צמחים, אבל מינים ושינויים ספציפי רקמות לפרוטוקול עשויים להידרש במקרים מסוימים.

<table><tbody><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>1,009,861,000</td><td>absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP</td></tr><tr><td>15 ml falcon centrifuge tubes</td><td>VWR</td><td>62406-200</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Acid</td><td>Applichem</td><td>A3686,2500</td><td>100% Molecular biology grade</td></tr><tr><td>Ambion Nuclease free water</td><td>life technologies</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>ASP200 S</td><td>Leica</td><td>14048043624</td><td>tissue processor&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>black cardboard</td><td></td><td></td><td>can be purchased in special paper shops</td></tr><tr><td>DNA- and RNAse-free Frame Slides</td><td>Micro Dissect GmbH</td><td></td><td>1, 4 &amp;micro;m PET-membrane; can also be purchased from Leica</td></tr><tr><td>Dumond Forceps</td><td>Actimed</td><td>0208-5SPSF-PS</td><td></td></tr><tr><td>ethanol lamp</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>exsiccator</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z354074-1EA</td><td>Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment</td></tr><tr><td>filter tips 10&amp;nbsp;&amp;micro;l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60010</td><td>can be replaced by similar tips</td></tr><tr><td>filter tips 1,000&amp;nbsp;&amp;micro;l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60010</td><td>can be replaced by similar tips</td></tr><tr><td>filter tips 20&amp;nbsp;&amp;micro;l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60020</td><td>can be replaced by similar tips</td></tr><tr><td>filter tips 200&amp;nbsp;&amp;micro;l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60200</td><td>can be replaced by similar tips</td></tr><tr><td>forceps precision</td><td>VWE</td><td>232-1221</td><td></td></tr><tr><td>glass slide holder</td><td>Huber &amp;amp; Co.AG</td><td>10.0540.01</td><td>F&amp;auml;rbek&amp;auml;sten nach Hellendahl</td></tr><tr><td>glass staining trough</td><td>Huber &amp;amp; Co.AG</td><td>10.0570.01</td><td>F&amp;auml;rbekasten</td></tr><tr><td>Heated Paraffin Embedding Module Leica</td><td>Leica</td><td>Leica EG 1150 H</td><td>blocking station, similar devises are suitable</td></tr><tr><td>Heating and Drying Table</td><td>Medax</td><td>15501</td><td>other models and/or suppliers are suitable</td></tr><tr><td>ice bucket</td><td>VWR ice bucket with lid&amp;nbsp;</td><td>10146-184</td><td>similar buckets equally suitable</td></tr><tr><td>light table</td><td>UVP An Analytical Jena Company</td><td>TW-26&amp;nbsp;</td><td>white light transluminator</td></tr><tr><td>microscope slide</td><td>Thermo Scientific</td><td>10143562CE</td><td>cut edges</td></tr><tr><td>microtome blade</td><td>Thermo Scientific</td><td>FEAHS35</td><td>S35 microtome blade disposable</td></tr><tr><td>MMI Cell Cut Plus Instrument</td><td>MMI (Molecular Machines and Industries)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2 ml</td><td>life technologies</td><td>AM12475</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast X-TRA</td><td>Roth</td><td>X882.2</td><td>for histology</td></tr><tr><td>PicoPure RNA Isolation Kit</td><td>life technologies</td><td>KIT0204</td><td>Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit</td></tr><tr><td>plastic balancing trays</td><td>Semadeni AG</td><td>2513</td><td></td></tr><tr><td>plastic box</td><td>Semadeni AG</td><td>2971</td><td>Plastikdose PS</td></tr><tr><td>plastic lid for heating plate</td><td></td><td></td><td>homemade</td></tr><tr><td>preparation needle</td><td>VWR</td><td>631-7159</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Pico Kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>RNAse free microfuge tubes</td><td>life technologies</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>RNAse ZAP Decontamination Solution</td><td>life technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Semi-automated Rotary Microtome&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td>RM2245</td><td>similar devices are equally suitable</td></tr><tr><td>Tissue Loc Histo Screen Cassettes</td><td>Thermo Scientific</td><td>C-1000_AQ</td><td>similar cassettes of other suppliers are suitable</td></tr><tr><td>Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 &amp;micro;l&amp;nbsp;</td><td>MMI (Molecular Machines and Industries)</td><td>50204</td><td></td></tr><tr><td>Xylol (Isomere) ROTIPURAN</td><td>VWR</td><td>4436.2</td><td>min. 99%, p.a., ACS, ISO SP</td></tr><tr><td>process embedding cassettes</td><td>Leica</td><td>14039440000</td><td>Leica Jet Cassette I without lid</td></tr><tr><td>Universal Oven</td><td>Memmert</td><td>UF55</td><td>other models and/or suppliers are suitable</td></tr></tbody></table>

laser-assisted microdissection (lam) as a tool for transcriptional profiling of individual cell types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

הכנת המדגם LAM נעשים צעדים עוקבים מספר צעדים רצופים נדרשים להכין RNA לניתוח תעתיק סוגי תאים שנבחרו על ידי LAM (איור 1). זה מתחיל עם הקציר של פרחי קיבעון מיידי על מנת להבטיח כי אוכלוסיית RNA נותרת ללא שינוי לאחר קציר. הרקמה מוטבעת, מחולק, רכובה על שקופיות. זה מאפשר הבידוד של התאים על ידי LAM ואת איגום סעיפי סוג תא ספציפי על כובעים אחד או כמה (איור 1). החומר יכול להיות קפוא לאחר מכן או מעובד באופן ישיר על ידי מיצוי RNA. מלבד היתרון של LAM יהיה ישים עבור סוג תא ספציפי המנתח בשני מיני המודל והלא-מודל, השיטה נשארת זולל-הזמן. לפחות שבוע של זמן עבודה, לפעמים יותר, נדרש עבור הצעדים מן tiקציר ssue כדי מיצוי RNA (איור 1). זה צריך להילקח בחשבון כי לעתים קרובות חלקים שנקטפו על פני כמה ימים של LAM הם אספו במדגם והפקת RNA אחד ביולוגית. עבור תאי ביצת Boechera, השימוש לפחות ~ 200 סעיפים לדגימה מומלץ מאוד, עם עד ~ 100 חלקים מבודדים ליום. בידוד של סוגי התאים של ריבית תלוי הראות שלהם בסעיפים יבשים בידוד של סעיפי סוג התא ספציפי הוא הצעד הכי הזמן רב של הפרוטוקול. עד כה, לא אוטומציה של שלב זה פותחה בשל האופי המורכב של דגימות. זיהוי של התאים בעלי עניין באמצעות כלי תוכנה הוא לא ריאלי, כי הסעיפים היבשים יש ניגודיות נמוכה ומטוס הסעיף משתנה בין הדגימות בשל העובדה כי ביציות מכוונות בזוויות שונות within הרקמה (איור 2). אף על פי כן, המורפולוגיה הייחודית של גמטופיט הנקבה הבוגר עם synergids, תא ביצית, והתא המרכזי (תאים נגדיים להידרדר לפני ההפריה) מאפשרת זיהוי חד המשמעי של תאי ביצה על ידי החוקר (התרשים 2B, C; איור 3). ואכן, Boechera divaricarpa, תא הביצה לעתים קרובות מתכווץ קצת במהלך הכנה ובכך מפריד בין הרקמות הסובבות, תכונת יתרון עבור הבידוד של אוכלוסיות תאי ביצת טוהר גבוה (איור 2 ב, ג; איור 3). בדיקה ויזואלית של השווי לאחר LAM מומלץ בדיקה ויזואלית של פני שטח הכובע אחרי LAM מאפשרת זיהוי של כל זיהומים אפשריים של המדגם, למשל, על ידי אבק. בנוסף, כדאי לוודא כי sections מקל על הכובע, כמו מדי פעם קטעים לאיבוד במהלך ההליך. בדרך כלל, רבי קטעים נבחרים, למשל, תאי ביצה, ניתן לראות על כובע אחד לאחר מספר שעות של LAM. זרימת העבודה שהוקמו תוצאות reproducibly בטוב RNA איכות מ בידודי LAM סוג ספציפי תא מפני גמטופיט נקבה, כמויות רנ&quot;א הכל הן רק בטווח ng הנמוך. סכום הגבלה זו של RNA עושה את זה צורך להשתמש מלא נציג מבודד מרקמות גדולות של כל שקופית כקירוב לבקרת איכות RNA לאחר LAM. זו באה לידי ביטוי על ידי השוואה של RNA סוג תא ספציפי מב תאי ביצת divaricarpa בהשוואה לקבוצת ביקורת מאזורים רקמות גדולים מהבודדים מאותו השקופיות, המציין איכות RNA דומה (איור 4 א, ​​ב). באמצעות שיטה זו, טוב לאיכות RNA גבוהה עם מספרי RIN &amp; #8805; 7 מתקבל reproducibly. איכות RNA שהושגה הייתה מתאימה תא סוג ספציפי RNA-seq, מוביל לזיהוי של 236 גנים הביעו בתא הביצה apomictic אך לא בתא המרכזי apomictic, תא synergid, או התא ראשוני apomictic, ולא בתאים או גמטופיט מינית בוגרת של thaliana ארבידופסיס (איור 5) 7. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53916/53916fig1.jpg" /> איור 1:. Scheme של הצעדים לפרוטוקול, המציין את הזמן המינימאלי הנדרש לכל שלב קיבוע של הפרחים או רקמות של העניין נעשה בין הלילה. למחרת, הטבעה הוא התחיל, אשר פועל במשך הלילה, וכתוצאה מכך החומר מוטבע ביום 3 לפרוטוקול. באותו יום 3 חלקי microtome החל דגימות מוטבעות בבלוקי שעווה יכולים להיוצר. הסרטים של חלקי פרפין דקים הם רכובים על שקופיות והשאירו לייבוש למשך הלילה. עַלדואר לכמה ימים של LAM יידרש להשיג מספיק חומר לשכפל ביולוגי אחד. לאחר בידוד RNA ובקרת איכות, הכנת הספרייה RNA-seq ניתן לבצע כדי להכין ניתוח transcriptome. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53916/53916fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53916/53916fig2.jpg" /> איור 2: תאי ביצה הם ברורים זיהוי בסעיפים רזים, בשל המורפולוגיה האופיינית של גמטופיט הנקבה (א) הציור סכמטי של גמטופיט נקבה הבוגר (סוג Polygonum) (ב - ג) סעיפים דקים דרך ביציות מחסות גמטופיט נשי.. Boechera divaricarpa. תאי ביצה גלויים לעין. בשל המורפולוגיה של גמטופיט הנקבה לעתים קרובות לא כל סוגי תאים (תא ביצית: דואר, synergids: שניותתא מרכזי,: cc) גלוי בחלק מסוים. ברי סולם = 50 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53916/53916fig2large.jpg" target="_blank">לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53916/53916fig3.jpg" /> איור 3. LAM של תאי ביצת Boechera divaricarpa. A ו- C. סעיף של גמטופיט הבוגרת של B. divaricarpa ב -7 מיקרומטר לפני, B ו- D, לאחר microdissection עם מכשיר הלייזר (תא ביצית: דואר, synergids: שניות, תא מרכזי: cc). ברי סולם = 50 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53916/53916fig3large.jpg" target="_blank">לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53916/53916fig4.jpg" /> &lt;strong&gt; איור 4. RNA איכות תאי ביצה גזור ליזר וסעיפי בקרה. (א) איכות RNA כפי שנותח ממקטעי תא ביצית לעומת (B) אזורי רקמות גדולים שנקטפו מאותו השקופיות כקבוצת ביקורת. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53916/53916fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53916/53916fig5.jpg" /> זיהוי איור 5. של גנים הביעו היחיד בתא Apomictic בייץ לעומת התאים של Apomictic ומינית למבוגרי גמטופיט או התא הראשוני Apomictic. Heatmap של 236 גנים הביעו בתא הביצה apomictic אך לא בתא המרכזי apomictic, תא synergid , התא הראשוני apomictic או של B. gunnisoniana ולא התאים של גמטופיט המינית הבוגרת של A. thaliana 7 מבנה היררכיאשכולות של דגימות וגנים התבססו על מרחק האוקלידית ו באשכולות agglomerative היררכיים. האדום מסמל ביטוי גבוה וביטוי נמוך שחור. צבעים הם מדורגים בכל שורה. apo:. apomictic <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53916/53916fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types at JoVE.com

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Microdissection לייזר בסיוע (LAM) ככלי פרופיל תעתיק של סוגי תאים בודדים

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

laser-assisted-microdissection-lam-as-tool-for-transcriptional

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

9.2K Views.  University of Zürich & Zürich-Basel Plant Science Center. Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera. 

Video: Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Laser Capture Microdissection of Mammalian Tissue

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. LMD techniques rely on a thermo labile membrane placed either on top of, or underneath, the tissue section. In one method, focused laser energy is used to melt the membrane onto the underlying cells, which can then be lifted out of the tissue section. In the other, the laser energy vaporizes the foil along a path "drawn" on the tissue, allowing the selected cells to fall into a collection device. Each technique allows the selection of cells with a minimum resolution of several microns. DNA, RNA, protein, and lipid samples may be isolated and analyzed from micro-dissected samples. In this video, we demonstrate the use of the Leica AS-LMD laser microdissection instrument in seven segments, including an introduction to the principles of LMD, initializing the instrument for use, general considerations for sample preparation, mounting the specimen and setting up capture tubes, aligning the microscope, adjusting the capture controls, and capturing tissue specimens. Laser-capture micro-dissection enables the investigator to isolate samples of pure cell populations as small as a few cell-equivalents. This allows the analysis of cells of interest that are free of neighboring contaminants, which may confound experimental results.

לייזר Microdissection לכידה של רקמות היונקים

Laser capture microscopy, also known as laser microdissection (LMD), enables the user to isolate small numbers of cells or tissues from frozen or ...

Transcriptome Analysis of Single Cells

Many gene expression analysis techniques rely on material isolated from heterogeneous populations of cells from tissue homogenates or cells in culture.1,2,3 In the case of the brain, regions such as the hippocampus contain a complex arrangement of different cell types, each with distinct mRNA profiles. The ability to harvest single cells allows for a more in depth investigation into the molecular differences between and within cell populations. We describe a simple and rapid method for harvesting cells for further processing. Pipettes often used in electrophysiology are utilized to isolate (using aspiration) a cell of interest and conveniently deposit it into an Eppendorf tube for further processing with any number of molecular biology techniques. Our protocol can be modified for the harvest of dendrites from cell culture or even individual cells from acute slices.
We also describe the aRNA amplification method as a major downstream application of single cell isolations. This method was developed previously by our lab as an alternative to other gene expression analysis techniques such as reverse-transcription or real-time polymerase chain reaction (PCR).4,5,6,7,8 This technique provides for linear amplification of the polyadenylated RNA beginning with only femtograms of material and resulting in microgram amounts of antisense RNA. The linearly amplified material provides a more accurate estimation than PCR exponential amplification of the relative abundance of components of the transcriptome of the isolated cell. The basic procedure consists of two rounds of amplification. Briefly, a T7 RNA polymerase promoter site is incorporated into double stranded cDNA created from the mRNA transcripts. An overnight in vitro transcription (IVT) reaction is then performed in which T7 RNA polymerase produces many antisense transcripts from the double stranded cDNA. The second round repeats this process but with some technical differences since the starting material is antisense RNA. It is standard to repeat the second round, resulting in three rounds of amplification. Often, the third round in vitro transcription reaction is performed using biotinylated nucleoside triphosphates so that the antisense RNA produced can be hybridized and detected on a microarray.7,8

In this article we describe a simple method for the harvesting of single cells from rat primary neuronal cultures and subsequent transcriptome analysis using aRNA amplification. This approach is generalizable to any cell type.

ניתוח Transcriptome של תאים בודדים

Many gene expression analysis techniques rely on material isolated from heterogeneous populations of cells from tissue homogenates or cells in ...

Neuroscience

Combining Laser Capture Microdissection and Microfluidic qPCR to Analyze Transcriptional Profiles of Single Cells: A Systems Biology Approach to Opioid Dependence

Profound transcriptional heterogeneity in anatomically adjacent single cells suggests that robust tissue functionality may be achieved by cellular phenotype diversity. Single-cell experiments investigating the network dynamics of biological systems demonstrate cellular and tissue responses to various conditions at biologically meaningful resolution. Herein, we explain our methods for gathering single cells from anatomically specific locations and accurately measuring a subset of their gene expression profiles. We combine laser capture microdissection (LCM) with microfluidic reverse transcription quantitative polymerase chain reactions (RT-qPCR). We also use this microfluidic RT-qPCR platform to measure the microbial abundance of gut contents.

This protocol explains how to collect single neurons, microglia, and astrocytes from the central nucleus of the amygdala with high accuracy and anatomic specificity using laser capture microdissection. Additionally, we explain our use of microfluidic RT-qPCR to measure a subset of the transcriptome of these cells.

שילוב לכידת לייזר ובדיקות מיקרופלוטואידים לניתוח פרופילים של תאים בודדים: גישת ביולוגיה של מערכות לתלותיות באופטואיד

Profound transcriptional heterogeneity in anatomically adjacent single cells suggests that robust tissue functionality may be achieved by cellular ...

Genetics

Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that is critical for learning, memory and executive function.1,2 Hence our studies focus on gene expression analysis of specific neuronal populations in distinct subregions of the hippocampus. The technique of laser capture microdissection (LCM), introduced in 1996 by Emmert-Buck, et al.,3 has allowed for significant advances in gene expression analysis of single cells and enriched populations of cells from heterogeneous tissues such as the mammalian brain that contains thousands of functional cell types.4 We use LCM and a well established rat model of traumatic brain injury (TBI) to investigate the molecular mechanisms that underlie the pathogenesis of TBI. Following fluid-percussion TBI, brains are removed at pre-determined times post-injury, immediately frozen on dry ice, and prepared for sectioning in a cryostat. The rat brains can be embedded in OCT and sectioned immediately, or stored several months at -80 &deg;C before sectioning for laser capture microdissection. Additionally, we use LCM to study the effects of TBI on circadian rhythms. For this, we capture neurons from the suprachiasmatic nuclei that contain the master clock of the mammalian brain. Here, we demonstrate the use of LCM to obtain single identified neurons (injured and degenerating, Fluoro-Jade-positive, or uninjured, Fluoro-Jade-negative) and enriched populations of hippocampal neurons for subsequent gene expression analysis by real time PCR and/or whole-genome microarrays. These LCM-enabled studies have revealed that the selective vulnerability of anatomically distinct regions of the rat hippocampus are reflected in the different gene expression profiles of different populations of neurons obtained by LCM from these distinct regions. The results from our single-cell studies, where we compare the transcriptional profiles of dying and adjacent surviving hippocampal neurons, suggest the existence of a cell survival rheostat that regulates cell death and survival after TBI.

We describe how to use laser capture microdissection (LCM) to obtain enriched populations of hippocampal neurons or single neurons from frozen sections of the injured rat brain for subsequent gene expression analysis using quantitative real time PCR and/or whole-genome microarrays.

Microdissection לכידת ליזר אוכלוסיות מועשרות של הנוירונים או נוירונים יחידים לניתוח ביטוי גנים לאחר פגיעה מוחית טראומטית

Long-term cognitive disability after TBI is associated with injury-induced neurodegeneration in the hippocampus-a region in the medial temporal lobe that ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and molecular complexity of skeletal elements increases with development. Tissue heterogeneity, such as at the interface of cartilaginous and osseous elements with each other or with surrounding tissues, is one obstacle to the study of developing cartilage and bone. Our protocol provides a rapid method of tissue processing and isolation of cartilage and bone that yields high quality RNA for gene expression analysis. Fresh frozen tissues of mouse embryos are sectioned and brief cresyl violet staining is used to visualize cartilage and bone with colors distinct from surrounding tissues. Slides are then rapidly dehydrated, and cartilage and bone are isolated subsequently by LCM. The minimization of exposure to aqueous solutions during this process maintains RNA integrity. Mouse Meckel&rsquo;s cartilage and mandibular bone at E16.5 were successfully collected and gene expression analysis showed differential expression of marker genes for osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, and chondrocytes. High quality RNA was also isolated from a range of tissues and embryonic ages. This protocol details sample preparation for LCM including cryoembedding, sectioning, staining and dehydrating fresh frozen tissues, and precise isolation of cartilage and bone by LCM resulting in high quality RNA for transcriptomic analysis.

This protocol describes laser capture microdissection for the isolation of cartilage and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Cartilage and bone can be rapidly visualized by cresyl violet staining and collected precisely to yield high quality RNA for transcriptomic analysis.

לכידת לייזר מיקרו חיתוך של העכבר סחוס ועצם עבור ניתוח ביטוי גנים

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

Developmental Biology

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, compromising downstream analyses. Considering the complex and dynamic cellular associations existing within many tissues, in order to recapitulate the in vivo interactions thorough molecular analysis one must be able to analyze specific cell populations within their native context. Laser-mediated microdissection can achieve this goal, allowing unambiguous identification and successful harvest of cells of interest under direct microscopic visualization while maintaining molecular integrity. We have applied this technology to analyse gene expression within defined areas of the developing Drosophila wing disc, which represents an advantageous model system to study growth control, cell differentiation and organogenesis. Larval imaginal discs are precociously subdivided into anterior and posterior, dorsal and ventral compartments by lineage restriction boundaries. Making use of the inducible GAL4-UAS binary expression system, each of these compartments can be specifically labelled in transgenic flies expressing an UAS-GFP transgene under the control of the appropriate GAL4-driver construct. In the transgenic discs, gene expression profiling of discrete subsets of cells can precisely be determined after laser-mediated microdissection, using the fluorescent GFP signal to guide laser cut. 
Among the variety of downstream applications, we focused on RNA transcript profiling after localised RNA interference (RNAi). With the advent of RNAi technology, GFP labelling can be coupled with localised knockdown of a given gene, allowing to determinate the transcriptional response of a discrete cell population to the specific gene silencing. To validate this approach, we dissected equivalent areas of the disc from the posterior (labelled by GFP expression), and the anterior (unlabelled) compartment upon regional silencing in the P compartment of an otherwise ubiquitously expressed gene. RNA was extracted from microdissected silenced and unsilenced areas and comparative gene expression profiling determined by quantitative real-time RT-PCR. We show that this method can effectively be applied for accurate transcriptomics of subsets of cells within the Drosophila imaginal discs. Indeed, while massive disc preparation as source of RNA generally assumes cell homogeneity, it is well known that transcriptional expression can vary greatly within these structures in consequence of positional information. Using localized fluorescent GFP signal to guide laser cut, more accurate transcriptional analyses can be performed and profitably applied to disparate applications, including transcript profiling of distinct cell lineages within their native context.

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Laser microdissection was applied to analyse gene expression profiling in specific compartments of Drosophila wing disc subjected to localised RNAi in vivo. RNA extracted from equivalent areas of silenced and unsilenced compartments was analysed by quantitative RT-PCR to determine comparative gene expression profiling within the context of native tissue microecology.

Microdissection לייזר יישומית כדי Gene Expression Profiling של תת קבוצה של תאים מן תסיסנית אגף דיסק

Heterogeneous nature of tissues has proven to be a limiting factor in the amount of information that can be generated from biological samples, ...

Laser Capture Microdissection - A Demonstration of the Isolation of Individual Dopamine Neurons and the Entire Ventral Tegmental Area

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue sections on a microscope slide. When combined with immunohistochemistry, LCM can be used to isolate individual cells types based on a specific protein marker. Here, the LCM technique is described for collecting a specific population of dopamine neurons directly labeled with&#160;tyrosine hydroxylase immunohistochemistry and for isolation of the dopamine neuron containing region of the ventral tegmental area using indirect tyrosine hydroxylase immunohistochemistry on a section adjacent to those used for LCM. An infrared (IR) capture laser is used to both dissect individual neurons as well as the ventral tegmental area off glass slides and onto an LCM cap for analysis. Complete dehydration of the tissue with 100% ethanol and xylene is critical. The combination of the IR capture laser and the ultraviolet (UV) cutting laser is used to isolate individual dopamine neurons or the ventral tegmental area when using PEN membrane slides. A PEN membrane slide has significant advantages over a glass slide as it offers better consistency in capturing and collecting cells, is faster collecting large pieces of tissue, is less reliant on dehydration and results in complete removal of the tissue from the slide. Although removal of large areas of tissue from a glass slide is feasible, it is considerably more time consuming and frequently leaves some residual tissue behind. Data shown here demonstrate that RNA of sufficient quantity and quality can be obtained using these procedures for quantitative PCR measurements. Although RNA and DNA are the most commonly isolated molecules from tissue and cells collected with LCM, isolation and measurement of microRNA, protein and epigenetic changes in DNA can also benefit from the enhanced anatomical and cellular resolution obtained using LCM.

The isolation of individual dopamine neurons or the ventral tegmental area with direct or indirect immunohistochemistry is demonstrated using laser capture microdissection. Parameters for isolation of tissue from a glass slide using an infrared laser and from membrane slides using the combination of an infrared and ultraviolet laser are discussed.

Microdissection לכידת לייזר - הפגנה של הבידוד של פרט דופמין נוירונים ופינת הגחון tegmental השלם

Laser capture microdissection (LCM) is used to isolate a concentrated population of individual cells or precise anatomical regions of tissue from tissue ...

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.

The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

Microdissection לייזר לכידתו של אדם הערמונית האפיתל לניתוח RNA

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

Medicine

RNA Isolation from Cell Specific Subpopulations Using Laser-capture Microdissection Combined with Rapid Immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires precise identification of cells subpopulations from a heterogeneous tissue. Identification of cells of interest for LCM is usually based on morphological criteria or on fluorescent protein reporters. The combination of LCM and rapid immunolabeling offers an alternative and efficient means to visualize specific cell types and to isolate them from surrounding tissue. High-quality RNA can then be extracted from a pure cell population and further processed for downstream applications, including RNA-sequencing, microarray or qRT-PCR. This approach has been previously performed and briefly described in few publications. The goal of this article is to illustrate how to perform rapid immunolabeling of a cell population while keeping RNA integrity, and how to isolate these specific cells using LCM. Herein, we illustrated this multi-step procedure by immunolabeling and capturing dopaminergic cells in brain tissue from one-day-old mice. We highlight key critical steps that deserve special consideration. This protocol can be adapted to a variety of tissues and cells of interest. Researchers from different fields will likely benefit from the demonstration of this approach.

Gene expression analysis of a subset of cells in a specific tissue represents a major challenge. This article describes how to isolate high-quality total RNA from a specific cell population by combining a rapid immunolabeling method with laser capture microdissection.

בידוד RNA מן אוכלוסיות תאים ספציפיות באמצעות Microdissection לייזר ללכוד בשילוב עם ראפיד immunolabeling

Laser capture microdissection (LCM) allows the isolation of specific cells from thin tissue sections with high spatial resolution. Effective LCM requires ...

Laser Microdissection for Species-Agnostic Single-Tissue Applications

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific genetic &#34;toolkits,&#34; such as promoters driving tissue-specific expression of fluorescent proteins. Further, protocols that disrupt tissues to isolate individual cells remove cells from their native environment (e.g., signaling from neighbors) and may result in stress responses or other differences from native gene expression states. In the present protocol, laser microdissection (LMD) is optimized to isolate individual nematode tail tips for the study of gene expression during male tail tip morphogenesis.
LMD allows the isolation of a portion of the animal without the need for cellular disruption or species-specific toolkits and is thus applicable to any species. Subsequently, single-cell RNA-seq library preparation protocols such as CEL-Seq2 can be applied to LMD-isolated single tissues and analyzed using standard pipelines, given that a well-annotated genome or transcriptome is available for the species. Such data can be used to establish how conserved or different the transcriptomes are that underlie the development of that tissue in different species.
Limitations include the ability to cut out the tissue of interest and the sample size. A power analysis shows that as few as 70 tail tips per condition are required for 80% power. Tight synchronization of development is needed to obtain this number of animals at the same developmental stage. Thus, a method to synchronize animals at 1 h intervals is also described.

A protocol is described that uses laser microdissection to isolate individual nematode tissues for RNA-sequencing. The protocol does not require species-specific genetic toolkits, allowing gene expression profiles to be compared between different species at the level of single-tissue samples.

מיקרו-דיסקציה של לייזר עבור יישומים של רקמה אחת אגנוסטית של מינים

Single-cell methodologies have revolutionized the analysis of the transcriptomes of specific cell types. However, they often require species-specific ...