עבודה זו נתמכת על ידי NIH DK095137 (עד THC). אנו מודים לחברי המעבדה בהווה ובעבר אשר תרמו להתפתחות והתחכום של השיטות שתוארו.

משפט ואתיקה: אוניברסיטת מישיגן ועדת על השימוש והטיפול של בעלי חיים (UCUCA) ואישר את כל שיטות ופרוטוקולים בהתאם מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (המכון מעבדה בבעלי חיים למחקר, המועצה הלאומית למחקר). עכברים נשמרות ביבר אוניברסיטת מישיגן מקבלים גישה חופשית למזון ומים ושמר על מחזור 12 שעות חושך / אור. 1. הכנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן תקשורת התרבות העיקרית עם DMEM, 10% FBS, 1x P / S / G ו- 1x אנטיביוטיקה / antifungals. זה ישמש כדי לשמור רקמות לעיכול לפני. מניח מניות aliquot באמבט מים 37 ºC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן חמישה מיליליטר של תמיסת collagenase Type III ב 5 מג / מיליליטר מומס HBSS (+ Ca, Mg +) עבור כל סוג של כרית שומן מבודדת, עד חמישה עכברים. לדוגמה, כאשר לבודד SQ ו VIS מ גנוטיפ יחיד, לעשות 10 מ&quot;ל, אם סוג-בר SQ מוטנטים VIS, לעשות 20 מ&quot;ל. התאם ל- pH 7.4 ו STEלהרגיז מסנן. Aliquot לתוך צינורות 50 מ&quot;ל. מניחים בצד הרחק מאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 70% אתנול לחיטוי בתחום כירורגית. נגב ולכסות עם כרית כחולה. לרסס קצת אתנול על כרית כחולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 22 מחטי G כדי להצמיד כרית ספיגה ללוח הקלקר לקצץ במספריים. תרסיס כרית עם אתנול ולאחר מכן להגדיר את הלוח על כרית כחולה ומכסים כרית כחולה אחרת עד תחילת לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו שני צינורות 50 מ&quot;ל עם אתנול ומניחים עמדה סמוך בתחום כירורגית. מניח את מספרי מלקחיים של אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו אחר צינור 50 מ&quot;ל עם PBS בתוספת 1x אנטי-אנטי לשטיפה אתנול מחוץ כלים כירורגיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב למכסה המנוע, מנות התווית 60 מ&quot;מ לכל סוג רקמה ולמלא עם התקשורת והתרבות חימם עד 37 ºC. מניח את הצלחות סמוכות לאזור כירורגית. </li></ol> בידוד 2. של תת עורי (SQ) רפידות שומן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר עם ממנת יתר של isoflurane ו pneumothorax. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינותלרסס עכבר עם 70% אתנול ושכב פרקדן. הצמד את הכפות אל קאפה עם 22 מחטים G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך קטן בעור של הבטן התחתונה. החזקת החלק העליון של החתך עם מלקחיים, לקחת את המספריים ולהפריד את העור מפני הצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העור מופרד הצפק מן הבטן אל החזה, לשקף את העור הרחק הצפק לכיוון הראש על ידי ביצוע חתכים לרוחב בעור לאורך צדי הגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקף את העור שנותר מחזיק את השומן מפשעתי מהגוף להצמיד ללוח עם 22 מחטים G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Switch to מספרי מלקחיים בסדר. תפוס את כרית השומן מפשעתי עם מלקחיים בראשית הצירים ליד הצפק לגזוז בין עור ושומן מפשעתי התקדמות לקראת במפשעה הימנעות זיהום SQ עם העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את כרית השומן מפשעתי insolated בצלחת שכותרתו 60 מ&quot;מ. </li></ol> 3. בידוד של הקרביים (VIS) רפידות שומן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן דומה לשלב 2.5, לחתוך הצפק פתוח לחשוף את רפידות ובמעיים שומן הקרביים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הבטן משם לכיוון בית החזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפוס את כרית השומן VIS בקצה הדיסטלי ולמשוך בעדינות. לנתח את כרית שומן VIS תוך הקפדה שלא לכלול epididymal (או רחם, אם באמצעות נקבת עכברים) רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום בצלחת שכותרתו וחזור על שלב 3.3 עבור כרית VIS הנותרים. </li></ol> 4. עיכול Collagenase של רפידות שומן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז 60 מ&quot;מ צלחות למכסה המנוע בתרבית רקמה ו לשאוב את התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכך את רפידות שומן עם מספריים מעוקל מכן להוסיף לפתרון collagenase. הקפידו לשטוף את המספריים מלקחיים בין סוגי רקמות עם אתנול PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Shake ב 300 סל&quot;ד ו -37 ºC עבור 10-20 דקות עד רקמות מתעכלות. מקובל אם כמה חתיכות של SQ עדיין גלויות. זה יטופל בשלב מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 מ&quot;ל של התקשורת בתרבות לפתרון collagenase לעצור את collagטיפול enase, ו פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים עם טפטף סרולוגיות 10 מיליליטר לפזר את הרקמות המעוכלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי זנים באמצעות מסננת תא 100 מיקרומטר. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב g 300 x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות למזוג את התקשורת לא להפריע גלולה ולהוסיף 5 מ&quot;ל של מים סטריליים כדי גלולה ו פיפטה בעדינות להשעות תאים. חכה 2 דקות כדי lyse אריתרוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 25 מ&quot;ל של התקשורת עם תאים FBS ומתח 10% דרך מסננת תא חדש 100 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 10 דקות ב g 300 x. התקשורת למזוג ו resuspend גלולה ב 1 מ&quot;ל של התקשורת והתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים עם hemocytometer באמצעות 1: 1 trypan כחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט 1 x 10 6 תאים היטב אחד על צלחת 6 באר. </li></ol> 5. הפרדת Cell מגנטית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כ -4 עד 6 שעות של הידבקות התא, לשטוף תאים פעמיים עם HBSS (-Ca, -Mg). לנתק תאים חסידים באמצעות טריפסין 0.05%. לדלל השעית תא טריפסין חיץ הפרדה 1 מיליליטר ספין עבור5 דקות ב g 300 x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant. תאי Resuspend במאגר 500 μl. הסרת aliquot 10 μl ולספור תאים באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין תאים למשך 5 דקות ב 300 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant לחלוטין. תאי Resuspend ב 90 חיץ μl. הוסף 10 μl נוגדן ראשוני נגד Sca1-FITC. מערבבים היטב דגירה במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים עם 1 מ&quot;ל חיץ תאים צנטריפוגות במשך 5 דקות ב g 300 x. הסר supernatant לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Resuspend ב 80 חיץ μl. הוסף 20 μl microbeads אנטי FITC. מערבבים היטב דגירה במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים עם 1 מ&quot;ל חיץ תאים צנטריפוגות במשך 5 דקות ב g 300 x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant ו resuspend גלולה במאגר 500 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום עמודה בעל מגנטית ולשטוף טור עם 500 חיץ μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף השעית תא לעמודה. הימנע בועות תוך pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את Sca1 ללא תווית - &lt;/ Sup&gt; תאים ולשטוף פעמים בטור 3 עם 500 חיץ μl. רק להוסיף למאגר חדש כאשר המאגר ריק. הימנע בועות תוך pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר עמודה מבעל מגנטי ומקום לתוך צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל חיץ לעמודה ו elute Sca1 + על ידי דחיפת הבוכנה המסופק באמצעות המאגר טור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה שברי תא במשך 5 דקות ב 300 x ז. תאים Resuspend בתקשורת תרבות 1 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת aliquot 10 μl מן השברים שכותרתו ללא תווית ולספור תאים באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט כל שבריר תא 1 גם צלחת 6 באר. </li></ol> 6. אימות של הפרדת immunomagnetic של ACSs Sca1 הגבוה עם cytometry הזרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את התאים פעמיים עם HBSS (-Ca, -Mg) ו לנתק תאים באמצעות טריפסין 0.05%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות. תאים Resuspend בתקשורת תרבות 1 מ&quot;ל ולספור באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג&gt; 10 6 </sup&gt; תאים 1 מ&quot;ל התקשורת בתרבות צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צעד supernatant וחזור 6.3 פעמיים נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend עם 1 מ&quot;ל של סרום עיזים 2% + 2% BSA ולחסום במשך 30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר חסימת פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף עכברוש IgG2a אלקסה פלואוריד 647 (0.25 מיקרוגרם, 1: 400) או אנטי-Sca1 אלקסה פלואוריד 647 (0.25 מיקרוגרם, 1: 400), ב 100 μl של PBS עם 2% נסיוב עז ו -2% BSA + PBS ב 4 ° C במשך 30 דקות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של קר PBS לתאים. צנטריפוגה XG 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צעד supernatant וחזור 6.9 פעמיים נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 1 מ&quot;ל PBS. Pass השעיות התא דרך מסננת התא 100 מיקרומטר כהכנה ניתוח תזרים cytometric. </li></ol>

<ol>
	<li>Chun, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pericellular+collagenase+directs+the+3-dimensional+development+of+white+adipose+tissue.">A pericellular collagenase directs the 3-dimensional development of white adipose tissue.</a> Cell. 125 (3), 577-591 (2006).</li><li>Chun, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+link+between+obesity+and+MMP14-dependent+adipogenic+collagen+turnover.">Genetic link between obesity and MMP14-dependent adipogenic collagen turnover.</a> Diabetes. 59 (10), 2484-2494 (2010).</li><li>Chun, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peri-adipocyte+ECM+remodeling+in+obesity+and+adipose+tissue+fibrosis.">Peri-adipocyte ECM remodeling in obesity and adipose tissue fibrosis.</a> Adipocyte. 1 (2), 89-95 (2012).</li><li>Sun, K., Tordjman, J., Clement, K., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrosis+and+adipose+tissue+dysfunction.">Fibrosis and adipose tissue dysfunction.</a> Cell Metab. 18 (4), 470-477 (2013).</li><li>Spangrude, G., Heimfeld, S., Weissman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Characterization+of+Mouse+Hematopoietic+Stem+Cells.">Purification and Characterization of Mouse Hematopoietic Stem Cells.</a> Science. 241, 58-62 (1988).</li><li>Welm, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sca-1(pos)+cells+in+the+mouse+mammary+gland+represent+an+enriched+progenitor+cell+population.">Sca-1(pos) cells in the mouse mammary gland represent an enriched progenitor cell population.</a> Dev Biol. 245 (1), 42-56 (2002).</li><li>Gesta, S., Tseng, Y. H., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+origin+of+fat:+tracking+obesity+to+its+source.">Developmental origin of fat: tracking obesity to its source.</a> Cell. 131 (2), 242-256 (2007).</li><li>Tang, W., Zeve, D., Suh, J. M., Bosnakovski, D., Kyba, M., Hammer, R. E., Tallquist, M. D., Graff, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White+fat+progenitor+cells+reside+in+the+adipose+vasculature.">White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature.</a> Science. 322, 583-586 (2008).</li><li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo.">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li><li>Tokunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+depot-specific+gene+signature+and+ECM+remodeling+of+Sca1(high)+adipose-derived+stem+cells.">Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells.</a> Matrix Biol. 36, 28-38 (2014).</li><li>Chun, T. H., Inoue, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+adipocyte+differentiation+and+peri-adipocyte+collagen+turnover.">3-D adipocyte differentiation and peri-adipocyte collagen turnover.</a> Methods Enzymol. 538, 15-34 (2014).</li><li>Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+ready-to-use,+storable+and+reconstituted+type+I+collagen+from+rat+tail+tendon+for+tissue+engineering+applications.">Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).</li><li>Ma, X., Robin, C., Ottersbach, K., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ly-6A+(Sca-1)+GFP+Transgene+is+Expressed+in+all+Adult+Mouse+Hematopoietic+Stem+Cells.">The Ly-6A (Sca-1) GFP Transgene is Expressed in all Adult Mouse Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells. 20 (6), 514-521 (2002).</li><li>Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+adipocyte+cellular+lineage+in+vivo.">Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo.</a> Nat Cell Biol. 15 (3), 302-308 (2013).</li><li>Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+depot-specific+activation+of+adipocyte+precursor+cells+at+the+onset+of+obesity.">Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity.</a> Nat Cell Biol. 17 (4), 376-385 (2015).</li><li>Mori, S., Kiuchi, S., Ouchi, A., Hase, T., Murase, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristic+Expression+of+Extracellular+Matrix+in+Subcutaneous+Adipose+Tissue+Development+and+Adipogenesis;+Comparison+with+Visceral+Adipose+Tissue.">Characteristic Expression of Extracellular Matrix in Subcutaneous Adipose Tissue Development and Adipogenesis; Comparison with Visceral Adipose Tissue.</a> Int J Biol Sci. 10 (8), 825-833 (2014).</li><li>Ong, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Specific+Cell-Surface+Markers+of+Adipose-Derived+Stem+Cells+from+Subcutaneous+and+Visceral+Fat+Depots.">Identification of Specific Cell-Surface Markers of Adipose-Derived Stem Cells from Subcutaneous and Visceral Fat Depots.</a> Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

בזאת אנו מדגימים את הבידוד והפרדה תא immunomagnetic של ASCs בעכברים מ רפידות שומן שונים והשימוש בהם לניסויים במבחנה. השיטה המוצגת היא יעילה עבור הבידוד המהיר של מספר רב של ASCs Sca1 החיובי, המהווה יתרון על FACS בתיווך מורכב ויקר טכניים הבידוד של ASCs 9,14. בניגוד FACS, הפרדת תא immunomagnetic אינה מאפשרת את השימוש של אנטיגן המרובה לאיתור אוכלוסיית תא המטרה. אף על פי כן, אם אנטיגן השטח היטב מאופיין, שימוש פרדת immunomagnetic מגדיל את מספר התאים להיות מנותח ללא הסתמכות על השימוש במכשירי FACS 15, אשר עדיין אינו נגיש לחוקרים ביולוגיים רבים במוסדות קטנים ללא מתקני ליבה . ישנם כמה היבטים קריטיים של ההליך כי יש להקפיד על מנת להבטיח תוצאה מוצלחת. הרכש של ADIPOSE שמקורם בתאי גזע דורש הבידוד כירורגית של מחסני רקמת שומן עכבר. לכן, את המהירות והדיוק של חזר רקמה הכרחית כדי להניב מספר גבוה של תאי קיימא. בנוסף, השמירה על שדות ומכשירי ניתוח נקיים חיונית התוצאה של ההליך על ידי מניעת זיהום מיקרוביאלי של דגימות תאים ורקמות. רקמות השומן גזור חייב להיות מנותק enzymatically בתמיסה collagenase מסוג II. הרכב ECM שונה בין SQ ו VIS רפידות שומן 10,16, שבו VIS מכילים פחות collagens מ SQ. לכן, משך עיכול כרית שומן VIS דורש כמחצית פרק הזמן כפי SQ. מקובל לעצור עיכול רקמות לאחר תקופת הדגירה המוצהרת גם אם חלקיקים קטנים של רקמות עדיין נוכח הפתרון collagenase. יצירות אלה ניתן ניתק מכאני עם pipetting פעם תקשורת ותרבות נוספה לעכב פעילות collagenase. למרות זאת, ניתן להמשיךישירות מיון immunomagnetic הבא בידוד SVF, זרעי קבוצתנו 1 x 10 6 תאים ממוינים על צלחות פלסטיק עבור 4 עד 6 שעות על לפני שתמשיך עם מיון תא. למרות צעדי סינון מרובים במהלך בידוד SVF, פסולת עדיין תהיה נוכחת בתוך השעית התא. ציפוי התא לפני שתמשיך הפרדת תא immunomagnetic מספק הזדמנות לשטוף פסולת תאים פנויים משם, ובכך מאפשר מיון מגנטי להיות מיושם רק תאי חסיד המכילים ובתאי adipogenic. בעוד Sca1 לא נמצא הגנום אנושי, זיהוי והאימות של אנטיגנים פני תא אלטרנטיבה הביעו על תאי גזע שומן אנושי דיפו תלוי שומן 17, כאשר יחד עם טכניקת הפרדת תא זה, עשוי לעזור לנו להגדיר את הביולוגיה של תאי גזע שומן אנושיים.

תאי גזע אנטיגן 1 (Sca1, או Ly6A / E) זוהה לראשונה כסמן פני התא הביע על ידי תאים hematopoietic ו גזע mesenchymal 5,6. השבר וסקולרית סטרומה (SVF) של רקמת שומן המתקבלת מאגרי שומן עכבר הוא אוכלוסייה הטרוגנית של תאים הכוללים פיברובלסטים, מקרופאגים, תאי אנדותל של כלי דם, תאים עצביים, ועל ובתאים adipocyte 7. ובתאי adipocyte, או תאי גזע שמקורם שומן (ASCs) הם תאים שאינם שומנים-לאדן כי מתגוררים מטריקס perivascular עשיר קולגן (ECM) 8. כ -50% של SVF מורכב ASCs, המאופיינים שלילי השושלת (לין -) ו CD29 +: CD34 +: Sca1 + 9. רוב של תאים אלה הם Sca1 +: CD24 - אבות adipocyte, המסוגלים בידול adipocyte במבחנה; עם זאת, רק חלק קטן של תאים (0.08% של SVF) מהווה Sca1 <sעד&gt; +: CD24 + תאים המסוגלים מלא של מתרבים ומבדל לתוך adipocytes בתנאים vivo ב 9. למרות הסייגים הפוטנציאל של שימוש Sca1 + SVF ללא אפלית CD24 + תאי CD24 - תאים, לבודד Sca1 + ASCs מן מחסני שומן באמצעות פרדת תא immunomagnetic היא גישה יעילה ומעשית כדי לקבוע את הפנוטיפ-אוטונומי תא של ובתאים adipocyte העיקרי. בתחום השמנת יתר וסוכרת, סיסטיק לרקמות ודלקת לשחק תפקיד קריטי בפיתוח ותחזוקה של סוכרת מסוג 2 3. לאחרונה, Tokunaga et al. הראה כי תאי גבוה Sca1 המבודד מפשעתי (או תת עורית, SQ) ו perigonadal (או קרבי, VIS) מאגרי שומן C57BL6 / J להפגין חתימות גנטיות שונות שיפוץ ECM במבחנה 10. MMP14 (MT1-MMP), חבר אבטיפוס של-t הממברנהמטלו מטריקס ype (MMP) המשפחה מתווכת בפיתוח שומן לבן (WAT) דרך פעילותה collagenolytic 1. דוגמאות של ניסויים שעלולים להתנהל עם התאים מבודדים והעשירו באמצעות הפרוטוקול הבא כוללות תרבות תלת ממדים, מחקרי בידול, מבחני שפלת קולגן, ו- RNA רצף 10,11. מבחני שפלה צריכים להתנהל עם קולגן חומצת חילוץ כדי להבטיח את השימור של telopeptide 11,12. הפרוטוקול הבא יהיה להדגים את השיטות לבודדות תאי סטרומה וסקולרית ראשית ממנהל מאגרי שומן שונים ולהעשיר ובתאי adipocyte באמצעות פרדת תא immunomagnetic. תוקפו של מיון התא יוערכו עם זרימת cytometry ובאמצעות באמצעות עכברים Sca1-GFP המבטאים GFP ב Sca1 + תאים, מונע על ידי האמרגן Sca1 13.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Type 3 Collagenase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004182</td>
			<td>Tissue digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>High-glucose culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep/Glutamine (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td>Media antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-anti (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>Media antifungal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x, pH 7.4)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (0.05%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352360</td>
			<td>100-&#956;m cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14001-12</td>
			<td>Large</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14091-11</td>
			<td>Fine, curved tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G 5/8&#8221; needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22G 1.5&#8221; needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS separation columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Anti-Sca1 microbead kit (FITC)</td>
			<td rowspan="3">Miltenyi Biotec</td>
			<td rowspan="3">130-092-529</td>
			<td rowspan="3">FITC-anti-Sca1 1&#186;Ab and anti-FITC microbeads 2&#186;Ab</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS running buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue chux pads</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>276-12424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent pads</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>19-165-621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use from 50ml tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2a Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R2a21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MSCA21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2a R-PE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R2a04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MF48004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (&#8211;Ca, &#8211;Mg)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (+Ca, +Mg)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td>For collagenase solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid</td>
			<td>Prepare in house12</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11430-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.34N NaOH</td>
			<td>Prepare in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2870-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-20004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.89M NaHCO3&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25080-094</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunomagnetic separation of fat depot-specific sca1high adipose-derived stem cells (ascs)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1high ASCs.

העשרה של ASCs הגבוהה Sca1 מ רפידות שומן שונות. תאי סטרומה וסקולרית המבודדים תצוגת שומן SQ פיברובלסטים דמויים, נמתחו צורת תא ללא קשר לרמת ביטוי Sca1 (איור 1 א). מצד השני, VIS (eWAT נגזרת) תאי נמוך Sca1 גבוה Sca1 להדגים הבדל מובהק בצורת התא שלהם. כמו SQ (iWAT נגזרת) תאים גבוהים Sca1, VIS (eWAT נגזרת) תאים גבוהים Sca1 לתצוגה נמתחת, צורת תא דמוי פיברובלסטים, ואילו תאים נמוכים VIS Sca1 להפגין צורת epithelioid. תאים גבוה Sca1 מבודדים מעכברים-GFP Sca1 מזוהים בקלות כמו GFP חיובי תאים בתרבית רקמה (איור 1B). כאשר תאים אלו הוערכו עם זרימת cytometry, רוב תאי GFP החיוביים אושרו לבטא חלבוני Sca1 על פני התא כפי שזוהה עםנוגדן ti-Sca1 (תרשים 1C). תאים גבוהים Sca1 נגזרו כרית שומן מפשעתי שומרים גדלו קיבולת של בידול adipocyte ואילו תאים גבוהים Sca1 הנגזרות eWAT קשים יותר להתמיין adipocyte עם תערובת adipogenic קונבנציונלית 10. דיפו תלוי שומן ביטוי גנים של ASCs הגבוהה Sca1 (איור 2). הגנום כולו transcriptome ניתוחי עם רצף RNA הפגין להעשרת גנים הקשורים חלבונים תאים מטריקס מכפילים (GO: 0,031,012, GO: 0,005,578) באותם ASCs הגבוה Sca1 10. יחד עם בזמן אמת מנתח PCR, הצלחנו להדגים את הביטוי ההפרש של MMPs collagenolytic (MMP2, MMP8, MMP13, MMP14) בין iWAT- ו eWAT הנגזרות Sca1 גבוהה ASCs. כאשר שכותרתו והעמסה מהסוג I קולגן ג&#39;ל שמש t<html> o להעריך פעילות שפלת pericellular, צפינו בפעילות שיפוץ קולגן גדלה במידה הניכרת בתיווך VIS Sca1 הגבוהה ASCs 10. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53890/53890fig1.jpg" /> איור 1: ההפרדה immunomagnetic של ASCs גבוהה Murine Sca1 מ מאגרי שומן שונים (א) Sca1 גבוהה Sca1 נמוך ASCs מבודד SQ (iWAT) ו VIS (eWAT).. סולם = 100 מיקרומטר. (ב) בתאים-GFP Sca1 מבודד iWAT של עכברים SCA-GFP. סולם = 100 מיקרומטר. (C) ביטוי פני התא של Sca1 בתאים Sca1-GFP חיובי העריכו עם cytometry הזרימה. (משמאל) שליטה עכברוש IgG (מימין) נוגדן אנטי Sca1. ציר ה- X, עוצמת GFP. ציר ה- Y, Alexa פלואוריד 647. פאנל הראו בעבר ב Tokunaga, M. et al., (2014).ig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53890/53890fig2.jpg" /> איור 2:. שומן דיפו-Dependent ביטוי של Collagenolytic MMPs, TIMPs, ו collagens (א) ביטוי גנים דיפרנציאלי של ECMS מכפילי ECM ב Sca1 הגבוהה ASCs מבודד מאגרי שומן שונים. (ב) פעילות שפלה קולגן מוגברת של VIS (eWAT נגזרת) ASCs הגבוהה Sca1. ביזוי של קולגן מוצג היעלמות אותות ניאון (חיצים וראשי החץ). הבלעה היא תמונה מוגדלת של השפלה קולגן ממוקד בתיווך תא יחיד של ASCs SQ. התאים היו בתרבית למשך 72 שעות. הנתונים המוצגים בעבר Tokunaga, M. et al., (2014). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53890/53890fig2large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן נ</a>iew גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Watch this Scientific Journal Video about Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs at JoVE.com

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.

הפרדת immunomagnetic של שומן דיפו ספציפי Sca1<sup&gt; גבוה</sup&gt; בתאי גזע שמקורם שומן (ASCs)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

immunomagnetic-separation-fat-depot-specific-sca1high-adipose-derived

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

6.8K Views.  Biointerfaces Institute, University of Michigan. We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.

Video: Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the process by which they must be harvested can be associated with significant donor site morbidity. In contrast, adipose-derived stromal cells (ASCs) are more readily abundant and more easily harvested, making them an appealing alternative to BM-MSCs. Like BM-MSCs, ASCs can differentiate into osteogenic lineage cells and can be used in tissue engineering applications, such as seeding onto scaffolds for use in craniofacial skeletal defects. ASCs are obtained from the stromal vascular fraction (SVF) of digested adipose tissue, which is a heterogeneous mixture of ASCs, vascular endothelial and mural cells, smooth muscle cells, pericytes, fibroblasts, and circulating cells. Flow cytometric analysis has shown that the surface marker profile for ASCs is similar to that for BM-MSCs. Despite several published reports establishing markers for the ASC phenotype, there is still a lack of consensus over profiles identifying osteoprogenitor cells in this heterogeneous population. This protocol describes how to isolate and use a subpopulation of ASCs with enhanced osteogenic capacity to repair critical-sized calvarial defects.

The transcriptional heterogeneity within human adipose-derived stromal cells can be defined on the single cell level using cell surface markers and osteogenic genes. We describe a protocol utilizing flow cytometry for the isolation of cell subpopulations with increased osteogenic potential, which may be used to enhance craniofacial skeletal reconstruction.

בידוד וההעשרה של אדם שומן המופק מתאי סטרומה לOsteogenesis משופר

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. Although numerous immortalized adipogenic cell lines have been established, adipose-derived stem cells from the stromal vascular fraction of subcutaneous white adipose tissues provide a reliable cellular system ex vivo much closer to adipose development in vivo. Pig adipose-derived stem cells (pADSC) are isolated from 7- to 9-day old piglets. The dorsal white fat depot of porcine subcutaneous adipose tissues is sliced, minced and collagenase digested. These pADSC exhibit strong potential to differentiate into adipocytes. Moreover, the pADSC also possess multipotency, assessed by selective stem cell markers, to differentiate into various mesenchymal cell types including adipocytes, osteocytes, and chondrocytes. These pADSC can be used for clarification of molecular switches in regulating classical adipocyte differentiation or in direction to other mesenchymal cell types of mesodermal origin. Furthermore, extended lineages into cells of ectodermal and endodermal origin have recently been achieved. Therefore, pADSC derived in this protocol provide an abundant and assessable source of adult mesenchymal stem cells with full multipotency for studying adipose development and application to tissue engineering of regenerative medicine.

This protocol describes the isolation of pig adipose-derived stem cells (pADSC) from subcutaneous adipose tissues with examination of multipotency. The multipotent pADSC are used to delineate processes of adipocyte differentiation and study transdifferentiation into multiple cell lineages of mesodermal mesenchyme or further lineages of ectoderm and endoderm for regenerative studies.

בידוד ובידול של תאי גזע נגזר שומן מרקמות שומן תת עורי בשר חזירים

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used therapeutically, in the near future, to restore function to damaged organs. Nevertheless, several technical issues, including the highly invasive procedure of isolating MSCs and the inefficiency surrounding their amplification, currently hamper the potential clinical use of these therapeutic modalities. Herein, we introduce a highly efficient method for the generation of dedifferentiated fat cells (DFAT), MSC-like cells. Interestingly, DFAT cells can be differentiated into several cell types including adipogenic, osteogenic, and chondrogenic cells. Although other groups have previously presented various methods for generating DFAT cells from mature adipose tissue, our method allows us to produce DFAT cells more efficiently. In this regard, we demonstrate that DFAT culture medium (DCM), supplemented with 20% FBS, is more effective in generating DFAT cells than DMEM, supplemented with 20% FBS. Additionally, the DFAT cells produced by our cell culture method can be redifferentiated into several tissue types. As such, a very interesting and useful model for the study of tissue dedifferentiation is presented.

We have modified the conditions for DFAT cell generation and provide herein information regarding the use of an improved growth medium for the production of these cells.

שיטה יעילה להשיג תאי Dedifferentiated שומן

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes differentiated from stem cells using cytokines. Unfortunately, cytokine-induced chondrogenic differentiation is costly, time-consuming, and associated with a high risk of contamination during in vitro differentiation. However, biomechanical stimuli also serve as crucial regulatory factors for chondrogenesis. For example, mechanical stress can induce chondrogenic differentiation of stem cells, suggesting a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. In this study, we demonstrated that centrifugal gravity (CG, 2,400 &#215; g), a mechanical stress easily applied by centrifugation, induced the upregulation of sex determining region Y (SRY)-box 9 (SOX9) in adipose-derived stem cells (ASCs), causing them to express chondrogenic phenotypes. The centrifuged ASCs expressed higher levels of chondrogenic differentiation markers, such as aggrecan (ACAN), collagen type 2 alpha 1 (COL2A1), and collagen type 1 (COL1), but lower levels of collagen type 10 (COL10), a marker of hypertrophic chondrocytes. In addition, chondrogenic aggregate formation, a prerequisite for chondrogenesis, was observed in centrifuged ASCs.

Mechanical stress can induce the chondrogenic differentiation of stem cells, providing a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. We present a protocol to induce the chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells (ASCs) using centrifugal gravity (CG). CG-induced upregulation of SOX9 results in the development of chondrogenic phenotypes.

Chondrogenic בידול האינדוקציה של תאי גזע שמקורם שומן על ידי הכביד צנטריפוגלי

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own body. The ability to grow bone de novo using a patient's own cells would allow bony defects to be filled with adequate tissue without the morbidity of harvesting native bone. There is interest in the use of adipose-derived stromal cells (ASCs) as a source for tissue engineering because these are obtained from an abundant source: the patient's own adipose tissue. However, ASCs are a heterogeneous population and some subpopulations may be more effective in this application than others. Isolation of the most osteogenic population of ASCs could improve the efficiency and effectiveness of a bone engineering process. In this protocol, ASCs are obtained from subcutaneous fat tissue from a human donor. The subpopulation of ASCs expressing the marker BMPR-IB is isolated using FACS. These cells are then applied to an in vivo calvarial defect healing assay and are found to have improved osteogenic regenerative potential compared with unsorted cells.

Adipose-derived stromal cells may be useful for engineering new tissue from a patient's own cells. We present a protocol for the isolation of a subpopulation of human adipose-derived stromal cells (ASCs) with increased osteogenic potential, followed by application of the cells in an in vivo calvarial healing assay.

בידוד מהיר של BMPR-IB + השומן שמקורם בתאי סטרומה לשימוש במודל ריפוי פגם calvarial

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

רומן חדש פאט שומן טכניקת השתלת לדמיין את כלי השיט הדור של כלי הדם בתאי גזע אנדותל

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

אופקי הר שלם: עיבוד רומן פרוטוקול הדמיה על רקמה עבה, תלת מימדי חתכים של העור

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the efficacy of cell persistence and biodistribution of haMSCs in animal models. We demonstrated a method to label the cell membrane of haMSCs with lipophilic fluorescent dye. Subsequently, intra-articular injection of the labeled cells in rats with surgically induced KOA was monitored dynamically by an in vivo imaging system. We employed the lipophilic carbocyanines DiD (DilC18 (5)), a far-red fluorescent Dil (dialkylcarbocyanines) analog, which utilized a red laser to avoid excitation of the natural green autofluorescence from surrounding tissues. Furthermore, the red-shifted emission spectra of DiD allowed deep-tissue imaging in live animals and the labeling procedure caused no cytotoxic effects or functional damage to haMSCs. This approach has been shown to be an efficient tracking method for haMSCs in a rat KOA model. The application of this method could also be used to determine the optimal administration route and dosage of MSCs from other sources in pre-clinical studies.

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

This protocol describes an efficient way to monitor the cell persistence and biodistribution of human adipose-derived mesenchymal stem cells (haMSCs) by far-red fluorescence labeling in a rat knee osteoarthritis (KOA) model via intra-articular (IA) injection.

אין ויוו מעקב של האדם נגזר שומן בתאי גזע Mesenchymal במודל דלקת מפרקים ניוונית של הברך עכברוש עם קרום Lipophilic פלורסנט לצבוע

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Photoconversion תא בודד בהמחיה שלם דג זברה

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...