Bu eser (THC) NIH DK095137 tarafından desteklenmektedir. Biz anlatılan yöntemlerin geliştirilmesine ve gelişmişliği katkıda mevcut ve eski laboratuar üyelerine teşekkür ederim.

Etik Beyanı: Hayvanların Kullanımı ve Bakımı Michigan Komitesi Üniversitesi (UCUCA) (Laboratuar Hayvan Araştırma Enstitüsü, Ulusal Araştırma Konseyi) Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu uyarınca tüm yöntemleri ve protokolleri onayladı. Fareler bir Michigan Üniversitesi vivari tutulur ve gıda ve suya ücretsiz erişim verildi ve 12 saat aydınlık / karanlık döngüsü üzerinde tutulur. 1. hazırlıklar <ol><li> DMEM,% 10 FBS, 1x P / S / G, ve 1x antibiyotikler / antifungal ile primer kültür ortamı hazırlayın. Bu daha önce sindirime dokuları tutmak için kullanılır. 37 ºC su banyosunda stok ve kısım yerleştirin. </li><li> 5 mg / ml (+ Ca, Mg), yağ yastığı her bir tipi için beş fare kadar yalıtıldıktan HBSS içinde çözülmüş tip III kolajenaz çözeltisi, beş mililitre hazırlayın. Tek bir genotipten SQ ve VIS izole edilirken, vahşi tip ve mutant kare olduğu ve VIS, 20 ml yapmak, örneğin, 10 ml yapmak. 7.4 Ste pH ayarlamaFiltreyi rile. 50 ml tüpler içine kısım. kenara ışıktan uzakta ayarlayın. </li><li> Cerrahi alan dezenfekte% 70 etanol kullanın. aşağı silin ve mavi ped ile kaplayın. Mavi pad üzerinde bazı etanol püskürtün. </li><li> strafor kurulu bir emici ped aşağı pin ve makasla kesme 22 G iğne kullanın. sonra mavi pad üzerinde kurulu ayarlayabilir ve diseksiyon başlamadan kadar başka bir mavi ped ile kaplayın etanol ile pedi püskürtün. </li><li> cerrahi alan bitişik bir stand etanol ve yer ile iki 50 ml tüpler doldurun. Etanol makas ve forseps yerleştirin. </li><li> cerrahi aletleri etanol kapalı durulama için PBS artı 1x anti-anti başka 50 ml tüp doldurun. </li><li> kaputu, her bir doku tipi etiket 60 mm yemekleri ve 37 ºC ısıtılmış kültür ortamı ile doldurun. Cerrahi alana bitişik tabak yerleştirin. </li></ol> Subkütan (SQ) Yağ Pads 2. izolasyonu <ol><li> izofluran ve pnömotoraks aşırı dozda fare Euthanize. </li><li> Nazikçe% 70 etanol ile fare sprey ve sırtüstü yatıyordu. 22 G iğne ile köpük kuruluna pençeleri sabitleyin. </li><li> Alt karın derisinde küçük bir kesim yapın. forseps ile kesilen üst Holding, makas almak ve periton cilt ayırmak. </li><li> Cilt karından göğüse periton ayrılır sonra, vücudun yan tarafında deride yan keser yaparak uzak kafasına doğru periton cilt yansıtır. </li><li> vücuttan uzak kasık yağ tutma kalan cilt yansıtır ve 22 G iğne ile kuruluna aşağı pin. </li><li> ince makas ve forseps geçin. periton yakın kökeni forseps ile kasık yağ yastığı tut ve deri ile SQ kirletici kaçınarak kasık doğru ilerleyen deri ve kasık yağ arasında uzak snip. </li><li> etiketli 60 mm çanak güneşe maruz kasık yağ yastığı yerleştirin. </li></ol> Visseral (VIS) Yağ Pads 3. İzolasyon <ol><li> Benzer bir şekilde, 2.5 adım yağ yastıkları ve bağırsak visseral maruz açık periton kesmek için. </li><li> uzakta toraks doğru gut hareket ettirin. </li><li> uzak ucunda VIS yağ yastığı tut ve yavaşça yukarı doğru çekin. doku (dişi fareler kullanıyorsanız, ya da rahim) epididimal dışlamak için dikkat ederek VIS yağ yastığı parçalara ayır. </li><li> etiketli çanak ve kalan VIS pad adımı yineleyin 3.3 yerleştirin. </li></ol> Yağ Pads 4. kollajenaz sindirimi <ol><li> doku kültürü kaputu 60 mm yemekleri taşımak ve medya aspire. </li><li> kavisli makas sonra kollajenaz çözüm eklemek ile yağ yastıkları kıyma. etanol ve PBS ile doku tipleri arasındaki makas ve forseps durulama emin olun. </li><li> dokular dijeste kadar 300 rpm&#39;de 10-20 dakika boyunca 37 ° C&#39;de çalkalanır. SQ bazı parçaları hala görünür eğer kabul edilebilir. Bu bir sonraki adımda ele alınacaktır. </li><li> collag durdurmak için kollajenaz çözeltisine kültür ortamı 25 ml ilave edilir10 ml&#39;lik serolojik pipet ile enase tedavi ve pipet yukarı ve aşağı 10 kez sindirilmiş dokuları dağıtmak için. </li><li> 100 mikron hücre süzgeç kullanarak Gerilme hücreleri. 300 x g, 10 dakika boyunca santrifüj. </li><li> Dikkatle pelet rahatsız ve yavaşça hücrelerin askıya pipet pelet steril su 5 ml ekleyin ve için medyayı kapalı süzün. eritrositleri lizise uğratmak üzere 2 dakika bekleyin. </li><li> yeni bir 100 mikron hücre süzgecinden% 10 FBS ve şekil hücreleri ile ortam 25 ml ilave edilir. </li><li> 300 x g, 10 dakika boyunca santrifüj. Durusu medya ve kültür ortamı 1 ml tekrar süspansiyon pelet. </li><li> 1 tripan mavi: 1 kullanarak bir hemasitometre ile hücre sayımı. </li><li> 6 oyuklu bir plaka üzerinde, bir oyuk Levha 1 x 10 6 hücre. </li></ol> 5. Manyetik Hücre Ayırma <ol><li> Hücre yapışması, yaklaşık 4 ila 6 saat sonra, HBSS (-Ca, -mg) ile iki kez hücreleri yıkayın. % 0.05 tripsin kullanılarak yapışkan hücreleri ayırmak. 1 ml ayırma tamponu ve spin tripsin hücre süspansiyonu seyreltilir300 x g 5 dak. </li><li> Süpernatant aspire. 500 ul tampon içinde süspanse edin hücreleri. 10 ul kısım çıkarın ve hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. </li><li> 300 x g, 5 dakika boyunca Spin hücreleri. </li><li> Aspire tamamen süpernatanlarına. 90 ul tampon içinde süspanse edin hücreleri. 10 ul anti-Sca1-FITC ile primer antikor ekleyin. İyice karıştırın ve karanlıkta 4 ° C&#39;de 10 dakika inkübe edilir. </li><li> mi tampon ve santrifüj hücreler, 300 x g, 5 dakika için 1 hücreleri yıkayın. tamamen süpernatantı. </li><li> 80 ul tampon içinde süspanse edin hücreleri. 20 ul anti-FITC mikroboncukları ekleyin. İyice karıştırın ve karanlıkta 4 ° C&#39;de 15 dakika inkübe edilir. </li><li> mi tampon ve santrifüj hücreler, 300 x g, 5 dakika için 1 hücreleri yıkayın. </li><li> 500 ul tampon süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet çıkarın. </li><li> Manyetik tutucu sütun yerleştirin ve 500 ul tamponu ile sütun yıkayın. </li><li> kolonuna hücre süspansiyonu ekleyin. pipetlenmesinden sırasında kabarcıkları kaçının. </li><li> Etiketsiz SCA1 toplayın - &lt;/ Sup&gt; hücreler ve 500 ul tampon ile kolon 3 kere yıkayın. rezervuar boşken sadece yeni tampon ekleyin. pipetlenmesinden sırasında kabarcıkları kaçının. </li><li> manyetik tutucu sütunu çıkarın ve 15 ml konik tüp içine yerleştirin. </li><li> Kolon rezervuar üzerinden sağlanan pistonu iterek Sca1 + kolona tampon ve Zehir ml 1 ekleyin. </li><li> 300 x g&#39;de 5 dakika boyunca hücre kesirler aşağı doğru döndürün. 1 ml kültür ortamı içinde süspanse hücreleri. </li><li> etiketli ve etiketsiz kesirler 10 ul kısım çıkarın ve hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. </li><li> 6 plaka 1 kuyuda her bir hücre fraksiyonu Plate. </li></ol> Akım Sitometrisi ile Sca1 yüksek ACSS ve İmmunomanyetik Ayrılık 6. Doğrulama <ol><li> HBSS (-Ca, -MG) ile iki kez hücreleri durulayın ve% 0.05 tripsin kullanarak hücreleri ayırmak. </li><li> 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüje hücreleri. 1 ml kültür ortamı içinde süspanse edin hücreleri ve hemasitometre kullanarak saymak. </li><li> Elde&gt; 10 6 </sup&gt; 1 ml kültür ortamı içinde hücre ve 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> süpernatant ve tekrar adım 6.3 iki kez daha çıkarın. </li><li> % 2 keçi serumu, 1 ml +% 2 BSA ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir blok ile yeniden süspanse hücreleri. </li><li> 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüje hücreleri. </li><li> çözümü engelleme çıkarın. </li><li> 4 ° C&#39;de% 2 keçi serumu ve% 2 BSA + PBS ile 100 ul PBS içinde: ya da anti-SCA1 Alexa Fluor 647 (400, 0.25 ug, 1): sıçan IgG2a Alexa Fluor 647 (400, 0.25 ug, 1) ekleme karanlıkta 30 dakika karıştırıldı. </li><li> hücreler soğuk PBS ile 1 ml ilave edilir. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca santrifüje 300 x g. </li><li> süpernatant ve tekrar adım 6.9 iki kez daha çıkarın. </li><li> 1 ml PBS içinde yeniden süspanse hücreleri. akım sitometri analizi için hazırlık 100 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonları iletin. </li></ol>

<ol>
	<li>Chun, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pericellular+collagenase+directs+the+3-dimensional+development+of+white+adipose+tissue.">A pericellular collagenase directs the 3-dimensional development of white adipose tissue.</a> Cell. 125 (3), 577-591 (2006).</li><li>Chun, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+link+between+obesity+and+MMP14-dependent+adipogenic+collagen+turnover.">Genetic link between obesity and MMP14-dependent adipogenic collagen turnover.</a> Diabetes. 59 (10), 2484-2494 (2010).</li><li>Chun, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peri-adipocyte+ECM+remodeling+in+obesity+and+adipose+tissue+fibrosis.">Peri-adipocyte ECM remodeling in obesity and adipose tissue fibrosis.</a> Adipocyte. 1 (2), 89-95 (2012).</li><li>Sun, K., Tordjman, J., Clement, K., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrosis+and+adipose+tissue+dysfunction.">Fibrosis and adipose tissue dysfunction.</a> Cell Metab. 18 (4), 470-477 (2013).</li><li>Spangrude, G., Heimfeld, S., Weissman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Characterization+of+Mouse+Hematopoietic+Stem+Cells.">Purification and Characterization of Mouse Hematopoietic Stem Cells.</a> Science. 241, 58-62 (1988).</li><li>Welm, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sca-1(pos)+cells+in+the+mouse+mammary+gland+represent+an+enriched+progenitor+cell+population.">Sca-1(pos) cells in the mouse mammary gland represent an enriched progenitor cell population.</a> Dev Biol. 245 (1), 42-56 (2002).</li><li>Gesta, S., Tseng, Y. H., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+origin+of+fat:+tracking+obesity+to+its+source.">Developmental origin of fat: tracking obesity to its source.</a> Cell. 131 (2), 242-256 (2007).</li><li>Tang, W., Zeve, D., Suh, J. M., Bosnakovski, D., Kyba, M., Hammer, R. E., Tallquist, M. D., Graff, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White+fat+progenitor+cells+reside+in+the+adipose+vasculature.">White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature.</a> Science. 322, 583-586 (2008).</li><li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo.">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li><li>Tokunaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+depot-specific+gene+signature+and+ECM+remodeling+of+Sca1(high)+adipose-derived+stem+cells.">Fat depot-specific gene signature and ECM remodeling of Sca1(high) adipose-derived stem cells.</a> Matrix Biol. 36, 28-38 (2014).</li><li>Chun, T. H., Inoue, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+adipocyte+differentiation+and+peri-adipocyte+collagen+turnover.">3-D adipocyte differentiation and peri-adipocyte collagen turnover.</a> Methods Enzymol. 538, 15-34 (2014).</li><li>Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+ready-to-use,+storable+and+reconstituted+type+I+collagen+from+rat+tail+tendon+for+tissue+engineering+applications.">Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).</li><li>Ma, X., Robin, C., Ottersbach, K., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ly-6A+(Sca-1)+GFP+Transgene+is+Expressed+in+all+Adult+Mouse+Hematopoietic+Stem+Cells.">The Ly-6A (Sca-1) GFP Transgene is Expressed in all Adult Mouse Hematopoietic Stem Cells.</a> Stem Cells. 20 (6), 514-521 (2002).</li><li>Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+adipocyte+cellular+lineage+in+vivo.">Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo.</a> Nat Cell Biol. 15 (3), 302-308 (2013).</li><li>Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+depot-specific+activation+of+adipocyte+precursor+cells+at+the+onset+of+obesity.">Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity.</a> Nat Cell Biol. 17 (4), 376-385 (2015).</li><li>Mori, S., Kiuchi, S., Ouchi, A., Hase, T., Murase, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristic+Expression+of+Extracellular+Matrix+in+Subcutaneous+Adipose+Tissue+Development+and+Adipogenesis;+Comparison+with+Visceral+Adipose+Tissue.">Characteristic Expression of Extracellular Matrix in Subcutaneous Adipose Tissue Development and Adipogenesis; Comparison with Visceral Adipose Tissue.</a> Int J Biol Sci. 10 (8), 825-833 (2014).</li><li>Ong, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Specific+Cell-Surface+Markers+of+Adipose-Derived+Stem+Cells+from+Subcutaneous+and+Visceral+Fat+Depots.">Identification of Specific Cell-Surface Markers of Adipose-Derived Stem Cells from Subcutaneous and Visceral Fat Depots.</a> Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu yazıda izolasyon ve farklı yağ pedleri gelen fare TSK immunomagnetic hücre ayırma ve in vitro deneyler için onların kullanımını göstermektedir. Sunulan yöntem TSK 9,14 arasında, teknik olarak karmaşık ve pahalı FACS aracılı izolasyon avantajlıdır Sca1 pozitif TSK sayıda hızlı izolasyonu için etkilidir. FACS aksine immünomanyetik hücre ayırma, bir hedef hücre popülasyonunun belirlenmesine ilişkin birden fazla antijenin kullanılmasına izin vermez. Yüzey antijeni iyi karakterize eğer Bununla birlikte, immunomagnetic ayrılık kullanımı çekirdek tesisleri olmadan hala küçük enstitülerde birçok biyolojik araştırmacılara kolayca erişilebilir değil FACS ekipman 15, kullanımı dayanmadan analiz edilecek hücrelerin sayısı artar . başarılı bir sonuç sağlamak için uyulması gereken prosedür bazı kritik yönleri vardır. ADIP tedarikFare adipoz doku depoları cerrahi izolasyon kök hücreleri gerektirir ose türetilmiş. Bu yüzden, doku alma hızı ve doğruluğu canlı hücre sayısının yüksek verim şarttır. Buna ek olarak, temiz cerrahi alanları ve araçların bakım, hücre ve doku örneklerinin mikrobiyal kontaminasyonu engelleyerek prosedürün sonucu için çok önemlidir. Dissected adipoz doku, enzimatik olarak bir tip II kolajenaz çözeltisi içinde ayrılmış olmalıdır. ECM, kompozisyon SQ daha az kollagenler içerirler VIS SQ ve VIS yağ pedleri 10,16 arasında değişmektedir. Bu nedenle, VIS yağ yastığı sindirim süresi SQ olarak zaman yaklaşık yarısı gerektirir. Doku küçük parçacıklar de kolajenaz çözeltisi içinde mevcut olsa bile belirtilen bir enkübasyon süresinden sonra, doku sindirim durdurmak için kabul edilebilir. Kültür ortamı kolajenaz aktivitesini inhibe eklendikten sonra bu parçalar mekanik pipetleme ile ayrılabilir. Bu mümkün olsa da devam etmek içindoğrudan immunomagnetic sıralamaya hücre sıralama ile devam etmeden önce yaklaşık 4 ila 6 saat boyunca bizim grup tohumları, plastik plakalar üzerinde 1 x 10 6 sıralanmamış hücreleri SVF izolasyon aşağıdaki. SVF izolasyonu sırasında birden filtrasyon adımlara rağmen, enkaz hala hücre süspansiyonu içinde mevcut olacaktır. immunomagnetic hücre ayırma geçmeden önce kaplama hücreleri böylece manyetik sıralama sadece adipogenic progenitör hücreleri içeren yapışık hücrelere uygulanacak sağlayan, uzak enkaz ve serbest hücreleri yıkamak için bir fırsat sağlar. Sca1 insan genomunda bulunan olmasa da, kimlik ve bu hücre ayırma tekniği ile birleştiğinde yağ depo bağımlı insan adipoz kök hücreleri 17, ifade alternatif hücre yüzey antijenleri doğrulama, bize insan adipoz kök hücre biyolojisi tanımlanmasına yardımcı olabilir.

Hücre antijeni 1 (SCA1 veya LY6A / e) kök ilk hematopoietik ve mezenkimal kök hücreleri 5,6 ile ifade edilen bir hücre yüzey markerı olarak tespit edilmiştir. Fare yağ depolarından elde edilen yağ dokusu stromal vasküler fraksiyonu (SVF) fibroblastlar, makrofajlar, vasküler endotelyal hücreler, nöronal hücrelerin ve adiposit progenitör hücrelerin 7 hücrelerinden oluşan heterojen bir popülasyonu. Adiposit progenitör hücreleri veya adipoz kaynaklı kök hücreler (TSK) kollajen zengin perivasküler hücre dışı matriks (ECM) 8 ikamet dışı lipid yüklü hücrelerdir. CD34 +: SCA1 + 9 ve CD29 + - yaklaşık SVF% 50 soy-negatif (Lin) olarak karakterize edilmiştir TSK oluşmaktadır. In vitro adiposit farklılaşması edebilen adiposit ataları, - CD24: bu hücrelerin çoğu Sca1 + &#39;dır Bununla birlikte, hücrelerin sadece küçük bir kısmı (SVF 0.08%) SCA1 teşkil <syukarı&gt; +: çoğalan ve in vivo koşullarda 9 adipositlere farklılaşma tamamen yetenekli CD24 + hücreler. CD24 gelen CD24 + hücreler demeden Sca1 + SVF kullanarak potansiyel ihtar rağmen - immunomagnetic hücre ayırma kullanarak yağ depolarından SCA1 + TSK, hücreler izole birincil adiposit progenitör hücrelerin hücre özerk fenotip belirlemek için etkili ve pratik bir yaklaşımdır. Obezite ve diyabet, doku fibrozu ve enflamasyon alanına tip-2 diyabet 3 gelişimi ve korunmasında önemli bir rol oynamaktadır. Son zamanlarda, Tokunaga ve ark. (VIS veya visseral) inguinal (ya da deri altı, SQ) ve perigonadal izole Sca1 yüksek hücreler C57BL6 / J yağ depoları vitro 10 farklı gen imzalar ve ECM biçimlenme sergilerler gösterdi. MMP14 (MT1-MMP), membran-t prototip üyesiYPE matriks metalloproteinaz (MMP) ailesi kolajenolitik aktiviteye 1 ile beyaz adipoz dokuda (WAT) gelişimini aracılık eder. Aşağıdaki protokol ile izole edilmiş ve zenginleştirilmiş hücreleri ile gerçekleştirilebilir deney örnekleri arasında, üç boyutlu bir kültür, farklılaşma çalışmaları, kolajen alçalmasının tahlilleri ve RNA sıralaması 10,11 bulunmaktadır. Parçalanma deneyleri telopeptit 11,12 korunmasını sağlamak için asit ekstre kollajen ile yapılmalıdır. Aşağıdaki protokol farklı yağ depolarından birincil vasküler stroma hücreleri izole ve immunomagnetic hücre ayırma yöntemi adiposit progenitör hücreler zenginleştirmek için yöntemler gösterecektir. Hücre sıralama geçerliliği akım sitometri ile ve bir Sca1 promotör 13 tarafından tahrik SCA1 + hücrelerde GFP ifade Sca1-GFP fareler kullanılarak yoluyla değerlendirilecektir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Type 3 Collagenase</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS004182</td>
			<td>Tissue digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>High-glucose culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep/Glutamine (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td>Media antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-anti (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>Media antifungal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x, pH 7.4)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (0.05%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>352360</td>
			<td>100-&#956;m cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm plates</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14001-12</td>
			<td>Large</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14091-11</td>
			<td>Fine, curved tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11000-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G 5/8&#8221; needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22G 1.5&#8221; needles</td>
			<td>BD</td>
			<td>305159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml conical tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml conical tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS separation columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Anti-Sca1 microbead kit (FITC)</td>
			<td rowspan="3">Miltenyi Biotec</td>
			<td rowspan="3">130-092-529</td>
			<td rowspan="3">FITC-anti-Sca1 1&#186;Ab and anti-FITC microbeads 2&#186;Ab</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS running buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue chux pads</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>276-12424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbent pads</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>19-165-621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam board</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use from 50ml tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2a Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R2a21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2a anti-mouse Sca1 Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MSCA21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2a R-PE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R2a04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat IgG2a anti-mouse F4/80 R-PE</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MF48004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-bottom tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (&#8211;Ca, &#8211;Mg)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (+Ca, +Mg)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
			<td>For collagenase solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type I collagen (2.7 mg/ml in 37mm acetic acid</td>
			<td>Prepare in house12</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11430-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.34N NaOH</td>
			<td>Prepare in house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2870-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 carboxylic acid, succinimidyl ester, mixed isomers</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-20004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.89M NaHCO3&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25080-094</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunomagnetic separation of fat depot-specific sca1high adipose-derived stem cells (ascs)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix (ECM) remodeling. In vivo, ECM-rich environment consisting of fibrillar collagens provides a structural support to adipose tissues during the progression and regression of obesity. Physiological ECM remodeling mediated by matrix metalloproteinases (MMPs) plays a major role in regulating adipose tissue size and function1,2. The loss of physiological collagenolytic ECM remodeling may lead to excessive collagen accumulation (tissue fibrosis), macrophage infiltration, and ultimately, a loss of metabolic homeostasis including insulin resistance3,4. When a phenotypic change of the adipose tissue is observed in gene-targeted mouse models, isolating primary ASCs from fat depots for in vitro studies is an effective approach to define the role of the specific gene in regulating the function of ASCs. In the following, we define an immunomagnetic separation of Sca1high ASCs.

Farklı Yağ Pads gelen Sca1 yüksek TSK zenginleştirilmesi. SQ yağ görüntüleme fibroblast benzeri izole vasküler stromal hücreler SCA1 sentezleme seviyesi (Şekil 1A) bağımsız hücre şekli uzanıyordu. VIS Öte yandan, (eWAT türevi), yüksek Sca1 ve Sca1 düşük hücreleri, hücre şekli belirgin farkı göstermektedir. VIS SQ (IWAT türevi) Sca1 yüksek hücreler gibi VIS Sca1 düşük hücreler epiteloid şekil göstermek ise Sca1 yüksek hücreler, fibroblast benzeri hücre şekli gergin göstermezse (eWAT türevi). Sca1-GFP farelerden izole Sca1 yüksek hücreleri kolayca doku kültürü (Şekil 1B) GFP-pozitif hücreler olarak tanımlanır. Bu hücreler, akış sitometrisi ile değerlendirildiğinde An ile saptanan, GFP pozitif hücrelerinin çoğu hücre yüzeyi üzerinde Sca1 proteinleri ifade etmek için doğrulanmıştırTi-Sca1 antikoru (Şekil 1C). EWAT türetilmiş Sca1 yüksek hücreler, geleneksel adipojenik karışımı 10 adiposit farklılaşması için daha zor ise inguinal yağ yastığı türetilen Sca1 yüksek hücre adiposit farklılaşmasının kapasitesi artmıştır saklamalıdır. Sca1 yüksek TSK Yağ Deposu bağımlı Gen İfadesi (Şekil 2). Hücre dışı matriks proteinlerine ve modifiye ile ilişkili genlerin zenginleştirme gösterdi genom çapında transcriptome RNA sıralanması ile analizleri (GO: 0031012, GO: 0005578) bu Sca1 yüksek TSK 10. PCR analizleri gerçek zamanlı ile birleştiğinde, biz kolajenolitik MMP (MMP2, MMP8, MMP13, MMP14) iWAT- arasında eWAT türetilmiş Sca1 yüksek TSK diferansiyel ifadesini göstermek başardık. Tüm floresan işaretli tip jeller t kullanılmıştır kollajen<html> o perisellüler bozulma aktivitesini değerlendirmek, biz VIS Sca1 yüksek TSK 10 aracılığı ile belirgin artmış kollajen remodeling aktivitesini gözlendi. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53890/53890fig1.jpg" /> Şekil 1: Farklı Yağ Depolarında gelen Fare Sca1 yüksek TSK İmmunomanyetik Ayırma SQ (IWAT) ve VIS (eWAT) izole (A) Sca1 yüksek ve Sca1 düşük TSK.. Ölçek = 100 um. (B) Sca-GFP farelerin IWAT izole Sca1-GFP hücreleri. Ölçek = 100 um. Akış sitometrisi ile değerlendirildi Sca1-GFP pozitif hücrelerde SCA1 (C) hücre yüzeyi ekspresyonu. (Solda), kontrol sıçan IgG (sağda), anti-Sca1 antikor. X ekseni, GFP yoğunluğu. Y-ekseni, Tokunaga, M. ve arkadaşları, daha önce gösterilen Alexa Fluor 647 Panel A., (2014).ig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53890/53890fig2.jpg" /> Şekil 2:. Farklı yağ depolarından izole Sca1 yüksek TSK içinde ECM&#39;lerin kolajenolitik MMP, TIMP&#39;lerin ve kollagen Yağ Deposu Bağımlı Anlatım (A) Diferansiyel gen ekspresyonu ve ECM düzenleyiciler. (B) VIS Artan kolajen yıkımı aktivitesini Sca1 yüksek TSK (eWAT türevi). kollajen bozulması floresan sinyalleri (oklar ve ok uçları) kaybolması olarak gösterilir. Ankastre SQ TSK bireysel bir hücrenin aracılık ettiği odaklı kolajen degradasyonu büyütülmüş bir görüntüdür. Hücreler, 72 saat boyunca kültürlenmiştir. Tokunaga, M. ve ark önceden gösterilen veriler., (2014). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53890/53890fig2large.jpg" target="_blank">V için tıklayınız</a>Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu iew.

Watch this Scientific Journal Video about Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs at JoVE.com

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.

Yağ Deposu özgü SCA1 ve İmmunomanyetik Ayırma<sup&gt; yüksek</sup&gt; Yağ türetilmiş Kök Hücreler (TSK)

The isolation of adipose-derived stem cells (ASCs) is an important method in the field of adipose tissue biology, adipogenesis, and extracellular matrix ...

immunomagnetic-separation-fat-depot-specific-sca1high-adipose-derived

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells (ASCs)

6.8K Görüntüleme.  Biointerfaces Institute, University of Michigan. We present the techniques required to isolate the stromal vascular fraction (SVF) from mouse inguinal (subcutaneous) and perigonadal (visceral) adipose tissue depots to assess their gene expression and collagenolytic activity. This method includes the enrichment of Sca1high adipose-derived stem cells (ASCs) using immunomagnetic cell separation.

Video: Immunomagnetic Separation of Fat Depot-specific Sca1high Adipose-derived Stem Cells ASCs

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the process by which they must be harvested can be associated with significant donor site morbidity. In contrast, adipose-derived stromal cells (ASCs) are more readily abundant and more easily harvested, making them an appealing alternative to BM-MSCs. Like BM-MSCs, ASCs can differentiate into osteogenic lineage cells and can be used in tissue engineering applications, such as seeding onto scaffolds for use in craniofacial skeletal defects. ASCs are obtained from the stromal vascular fraction (SVF) of digested adipose tissue, which is a heterogeneous mixture of ASCs, vascular endothelial and mural cells, smooth muscle cells, pericytes, fibroblasts, and circulating cells. Flow cytometric analysis has shown that the surface marker profile for ASCs is similar to that for BM-MSCs. Despite several published reports establishing markers for the ASC phenotype, there is still a lack of consensus over profiles identifying osteoprogenitor cells in this heterogeneous population. This protocol describes how to isolate and use a subpopulation of ASCs with enhanced osteogenic capacity to repair critical-sized calvarial defects.

The transcriptional heterogeneity within human adipose-derived stromal cells can be defined on the single cell level using cell surface markers and osteogenic genes. We describe a protocol utilizing flow cytometry for the isolation of cell subpopulations with increased osteogenic potential, which may be used to enhance craniofacial skeletal reconstruction.

İzolasyon ve İnsan zenginleştirilmesi Gelişmiş Osteogenezi için Stromal Hücreleri adipoz-türevi

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Gelişim Biyolojisi

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. Although numerous immortalized adipogenic cell lines have been established, adipose-derived stem cells from the stromal vascular fraction of subcutaneous white adipose tissues provide a reliable cellular system ex vivo much closer to adipose development in vivo. Pig adipose-derived stem cells (pADSC) are isolated from 7- to 9-day old piglets. The dorsal white fat depot of porcine subcutaneous adipose tissues is sliced, minced and collagenase digested. These pADSC exhibit strong potential to differentiate into adipocytes. Moreover, the pADSC also possess multipotency, assessed by selective stem cell markers, to differentiate into various mesenchymal cell types including adipocytes, osteocytes, and chondrocytes. These pADSC can be used for clarification of molecular switches in regulating classical adipocyte differentiation or in direction to other mesenchymal cell types of mesodermal origin. Furthermore, extended lineages into cells of ectodermal and endodermal origin have recently been achieved. Therefore, pADSC derived in this protocol provide an abundant and assessable source of adult mesenchymal stem cells with full multipotency for studying adipose development and application to tissue engineering of regenerative medicine.

This protocol describes the isolation of pig adipose-derived stem cells (pADSC) from subcutaneous adipose tissues with examination of multipotency. The multipotent pADSC are used to delineate processes of adipocyte differentiation and study transdifferentiation into multiple cell lineages of mesodermal mesenchyme or further lineages of ectoderm and endoderm for regenerative studies.

Domuz Subkutan yağ dokularındaki İzolasyonu ve Yağ-Türetilmiş Kök Hücre Farklılaşması

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used therapeutically, in the near future, to restore function to damaged organs. Nevertheless, several technical issues, including the highly invasive procedure of isolating MSCs and the inefficiency surrounding their amplification, currently hamper the potential clinical use of these therapeutic modalities. Herein, we introduce a highly efficient method for the generation of dedifferentiated fat cells (DFAT), MSC-like cells. Interestingly, DFAT cells can be differentiated into several cell types including adipogenic, osteogenic, and chondrogenic cells. Although other groups have previously presented various methods for generating DFAT cells from mature adipose tissue, our method allows us to produce DFAT cells more efficiently. In this regard, we demonstrate that DFAT culture medium (DCM), supplemented with 20% FBS, is more effective in generating DFAT cells than DMEM, supplemented with 20% FBS. Additionally, the DFAT cells produced by our cell culture method can be redifferentiated into several tissue types. As such, a very interesting and useful model for the study of tissue dedifferentiation is presented.

We have modified the conditions for DFAT cell generation and provide herein information regarding the use of an improved growth medium for the production of these cells.

Etkin Bir Yöntem Dediferansiye Yağ Hücreleri Elde

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes differentiated from stem cells using cytokines. Unfortunately, cytokine-induced chondrogenic differentiation is costly, time-consuming, and associated with a high risk of contamination during in vitro differentiation. However, biomechanical stimuli also serve as crucial regulatory factors for chondrogenesis. For example, mechanical stress can induce chondrogenic differentiation of stem cells, suggesting a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. In this study, we demonstrated that centrifugal gravity (CG, 2,400 &#215; g), a mechanical stress easily applied by centrifugation, induced the upregulation of sex determining region Y (SRY)-box 9 (SOX9) in adipose-derived stem cells (ASCs), causing them to express chondrogenic phenotypes. The centrifuged ASCs expressed higher levels of chondrogenic differentiation markers, such as aggrecan (ACAN), collagen type 2 alpha 1 (COL2A1), and collagen type 1 (COL1), but lower levels of collagen type 10 (COL10), a marker of hypertrophic chondrocytes. In addition, chondrogenic aggregate formation, a prerequisite for chondrogenesis, was observed in centrifuged ASCs.

Mechanical stress can induce the chondrogenic differentiation of stem cells, providing a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. We present a protocol to induce the chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells (ASCs) using centrifugal gravity (CG). CG-induced upregulation of SOX9 results in the development of chondrogenic phenotypes.

Santrifüj Yerçekimi ile adipoz kaynaklı Kök Hücrelerin kondrojenik Farklılaşma İndüksiyon

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

Rapid Isolation of BMPR-IB+ Adipose-Derived Stromal Cells for Use in a Calvarial Defect Healing Model

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own body. The ability to grow bone de novo using a patient's own cells would allow bony defects to be filled with adequate tissue without the morbidity of harvesting native bone. There is interest in the use of adipose-derived stromal cells (ASCs) as a source for tissue engineering because these are obtained from an abundant source: the patient's own adipose tissue. However, ASCs are a heterogeneous population and some subpopulations may be more effective in this application than others. Isolation of the most osteogenic population of ASCs could improve the efficiency and effectiveness of a bone engineering process. In this protocol, ASCs are obtained from subcutaneous fat tissue from a human donor. The subpopulation of ASCs expressing the marker BMPR-IB is isolated using FACS. These cells are then applied to an in vivo calvarial defect healing assay and are found to have improved osteogenic regenerative potential compared with unsorted cells.

Adipose-derived stromal cells may be useful for engineering new tissue from a patient's own cells. We present a protocol for the isolation of a subpopulation of human adipose-derived stromal cells (ASCs) with increased osteogenic potential, followed by application of the cells in an in vivo calvarial healing assay.

BMPR-IB + hızlı İzolasyon Kalvaryum Hata Şifa Modeli Kullanılan Stromal Hücreleri yağ kaynaklı

Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient's own ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

Vasküler Endotelyal Kök Hücrelerin Damar Oluşumunu Görselleştirmek İçin Yeni Bir Göğüs Göğsü Transplantasyon Tekniği

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

Yatay Dağ Dağı: Derinin kalın, üç boyutlu doku kesitleri için yeni bir İşleme ve Görüntüleme Protokolü

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the efficacy of cell persistence and biodistribution of haMSCs in animal models. We demonstrated a method to label the cell membrane of haMSCs with lipophilic fluorescent dye. Subsequently, intra-articular injection of the labeled cells in rats with surgically induced KOA was monitored dynamically by an in vivo imaging system. We employed the lipophilic carbocyanines DiD (DilC18 (5)), a far-red fluorescent Dil (dialkylcarbocyanines) analog, which utilized a red laser to avoid excitation of the natural green autofluorescence from surrounding tissues. Furthermore, the red-shifted emission spectra of DiD allowed deep-tissue imaging in live animals and the labeling procedure caused no cytotoxic effects or functional damage to haMSCs. This approach has been shown to be an efficient tracking method for haMSCs in a rat KOA model. The application of this method could also be used to determine the optimal administration route and dosage of MSCs from other sources in pre-clinical studies.

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

This protocol describes an efficient way to monitor the cell persistence and biodistribution of human adipose-derived mesenchymal stem cells (haMSCs) by far-red fluorescence labeling in a rat knee osteoarthritis (KOA) model via intra-articular (IA) injection.

Vivo İnsan yağ elde edilen Mezenkimal kök hücrelerin sıçan diz osteoartrit modelinde floresan lipofilik membran boya ile izleme

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Yaşam sağlam Zebra balığı tek hücreli Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...