SAS and MGA are supported by Project Grants, a Program Grant and Research Fellowships from the National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC), and by funds from the Operational Infrastructure Support Program provided by the Victorian Government, Australia. MMH has support from a Peter MacCallum Foundation Grant.

מקור IL-3 ו הכנת אחד מעמיתי המחקר-3D ממוזג בינוני הערה: תא לוקמיה granulocytic העכבר קו אחד מעמיתי המחקר-3D הוא תרבותי כדי ליצור בינוני מותנה המכיל IL-3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות, אחד מעמיתי המחקר-3D ב בינוני של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM), 10% בסרום שור העובר (FBS), 1% תוספת גלוטמין לכל החיים, 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​גנטמיצין. לחסן 5 × 10 6 תאים בשלב יומן של צמיחה לתוך 50 מ&quot;ל של מדיום תרבות טרי בבקבוק תרבות T175 ס&quot;מ 3 רקמות לגדול במשך כ -7 ימים או עד שהתאים עברו שלב יומן שלהם הצמיחה בכ 24 - 48 שעות (למנוע מוות של תאים מוגזם בתרבות). התקשורת אוויר הוא מסוגל להיות מאוחסן במשך שנים מרובות ב -20 ° C, ולכן אצוות של 200 - 500 מ&quot;ל יכול להיות מיוצר בבת אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג נוזל ותאי צלוחיות ספין ב 1000 x ז במשך 15 דקות כדי להסיר תאים ופסולת הסלולר. הסר את% 90 העליון של supernatant. סינון דרך יחידה מסננת 0.22 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot בינוני מותנה, אחד מעמיתי המחקר-3D (CM) לתוך 1 מ&quot;ל, 50 מ&quot;ל ו -200 מ&quot;ל כרכים לאחסון ב -20 ° C או -70 ° C. קטן aliquots שימושי להכנת assay, כרכי ביניים להכנת בינוני תרבות למעבר של שורות תאים תלויי גורם, ואת כמויות גדולות יותר עבור אחסון לטווח ארוך. IL-3 הם יציבים יחסית ב 4 ° C כך בינוני מופשר יכול להיות מאוחסן במשך כמה שבועות אם נעשה שימוש בתנאים סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, להשתמש בעכבר רקומביננטי IL-3 ברמות של 50 ng / ml מדולל לתוך מדיום התרבות, לאחר מסונן דרך יחידת 0.22 מיקרומטר הסינון. </li></ol> תרבות 2. והערכה של VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 ובקרה Ba / F3 שורות תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שליטה תרבות תאים Ba / F3 ב DMEM, 10% FBS, 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​גנטמיצין או פניצילין / תוספת סטרפטומיצין, 1% התייצב L- גלוטמין ו -10%, אחד מעמיתי המחקר-3D-CM. תאי מעבר בשעת 1:15 דילולים על כל שלושה ימים מתאיםגדל בשלב יומן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> VEGFR2-EpoR-Ba / F3 תרבות התאים DMEM, 10% FBS, 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​gentamycin, 1% התייצב L- גלוטמין ו -10%, אחד מעמיתי המחקר-3D-CM ו 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​G418. תאי המעבר בשעה 1:15 דילולים מתאי גדל בשלב יומן. ראה 24 לפרטים נוספים על בניית הביטוי של הקולטן chimeric. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שליטה קציר Ba / F3 או VEGFR2-EpoR-Ba / תאים F3 מתרבויות יומן פאזיים באמצע. בעדינות פיפטה כדי להסיר תאים שאינם חסידים אלה מן החלק התחתון של הבקבוק. לשטוף שלוש פעמים מלוחות עכבר טוני שנאגר פוספט, 7.3 pH (PBS), (10 מיליליטר, צנטריפוגות ב g 750 x למשך 5 דקות כדי להתאושש תא גלול) להסיר המכיל בינוני IL-3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את התאים פעם עם DMEM ותוספים, ללא אחד מעמיתי המחקר-3D-CM או IL-3 רקומביננטי, ולאחר מכן resuspend במדיום זה בריכוז של 7.4 × 10 4 תאים / מ&quot;ל (כלומר, 1,000 תאים לכל 13.5 μl; 10,000 תאים לכל 135 μl כפי שנקבע על ידי ספירת באמצעות hemocytometer) עבורלהשתמש בגרסאות וכמותיות או כמותי של assay בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך תאים כדאיים על ידי ההרחקה הכחולה Trypan (זהירות). מערבבים כחול Trypan PBS (0.4%) 1: 1 עם אוכלוסיית תאים ולספור מינימום של 100 תאים על hemocytometer. תאים תופסים צבע נחשבים מתים או גוססים. הכדאיות של יותר מ 98% נדרש לבצע את assay. </li></ol> 3. Assay וכמותיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת תאי שטף (1,000 תאים) כלולים 13.5 μl של מדיום IL-3 המחסר אל הבארות של צלחת microwell 72-גם ב RT. תשמרי על עצמך כדי לערבב את ההשעיה התא במהלך aliquotting כדי להבטיח שיקוע התא על ידי כוח הכבידה לא ריכוז התא הטיה. השתמש פיפטה אוטומטית P20 היטב מכויל, וטיפים autoclaved. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף דוגמאות בדיקה ובקרות על בארות ב 10 נפח% (1.5 μl, מה שהופך נפח סופי של 15 μl המכיל 1,000 תאים לכל טוב) בעזרת פיפטה P20 מכויל או, עדיף, פיפטה P2. קח caמחדש על מנת להבטיח כי דגימות עולות בקנה אחד עם תנאי התרבות עבור תאי Ba / F3 מבחינת pH, מלח אחר עלול להיות ציטוטוקסיות / חומרי cytostatic. במידת האפשר, להשתמש במדיום תואם או חיץ (למשל, DMEM או PBS, בהתאמה) או לדלל במדיום או חיץ כזה. טחינה דקה עם אותו הקצה תבטיח ערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת דוגמיות שליטה, כולל (i) בינוני לבד המכיל שום IL-3; (Ii), אחד מעמיתי המחקר-3BD-CM הוסיף עד בינוני לבד בווליום הסופי 10%; ו / או (iii) VEGF-A מדולל ל 100 ng / ml במדיום לבד, המכיל לא IL-3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו כל בארות בשימוש של צלחת microwell עם מים סטריליים, PBS או בינוני ומניחים בצלחת בתוך מיכל humidified (עם מים ספוג ממחטת נייר) חילוף הגזים המאפשר. דגירה תאים בתוך מכולות באווירה humidified של 10% CO 2. assay זה ניתן להגדיר בנוחות 3 שעות על ידי אדם אחד אם דגימות בדיקת רכיבי תקשורת זמינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך צלחות בדרך כלל לאחר 16 שעות שלהדגירה שבה אפליה הזמן בין דגימות חיוביות ושליליות ניכר. ראה איור 3 עבור דוגמאות כיצד תאים להופיע בתרבות. לנתח צלחות באמצעות מיקרוסקופ-בניגוד שלב הפוך תקן 40 - 100 × הגדלה. הערה: ולס המכיל גורמי גדילה תומכים כגון IL-3 או-A VEGF יכיל תאים המופיעים עגול שקופה. וולס ללא גורמי גדילה תומכים או עם מדיום לבד צמצמיו מספרים של תאים עגולים, כמו גם תאים מתים או גוססים ופסולת הסלולר (למשל, איור 3 ג). הערכת assay ב הדגירה 24-48 שעות שלאחר הוא האופטימלי עבור רגישות. </li></ol> 4. מבדק כמוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת תאים שטף (10,000 תאים 135 μl) ב IL-3-לקוי בינוני עד בארות צלחת microtiter תקן 96-גם ב RT. תשמור על עצמך כדי לערבב את השעית התא במהלך aliquotting כדי להבטיח שיקוע תא על ידי כוח הכבידה אינו משפיע ceריכוז ll. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף דוגמאות בדיקה ובקרות על בארות ב 10 נפח% (15 μl) בעזרת פיפטה מכויל (P20). תשמור על מנת להבטיח כי דגימות עולות בקנה אחד עם תנאי התרבות עבור תאי Ba / F3 מבחינת pH, מלח או חומרים ציטוטוקסיים אפשרי אחרים / cytostatic. במידת האפשר, להשתמש במדיום תואם או חיץ (למשל., DMEM או PBS) או לדלל במדיום או חיץ כזה. סנן לעקר בנפחים קטנים באמצעות יחידת מסנן צינור צנטריפוגות אצטט תאית 0.22 מיקרומטר הנקבוביות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את התערובת של תאים, גורמי גדילה ו / או מעכב סוכנים באווירה humidified של 10% CO 2 למשך 48 שעות. בצע את assay בתוך מיכל humidified כי יש נייר טישו ספוג מים ומאפשר-חילוף גזים. בסיום תקופת הדגירה, להעריך את assay באמצעות אחת השיטות החלופיות המפורטות להלן שהם סמנים פונדקאיים של המספר הסלולרי קיימא הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> # 1 אלטרנטיבי: 3 H-thymidine התאגדות הערה: כימות זה מיועד בפורמט צלחת 96-היטב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה של צלחות assay למשך 48 שעות ב 37 ° C (150 נפח μl לכל היטב), להוסיף 3 H-thymidine בהיקף של 50 μl של המדיום assay (בינוני תרבות Ba / F3 ללא IL-3 / אחד מעמיתי המחקר-3D CM) לכל טוב בריכוז של מ&quot;ל 20 μCi /, מתן מינון סופי של 1 μCi לכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת צלחות במשך שעה 4 נוספת על 37 מעלות צלזיוס לפני תאי הקצירה באמצעות מקצרת תא. חלץ דוגמאות בודדות על ידי צבת בפילטרים נוצץ ולכמת עם מונה נצנץ נוזלי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> # 2 אלטרנטיבי: פליטת אור איתור של הסלולרית ATP הערה: גישה זו משתמשת מגיבה ניטור ATP אשר בשילוב עם lysate תא יכול ליצור אות פליטת אור המשקפת את תאי הקיימא באוכלוסייה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse תאים לחלץ ATP ולהשתמש מגיב ניטור ATP כדי ליצוראות זורח פי הוראות היצרן. קרא הארה באמצעות luminometer תואם פורמט צלחת 96-היטב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> # 3 אלטרנטיבי: הפחתת אנזימתי של צבע אינדיקטור על ידי תאי קיימא הערה: מבחנים מבוססים Resazurin להראות קורלציה טובה כדאי תא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב תאים בתרבית עם הצבע המבוסס resazurin ולכמת מבחנים באמצעות קורא צלחת פלואורסצנטי פי הוראות היצרן. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ferrara, N., Gerber, H. P., LeCouter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+VEGF+and+its+receptors.">The biology of VEGF and its receptors.</a> Nat Med. 9, 669-676 (2003).</li><li>Achen, M. G., Stacker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor-D:signalling+mechanisms,+biology+and+clinical+relevance.">Vascular endothelial growth factor-D:signalling mechanisms, biology and clinical relevance.</a> Growth Factors. 5, 283-296 (2012).</li><li>Ferrara, N., Mass, R. D., Campa, C., Kim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+VEGF-A+to+treat+cancer+and+age-related+macular+degeneration.">Targeting VEGF-A to treat cancer and age-related macular degeneration.</a> Annu Rev Med. 58, 491-504 (2007).</li><li>Ferrara, N., Hillan, K. J., Gerber, H. P., Novotny, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+development+of+bevacizumab,+an+anti-VEGF+antibody+for+treating+cancer.">Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer.</a> Nat Rev Drug Discov. 3, 391-400 (2004).</li><li>Korpelainen, E. I., Alitalo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+angiogenesis+and+lymphangiogenesis.">Signaling angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Curr Opin Cell Biol. 10, 159-164 (1998).</li><li>Senger, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+cells+secrete+a+vascular+permeability+factor+that+promotes+accumulation+of+ascities+fluid.">Tumour cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascities fluid.</a> Science. 219, 983-985 (1983).</li><li>Joukov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+vascular+endothelial+growth+factor,+VEGF-C,+is+a+ligand+for+the+Flt-4+(VEGFR-3)+and+KDR+(VEGFR-2)+receptor+tyrosine+kinases.">A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt-4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases.</a> EMBO J. 15, 290-298 (1996).</li><li>Achen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+D+(VEGF-D)+is+a+ligand+for+the+tyrosine+kinases+VEGF+receptor+2+(Flk1)+and+VEGF+receptor+3+(Flt4).">Vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor 2 (Flk1) and VEGF receptor 3 (Flt4).</a> Proc Natl Acad Sci USA. 95, 548-553 (1998).</li><li>Leppanen, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+determinants+of+vascular+endothelial+growth+factor-D+receptor+binding+and+specificity.">Structural determinants of vascular endothelial growth factor-D receptor binding and specificity.</a> Blood. 117, 1507-1515 (2011).</li><li>Wise, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF)-like+protein+from+orf+virus+NZ2+binds+to+VEGFR2+and+neuropilin-1.">Vascular endothelial growth factor (VEGF)-like protein from orf virus NZ2 binds to VEGFR2 and neuropilin-1.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96, 3071-3076 (1999).</li><li>Yamazaki, Y., Takani, K., Atoda, H., Morita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Snake+venom+vascular+endothelial+growth+factors+(VEGFs)+exhibit+potent+activity+through+their+specific+recognition+of+KDR+(VEGF+receptor+2).">Snake venom vascular endothelial growth factors (VEGFs) exhibit potent activity through their specific recognition of KDR (VEGF receptor 2).</a> J Biol Chem. 278, 51985-51988 (2003).</li><li>Stacker, S. A., Achen, M. G., Jussila, L., Baldwin, M. E., Alitalo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphangiogenesis+and+cancer+metastasis.">Lymphangiogenesis and cancer metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 2, 573-583 (2002).</li><li>Stacker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-D+promotes+the+metastatic+spread+of+tumor+cells+via+the+lymphatics.">VEGF-D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics.</a> Nat Med. 7, 186-191 (2001).</li><li>Skobe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+tumor+lymphangiogenesis+by+VEGF-C+promotes+breast+cancer+metastasis.">Induction of tumor lymphangiogenesis by VEGF-C promotes breast cancer metastasis.</a> Nat Med. 7, 192-198 (2001).</li><li>Mandriota, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+endothelial+growth+factor-C-mediated+lymphangiogenesis+promotes+tumour+metastasis.">Vascular endothelial growth factor-C-mediated lymphangiogenesis promotes tumour metastasis.</a> EMBO J. 20, 672-682 (2001).</li><li>Stacker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphangiogenesis+and+lymphatic+vessel+remodelling+in+cancer.">Lymphangiogenesis and lymphatic vessel remodelling in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 14, 159-172 (2014).</li><li>Karnezis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-D+promotes+tumor+metastasis+by+regulating+prostaglandins+produced+by+the+collecting+lymphatic+endothelium.">VEGF-D promotes tumor metastasis by regulating prostaglandins produced by the collecting lymphatic endothelium.</a> Cancer Cell. 21, 181-195 (2012).</li><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis:+an+organizing+principle+for+drug+discovery.">Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 6, 273-286 (2007).</li><li>Stacker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+vascular+endothelial+growth+factor-D+involves+proteolytic+processing+which+generates+non-covalent+homodimers.">Biosynthesis of vascular endothelial growth factor-D involves proteolytic processing which generates non-covalent homodimers.</a> J Biol Chem. 274, 32127-32136 (1999).</li><li>McColl, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmin+activates+the+lymphangiogenic+growth+factors+VEGF-C+and+VEGF-D.">Plasmin activates the lymphangiogenic growth factors VEGF-C and VEGF-D.</a> J Exp Med. 198, 863-868 (2003).</li><li>Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+human+endothelial+cells+derived+from+umbilical+veins.+Identification+by+morphologic+and+immunologic+criteria.">Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by morphologic and immunologic criteria.</a> J Clin Invest. 52, 2745-2756 (1973).</li><li>Shibuya, M., Claesson-Welsh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+by+VEGF+receptors+in+regulation+of+angiogenesis+and+lymphangiogenesis.">Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Exp Cell Res. 312, 549-560 (2006).</li><li>Pacifici, R. E., Thomason, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+tyrosine+kinase/cytokine+receptors+transmit+mitogenic+signals+in+response+to+ligand.">Hybrid tyrosine kinase/cytokine receptors transmit mitogenic signals in response to ligand.</a> J Biol Chem. 269, 1571-1574 (1994).</li><li>Stacker, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutant+form+of+vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF)+that+lacks+VEGF+receptor-2+activation+retains+the+ability+to+induce+vascular+permeability.">A mutant form of vascular endothelial growth factor (VEGF) that lacks VEGF receptor-2 activation retains the ability to induce vascular permeability.</a> J Biol Chem. 274, 34884-34892 (1999).</li><li>Davydova, N., Roufail, S., Streltsov, V. A., Stacker, S. A., Achen, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+VD1+neutralizing+antibody+to+vascular+endothelial+growth+factor-D:+binding+epitope+and+relationship+to+receptor+binding.">The VD1 neutralizing antibody to vascular endothelial growth factor-D: binding epitope and relationship to receptor binding.</a> J Mol Biol. 407, 581-593 (2011).</li><li>Wise, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+vascular+endothelial+growth+factors+vary+extensively+in+amino+acid+sequence,+receptor-binding+specificities,+and+the+ability+to+induce+vascular+permeability+yet+are+uniformly+active+mitogens.">Viral vascular endothelial growth factors vary extensively in amino acid sequence, receptor-binding specificities, and the ability to induce vascular permeability yet are uniformly active mitogens.</a> J Biol Chem. 278, 38004-38014 (2003).</li><li>Davydova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+human+vascular+endothelial+growth+factor-D+for+structural+and+preclinical+therapeutic+studies.">Preparation of human vascular endothelial growth factor-D for structural and preclinical therapeutic studies.</a> Protein Expr. Purif. 82, 232-239 (2012).</li><li>Baldwin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forms+of+mouse+vascular+endothelial+growth+factor-D+are+generated+by+RNA+splicing+and+proteolysis.">Multiple forms of mouse vascular endothelial growth factor-D are generated by RNA splicing and proteolysis.</a> J. Biol. Chem. 276, 44307-44314 (2001).</li><li>Baldwin, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specificity+of+receptor+binding+by+vascular+endothelial+growth+factor-D+is+different+in+mouse+and+man.">The specificity of receptor binding by vascular endothelial growth factor-D is different in mouse and man.</a> J. Biol. Chem. 276, 19166-19171 (2001).</li><li>Makinen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+lymphatic+endothelial+cells+transduce+growth,+survival+and+migratory+signals+via+the+VEGF-C/D+receptor+VEGFR-3.">Isolated lymphatic endothelial cells transduce growth, survival and migratory signals via the VEGF-C/D receptor VEGFR-3.</a> EMBOJ. 20, 4762-4773 (2001).</li><li>Achen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+to+vascular+endothelial+growth+factor-D+block+its+interactions+with+both+VEGF+receptor-2+and+VEGF+receptor-3.">Monoclonal antibodies to vascular endothelial growth factor-D block its interactions with both VEGF receptor-2 and VEGF receptor-3.</a> Eur J Biochem. 267, 2505-2515 (2000).</li><li>Bamford, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+COSMIC+(Catalogue+of+Somatic+Mutations+in+Cancer)+database+and+website.">The COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer) database and website.</a> Br J Cancer. 91, 355-358 (2004).</li><li>Pleasance, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+catalogue+of+somatic+mutations+from+a+human+cancer+genome.">A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome.</a> Nature. 463, 191-196 (2010).</li></ol>

סטיבן א Stacker ומארק מ achen הם בעלי המניות היממה טכנולוגיות בע&quot;מ, חברה לפיתוח תרופות על ידי מיקוד המשפחה VEGF של גורמי גדילה.

Assay המתואר כאן מסתמך על שימוש בתאים של כדאיויות גבוהות, אשר תלויים בגורמי צמיחה. תאים ולכן צריכים להיות מתורבת בקפידה כדי לוודא שהם גורמים תלויים, ולשמר ביטוי של הקולטן chimeric. הבטיח כי המדיום הוא עשה טרי ולא מאוחסן לתקופת זמן ממושכת מדי וכי אחד מעמיתי המחקר-3D CM הוא מאוד פעיל חשוב. תאים צריכים לשטוף ביסודיות מ- IL-3 בינוני המכיל לתוך מדיום assay כדי לוודא ששום שיורית IL-3 ומזהמים את assay כאשר חושפים את תאי הליגנדים ההצלה. כפי הליגנדים יכול לבוא במספר צורות שונות, טיפול צריך לקחת בעת הכנת אלה עבור assaying. משמרים, חומרים אנטי-בקטריאליים, מלח או מאגרים של pH שונים יכולים להשפיע על assay, וזו הסיבה בדיקות מקבילות של תאים Ba / F3 untransfected יכול להודיע ​​על בעיות הקשורות חיץ. אנו משתמשים בשני הפרוטוקולים וכמותיות וכמותית. החצי-quantitatiassay ve מאפשר הערכה מהירה של הפעילות של דגימות לפני שאתחייב assay כמוני לחלוטין אשר דורש יותר זמן מדגם. שיטת הכמותית משמשת אך ורק בעת יצירת נתונים לפרסום. השיטות החלופיות לאיתור את הכדאיות של התרבות הם פשוט יחסית. את assay כמותי הותאם מספר פורמטים שונים עבור כימות של התפשטות, השתמשנו (3- (4,5-Dimethylthiazol-2-י.ל.) -2,5-Diphenyltetrazolium ברומיד) MTT 30, זיהוי פליטת אור של ATP הסלולר (לא פורסם), לצבוע מבוססי resazurin (איור 2) ו -3 H-thymidine 31 עם הצלחה. בשנים האחרונות אנו התפתחנו מן שימוש קרינה להתאים גישות פליטת אור ו נצלנו את צבען מבוסס resazurin בשל העלות-התועלת שלו. כל אחת מהגישות לתת תוצאות מתאימות והבחירה יכולה להיות תלויה בזמינות של ריאגנטים אssociated קוראי צלחת מיוחדים במעבדה / מכון או היכרות נתונות עם גישות מסוימות. פתרון בעיות סובבת סביב הפעילות של שלושת המרכיבים העיקריים של assay, i) IL-3 CM, ii) VEGFR-2-EpoR-Ba / תאים F3 ו- III) הליגנדים מגרה. רמות ירודות של IL-3 ב CM עקב תאים, אחד מעמיתי המחקר 3D לקויים בתרבות הראשונית, תנאי אחסון עניים, מחזורי הפשרת ההקפאה מוגזמים או באמצעות בשעה גבוהה מדי דילול יכול ליצור תרבויות גדלות גרוע שתקשינה על assay. זה בדרך כלל מזוהה בבארות שליטת אוכלוסיות תאים גדלו לאט, לאבד המראה הבהיר הנורמלי שלהם. VEGFR-2-EpoR-Ba / תאים assay F3 יכול להפסיד ביטוי פני התא של לבנות כימרי לאורך זמן אם כל הזמן בתרבות לתקופות ממושכות. שמירת מספרים טובים של מניות חנקן נוזליות מאפשרת תרבויות טריות של תאים מאוד המבטאות את הקולטן כימרי להיות זמינות בכל העת. אם נדרש אוכלוסייה להביע גבוהה יכולה להיותמושגת על ידי גידול התאים הליגנדים VEGFR-2 ובחירת האוכלוסייה להביע רמות גבוהות של הקולטן chimeric על ידי זרימת cytometry מיון. תאים אלה יורחבו עוד בתרבות להקפאה. בעוד הטכניקה היא אלטרנטיבה נוחה ופשוט יותר לניתוח אינטראקציות עם תחום תאי VEGFR-2 זה לא ניתן לראות להחליף ניסויים מתוחכמים יותר שבו קולטן דובר על תאי האנדותל העיקרי הוא נחקר בנוכחות VEGFRs אחרים, שיתוף קולטנים כגון neuropilins. התאים שעליו assay זה מבוסס (תאי B) נבדלים מתאי אנדותל ועל כן לא ניתן להשתמש כדי ללמוד את מסלולי איתות ציטופלסמית וגורמים שעתוק המגיבים ההפעלה VEGFR-2 בתאי האנדותל. אף על פי כן, השיטה מספקת גישה יעילה לנתח אינטראקציה ליגנד לרצפטור שנמצאת בין assay מחייב פשוט הבוחנת אינטראקציה של ליגנד עם רג&#39;פ נייחטור לבן (כגון אזור המסיס קולטן תאי או אזור תאיים קולטן התמזג אימונוגלובולינים), ועל הניתוח של קולטן מחייב ואפקטים במורד לראות מחייב מבחנים לתאי אנדותל עיקריים. הוא מספק מערכת לאפשר מחייב cross-linking של קולטנים, שני השלבים הראשונים שבאמצעותו רבים טירוזין קינאז קולטן מסוג נפוץ ליזום מפל הולכת אותות שלהם. ותחולתו במשפט מספר ההגדרות אקדמיות ומסחריות הוכיחה מקובל כמו assay שימושי לבחינת מאפיינים חייב, במיוחד כאשר אנו מעריכים הליגנדים גרסה או מעכבים של אינטראקצית קולטן ליגנד. Assay הוא גם שימושי עבור ניתוח של מעכבים חדשים של תחום תאי קולטן או של הליגנדים שלה. את assay יכול לשמש עוד במהירות המסך וריאנטים של הליגנדים או אזורים תאיים קולטן לראות בהקשר של מוטציות גנומי (הן בירושה סומטיים) נמצא האדם geנוס במחלות כגון סרטן 32,33 לקבוע התוצאה התפקודית שלהם. לפיכך היישומים של assay VEGFR-2 זה, צפויים להתרחב בעתיד. יתר על כן, הגישה הכללית שבבסיס assay זה יכול להיות מנוצל באופן נרחב יותר עבור טירוזין קינאז קולטן תא השטח, המהווים משפחה גדולה וחשובה של מולקולות איתות בבריאות ובחולי.

הגורם (vascular endothelial growth VEGF) המשפחה של גורמי גדילה חלבון המופרש ו קולטנים בתא השטח מאותו מקור שלהם היא קבוצה חשובה ומגוונת של הליגנדים מסיסים קולטני-מוטבע הממברנה, בהתאמה כי הפונקציה transducing אותות על פני קרום התא. הן מתפקדות בעיקר בתאי האנדותל אלא גם בתאים ממוצא אפיתל ואלה של 1,2 מערכת החיסון. מסלולי איתות עוסקת ידי קולטני VEGF המופעל ליגנד (VEGFRs) הן קריטיות פתולוגיות הגדולות, כגון ניוון וסרטן מקולרי הקשור לגיל, ותרופות מיקוד מהם נמצאים בשימוש קליני תכופים (למשל, bevacizumab נוגדן חד-שבטי שמכוונת-A VEGF) 3,4. אחת המורכבויות של משפחת VEGF הוא המגוון של הליגנדים מסיסים הנוכחי בטבע (-A VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, חלבונים VEGF המקודדים על ידי ORF המשפחה וירוס parapox ו VEGF ארס נחשים, בתוספת אחרים מעכבisoforms של VEGF-A) 2. ליגנדים אלה אינטראקציה עם שלושה מבני משפחת טירוזין קינאז קולטן, כלומר VEGFR-1, VEGFR-2 ו VEGFR-3. קולטנים אלה באים לידי ביטוי variably על תאים מסוגים שונים, אך לעתים קרובות הם הביעו במשותף על פני השטח של תאי האנדותל המרפדים את כלי הדם הלימפה מכל הגדלים 5. VEGFR-2 יכול לחייב את יונקים הליגנדים VEGF-A 6, VEGF-C 7 ו VEGF-D 8,9 וכן ORF וירוס 10 VEGF ו- נחש ארס 11 VEGF. VEGFR-2 משחק תפקיד מרכזי בהנעת אנגיוגנזה (צמיחת כלי דם חדשים מכלי קיימים) ב ההתפתחות העוברית, ריפוי פצעים, סרטן ומחלות עיניים. בהקשרים אלה, הליגנדים כגון-A VEGF, לאגד -C ו -D ולהפעיל את הקולטן על תאי האנדותל של כלי דם דם 12-15. על תאי אנדותל הלימפה, VEGFR-2 ממלא תפקיד lymphangiogenesis, היווצרות של כלי הלימפה חדש 16. VEGFR-2 יכול גם לקדם התרחבות והרחבת העורקים הגדולים lymphatics בתאים בריאים המחלה 17. הבנה מלאה של VEGFR-2: אינטראקציות ליגנד לכן חשובה לפיתוח מעכבים לשימוש בטיפול במחלות תלויה אנגיוגנזה 18. בעוד שרוב isoforms של VEGF-A נקשר VEGFR-2, מחשוף פרוטאוליטים של VEGF-C ו- VEGF-D נדרש לשחרר שבר המורכב של תחום VEGF-ההומולוגיה שמספק זיקה גבוהה מחייבת VEGFR-2 19,20. פתחנו מבדק לפקח ליגנדים של VEGFR-2 אשר נועד לעקוף את הצורך בתאי האנדותל עיקריים, אשר קשים מבחינה טכנית למעבר, יקרים לרכישת תרבות (הדורשים בינוני מיוחד) 21 ולהביע VEGFRs מרובה הקשורים שיתוף קולטני 22. Heterodimerization של VEGFR-2 עם קולטנים VEGF אחרים או-קולטנים שיתוף יכול לגרום מורכבות רצויות כאשר מכוון כדי הרבעהקולטן ליגנד אינטראקציות בינארי y, הערכת פעילות מיוחסת קולטן מסוים, או בהערכת ההשפעה של חומרים כימיים מעכבות. 23. המבדק שומר ניידות של הקולטן הרלוונטי בקרום התא ומאפשר הערכה של יכולתו של ליגנד לקשור קשר צולב באזור תאיים VEGFR-2. המבדק מסתמך על יצירת קולטן chimeric בו נמצא האזור תאיים של קולטן VEGF (במקרה זה VEGFR-2) הוא קיבע את הטרנסממברני ואזורים תאיים של קולטן אריתרופואטין (EpoR), חבר של המשפחה הקולטן ציטוקינים 8,24. חלבון היתוך זו בא לידי ביטוי אז הקו הסלולרי פרו-B תלוי הגורם Ba / F3, שעליו גירוי עם ליגנד מסוגל מחייב צולבות המקשרים את התחום התאי של הקולטן גורם הפעלה של האזור מפעיל cytoplasmic, מסוגל של transducing אות הישרדות באמצעות קינאזות יאנוס (JAKs) לקדם התאהישרדות ו / או התפשטות. לעומת זאת, הביטוי של VEGFR-2 באורך מלא בסוג התא אותו, וגירוי עם ליגנד, אינו מקדם הישרדות התא ושגשוגם, המציין כי effectors איתות הפרוקסימלי של מסלול VEGFR-2 אינם זמינים סוג תא זה. השתמשנו assay במגוון בהקשרים לחקור מחייב של הליגנדים VEGFR-2 הרומן 10,19,20,24-29. בשילוב עם assay VEGFR-3-EpoR-Ba / F3, השווינו את הפעילות היחסית של VEGF-C ו- גורמי גדילה VEGF-D לקשירה cross-linking VEGFR-2 ו VEGFR-3 30. את assay נעשה שימוש כדי לאפיין את פעילות המעכבת של נוגדנים מנטרלים חד-שבטיים כדי VEGFR-2 או VEGF-D, מלכודת VEGFR-2 מסיסים peptidomimetics מיקוד המשפחה VEGF 31. את assay שימש גם להראות את היכולת של VEGFs מן זני נגיף ORF שונים לקשור קשר צולב VEGFR-2 לפני הבדיקה בתאי האנדותל העיקרי <sעד&gt; 10,26. Assay הוא שימושי במיוחד עבור לסינון המהיר של מוטציות של VEGFs אשר ניתן להעריך במהירות לפעילות לפני שהם מוצגים בפני מבחני תא האנדותל המייגעים יותר 25 או כאשר פרוטוקולי הערכה לצמיחת טיהור גורמי 27. את assay אנו מתארים הוא קל לביצוע, והגרסה וכמותיות מאפשרת לקביעות מהירה שלפעמים נדרשות כאשר הניטור בייצור או הטיהור של גורמי גדילה, נוגדנים או תחומי קולטן מסיסים לניסויים אחרים. קלות השימוש של assay עושות את זה אידיאלי המשלים עוד ועוד מחקרים מלאים הופיעו עם תאי אנדותל עיקריים נגזרו דם או כלי לימפה מרקמות ספציפיות או מערכות איברים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1110">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:181px;">T8154</td>
			<td style="width:424px;">0.4% solution in PBS is used 1:1 with cell suspensions to measure viable cells. Hazard-may cause cancer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">G418 Sulphate (Geneticin)</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-gn-5</td>
			<td>Agent for selecting transfected eukaryotic cells. Hazard-may cause allergy or asthma symptoms or breathing difficluties.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">3H-Thymidine</td>
			<td style="width:183px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:181px;">NET-027</td>
			<td>This radioactive nucleoside is incorporated into chromosomal DNA during mitosis. Hazard-radiation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vialight Plus Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>LT07-221</td>
			<td>Bioluminescent detection of cellular ATP to quantify viability, using ATP Monitoring Reagent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Prestoblue Cell Viability Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A13261</td>
			<td>Resazurin-based indicator of cell viability. Turns red in color in the reducing environment of the cell</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Nunc Minitray with Nunclon Delta Surface (72 well)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>136528</td>
			<td>Small microtitre plate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">96 well Tissue Culture Plate</td>
			<td style="width:183px;">Falcon, Corning Inc.</td>
			<td style="width:181px;">353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">DMEM (1X)</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:181px;">11965-92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">GlutaMAX (100X)</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:181px;">35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Foetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:181px;">&#160;10099-141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell Harvester</td>
			<td style="width:183px;">Tomtec Life Sciences</td>
			<td style="width:181px;">N/A</td>
			<td>Tomtec Harvester, 96 Mach 3M Cell Harvester</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Liquid Scintillation Counter</td>
			<td style="width:183px;">LKB Wallac</td>
			<td style="width:181px;">1205</td>
			<td>LKB Wallac 1205 Betaplate Scintillation Counter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">UniFilter-96 GF/B</td>
			<td style="width:183px;">Perkin Elmer</td>
			<td>6005177</td>
			<td>White 96-well Barex Microplate with GF/B filterof 1 &#181;m poresize</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:323px;">Gentamicin</td>
			<td style="width:183px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:181px;">15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:183px;">Gibco, Life Technologies</td>
			<td style="width:181px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;width:323px;">0.22um pore cellulose acetate centrifuge tube filter unit</td>
			<td style="width:183px;">Costar, Corning Inc.</td>
			<td style="width:181px;">8160</td>
			<td>Centrifuge tube filters have a 0.22&#181;m pore CA membrane-containing filter unit within a 500&#181;l capacity polypropylene microcentrifuge tube.</td>
		</tr>
		<tr height="16">
			<td height="16" style="height:16px;">Fluorescence Reader</td>
			<td style="width:183px;">BioTek</td>
			<td style="width:181px;">N/A</td>
			<td>BioTek Synergy 4 Hybrid Microplate Reader&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple bioassay for the evaluation of vascular endothelial growth factors

הניתוח של טירוזין קינאז הקולטן הליגנדים האינטראקציה שלהם מעורב ביולוגיה וסקולרית הרבה פעמים הוא מאתגר בשל הביטוי המכונן של משפחות של רצפטורים קשורים, מגוון רחב של הליגנדים המתייחסים ואת הקושי להתמודד עם תרבויות עיקריות של תאי אנדותל מיוחדים. כאן אנו מתארים מבדק לצורך זיהוי של הליגנדים לגורם צמיחה של אנדותל כלי דם קולטן 2 (VEGFR-2), מתמר מפתח של אותות המקדמים אנגיוגנזה lymphangiogenesis. CDNA קידוד היתוך של האזור (ליגנד המחייבת) תאיים של VEGFR-2 עם הטרנסממברני ואזורי cytoplasmic של הקולטן אריתרופואטין (EpoR) מתבטא הקו הסלולרי גורם תלויה Ba / F3. שורת תאים זה גדל בנוכחות interleukin-3 (IL-3) ונסיגה של תוצאות גורם זה מוות של תאים בתוך 24 שעות. הביטוי של היתוך קולטן VEGFR-2 / EpoR מספק מנגנון חלופי לקדם הישרדות בפוטנציהlly תרבות תאי Ba / F3 transfected ביציבות בנוכחות ליגנד מסוגל חייב cross-linking החלק התאי של חלבון ההיתוך (כלומר, אחד שיכול קשר צולב באזור תאיים VEGFR-2). Assay יכול להתבצע בשתי דרכים: גישה כמותית למחצה שבו כמויות קטנות של ליגנד ותאי להתיר מכך מהיר ב -24 שעות, ועל גישת כמותית המעורבת סמנים פונדקאיים של מספר תאי קיימא. Assay הוא יחסית קל לבצע, הוא היענות נלהבת הליגנדים VEGFR-2 ידוע והוא יכול להכיל מעכבי תאיים של VEGFR-2 איתות כגון נוגדנים חד שבטיים לקולטן או ליגנדים, ומלכודות ליגנד מסיסים.

בחלק זה, אנו מציגים את התוצאות של ניסוי המדגימות את התכונות החיוניות של מבדק VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 (ראה איור 1 עבור עקרונות של assay). מחקרים שפורסמו אחרים מדגימים יישומים רחבים של assay עבור הליגנדים VEGFR-2 חלופיים, מולקולות VEGF מוטציה ונוגדנים חד-שבטיים מעכבים 8,10,19,24-30. הנתונים המוצגים כאן מייצגים assay שבו המבדק VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 משמש לכמת את הפעילות של שלושת הליגנדים אנושי רקומביננטי (VEGF-A 165, VEGF-C ו- VEGF-D) עם סגוליות עבור VEGFR -2 בנוכחות נוגדן חד שבטי מעכבות (bevacizumab) כדי VEGF-A נתונים 165. כבר מנורמל מול בתגובה VEGF-A 165 בלבד (איור 2). כצפוי, bevacizumab חסם את ההשפעה של VEGF-A 165 ב assay, אבל<html> לא היתה כל השפעה על פעילות-C VEGF ו- D-VEGF. בגרסת וכמותיות של assay או כאשר התבוננות assay במהלך פיתוחו, הצגת assay באמצעות מיקרוסקופ שלב הפוך רגיל יכול לספק מידע רב ערך על ההתקדמות של assay. מניתוח של assay (איור 3) מראה את הכדאיות הטובה של VEGFR-2-EpoR-Ba / תאי מבדק F3 כאשר מודגרות עם מדיום המכיל IL-3, או ליגנד עבור VEGFR-2, למשל, VEGF-A. תאים אלה הנם גדולים שקופים, ואין או עדות מינימאלית גרעינית בציטופלסמה הסלולר או פסולת תא בתרבות. בשנת הבאר ללא גורמי גדילה נוספים כיום קיימות ראיות של מספרים סלולריים מופחתים כמה תאים בריאים. תאים נוכחיים יש גרעיניויות משמעותיות הציטופלסמה שלהם פסולת תא היא תכונה עקבית של התרבות. לאחר 48 שעות ואין שום סימן של תאי קיימא. FO: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53867/53867fig1.jpg" /> איור 1. תרשים סכמטי המתאר את העקרונות של VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 המבדק. (א) Ba / תאי F3 הם גורמים תלויים ודורשים גורם צמיחה אקסוגנית כגון IL-3 כדי לעורר צמיחת תאים / כדאיות באמצעות קולטנים IL-3 אנדוגני ואת מסלול איתות JAK. אם EpoR מתבטא הצלת תאים אלה יכולים להתרחש גם דרך מסלול JAK. ביטוי של טירוזין קינאז קולטן באורך מלא כגון VEGFR-2 תוצאות איתות מינימאלית כמטרות במורד זרם של הפעלת VEGFR-2 אינו עוסק מסלול JAK. קולט כימרי עם האזור התאי של VEGFR-2 התמזג אזורי הטרנסממברני cytoplasmic של EpoR, כאשר transfected לתאי Ba / F3 ו מגורה עם ליגנדים ספציפיים VEGFR-2, הוא מסוגל הפעלת מסלול JAK ונהיגת תאהישרדות ושגשוגם. (ב) VEGFR-2-EpoR-Ba / תאים F3 להביע רמות משמעותיות של הקולטן VEGFR-2-EpoR כימרי אשר ניתן לכמת באמצעות cytometry הזרימה. לאחר דהוי של IL-3 בינוני המכיל, תאים מוקם במגוון תנאי תרבות אשר כונן או הישרדות / תרבות תאים. תאים Ba / F3 untransfected או VEGFR-2-EpoR-Ba / תאים F3 ללא גורמי גדילה ספציפיים מצליחים לגדול / לשרוד. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53867/53867fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53867/53867fig2.jpg" /> איור 2. הערכת VEGFR-2 הליגנדים ב הכימרה VEGFR-2-EpoR-Ba / F3 המבדק. IL-3-תלויים תאים Ba / F3 לבטא עכבר VEGFR-2-EpoR היו זורעים במדיום ללא IL-3 (למעט לתת + IL-3, כפי שצוין) בתוספת האדם VEGF-A 165, VEGF-CΔNΔC (VC) (זו היא צורה של-C VEGF אשר מורכב באזור המרכז כולל את propeptides N ו- C-terminal), או VEGF-DΔNΔC (זו היא צורה של-D VEGF הכולל באזור המרכז כולל את propeptides N ו- C-terminal (VD)) ב -100 bevacizumab נוגדן חד-שבטי נטרול ng / ml ו אנושי (אשר נקשר ומעכב-A VEGF, אבל לא VEGF-C או VEGF-D), או לשלוט ללא נטרול trastuzumab נוגדן, כמצוין על 0.75 מיקרומטר. NF = בינוני המכיל אין גורמי גדילה נוספים. ארבעים ושמונה שעות לאחר מכן, מספר תאים ביחס חיים היה לכמת באמצעות זיהוי פליטת אור של ATP הסלולר. קווים אנכיים מייצגים אמצעי (מנורמל מול בתגובת VEGF-A 165 לבד, הבר ראשון) ואת סטיית התקן של הממוצע של שלושה ניסויים בלתי תלויים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53867/53867fig2large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן נ</a>iew גרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53867/53867fig3.jpg" /> איור 3. VEGFR-2-EpoR-Ba / תאי F3 תלויים בגורמים חיצוניים צמיחה עבור הישרדות. דוגמאות VEGFR-2-EpoR-Ba / מבדק F3 שבו IL-3-תלוי Ba / F3 תאי מבטאי עכבר VEGFR- הכימרה 2-EpoR היו זורעים במדיום (א) המכיל 10%, אחד מעמיתי המחקר-3D מותנה בינוני המספק IL-3, (ב) 100 ng / VEGF-A האדם מ&quot;ל 165 (לא IL-3), או (C) בינוני עם אין IL-3 או גורמי גדילה נוספים. תרבות מתוארת 24 שעות לתוך assay מראות תאי קיימא מאוד בנוכחות של IL-3 (א) או VEGF-A 165 (ב), ואילו בתרבות ללא IL-3 או גורמי גדילה נוספים (C) תא מוות אָדוֹםכדאיות uced ניכרת היטב. ברי סולמות הם 100 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53867/53867fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors at JoVE.com

A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

אנו מתארים המבדק פשוט מבוססי תאים לזיהוי, כימות לפקח על פעילות בני משפחת פקטור הגדילה של אנדותל כלי הדם של הליגנדים. את assay משתמש קולטנים chimeric לידי ביטוי קו תא גורם תלוי לתת הערכה וכמותיות או הכמות של קולטן מחייב cross-linking ידי ליגנד.

מבדק פשוט עבור הערכת גורמי הגדילה של אנדותל כלי דם

The analysis of receptor tyrosine kinases and their interacting ligands involved in vascular biology is often challenging due to the constitutive ...

a-simple-bioassay-for-evaluation-vascular-endothelial-growth

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.6K Views.  Peter MacCallum Cancer Centre.  אנו מתארים המבדק פשוט מבוססי תאים לזיהוי, כימות לפקח על פעילות בני משפחת פקטור הגדילה של אנדותל כלי הדם של הליגנדים. את assay משתמש קולטנים chimeric לידי ביטוי קו תא גורם תלוי לתת הערכה וכמותיות או הכמות של קולטן מחייב cross-linking ידי ליגנד. 

Video: A Simple Bioassay for the Evaluation of Vascular Endothelial Growth Factors

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle 1. In larval stages of insects belonging to the orders of Lepidoptera (moths and butterflies) and Diptera (true flies), hemocytes are formed from the lymph gland (a specialized hematopoietic organ) or embryonic cells and can be carried through to the adult stage. Embryonic hemocytes are involved in cell migration during development and chemotaxis regulation during inflammation. They also take part in cell apoptosis and are essential for embryogenesis 2. Hemocytes mediate the cellular arm of the insect innate immune response that includes several functions, such as cell spreading, cell aggregation, formation of nodules, phagocytosis and encapsulation of foreign invaders 3. They are also responsible for orchestrating specific insect humoral defenses during infection, such as the production of antimicrobial peptides and other effector molecules 4, 5. Hemocyte morphology and function have mainly been studied in genetic or physiological insect models, including the fruit fly, Drosophila melanogaster 6, 7, the mosquitoes Aedes aegypti and Anopheles gambiae 8, 9 and the tobacco hornworm, Manduca sexta 10, 11. However, little information currently exists about the diversity, classification, morphology and function of hemocytes in non-model insect species, especially those collected from the wild 12.
Here we describe a simple and efficient protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. We use penultimate instar Lithacodes fasciola (yellow-shouldered slug moth) (Figure 1) and Euclea delphinii (spiny oak slug) caterpillars (Lepidoptera: Limacodidae) and show that sufficient volumes of hemolymph (insect blood) can be isolated and hemocyte numbers counted from individual larvae. This method can be used to efficiently study hemocyte types in these species as well as in other related lepidopteran caterpillars harvested from the field, or it can be readily combined with immunological assays designed to investigate hemocyte function following infection with microbial or parasitic organisms 13.

Insect hemocytes carry out many important functions, both immune and non-immune, throughout all stages of insect development. Our present knowledge of hemocyte types and function comes from studies on insect genetic models. Here, we present a method for extracting, quantifying and visualizing hemocytes from wild caterpillars.

פרוטוקול פשוט לחילוץ Hemocytes מזחלי Wild

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline cells. This heterogeneity is an important drawback concerning the study of the bases of mammalian spermatogenesis, as pure or enriched cell populations in certain stages of sperm development are needed for most molecular analyses1.
 Various strategies such as Staput2,3, centrifugal elutriation1, and flow cytometry (FC)4,5 have been employed to obtain enriched or purified testicular cell populations in order to enable differential gene expression studies. 
It is required that cells are in suspension for most enrichment/ purification approaches. Ideally, the cell suspension will be representative of the original tissue, have a high proportion of viable cells and few multinucleates - which tend to form because of the syncytial nature of the seminiferous epithelium6,7 - and lack cell clumps1 . Previous reports had evidenced that testicular cell suspensions prepared by an exclusively mechanical method clumped more easily than trypsinized ones1 . On the other hand, enzymatic treatments with RNAses and/or disaggregating enzymes like trypsin and collagenase lead to specific macromolecules degradation, which is undesirable for certain downstream applications. The ideal process should be as short as possible and involve minimal manipulation, so as to achieve a good preservation of macromolecules of interest such as mRNAs. Current protocols for the preparation of cell suspensions from solid tissues are usually time-consuming, highly operator-dependent, and may selectively damage certain cell types1,8 . 
	The protocol presented here combines the advantages of a highly reproducible and extremely brief mechanical disaggregation with the absence of enzymatic treatment, leading to good quality cell suspensions that can be used for flow cytometric analysis and sorting4, and ulterior gene expression studies9 .

A novel protocol for the mechanical preparation of testicular cell suspensions from rodent material, avoiding enzymes and detergents, is described. The method is very simple, fast, reproducible, and renders good quality cell suspensions, which are suitable for flow sorting and RNA extraction.

טכניקה פשוטה ויעילה להכנת השעיות תא אשכים

Mammalian testes are very complex organs that contain over 30 different cell types, including somatic testicular cells and different stages of germline ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

בידוד של תאי שריר חלק Murine כלילית דם

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

בידוד סינון של חומצות גרעין: שיטת הפקת DNA פשוטה ומהירה

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with organ fibrosis. In these conditions, differentiated endothelial cells acquire mesenchymal-like phenotypes. This process is called endothelial-mesenchymal transition (EndMT) and is characterized by downregulation of endothelial markers, upregulation of mesenchymal markers, and morphological changes. EndMT is induced by several signaling pathways, including transforming growth factor (TGF)-&#946;, Wnt, and Notch, and regulated by molecular mechanisms similar to those of epithelial-mesenchymal transition (EMT) important for gastrulation, tissue fibrosis, and cancer metastasis. Understanding the mechanisms of EndMT is important to develop diagnostic and therapeutic approaches targeting EndMT. Robust induction of EndMT in vitro is useful to characterize common gene expression signatures, identify druggable molecular mechanisms, and screen for modulators of EndMT. Here, we describe an in vitro method for induction of EndMT. MS-1 mouse pancreatic microvascular endothelial cells undergo EndMT after prolonged exposure to TGF-&#946; and show upregulation of mesenchymal markers and morphological changes as well as induction of multiple inflammatory chemokines and cytokines. Methods for the analysis of microRNA (miRNA) modulation are also included. These methods provide a platform to investigate mechanisms underlying EndMT and the contribution of miRNAs to EndMT.

A protocol for in vitro induction of endothelial-mesenchymal transition (EndMT), which is useful for investigating cellular signaling pathways involved in EndMT, is described. In this experimental model, EndMT is induced by treatment with TGF-&#946; in MS-1 endothelial cells.

אנליזה מולקולרית של אנדותל-mesenchymal מעבר המושרה על ידי הפיכת גורם גידול-β איתות

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...

Using En Face Immunofluorescence Staining to Observe Vascular Endothelial Cells Directly

Aberrant changes in endothelial phenotype and morphology are considered to be initial events in the pathogenesis of atherosclerosis. Direct observation of the intact endothelium will provide valuable information for understanding the cellular and molecular events in the dysfunctional endothelial cells. Here, we describe a modified en face immunofluorescence staining technique which enables scientists to obtain clear images of the intact endothelial surface and analyze the molecule expression patterns in situ. The method is simple and reliable for observing the entire endothelial monolayer at different sites of the aorta. This technique may be a promising tool for understanding the pathophysiology of atherosclerosis, especially at an early stage.

Here, we present a protocol for immunofluorescence staining to observe the endothelial cells of the mouse aorta directly. This technique is useful when studying the cellular and molecular phenotype of endothelial cells in different flow patterns and in the development of atherosclerosis.

שימוש בפני הפנים הללו Immunofluorescence כתמים כדי להתבונן בתאי כלי דם אנדותל ישירות

Aberrant changes in endothelial phenotype and morphology are considered to be initial events in the pathogenesis of atherosclerosis. Direct observation of ...

Demonstrating a Linear Relationship Between Vascular Endothelial Growth Factor and Luteinizing Hormone in Kidney Cortex Extracts

Vascular endothelial growth factor (VEGF) helps to control angiogenesis and vascular permeability in the kidney. Renal disorders, such as diabetic nephropathy, are associated with VEGF dysregulation in the kidney. The factors that govern VEGF under physiologic conditions in the kidney are not well-understood. Luteinizing hormone (LH), a pro-angiogenic hormone, helps regulate physiologic VEGF expression in reproductive organs. Given that LH receptors are found in the kidney, we, at Zietchick Research Institute, hypothesized here that LH also helps regulate VEGF expression in the kidney as well. To provide evidence, we aimed to show that LH levels are able to predict VEGF levels in the mammalian kidney. Most VEGF-related investigations involving the kidney have used lower order mammals as models (i.e., rodents and rabbits). To translate this work to the human body, it was decided to examine the relationship between VEGF and LH in higher order mammals (i.e., bovine and porcine models). This protocol uses the total protein lysate from the kidney cortex. Keys to this method&#39;s success include procurement of kidneys from slaughterhouse animals immediately after death as well as normalization of analyte levels (in the kidney extract) by total protein. This study successfully demonstrates a significant linear relationship between LH and VEGF in both bovine and porcine kidneys. The results are reproducible in two different species. The study provides supporting evidence that the use of kidney extracts from cows and pigs are an excellent, economical, and abundant resource for the study of renal physiology, particularly for examining the correlation between VEGF and other analytes.

Presented here is a protocol for utilizing a cortical kidney extract preparation and total protein normalization to demonstrate the correlation between vascular endothelial growth factor and luteinizing hormone in the mammalian kidney.

הפגנת קשר ליניארי בין גורם גידול של כלי דם אנדותל והורמון מחלגיזציה בתמציות קליפת הכליה

Vascular endothelial growth factor (VEGF) helps to control angiogenesis and vascular permeability in the kidney. Renal disorders, such as diabetic ...

Isolation of Human Primary Valve Cells for In vitro Disease Modeling

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve causes aortic stenosis and contributes to heart failure and stroke. Disease pathogenesis is multifactorial, and stresses such as inflammation, extracellular matrix remodeling, turbulent flow, and mechanical stress and strain contribute to the osteogenic differentiation of valve endothelial and valve interstitial cells. However, the precise initiating factors that drive the osteogenic transition of a healthy cell into a calcifying cell are not fully defined. Further, the only current therapy for CAVD-induced aortic stenosis is aortic valve replacement, whereby the native valve is removed (surgical aortic valve replacement, SAVR) or a fully collapsible replacement valve is inserted via a catheter (transcatheter aortic valve replacement, TAVR). These surgical procedures come at a high cost and with serious risks; thus, identifying novel therapeutic targets for drug discovery is imperative. To that end, the present study develops a workflow where surgically removed tissues from patients and donor cadaver tissues are used to create patient-specific primary lines of valvular cells for in vitro disease modeling. This protocol introduces the utilization of a cold storage solution, commonly utilized in organ transplant, to reduce the damage caused by the often-lengthy procurement time between tissue excision and laboratory processing with the benefit of greatly stabilizing cells of the excised tissue. The results of the present study demonstrate that isolated valve cells retain their proliferative capacity and endothelial and interstitial phenotypes in culture upwards of several days after valve removal from the donor. Using these materials allows for the collection of control and CAVD cells, from which both control and disease cell lines are established.

This protocol describes the collection of human aortic valves extracted during surgical aortic valve replacement procedures or from cadaveric tissue, and the subsequent isolation, expansion, and characterization of patient specific primary valve endothelial and interstitial cells. Included are important details regarding the processes needed to ensure cell viability and phenotype specificity.

בידוד תאי שסתום ראשוניים אנושיים למידול מחלות חוץ גופיות

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve ...