This work was supported by National Health and Medical Research Council (NHMRC) grants (Grant ID 1062383 and 1063646) awarded to HJN. EAL is supported by an Australian Postgraduate Award.

The authors have nothing to disclose.

מערכות הפרשה, ואת החלבונים מפעילים חיידק תחבורת מערכות אלה לתוך הציטופלסמה של תאי מארחים, הם מרכיב חשוב ארסיות שרב חיידקים פתוגניים לנצל להקים זיהום בתוך נישות בשכפול הדנ&quot;א ייחודיות. ההתמקדות של קבוצות מחקר רבות כבר לחקור את יחסי הגומלין בין effectors חיידקי חלבונים מארחים ואת ההשפעה שיש effectors אלה על מסלולים הסלולר מארחים. מחקר מצומצם מאוד, אם בכלל, בדק את פוטנציאל חלבונים מארחים להיות הכרחיים עבור טרנסלוקציה מפעיל חיידק מוצלח. במחקר זה השתמשנו לחייב, burnetii Coxiella הפתוגן התאי, הגורם הסיבתי של קדחת Q zoonotic. לאחר כניסתו תאי מארח, vacuole Coxiella המכיל traffics סביל דרך מסלול endocytic הקנונית עד השגת vacuole ליזוזום נגזרות חומצי, שם הוא משכפל למספר גבוה מאוד. מלבד לקיחת advantage של מסלול סחר מארח הנורמלי, את היכולת של Coxiella להקים נישה בשכפול הדנ&quot;א מוצלחת גם מסתמך על מערכת הפרשת IVB סוג תפקודי (T4SS) טרנסלוקציה מפעיל עוקב 8,17. מערכת הפרשה זה מבחינה פונקציונלית מקבילה T4SS Dot / ICM היטב המאופיין של הלגיונלה. הדבר בא לידי ביטוי בצורה הולמת על ידי המשלים מוטציות ספציפיות נקודה / ICM של הלגיונלה עם גני Coxiella שלהם 19,20. למרות T4SSs של שתי הלגיונלה ו Coxiella חיוני עבור שכפול, העיתוי כאשר מערכות אלה מופעלות שונה לגמרי ומשקף את טבעה מסתעף הנישות בשכפול הדנ&quot;א שלהם. הלגיונלה T4SS מופעלת מייד במגע עם תאים מארחים ושל טרנסלוקציה המהירה של effectors מאפשר לחיידקים להימנע מסלול endosomal-ליזוזומלית מחדל ובמקום ליצור vacuo בשכפול נגזרות מיון ייחודיle 42. לעומת זאת, T4SS של Coxiella אינו מופעל עד כ -8 שעות לאחר הפגיעה, לאחר חיידקים להגיע 21 ליזוזום הנגזרות vacuole חומצי. בהתחשב בכך Coxiella transits סביל דרך מסלול endocytic ומערכת טרנסלוקציה אינו מופעל עד שהוא מגיע ליזוזום, הזדמנות ייחודית להציג את עצמה להשתמש Coxiella ככלי ללמוד התבגרות endocytic. הדרישה עבור CCV כדי להיות acidified לפני effectors הוא translocated עולה כי מספר החלבונים המארחים חשוב טרנסלוקציה של חלבונים מפעילים לתוך הציטופלסמה המארח, בפרט, אך לא רק, חלבונים מעורבים מסלול סחר endocytic. ניצול siRNA באופן ממוקד ספציפי אנו יכולים להתחיל להבהיר את התפקיד של חלבוני שורה מסוימים ב טרנסלוקציה מפעיל. במחקר זה התמקדנו בשני חלבונים המווסתים את trafficki endocytic איקריוטייםng מסלול, ומכאן נחזו לחולל טרנסלוקציה של Coxiella מפעיל CBU0077. Rab5A ואיחוי קרום Rab7A שליטה עם endosomes המוקדם והמאוחר, בהתאמה. השתקה או של חלבונים אלה באמצעות siRNA הביאה לירידה משמעותית יעיל טרנסלוקציה של CBU0077 כאשר לעומת השליטה OTP siRNA (איור 5 ב). תוצאות הנציגים המוצגות כאן משקפות הממצאים המתפרסמים הקודמים שלנו 21 ולספק לתיקוף נוסף לחשיבות של החלבונים ראב האנושיות האלה טרנסלוקציה מפעיל Coxiella. טכניקה זו גם הועסקה כדי לאפיין את ההשפעה של תהליכים מארחים אחרים טרנסלוקציה מפעיל Coxiella Dot / ICM. מתחם retromer נמצא חשוב שכפול תאיים של Coxiella. ידי השתקת רכיבים retromer, באמצעות siRNA, ולאחר מכן עורכים assay טרנסלוקציה שנוכל להראות retromer הנדרש כדי ליצור את הסביבה שגורםCoxiella מפעיל טרנסלוקציה 43. למרות שהתוצאות נציג המוצג כאן הוא השוואה בין שליטה OTP נגוע siRNA מיקוד Rab5A ו Rab7A, הפרוטוקול ניתן לשנות בהתאם לצרכים ניסיוניים. לדוגמה, רמת טרנסלוקציה מפעיל יכול גם להיות לעומת תאים transfected עם siRNA מקושקשות או תאי-טרנספקציה שאינם. מוקד המחקר המסוים הזה היה ג הפתוגן לחייב, תאיים burnetii וחלבונים המעורבים בסחר endocytic, אולם השיטות שתוארו בתוך ניתן להתאים בקלות פתוגנים תאיים תאיים אחרים העושים שימוש במערכות הפרשת עבור ארסיות. ואכן, assay טרנסלוקציה מבוסס פלורסנט המסתמך על פעילות β-lactamase בתוך הציטופלסמה מארח משמש כאן, כבר נעשה שימוש נרחב על פני מגוון של פתוגנים 30-32,35,44. באופן טבעי, תנאי הזיהום שלשורות תאים ספציפיים בשימוש צריך להיות מותאם על מנת לשקף את דרישות זיהום של חיידקים מסויימים. בנוסף, מפעיל אנדוגני ידוע התמזג בטא לקטמאז הוא בעל חשיבות עליונה להצלחה בשיטות המתוארות בתוך. שיקול חשוב אחת עבור יישום מוצלח של הפרוטוקול הסביר כאן הוא ההשפעה השתקת מטרת שורה מסוימת יכול להיות על כניסת חיידקים שכפול הבא. הנה, טרנסלוקציה מפעיל ידי Coxiella נמדד 24 שעות שלאחר זיהום. במקרה זה, ועל חיידקים תאיים אחרים, את היכולת של האורגניזם כדי לקבל כניסה לתוך תאי מארחים חיונית. בנוסף, להשתקת גנים ספציפית יכולה להשפיע שכפולת חיידקים ולפיכך שינוי ברמה של טרנסלוקציה ציינה. אישור כי השתקת siRNA אינה משפיעה כניסת חיידקים משמעותית ו / או שכפול וכתוצאה מכך יעילה טרנסלוקציה, יכול להיות מושג גם באמצעות מיקרוסקופ או ספרור של חיידקים. טרנסלוקציהנתונים אז יכול להיות מנורמל למספר תאים נגועים בכל טיפול siRNA. שכפול חיידקים לא מבולבל בנתונים המוצגים כאן Coxiella עובר לא מעט על מנת שכפול במהלך תקופת הדגירה 24 שעות. שיטה זו דורשת transfection יעיל של siRNA לתאי המארח כדי להבטיח השתקה מספקת של הגן של עניין. עם זאת בחשבון, בחירת מגיב transfection הנכונה היא חשובה מאוד. מלבד מגיב ותנאי שימוש במחקר המסוים הזה, אשר עבר אופטימיזציה עבור הלה 229 תאים, יש חומרים כימיים רבים אחרים לבחירה. יעילות המציאה באמצעות ריאגנטים transfection שונים ניתן לכמת באמצעות RT-qPCR כדי להבטיח ששני המגיב המתאים ביותר נבחר וכי siRNA נבחר במיוחד מטרות תמליל העניין. אמנם לא הציג במחקר זה, אנו הוכחנו בעבר את יעילות המציאה של שני Rab5A ו Rab7A באמצעות RT-qPCR 21. בנוסף, השימוש של נוגדנים כנגד המטרה של עניין ואישור על ידי כתם המערבי יכול גם לאשר השתקת siRNA של מטרות ספציפיות. שני שיקולים חשובים אחרים לשים לב בעת שימוש siRNA כוללים את האפשרות של השפעות חוץ-היעד ואת כדאיות התא של תאים transfected. מחוץ יעד תופעות להתרחש כאשר מטרות מכוונות גם נהרסות. זה יכול להוביל שינויים פנוטיפי ועלול לגרום חיוביות שגויות. במחקר זה השתמשנו מאגר של ארבעה דופלקסים siRNA להשתיק יעד לארח אחת. אם השתקת מטרה מסוימת גורמת להקטנת יעילות טרנסלוקציה, אימות כי תוצאה זו היא לא בשל תופעות-היעד את יכולה להיות מושגת על ידי הפרדת ארבעת דופלקסים siRNA ולחזור על assay טרנסלוקציה. לפחות שתיים מתוך ארבעה דופלקסים siRNA צריך להפגין פנוטיפ דומה לברכת siRNA המקורית. עם תוצאה זו, אפשר להיות בטוח מאוד כי tr שנצפהיעילות anslocation אינה בשל השפעות חוץ-יעד. תוקפו של תוצאות טרנסלוקציה מיוצר תלוי גם כדאיות התא. היישום של כתם גרעינים לאחר assay טרנסלוקציה מאפשרת ספירה של כדאיות התא הבאים השתקת siRNA. במקרה של PLK1, מוות של תאים משמעותי ניתן להבחין בקלות ללא מכתים; עם זאת, באמצעות epifluorescence מיקרוסקופיה ייצוג מדויק יותר ניתן להשיג. אם על ידי השתקת מות תא משמעותי בפרט יעד מארח הוא ציין, למשל 50% לעומת השליטה, אין זה סביר כי תמונה מדויקת ניתן להסיק לגבי החשיבות של זה חלבון שורה מסוים אל טרנסלוקציה של effectors. כפי שניתן לראות במחקר זה, למרות השתקה או Rab5A או Rab7A יש השפעה קלה על כדאיות התא (איור 5 ג), הפחתה זו אינה בולטת מספיק כדי לבטל את תוקפה של נתונים טרנסלוקציה ציין. שיקול נוסף לגבי foll כדאיות התאבשל השתקת siRNA היא האבחנה מוות של תאים משמעותי לעתים קרובות מוביל לעלייה של יחס טרנסלוקציה. זו באה לידי ביטוי בצורה הולמת על ידי נתוני טרנסלוקציה ודווחו PLK1 (איור 5 א). מספר תאי מופחת התוצאה היא מגמת עלייה של משקל הריבוי של זיהום. זה יגביר את קצב הזיהום ומכאן יחס טרנסלוקציה. אמנם לא הציג במחקר זה, ויזואליזציה של טרנסלוקציה מפעיל יכול גם להניב תוצאה כמותית חינם. באמצעות מיקרוסקופ epifluorescent מצויד במראה dichroic ארוך לעבור לאור עירור והפליטה נפרד יכול לספק תצפית ויזואלית של קרינת מצע כלאם תאית. חלופה אפשרית למערכת כתב β-lactamase היא לנצל את מערכת הכתב-cyclase adenylate. בדומה למערכת הכתב המתוארת כאן, הגן של עניין הוא התמזג גן cyclase adenylate calmodulin התלוי (cyaA </em&gt;) נגזר שעלת Bordetella. טרנסלוקציה מפעיל יכול להימדד על ידי כימות (cAMP) תאיים המחזורי AMP באמצעות ערכת ELISA immunoassay. מאז פעילות של CyaA תלויה לחלוטין calmodulin התא המארח, אשר שוהה רק cytosol המארח, טרנסלוקציה מפעיל אושר על ידי עלייה ברמות cAMP. אמנם שיטה זו גם שמשה בהצלחה למדוד טרנסלוקציה מפעיל עבור מגוון רחב של חיידקים 45-47, כימות של cAMP התאי מסתמכת על תמוגה של תאי המארחים לחלץ cAMP, תהליך שהוא יותר timeconsuming לעומת השיטה המתוארת בתוך. מדידת טרנסלוקציה מפעיל באמצעות מערכת כתב הסריג מבוסס β-lactamase היא יעילה יותר מאז מצע כלאם ניתן להוסיף ישירות אל תאי קרינה ניתן למדוד בתוך שעות. בנוסף, השיטה המתוארת כאן ניתן להתאים בקלות רבה יותר כדי ליצור תוצאות תפוקה גבוהה, במיוחד בצורה 96-היטבבְּ. חיידקים פתוגנים רב תלויים במערכות טרנסלוקציה החלבון להציג חלבונים מפעילים לתוך תאי מארחים המאפשרים אפנון של פונקציות תא מארח להיטיב עם הפתוגן. מערכות IV הפרשת סוג נמצאות בשימוש על ידי חיידקים תאיים כגון הלגיונלה, Coxiella ו Brucella וסוג III מערכות הפרשה מנוצלות על ידי מגוון של פתוגנים כולל כלמידיה, הצמדה ולמחיקת E. coli ו סלמונלה. על ידי השוואת השפעת ביטוי השתקה של חלבונים מארחים ספציפיים על טרנסלוקציה מפעיל על ידי מגוון של פתוגנים, הבנה של גורמי מארח הכרחיים טרנסלוקציה מפעיל על ידי סוגים מסוימים של מערכות הפרשה או ספציפי לאחד הפתוגן שהיחיד יוכל הובהרה. זה מספק גישה ייחודית ללמוד את המורכבות של אינטראקציות בין מאכסן לפתוגן.

Burnetii Coxiella הוא פתוגן תאי ייחודי שגורם קדחת Q הידבקות בני אדם zoonotic. מחלה זו קשורה עם קשת רחבה של מצגות קליניות המשתרעות seroconversion אסימפטומטית לזיהום כרוני מסכנות החיים שבאו לידי לעתים קרובות ככל שנים אנדוקרדיטיס לאחר חשיפת 1. הדבקת בני אדם מתרחשת בעיקר באמצעות השאיפה של אירוסולים מזוהמים מעלי גירת המאגר העיקרי לזיהום, בפרט, פרות חולבות, כבשים ועזים. למרות זיהום Coxiella אצל בעלי חיים אלה הוא בדרך כלל תת-קליני, הזיהום עלול לגרום להפלה ואת עומס החיידקים ניכר בתוך נוזל שלית הלידה יכול לזהם בסביבה המקומית 1. דוגמה של זיהום כגון עומס עצום יכול להיות משני בריאות הציבור ועל ענף החקלאות נצפתה לאחרונה פרוץ קדחת Q שאירעו בהולנד 2. בין 2007 ו2010 למעלה מ -4,000 מקרים של בני אדם קדחת Q אובחנו פרוץ זה היה קשור זיהום משמעותי של חוות עיזים 3. בנוסף, Coxiella הוא נשק ביולוגי פוטנציאלי, כפי שסווג על ידי המרכז האמריקאי לבקרת מחלות ומניעתן, הודות ליציבות הסביבה של חיידקי מנת זיהומיות נמוכה צורך לגרום לתחלואה חמורה ולתמותה 4. Coxiella קיים בשני שלבים: שלב א &#39;אורגניזמים, מבודדים ממקורות טבעיים, הם ארסיים מאוד Phase II אורגניזמים הם נחלשו מאוד in vivo. לדוגמא, לאחר קטעי מספר במבחנה של Coxiella burnetii תשע המייל Phase I אורגניזמים, שני חיידקי השלב הופקו המכילות מחיקה כרומוזומליות בלתי הפיכה ותוצאת lipopolysaccharide הקטום (LPS) 5. זן זה, ג burnetii NMII, הוא phenotypically דומה Phase I במודלים בתרבית רקמה ומספק במצב בטוחl לחוקרים ללמוד בפתוגנזה Coxiella במעבדות 5. בשנים האחרונות כמה פריצות דרך במהירות קידמו בתחום הגנטיקה Coxiella. בעיקר, התפתחות המדיה axenic (acidified בינוני ציסטאין ציטראט - ACCM-2) אפשר את הגידול ללא תאים של Coxiella בשני הנוזליים על תקשורת מוצקה 6,7. זה הביא לשיפור ישיר של כלים גנטיים זמינים Coxiella כולל מערכת ביטוי גנים מושרה, וקטורי הסעות ומערכות transposon אקראיים 8-11. לאחרונה, שתי שיטות איון גן ממוקד גם פותחו, לסלול את הדרך לבחינת מועמדים גנים ארסיות ספציפית 12. בעקבות הפנמה על ידי מקרופאגים מכתשיים, Coxiella משכפל למספרים גבוהים בתוך תא קרום נכנס כינת Coxiella- המכיל vacuole (CCV). CCV דורש סחר endocytic מארח הendosomes המוקדם והמאוחר הגס עד שהוא מבשיל לכדי אברון נגזר ליזוזום 13. לאורך כל התהליך הזה, CCV רוכש גורמים מארחים כי גם מופיעים זמני או להישאר הקשורים vacuole, לרבות, אך לא רק, Rab5, Rab7, CD63 ו LAMP-1 13-15. שכפול של Coxiella בתוך תאי מארחים תלוי לחלוטין מערכת הפרשה Dot מתפקדת במלואה / ICM סוג IVB (T4SS) 8,16,17. מערכת ההפרשה זהו מבנה רב-חלבון הקשורים אבותיהם של מערכות נטייה והוא משתרע הוא ממברנות חיידקי vacuolar לספק חלבונים חיידקיים, כינת effectors, לתוך הציטופלסמה המארח 18. Coxiella T4SS מבחינה פונקציונלית מאוד דומה היטב את המערכת מאופיינת סוג IVB Dot / הפרשת ICM של הלגיונלה pneumophila 19,20. מעניין לציין, כי הפעלת טרנסלוקציה מפעיל T4SS ולאחר אינה מתרחשת עד Coxiella מגיע ליזוזום הנגזרות חומציאברון, כ 8 שעות לאחר הפגיעה 17,21. נכון להיום, מעל 130 effectors Dot / ICM זוהה 9,17,22-24. רבי effectors אלה לשחק תפקידים חשובים סבירים בעת שכפול של Coxiella בתוך תאי מארחים; עם זאת, effectors רק כמה מתאפיינים תפקודי 25-29. במחקר זה אנו מנצלים assay טרנסלוקציה הקרינה מבוססי המסתמכת על המחשוף של המצע CCF2-AM סריג (להלן המכונה המצע כלאם) באמצעות פעילות β-lactamase בתוך הציטופלסמה התא המארח (איור 1). הגן של עניין הוא התמזג TEM-1 β-lactamase (בום) על פלסמיד כתב המספק ביטוי מכונן. מצע כלאם מורכב משני fluorophores (coumarin ו והעמסה) יוצרות זוג סריג. עירור של תוצאות coumarin ב סריג של וההעמסה ו פליטת קרינה ירוקה בהעדר טרנסלוקציה מפעיל; עם זאת, אם בלהM-מפעיל חלבון היתוך הוא translocated לתוך הציטופלסמה המארחת, כתוצאת β-lactamase פעילות וחותכת את טבעת β-לקטם של מצע כלאם, הפרדת זוג הסריג לייצר פליטת קרינה כחולה הבאות עירור. Assay טרנסלוקציה זה הוכח גם כגישה לזהות חלבונים מפעיל מתוך מגוון רחב של חיידקים תאיים תאיים שונים, כולל ג burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, trachomatis כלמידיה, וחיידק E. coli, סלמונלה Brucella 17,30-35. כדי לקבוע את התפקיד של גורמי מארח ספציפיים על טרנסלוקציה מפעיל Coxiella אנו מנצלים שיטה מבוססת היטב עבור להשתקת גנים המכונית התערבות RNA, ב RNA התערבות הקטן במיוחד (siRNA). במקור מזוהה elegans Caenorhabditis, התערבות RNA היא תהליך הסלולר אנדוגני משומר המשמש defe המולדNSE מפני וירוסים כמו גם ויסות הגנים 36,37. לאחר עקדת siRNA רצף ספציפי, השפלה של mRNA מתרחשת דרך RISC (מורכב השתקה המושרה RNA) וכתוצאה מכך להשתקת גנים ספציפיים או 38 מציאה. במחקר זה, siRNA שמש למקד שני חלבונים מארחים, Rab5A ו Rab7A, אשר הם רגולטורים חשובים של מסלול endocytic. ההשפעה של השתקת Rab5A ו Rab7A על טרנסלוקציה מפעיל הוברר באמצעות ג burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 נבחרה כפי שהוא הוצג בעבר להיות translocated ידי מערכת הפרשת Dot / ICM Coxiella של 17. ניצול הוא להשתקת גני siRNA ואת assay טרנסלוקציה fluorescencebased המתואר כאן, אנחנו מתחילים להקים לחיקוי עבור גורמי המארח טרנסלוקציה של חלבונים מפעילים ידי Coxiella. גישה זו ניתן ליישם במגוון רחב של שניהם חיידקים תאיים תאיים שיש להם secretio דומהמערכות n אחראיות טרנסלוקציה של חלבונים מפעילים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="760">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Reagents</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Citric acid</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0759</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S4641</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Potassium phosphate</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">60218</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:87px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">442611</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C5080</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Iron sulfate</td>
			<td style="width:87px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S93248</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9625</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">L-cysteine</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C6852</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Bacto-neopeptone</td>
			<td style="width:87px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">211681</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Casamino acids</td>
			<td style="width:87px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1424</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Methyl beta cyclodextrin</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C4555</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">RPMI + Glutamax</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">61870-036</td>
			<td style="width:211px;">ACCM-2 medium component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C0378</td>
			<td style="width:211px;">For bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (OTP)</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">D-001810-10-05</td>
			<td style="width:211px;">Non-targeting control</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">siGENOME Human PLK1 (5347) siRNA - SMARTpool</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">M-003290-01-005</td>
			<td style="width:211px;">Causes cell death; measure of transfection efficiency</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">siGENOME Human RAB5A (5968) siRNA - SMARTpool</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">M-004009-00-0005</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">siGENOME Human RAB7A (7879) siRNA - SMARTpool</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">M-010388-00-0005</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:343px;">5X siRNA buffer</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">B-002000-UB-100</td>
			<td style="width:211px;">Use sterile RNase-free water to dilute 5X siRNA buffer to 1X siRNA buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DharmaFECT-1 Transfection Reagent</td>
			<td style="width:87px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">T-2001-01</td>
			<td style="width:211px;">For transfection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Opti-MEM + GlutaMAX</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">51985-034</td>
			<td style="width:211px;">Reduced-serum medium used for transfection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">DMEM + GlutaMAX</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10567-014</td>
			<td style="width:211px;">For cell culture and infection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Heat-inactivated fetal calf serum (FCS)</td>
			<td style="width:87px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">SH30071.03</td>
			<td style="width:211px;">Can use alternate equivalent product</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">DMSO</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td style="width:211px;">For storage of Coxiella strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">PBS</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">0.05% Trypsin + EDTA</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td style="width:211px;">For cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:343px;">dH2O</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For dilution of samples and standards for qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">Quick-gDNA Mini Prep</td>
			<td style="width:87px;">ZYMO Research</td>
			<td style="width:119px;">D3007</td>
			<td style="width:211px;">Can use alternate equivalent product to extract gDNA</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:343px;">SensiFAST SYBR No-ROX Kit</td>
			<td style="width:87px;">Bioline</td>
			<td style="width:119px;">BIO-98020</td>
			<td style="width:211px;">Can use alternate equivalent qPCR master mix product for qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:343px;">LiveBLAzer FRET-B/G Loading kit with CCF2-AM</td>
			<td style="width:87px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">K1032</td>
			<td style="width:211px;">For measurement of translocation using fluorescence and generation of the 6X loading solution (contains Solution A, B, C and DMSO)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:87px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">106469</td>
			<td style="width:211px;">Probenicid solution component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71505</td>
			<td style="width:211px;">Probenicid solution component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">di-Sodium hydrogen orthophosphate</td>
			<td style="width:87px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">106586</td>
			<td style="width:211px;">Probenicid solution component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Probenicid</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8761</td>
			<td style="width:211px;">Probenicid solution component</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:343px;">DRAQ5 Fluorescent Probe Solution (5 mM)</td>
			<td style="width:87px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">62251</td>
			<td style="width:211px;">Nuclei stain to determine cell viablity. Use 1:4000 diluted in PBS.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:343px;">4% PFA (paraformaldehyde) solution in PBS</td>
			<td style="width:87px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td style="width:211px;">Fixing solution for HeLa 229 cells</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:343px;">25cm2 tissue culture flask with vented cap</td>
			<td style="width:87px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430639</td>
			<td style="width:211px;">For growth of bacterial strain</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:343px;">96 Well Flat Clear bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually wrapped, with Lid, Sterile</td>
			<td style="width:87px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3603</td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:343px;">75cm2 tissue culture flask with vented cap</td>
			<td style="width:87px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430641</td>
			<td style="width:211px;">For growth of HeLa 229 cells</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:343px;">175cm2 tissue culture flask with vented cap</td>
			<td style="width:87px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">431080</td>
			<td style="width:211px;">For growth of HeLa 229 cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Haemocytometer</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For quantification of HeLa 229 cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Tear-A-Way 96 Well PCR plates</td>
			<td style="width:87px;">4titude</td>
			<td style="width:119px;">4ti-0750/TA</td>
			<td style="width:211px;">For qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">8-Lid chain, flat</td>
			<td style="width:87px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">65.989.002</td>
			<td style="width:211px;">For qPCR reaction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Equipment</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Bench top microfuge</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Bench top vortex</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Orbital mixer</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:87px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5810 R</td>
			<td style="width:211px;">For pelleting bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For gDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:343px;">Mx3005P QPCR machine</td>
			<td style="width:87px;">Aligent Technologies</td>
			<td style="width:119px;">401456</td>
			<td style="width:211px;">For quantification of Coxiella genomes in 7 day culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:343px;">ClarioSTAR microplate reader</td>
			<td style="width:87px;">BMG LabTech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:211px;">For measurement of fluorescence</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applying fluorescence resonance energy transfer (fret) to examine effector translocation efficiency by coxiella burnetii during sirna silencing

Burnetii Coxiella, הגורם הסיבתי של קדחת Q, הוא פתוגן תאיים שנשענת על סוג IV Dot / ICM הפרשת מערכת להקים נישה בשכפול הדנ&quot;א. קבוצה של effectors הם translocated דרך המערכת הזאת לתוך התא המארח כדי לתפעל תהליכים המארח לאפשר את הקמתה של vacuole ליזוזום הנגזרות ייחודי עבור שכפול. השיטה המוצגת כאן כוללת שילוב של שתי טכניקות ומבוססות: להשתקת גנים ספציפית באמצעות siRNA ומדידה של טרנסלוקציה מפעיל באמצעות מצע סריג מבוסס המסתמך על פעילות β-lactamase. במסגרתו קיימים שתי גישות אלה, אנו יכולים להתחיל להבין את התפקיד של גורמים מארחים בתפקוד טרנסלוקציה מפעיל מערכת הפרשת חיידקים. במחקר זה בדקנו את התפקיד של Rab5A ו Rab7A, הוא רגולטורים חשובים של מסלול סחר endocytic. אנו מראים כי השתקת ביטוי גם בתוצאות חלבון לירידה מפעיל translocatioיעילות n. ניתן שיטות אלה לשנות בקלות לבחון פתוגנים תאיים תאיים אחרים כי גם לנצל מערכות הפרשה. בדרך זו, תמונה גלובלית של גורמי מארח מעורבים טרנסלוקציה מפעיל חיידק עשויה להתגלות.

לצורך המחקר הזה, ג burnetii זן pBlaM-CBU0077 נבחר CBU0077 הוכח בעבר להיות מפעיל translocated של מערכת הפרשת Coxiella Dot / ICM 17. לפני ההדבקה, המספר הכולל של ml / הגנום של ג שבעה ימים תרבות burnetii pBlaM-CBU0077 הייתה מנויים באמצעות qPCR. איור 4 מדגי דוגמא של סף המחזור (CT) ערכים צפויים משני תקני הדגימות הבאים qPCR. ערכי CT (המיוצגים בעלילת ההגברה (האיור 4B) ומספרית (איור 4C)) יוצאו ונותחו כמתואר 4.3.3. בהתבסס על נתונים נציג לעין, היו 2.31 ​​× 10 8 הגנום / מ&quot;ל ב 10 מ&quot;ל מחדש תלויה תרבית החיידקים (איור 4D). כדי להפיק את הדילול בקטריאלי המתאים (1.88 × 10 8 הגנום / מיליליטר in 2 מ&quot;ל), 1.63 מ&quot;ל של חיידקים resuspended התווסף 370 μl של FCS טרי, מחומם מראש DMEM + 10%. תאים הפוכים טרנספקציה עם siRNA נדבקו כתוצאה מכך עם ג burnetii pBlaM-CBU0077 ב משרד הפנים של 300 למשך 24 שעות. לאחר דגירה של ההפך תאים נגועים טרנספקציה עם כימות המצע כלאם של טרנסלוקציה מפעיל ניתן לקבוע באמצעות קורא צלחת פלואורסצנטי. בעקבות ניתוח כמתואר 7, כל הערכים ייחסו כי כבר מנורמלים הנגוע OTP יכולים גם להיות מנורמלים הנגוע OTP. רמת טרנסלוקציה מפעיל אחרי שדכאתי של גני מארח יכולה להיות מקובצת לשלוש תוצאות לאחר השוואה לשליטת OTP נגועה: (1) ללא שינוי; (2) גברת טרנסלוקציה מפעיל; (3) ירד טרנסלוקציה מפעיל. ניתוח סטטיסטי לאחר, למשל מבחן t הסטודנטים, שניתן להשתמש בהם כדי לקבוע את המשמעות של כל t ההבדל שנצפהo נגוע שליטה OTP. תוצאת השתקה או Rab5A או Rab7A על טרנסלוקציה מפעיל משלושה ניסויים עצמאיים מוצג באיור 5A. ירידה משמעותית ברמת טרנסלוקציה בום-CBU0077 התרחשו במהלך השתקה שניהם Rab5A ו Rab7A לעומת קבוצת ביקורת OTP (ערך p = 0.0088 (Rab5A) וערך p = 0.0059 (Rab7A), זיווג, מבחן t הסטודנטים). ההשפעה של טיפול siRNA על כדאיות התא גם הוקמה. בעקבות assay טרנסלוקציה, התאים היו קבועים, מוכתם בכתם גרעינים ובהמשך לכמת. כפי שניתן לראות בתרשים 5 ג, למרות טיפול עם או תוצאות Rab5A או Rab7A לירידה כדאיות התא לעומת קבוצת ביקורת OTP (12% ו -31%, בהתאמה), ירידה זו היא לא חמורה כמו PLK1 (97%), בגן הידוע מוות של תאים כדי לגרום (p-value = 0.0102 (Rab5A); p-value = 0.0081 (Rab7A); p-value &lt;0.0001 (PLK1), זיווג, סטודנטים מבחן t). תוצאות אלו מראות כיצד השתקה של המארח geנוס באמצעות siRNA יכול לשנות את הרמות שליליות של טרנסלוקציה מפעיל חיידקים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54210/54210fig1.jpg" /> איור 1. את מנגנון הפעולה של מצע כלאם במהלך הדבקה. ג burnetii מופנם על ידי תאי מארחים ויוצר vacuole נגזר-ליזוזום כינת vacuole Coxiella המכיל. 24 שעות לאחר ההדבקה, תאים נטענים עם המצע כלאם חדיר קרום שיש לה שני fluorophores להרכיב זוג סריג (א). בהעדר β-lactamase כלומר, לא טרנסלוקציה של מפעיל בום-CBU0077, עירור של coumarin ב 410 תוצאות ננומטר סריג וההעמסה, ציינו כאיתות פלואורסצנטי ירוקה (520 ננומטר) (B). במקרה של מערכת הפרשת Dot / ICM פונקציונלית, חלבון ההיתוך בום-CBU0077 יהיה translocated לתוך התא המארח יהיה CLeave מצע כלאם, אגב פעילות β-lactamase, גרימת הפרדת שני הצבעים וכתוצאה מכך שיבוש סריג ו אות קרינה כחולה (450 ננומטר) לאחר העירור ב 410 ננומטר (C). שני אותות הקרינה הירוקים וכחול יכולים להיות זוהה באמצעות קורא צלחת פלואורסצנטי. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54210/54210fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54210/54210fig2.jpg" /> . איור 2. סקירה סכמטית של Transfection הפוך טרנסלוקציה Assay Workflow יום 1: הכן את ג burnetii pBlaM-CBU0077 תרבות יום 4:. transfect היפוך באמצעות 40 ננומטר siRNA זרע הלה 229 תאים בצפיפות סופית של 3.92 × 3 תאים 10 / גם לתוך מגש 96-גם יום 5:. Chהתקשורת ange יום 7:. לכמת את מ&quot;ל / הגנום הכולל של ג burnetii pBlaM-CBU0077 תרבות באמצעות qPCR ובהמשך להדביק תאי transfected הפוך עם משרד פנים של 300. יום 8:. להוסיף צבע טעינת 6x, מודד קרינה ולכמת מספר סלולארי <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54210/54210fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54210/54210fig3.jpg" /> איור 3. פריסת פלייט 96-גם משמשת הגדרת Transfection הפוך והזריעה של הלה 229 תאים. הבארות &quot;הריקות&quot; (באדום) מכילים מדיה בלבד ואינו צריך תוספת של או siRNA או הלה 229 תאים. SiRNA OTP (בכחול אור עבור בארות נגועות וכחול כהה עבור בארות נגועות) משמש כביקורת ללא מיקוד, שכן הוא כבר מותאםיש פחות תופעות מחוץ היעד. והחום של הבארות ירוקות לייצג את Rab5A ו Rab7A siRNA, בהתאמה. PLK1 siRNA (בצבע צהוב) משמש כמדד ליעילות transfection כאובדן ביטוי PLK1 יכול לגרום מסלולים פרו-אפופטוטיים מוות של תאים נרחבים בתוך רוב מכריע של שורות תאים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54210/54210fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54210/54210fig4.jpg" /> איור 4. ערכים נציג qPCR Ct משמש לכמת את המספר הכולל של הגנום / מ&quot;ל ב C. burnetii pBlaM-CBU0077 תרבות. (א) התנאים מחזור המשמש qPCR למנות את מספר מ&quot;ל / הגנום בתרבויות Coxiella. ערכי Ct לשני תקני דגימות מיוצגים גרפי (B) ו נומרית (C)פורמטים. (ד) ערכי ה- CT הרגילים היו בממוצע, בגרף לבין קו מגמת לוגריתמי חושב. באמצעות המשוואה ואת הממוצעים של המדגם Ct מעריך את המספר הכולל של מיליליטר / הגנום של ג burnetii תרבות pBlaM-CBU0077 היה נחוש בדעתו להיות 2.31 ​​× 8 10. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54210/54210fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54210/54210fig5.jpg" /> טרנסלוקציה איור 5. ה DOT / ICM מפעיל בום-CBU0077 במהלך siRNA השתקת Rab5A ו Rab7A. הלה 229 תאים היו transfected הפוכה עם siRNA הספציפי Rab5A (ברים חומים), Rab7A (פסים ירוקים), OTP (סורגים כחולים) או PLK1 (פסים צהובים) וטופחו במשך 72 שעות לפני ההדבקה עם ג burnetii זן pBlaM-CBU0077 ב משרד הפנים של 300 למשך 24 שעות. לאחר tהוא התוספת של מצע כלאם, קרינה נמדד באמצעות קורא microplate (א) הטבלה מדגימה את ערכי קרינת גלם המתקבלים בניסוי יחיד לצד 450:. ביחס יחס 520 ננומטר לשליטת OTP נגוע לאחר הפחתת הערכים הריקים (מדיה רק, לא תאים). רמת טרנסלוקציה (B) ואת כדאיות התא (C) מוצגים כאחוז ממוצע ± סטיית התקן ביחס לתאים נגועים טרנספקציה הפוכה OTP משלושה ניסויים עצמאיים. * P-value &lt;0.05; **-ערך p &lt;0.01; **** P-value &lt;0.0001 (זיווג, -test t סטודנטים). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54210/54210fig5large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רְכִיב </td><td> ריכוז </str<html> אונג&gt; </td></tr><tr><td> חוּמצַת לִימוֹן </td><td> 13.4 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> נתרן ציטרט </td><td> 16.1 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> פוספט אשלגן </td><td> 3.67 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> מגנזיום כלוריד </td><td> 1 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> סידן כלורי </td><td> 0.02 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> סולפט ברזל </td><td> 0.01 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> נתרן כלורי </td><td> 125.4 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> L- ציסטאין </td><td> 1.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> neopeptone </td><td> 0.1 גר &#39;/ ל </td></tr><tr><td> חומצות casamino </td><td> 2.5 גר &#39;/ ל </td></tr><tr><td> cyclodextrin בטא מתיל </td><td> 1 גר &#39;/ ל </td></tr><tr><td> RPMI </td><td> 125 מ&quot;ל / L </td></tr></tbody></table> טבלה 1. הרכיבים הנדרשים כדי להפוך 1x ACCM-2. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-ne</html style=";text-align:right;direction:rtl">xt.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <tbody><tr><td></td><td colspan="4"> ריכוז יעד </td></tr><tr><td></td><td> 1μM </td><td> 5 מיקרומטר </td><td> 10μM </td><td> 20 מיקרו-מטר </td></tr><tr><td> החל שומות </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 nmol </td><td> 1 מ&quot;ל </td><td> 200 μl </td><td> 100 μl </td><td> 50 μl </td></tr><tr><td> 2 nmol </td><td> 2 מ&quot;ל </td><td> 400 μl </td><td> 200 μl </td><td> 100 μl </td></tr><tr><td> 5 nmol </td><td> 5 מ&quot;ל </td><td> 1 מ&quot;ל </td><td> 500 μl </td><td> 250 μl </td></tr><tr><td> 10 ננומול </td><td> 10 מ&quot;ל </td><td> 2 מ&quot;ל </td><td> 1 מ&quot;ל </td><td> 500 μl </td></tr><tr><td> 20 ננומול </td><td> 20 מ&quot;ל </td><td> 4 מ&quot;ל </td><td> 2 מ&quot;ל </td><td> מ&quot;ל 1 </td></tr></tbody&gt; </table> נפח טבלת 2. של siRNA 1x כרית הון הנדרש עבור הידרציה Lyophilized siRNA לריכוז המתאים.

Watch this Scientific Journal Video about Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing at JoVE.com

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

חוקר את יחסי הגומלין בין חיידקים פתוגנים מארחיהם הוא אזור חשוב של מחקר ביולוגי. כאן אנו מתארים טכניקות צורך למדוד טרנסלוקציה מפעיל ידי burnetii Coxiella במהלך להשתקת גנים siRNA שימוש המצע כלאם.

החלת העברת אנרגית תהודת קרינה (סריג) לבחינת יעילות טרנסלוקציה מפעיל ידי<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; במהלך siRNA השתקה

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

applying-fluorescence-resonance-energy-transfer-fret-to-examine

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

10.6K Views.  University of Melbourne.  חוקר את יחסי הגומלין בין חיידקים פתוגנים מארחיהם הוא אזור חשוב של מחקר ביולוגי. כאן אנו מתארים טכניקות צורך למדוד טרנסלוקציה מפעיל ידי burnetii Coxiella במהלך להשתקת גנים siRNA שימוש המצע כלאם. 

Video: Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known phenotype.  Other bulk methods of purification include panning, complement depletion and magnetic bead separation.  However, FACS has several advantages over other available methods.  FACS is the preferred method when very high purity of the desired population is required, when the target cell population expresses a very low level of the identifying marker or when cell populations require separation based on differential marker density.  In addition, FACS is the only available purification technique to isolate cells based on internal staining or intracellular protein expression, such as a genetically modified fluorescent protein marker.  FACS allows the purification of individual cells based on size, granularity and fluorescence.  In order to purify cells of interest, they are first stained with fluorescently-tagged monoclonal antibodies (mAb), which recognize specific surface markers on the desired cell population (1).  Negative selection of unstained cells is also possible.  FACS purification requires a flow cytometer with sorting capacity and the appropriate software.  For FACS, cells in suspension are passed as a stream in droplets with each containing a single cell in front of a laser.  The fluorescence detection system detects cells of interest based on predetermined fluorescent parameters of the cells.  The instrument applies a charge to the droplet containing a cell of interest and an electrostatic deflection system facilitates collection of the charged droplets into appropriate collection tubes (2).  The success of staining and thereby sorting depends largely on the selection of the identifying markers and the choice of mAb.  Sorting parameters can be adjusted depending on the requirement of purity and yield.  Although FACS requires specialized equipment and personnel training, it is the method of choice for isolation of highly purified cell populations.

Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

For many scientific studies requiring a biological and chemical analysis of cell populations the cells must be in a high state of purity. Fluorescence activated cell sorting (FACS) is a superior method in which to obtain pure cell populations.

טיהור אוכלוסייה תאים ספציפיים על ידי מיון פלואורסצנטי תא פעיל (FACS)

Experimental and clinical studies often require highly purified cell populations.  FACS is a technique of choice to purify cell populations of known ...

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1. These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon targets within the eukaryotic cytosol. Some AB toxins travel by vesicle carriers from the cell surface to the endoplasmic reticulum (ER) before entering the cytosol2-4. In the ER, the catalytic A chain dissociates from the rest of the toxin and moves through a protein-conducting channel to reach its cytosolic target5. The translocated, cytosolic A chain is difficult to detect because toxin trafficking to the ER is an extremely inefficient process: most internalized toxin is routed to the lysosomes for degradation, so only a small fraction of surface-bound toxin reaches the Golgi apparatus and ER6-12.

To monitor toxin translocation from the ER to the cytosol in cultured cells, we combined a subcellular fractionation protocol with the highly sensitive detection method of surface plasmon resonance (SPR)13-15. The plasma membrane of toxin-treated cells is selectively permeabilized with digitonin, allowing collection of a cytosolic fraction which is subsequently perfused over an SPR sensor coated with an anti-toxin A chain antibody. The antibody-coated sensor can capture and detect pg/mL quantities of cytosolic toxin. With this protocol, it is possible to follow the kinetics of toxin entry into the cytosol and to characterize inhibitory effects on the translocation event. The concentration of cytosolic toxin can also be calculated from a standard curve generated with known quantities of A chain standards that have been perfused over the sensor. Our method represents a rapid, sensitive, and quantitative detection system that does not require radiolabeling or other modifications to the target toxin.

In this report, we describe how surface plasmon resonance is used to detect toxin entry into the host cytosol. This highly sensitive method can provide quantitative data on the amount of cytosolic toxin, and it can be applied to a range of toxins.

איתור של טרנסלוקציה רעלן לתוך Cytosol המארח ידי plasmon משטח תהודה

AB toxins consist of an enzymatic A subunit and a cell-binding B subunit1.  These toxins are secreted into the extracellular milieu, but they act upon ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of human Type 1 diabetes (T1D). Cell transfer studies in irradiated recipient mice have established that T cells are pivotal in T1D pathogenesis in this model. We describe herein a simple method to rapidly induce T1D by adoptive transfer of purified, primary CD4+ T cells from pre-diabetic NOD mice transgenic for the islet-specific T cell receptor (TCR) BDC2.5 into NOD.SCID recipient mice. The major advantages of this technique are that isolation and adoptive transfer of diabetogenic T cells can be completed within the same day, irradiation of the recipients is not required, and a high incidence of T1D is elicited within 2 weeks after T cell transfer. Thus, studies of pathogenesis and therapeutic interventions in T1D can proceed at a faster rate than with methods that rely on heterogenous T cell populations or clones derived from diabetic NOD mice.

We provide a reproducible method to induce type 1 diabetes (T1D) in mice within two weeks by the adoptive transfer of islet antigen-specific, primary CD4+ T cells.

אינדוקציה מואצת סוכרת סוג 1 בעכברים על ידי העברת המאמצת של CD4 + T תאי Diabetogenic

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

אינדוקציה של Murine דלקת מעיים על ידי העברת המאמצת של מפעיל CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; גבוה</sup&gt; תאי T לעכברי immunodeficient

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; מוטאנטים טרנספוזון

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a signaling pathway. The method is based, on the one hand, on the inducible expression of a specific protein to initiate a signaling event at a defined and predetermined step in the selected signaling cascade. Concomitant expression, on the other hand, of the gene of interest then allows the investigator to evaluate if the activity of the expressed target protein is located upstream or downstream of the initiated signaling event, depending on the readout of the signaling pathway that is obtained. Here, the apoptotic cascade was selected as a defined signaling pathway to demonstrate protocol functionality. Pathogenic bacteria, such as Coxiella burnetii, translocate effector proteins that interfere with host cell death induction in the host cell to ensure bacterial survival in the cell and to promote their dissemination in the organism. The C. burnetii effector protein CaeB effectively inhibits host cell death after induction of apoptosis with UV-light or with staurosporine. To narrow down at which step CaeB interferes with the propagation of the apoptotic signal, selected proteins with well-characterized pro-apoptotic activity were expressed transiently in a doxycycline-inducible manner. If CaeB acts upstream of these proteins, apoptosis will proceed unhindered. If CaeB acts downstream, cell death will be inhibited. The test proteins selected were Bax, which acts at the level of the mitochondria, and caspase 3, which is the major executioner protease. CaeB interferes with cell death induced by Bax expression, but not by caspase 3 expression. CaeB, thus, interacts with the apoptotic cascade between these two proteins.

The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.

יישום מערכת ביטוי עין מתנהלת לחקר הפרעות של גורמים בקטריאלי ארסיות עם איתות תאיים

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

ניתוח של<em&gt; Enterocolitica Yersinia</em&gt; מפעיל טרנסלוקציה לתאי מארח שימוש בטא לקטמאז מפעיל Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or neutralize the ingested material, or to present it as antigens and initiate adaptive immune responses. The pH of phagosomes is a critical parameter regulating fission or fusion with endomembranes and activation of proteolytic enzymes, events that allow the phagocytic vacuole to mature into a degradative organelle. In addition, translocation of H+ is required for the production of high levels of reactive oxygen species (ROS), which are essential for efficient killing and signaling to other host tissues. Many intracellular pathogens subvert phagocytic killing by limiting phagosomal acidification, highlighting the importance of pH in phagosome biology. Here we describe a ratiometric method for measuring phagosomal pH in neutrophils using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled zymosan as phagocytic targets, and live-cell imaging. The assay is based on the fluorescence properties of FITC, which is quenched by acidic pH when excited at 490 nm but not when excited at 440 nm, allowing quantification of a pH-dependent ratio, rather than absolute fluorescence, of a single dye. A detailed protocol for performing in situ dye calibration and conversion of ratio to real pH values is also provided. Single-dye ratiometric methods are generally considered superior to single wavelength or dual-dye pseudo-ratiometric protocols, as they are less sensitive to perturbations such as bleaching, focus changes, laser variations, and uneven labeling, which distort the measured signal. This method can be easily modified to measure pH in other phagocytic cell types, and zymosan can be replaced by any other amine-containing particle, from inert beads to living microorganisms. Finally, this method can be adapted to make use of other fluorescent probes sensitive to different pH ranges or other phagosomal activities, making it a generalized protocol for the functional imaging of phagosomes.

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

מדידת pH Phagosome ידי ratiometric מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

התפתחות Lyophilized Loop בתיווך ריאגנטים הגברה איזו תרמים לצורך זיהוי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

A Method to Assess Fc-mediated Effector Functions Induced by Influenza Hemagglutinin Specific Antibodies

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and Fc-regions. Here, we describe how to measure the activation of Fc effector functions by monoclonal antibodies targeting the influenza virus hemagglutinin with the use of a genetically engineered Jurkat cell line expressing an activating type 1 Fc-Fc&#947;R. Using this method, the contribution of specific Fc-Fc&#947;R interactions conferred by immunoglobulins can be determined using an in vitro assay.

We describe a method to measure the activation of Fc-mediated effector functions by antibodies that target the influenza virus hemagglutinin. This assay can also be adapted to assess the ability of monoclonal antibodies or polyclonal sera targeting other viral surface glycoproteins to induce Fc-mediated immunity.

שיטה להערכת פונקציות אפקטור בתיווך Fc המושרה על ידי שפעת Hemagglutinin נוגדנים ספציפיים

Antibodies play a crucial role in coupling the innate and adaptive immune responses against viral pathogens through their antigen binding domains and ...