Die Autoren möchten sich Anne Daron und Pierre Louis Loyher für redaktionelle Unterstützung danken, die Plateforme Imagerie Pitié-Salpêtrière (PICPS) für die Unterstützung bei der Zwei-Photonen-Mikroskop und das Tier Facility &quot;NAC&quot; und Camille Baudesson für Mäuse züchten Unterstützung. Die Forschung, die zu diesen Ergebnissen geführt Mittel aus dem Siebten Rahmenprogramm der Europäischen Gemeinschaft (FP7 / 2007-2013) unter Finanzhilfevereinbarung Nr 304.810 - RAIDs und Nr 241.440-EndoStem von Inserm, der Université Pierre et Marie Curie &quot;Emergence &quot;, von la&quot; Ligue contre le cancer &quot;, von&quot; Association pour la Recherche sur le Cancer &quot;und von&quot; Agence Nationale de la Recherche &quot;Programm Emergence 2012 (ANR-EMMA-050). PH wurde von la &quot;Ligue contre le cancer&quot; unterstützt.

HINWEIS: Alle Experiment Protokolle wurden von der Französisch Tierversuche und Ethik-Kommission genehmigt und vom &quot;Service Protection et Santé Animales, Environnement&quot; mit der Nummer A-75-2065 validiert. Probengrößen werden so gewählt, um die Reproduzierbarkeit der Experimente zu gewährleisten und nach dem 3R tierischen Ethik Regulierung. 1. Herstellung der Mäuse <ol><li> Anästhesie <ol><li> Für kurze Zeit der Bildgebung (weniger als 1 Stunde), betäuben die Maus mit einer intraperitonealen Injektion von 200 ul einer Kochsalzlösung mit Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg). </li><li> Alternativ kann für längere Zeitabbildung (bis zu 4 h), anaesthetize der Maus bei einer Inhalation von Isofluran 2,5% in einer 70/30 Mischung von O 2 / N 2 O, verdampft durch eine angepasste Maske. </li><li> HINWEIS: Auf diese Weise sorgt für stabilere Bewusstlosigkeit und vermeidet Serien intraperitoneale Injektion von Drogen. </li&gt; <li> Sobald die Maus betäubt, überprüfen Bewusstlosigkeit durch Stimulation der Fußsohle mit Zangen. </li></ol></li><li> Gefäßfärbung / zusätzliche Färbung <ol><li> Für vaskuläre Färbung: intravenös injizieren in die Schwanzvene wurden 200 ul Rhodamin-Dextran (2 MDa, 10 mg / ml in Kochsalzpuffer). </li><li> Für Neutrophilen-Färbung: injizieren 2 ug Ly6G-PE (Klon 1A8) in 100 ul Kochsalzlösung, intravenös in die Schwanzvene. </li></ol></li><li> Immobilisierung <ol><li> Zur Immobilisierung, verwenden Sie eine maßgeschneiderte stereotaktischen Halterung an das Mikroskop und mit dem Narkosegas Inhalator angepasst. HINWEIS: Die stereotaktische Halter ist ein Metallträger mit zwei Metallplatte Klammern, von denen einer fest und der andere Wechsel und anpassungsfähig, um den Kopf des Tieres fest. </li><li> Installieren Sie den Kopf der Maus zwischen den Halteplatten isoliert von Atembewegungen zu gewährleisten. Ziehen Sie die Ohren zwischen Halteplatten und den Kopf auf die sk streckenin. Prüfen Sie für die Stabilität und die Atmung Wohlbefinden der Tiere. </li></ol></li><li> Entfernen Sie die Kopfhaut <ol><li> Vorsichtig mit 70% igem Ethanol, um das Haar von der Kopfhaut mit einem sterilen Applikators benetzen, Vermeidung von Kontakt mit den Augen. </li><li> Schneiden Sie die Haut mit einer sterilen Schere und Zange, die Kopfhaut von der Rückwärts des Scheitelbein vollständig zu entfernen, um das Stirnbein. Fernhalten von bis zu 3 mm von Augen und Ohren, um umfangreiche Blutungen zu verhindern. Entfernen Sie die Abdeckung des Schädels (Knochenhaut) lockerem Bindegewebe. Waschen Sie die restlichen Haare mit warmem PBS getränkten Papiertuch. </li></ol></li><li> Immersion-System einrichten <ol><li> Fügen Sie einen Gummiring von 18 mm Durchmesser mit chirurgischer Kleber direkt auf den Schädel mit einer kleinen Nadel zu Verteilung zu steuern. Kleben den gesamten Umfang des Gummirings, um das Auslaufen zu verhindern (30 &amp; mgr; l ausreichend sein). </li><li> Reinigen Sie den Schädel unter dem Ring ein letztes Mal mit PBS-getränkten Papiertuch und fügen Sie dann 37 ° C PBS für ein vollständiges Eintauchen derSchädel. Fügen Sie einen Tropfen 0,9% NaCl-Lösung oder bestimmte Augensalbe auf jedem Auge der Maus an Augentrockenheit zu vermeiden. Ziehen Sie den stereotaktischen Halterung im Rahmen des Ziels. </li><li> Etwa positionieren Sie den Bereich mit dem Mikroskop Okular durch direkte Übertragung. </li></ol></li></ol> 2. Zwei-Photonen-Imaging Acquisition <ol><li> Verwenden einer Multiphotonen-Mikroskop in Verbindung mit einem Ti: Saphir-Kristall-Laser, der Impulse von 140fs NIR-Licht enthält, selektiv abstimmbar von 680 bis 1.080 nm und einen akusto-optischen Modulator für die Laserleistungssteuerung. Verwenden Sie eine Konfiguration mit 3 externen nichtdescannten Detektoren (NDD) mit einer Kombination von zwei dichroitischen Spiegel (565 nm und 690 nm), 565/610 und 500/550 Bandpassfilter (die gleichzeitige Aufnahme von 3 Fluoreszenzkanäle zu ermöglichen), und einen 485 Kurzpassfilter, mit einem Plan Achromat × 20 (NA = 1) Wasserimmersionsobjektiv. </li><li> Stellen Sie den Heizraum, gute homeothermy der ANAES ermöglichenthetized Maus., HINWEIS: Temperatur vielleicht 1 Stunde eingestellt werden, bevor die Abbildung Sitzung für eine bessere Stabilität. In unserem Fall 32 ° C wurde gewählt, um eine optimale Körpertemperatur des anästhesierten Maus (36-37 ° C) erhalten und ist für bis zu 4 h gehalten. Diese Temperatur kann mit dem System verwendet (digital Sonde kann verwendet werden, um diesen Punkt zu überprüfen) angepasst werden. Darüber hinaus ist das verwendete Heizkammer dunkel / schwarz und deckt einen Teil des Systems (Ziele und motorisierten Platte) fremdlicht Kontamination zu vermeiden. </li><li> Schalten Sie das System <ol><li> Einschalten des Ti: Saphir-Laser, dann das gesamte Mikroskopsystem. Starten Sie die Erfassungssoftware. Stellen Sie den Laser-Wellenlängenbereich um 870 nm. Wählen Sie die entsprechende NDD für die Aufnahme. HINWEIS: In unserem Fall sind Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG) 19 und cyan fluoreszierende Protein (ECFP) durch die NDD nach 485 Kurzpassfilter detektiert. ECFP wird auch durch die NDD detektiert, nachdem die 500/550 Bandpaßfilter und Rhodamin-Dextran wird durch t detektierter NDD nach dem 565/610 Bandpassfilter. </li></ol></li><li> Passen Akquisition Einstellungen <ol><li> Verwenden Sie die &quot;Live-Akquisition&quot; Imaging-Befehl der Software und mit dem Mikroskop Wege, stellen Sie den Fokus auf eine Region mit ECFP und Rhodamin-Signal. Eingestellt, die Laserleistung auf ein Minimum, um das beste Signal-zu-Rausch-Verhältnis bei minimalen Photoschäden zu erhalten. HINWEIS: Die Leistungseinstellung variiert je nach der Tiefe der Bereich von Interesse. Typischerweise werden die AOM-Einstellungen werden rund 20%, die eine Laserleistung über das Ziel um 15 mW repräsentiert gesetzt. Es ist besser, Gewinn Macht auf den PMTs erhöhen für jeden NDD an Photobleaching und Foto-Schaden zu reduzieren. Typische Erfassungseinstellungen einzigen Abtastung mit einem Pixelverweilzeit von 1,58 &amp; mgr; s und einer Auflösung von 512 x 512 Pixeln mit einer 1,5 Vergrößerung. </li></ol></li><li> Wählen Sie die Regionen von Interesse <ol><li> Sobald die Aufnahme Parameter eingestellt sind, verwenden Sie erneut die &quot;live&quot; Erwerb Befehl,und Erhebung des Gewebes, um eine gewünschte (x, y, z) der Wert in Echtzeit überwacht werden soll. HINWEIS: In der Regel haben wir uns für ein Feld sowohl vaskuläre und parenchymale Bereichen. </li><li> Registrieren Sie das Feld mit der &quot;Position&quot; Softwarebefehl. ANMERKUNG: Dieser Befehl speichert x, y, z-Koordinaten der verschiedenen entfernten Bereichen. </li><li> Wählen und registrieren zusätzliche Felder von Interesse (bis zu 3) nach dem gleichen Verfahren. </li><li> Festlegen eines 3D-Z-Stapel mit dem &quot;Z-Stapel&quot; Softwarebefehl auf der ersten gespeicherten Position entsprechend der gewünschten Lautstärke mit gewählten Vergrößerung. Merken tieferen Position zuerst, und dann die höchste Position. Normalisieren Laserleistung mit der Tiefe. HINWEIS: Bei mehreren gleichzeitigen Feldabbildung, so erwerben wir 5 Scheiben von 3 &amp; mgr; z-Schritte für jedes Feld getrennt werden, um ein Volumen von 12 &amp; mgr; m Dicke zu erwerben. Diese Einstellungen werden auf die Art der Zelle untersucht angepasst werden. </li></ol></li><li> Starten Erwerb <ol><li> Wählen Sie das220, Reihe &quot;Software-Befehl und wählen Sie die Dauer des Zeitintervalls und die Anzahl der Zyklen der Zeit. Beginnen Sie Zeitraffer-Bildgebung nach dem Zeitablauf und Dauer, indem Sie die &quot;Start-Experiment&quot; Software-Befehl erforderlich. HINWEIS: In unserem Fall haben wir ein Volumen jeweils 30 s bei 60 Hz entspricht 30 min Echtzeit zu erwerben. Kleinere Zeitablauf durchgeführt, um schnelle Zellvoll in das Blutgefäß zu verfolgen. In diesem Fall dünner z-Stapels und nicht mehr als 2 verschiedenen Felder können gleichzeitig aufgezeichnet werden. </li><li> Eine regelmäßige Überwachung der Einrichtung. <ol><li> Immer überwachen das Tier, um sicherzustellen, sie bewusstlos ist. HINWEIS: Schütteln der Whisker oder Beine des Tieres sind Indikatoren für die Wiederbelebung. Im Falle des Tieres Atmung ruckartig, kann die Menge von Isofluran leicht reduziert werden. Starke Gewebedrift während Akquisition ist ein Indikator für Maus Revival. </li><li> Stellen Sie sicher, das Ziel richtig eingetaucht. Erneuern 37ºC PBS between zwei Akquisitionen (30 min). HINWEIS: Progressive Verschwinden des Signals während der Erfassung ist Indikator für die PBS Leckage. </li></ol></li></ol></li><li> Ende der Prozedur <ol><li> Wenn die benötigten Videos aufgezeichnet werden, das Tier einschläfern durch Genickbruch schnell vor Reanimation. HINWEIS: Wundheilung führt zur Bildung einer Kruste in 24 bis 48 h, was die Möglichkeit zur Längs- Bildgebung auszuführen begrenzt. </li></ol></li></ol> 3. Datenanalyse <ol><li> Driftkorrektur <ol><li> Verwenden Imaris Bitplane Software für 3D-automatische Verfolgung. </li><li> Öffnen Sie die 3D-Bildfolge auf Imaris. Wählen Sie &quot;Spot&quot; Befehl ein, und erzeugen eine manuelle Spur (Mausklick + Shift) für alle Zeitpunkte für mindestens 4 verschiedene Ankerpunkte, möglichst homogen im Feld verteilt. </li><li> Übernehmen Sie die Driftkorrektur mit dem Befehl &quot;richtigen Drift&quot; im Register &quot;Bearbeitungsspur&quot;. </li><li> Prüfen Sie, ob ter Qualität der Korrektur in x, y und z, um vor allem in Artefakt Schwanken zu vermeiden. HINWEIS: Wenn die Korrektur nicht zufrieden stellend, versuchen andere Ankerpunkte oder ausschließen das Video von der Analyse. </li></ol></li><li> Zellverfolgung <ol><li> Verwenden Sie &quot;add new spots&quot; Befehl und wählen Sie &quot;Spur-Spots im Laufe der Zeit&quot; Algorithmus-Einstellung. Zum nächsten Schritt. </li><li> Bewerben automatischen Zelltrackingverfahren entweder auf der gesamten interessierenden Kanal mit &quot;Quellkanal&quot; -Befehl. Gruppenobjekte (dh Zellen) Durchmesser bis 10 um. Zum nächsten Schritt. HINWEIS: Die Wahl wird auf die Unterscheidung zwischen Objekten und Spezifität des Messsignals abhängen. Kurz gesagt, ist die automatische Verfolgung im ganzen Kanal nur möglich, wenn erfasste Signal spezifisch für das Objekt von Interesse ist. Da sowohl SHG und ECFP werden von der NDD nach 485 Kurzpassfilter erkannt wird, wird Tracking präziser und effizienter mit dem ECFP Signals durch die NDD nach der 5 aufgenommen sein00/550 Bandpassfilter. Gruppierten oder dichtgepackten Objekte manuelle Auswahl der ähnlich wie in Schritt 3.1.2 einzelne Objekte erfordern. </li><li> Wählen Sie &quot;Qualität&quot; Filtertyp können Sie den Schwellwert auf Verfolgung von unspezifischen Objekte ausschließen. Zum nächsten Schritt. </li><li> Wählen Sie &quot;Brownschen Algorithmus Motion&quot; mit genauen Parameter &quot;Max Abstand&quot; und &quot;Gap Größe&quot; zwischen zwei Punkten. Bestätigen Track Generation. </li><li> Sobald Spuren werden automatisch berechnet, &quot;Spurdauer&quot; Filtertyp auswählen, stellen Sie den Schwellenwert auf Spuren zu beseitigen kürzer als 120 Sekunden (die 4 Zeitpunkte). </li><li> Obligatorisch: Nach dem automatischen Verfolgung, prüfen Sie die Qualität der Tracks. <ol><li> Rollen Sie die Zeitleiste, um zu überprüfen, dass die Objekte folgen Bahnverläufe. Wenn nicht, verwenden Sie die Optionen der Spur Punktkorrektur in der Registerkarte &quot;Bearbeiten&quot;: Löschen Sie falsche oder unsachgemäße Spuren mit &quot;Löschen&quot; -Befehl (löschen jede Spur point einzeln mit dem Befehl &quot;Trennen&quot;). Wenn Track-Pfad unterbrochen ist, fügen fehlenden Zeitpunkten (Mausklick + Shift), wählen Sie alle Punkte auf einer bestimmten Spur, und verwenden Sie den Befehl &quot;Verbinden&quot; auf der Registerkarte &quot;Track bearbeiten&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Quantifizierung Parameter <ol><li> Wählen Sie die Registerkarte &quot;Statistik&quot; im Befehl &quot;Einstellungen&quot;, wählen Sie die dynamischen Parameter von Interesse in der Liste. Wählen Sie &quot;Exportieren Sie alle Statistiken in Datei&quot; Befehl und speichern Sie die Excel-Datei erzeugt. HINWEIS: Mehrere dynamische Parameter werden direkt aus der Software erhalten, wie Bahnlängen, momentane Geschwindigkeit, mittlere Geschwindigkeit und verfolgen Geradheit. Motilität Koeffizienten 6, 20 ermittelt werden kann, ist jedoch nicht direkt durch die Software zur Verfügung gestellt. </li><li> Für jede Zelle berechnet den Mittelwert der Verschiebungen für jeden Zeitraum (&amp; dgr; t) (bei einem 30 Sek Zeitrafferfilm, wird &amp; dgr; t 30, 60, 90 Sekunden, usw. sein).Zur Erstellung der Mittelwert der quadratischen Verschiebung als eine Funktion des Zeitintervalls. Erhalten Motilität Koeffizienten durch Berechnen der Steigung des linearen Teils der Kurve. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Die kritischen Punkte der in vivo Bildgebung Methodik, um die Stabilität der Ausrichtung, um die Dauer der Bildgebung zu maximieren und das Risiko einer bakteriellen Kontamination und Entzündungen, die die Dynamik der entzündlichen Zellen auswirken können, zu minimieren gewährleisten. Imaging Schädelknochenmark folgt diese Ziele auf die Operation durchgeführt, um Zugang zu dem Knochenmark zu erhalten, ist minimal. Die Verwendung von sterilem Material und Antiseptika ist wichtig, um das Risiko von Infektion, die Störung in Zellhomöostasie induzieren könnten, zu begrenzen. Die Entwicklung der stereotaktischen Halter könnte eine Herausforderung sein und erfordert spezifische Anpassung für jedes System (Abstand zwischen Objektiv und Motortisch des Mikroskops, die Verwendung von Gas Inhalator für Anästhesie). Es ist wichtig, den Kopf der Maus möglichst horizontal für eine größere Bildfläche Zugang zu erhalten. Sobald das Tier angeordnet ist, ist es wahrscheinlich, dass einige Minuten kann requir seined um eine gute Stabilität der Fokusebene zu erhalten. Daher empfiehlt es sich, für die Gewebe Drift überprüfen vor dem Start der Akquisition Aufnahme. Da dieser Prozess mit der Auswahl der Regionen von Interesse kann eine Weile dauern, wird auch empfohlen, regelmäßig zu überprüfen, dass das Tier bewusstlos wenn Ketamin / Xylazin verwendet worden sind, und um die richtige Eintauchen des Ziels zum Auslaufen oder Verdunstung kann überprüfen auftreten. Die gute Positionierung der Gummiring auf dem Schädel ist ein weiterer kritischer Schritt in dem Prozeß. Sekundenkleber liefert gute Ergebnisse in Bezug auf Stabilität und Dichtung, aber man braucht, um eine übermäßige Belastung der Klebstoff, der den Schädel und den Zugriff auf den interessierenden Bereich des Gewebes zu decken könnten. Der Vorteil der direkten Eintauchen des Schädels ohne Deckglas ist es, den Zugang zu tieferen Regionen des Knochens zu erhalten. Zusätzlich kann, da der Schädel ist keine ebene Fläche, es wird nicht die Bilderzeugungsfläche zum con begrenzenKontaktfläche zwischen dem Schädel und dem Deckglas, so dass ein breites Bildfeld, wie in Abbildung 1 dargestellt. Für alle bildgebenden Verfahren ist die Wahl zwischen Aufnahmegeschwindigkeit und Auflösung Qualitäts ein Kompromiss. Somit kann die Anzahl und die Qualität der Bilder pro Zeiteinheit begrenzt sind, und die Wahl hängt von der wissenschaftlichen Fragestellung gerichtet. Typischerweise werden Gefäß Monozyten schnell roll Zellen, während parenchymal Monozyten sind langsam bewegliche oder festsitzende. Eine genaue Überwachung des rollenden Zellen erfordert eine höhere zeitliche Auflösung der Akquisition, wie in Abbildung 2 dargestellt. Hohe Bildrate für festsitzenden Zellen ist nutzlos und Hoch x, y, z-Auflösung können vorgezogen, vorstehenden Tätigkeit von Dendriten zum Beispiel analysieren. Schnelle Zellen dicker Band, um eine längere Verfolgung ihrer Verschiebung in z zu erfordern. Die mittlere quadratische Verschiebung als Funktion der Zeit wird durch die Software nicht Imaris vorgesehen. Die principle von dieser Darstellung auf der Grundlage der Tatsache, dass für ein Objekt ballis können sie ohne Zusammenstoß oder strukturelle Verengung, die Distanz gereist wäre proportional zu dem Zeitintervall (Figur 2D). Somit Linearität der Steigung zeigt eine Zufallsbewegung in einem nicht-eingeschränkten Umgebung. Im Gegensatz dazu würde asymptotische Form der Kurve eine erzwungene Verschiebung über die Zeit der Zellpopulation zu reflektieren. Der zweite Vorteil dieser Berechnung ist, daß die Geschwindigkeit wird manchmal durch artefactual Verschiebung des Massenmittelschätzt. Dies ist besonders wichtig für langsame bewegliche Zelle mit vorspringenden Aktivität. Somit Berechnung der Motilität Koeffizienten durch die Neigung der durch lineare Regression berechnet Kurve zeigt eine echte Verschiebung des cellover Zeit 21. Ly6G Färbung in vivo veranschaulicht die Möglichkeit, eine neue Analysegröße während des Abbildungsprozesses hinzuzufügen (Abbildung 3 </strong&gt;). Wir haben diese Technik verwendet werden, um Gefäß Neutrophilen-Infiltration in die Hautwunde zu färben, und keinen Defekt in ihrer Mobilität hindeutet keine funktionelle Veränderung (Rodero et al in press) beobachtet. Obwohl mehr als 98% des Gefäß Neutrophilen ordnungsgemäß gekennzeichnet, ist das Färben von Knochenmark Neutrophilen weniger effizient, und die mittlere Fluoreszenzintensität stark reduziert wird, was auf den geringeren Zugang des Antikörpers in Richtung des Knochenmark Parenchym (Daten nicht gezeigt). Rhodamin Dextran, Quantenpunkte oder andere spezifische Farbstoffe der apoptotischen oder nekrotischen Zellen, wie DAPI Propidiumiodid SYTOX 22 oder fluoreszierenden Reporter für die Zellfunktionen, wie die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies 23 kann intravenös durch die Schwanzvene während der Bilderzeugung gegeben werden Prozess und bieten eine gute Gelegenheit, um funktionale Eigenschaften wie Zelltod, Phagozytose und Neutrophilen extrazellulären Falle zu quantifizieren. Mazo et al 12 schön verwendet zwei verschiedene Gefäß Farbstoffemit niedrigem und hohem Molekulargewicht, um einen besseren Kontrast Parenchym und Gefäßsystem. Die Wahl der Fluoreszenzfarbstoff ist für die gleichzeitige Erfassung der verschiedenen fluoreszierenden Reportern ermöglichen. Tatsächlich wird die Anregungswellenlänge entsprechend ausgewählt werden, um den besten Kompromiss zwischen allen verwendeten fluoreszierenden Farbstoffe zu erhalten. Die hier verwendete Protokoll ist es möglich, in vivo Analyse der biologischen Aktivität eines Zellkammer, Studie, von denen war bislang schwierig. Die histologische Analyse der Knochenmarksgewebe erfordert in der Regel eine lange Vorbereitung Knochenentkalkung zu Dünnschnitt zu ermöglichen, und es gibt nur eine statische Sicht des Gewebes. Die dynamische Sicht unterstreicht die Rate der Zellaustausch zwischen dem Parenchym und die Knochenmarksinuskurven. Dieses schnelle Verfahren ist ein entscheidender Schritt, um ein besseres Verständnis der Zellmobilisierung Mechanismus bei entzündlichen Signal 5 oder Präkonditionierung myeloaplasive Chemotherapie entziffernregimen 6. Wir haben Falle Zelle intravasation 6 angegeben, aber dieses Verfahren ist aufgrund der niedrigen Frequenz im stationären Zustand kaum nachweisbar. Es ist jedoch wahrscheinlich auf entzündliche Signalisierung verstärkt werden. Chemokinrezeptoren wie CCR2, CX3CR1 oder CXCR4 sind stark in den Prozess der intravasation gebracht, damit die Verwendung von genetischen Invalidierung dieser Rezeptoren sollten neue grundlegende Einsichten in die Wege der Zellmigration bereitzustellen

The bone marrow plays a central role in hematopoiesis and represents the main reservoir of monocytes that constitutively recirculate between the blood and the medullar parenchyma, renew the pool of circulating monocytes with a short life span 2,3 and participate in the reconstitution of the steady state tissue-macrophages and dendritic cells 4. During inflammation or after transient aplasia, monocytes are actively mobilized from either the bone marrow or the spleen 5, 6, 7 and colonize inflamed organs. Several chemoattractant axis have been involved in the process of myeloid cell mobilization from the bone marrow 8, 5, 6,9. Beyond the myeloid compartment the bone marrow is also an important site of T lymphocyte priming 10 and a niche of immunological memory 11,12. Thus, this tissue is central for numerous investigations in the field of hematology and immunology. Our knowledge on the structural organization of medullar myeloid cells mainly arises from the analysis of histological section of fixed tissues 13. This static view does not allow for a study of the cellular exchange dynamic between the different compartments of the bone marrow, which is the basis of its functional activity.
Intravital imaging constitutes an important biological input in the study of cell mobility, cell adherence and cell-to-cell interactions, which were previously described only from in vitro systems. Technical challenges for proper intravital imaging include the ability to reach the tissue of interest in an optical point of view, and to maximize its isolation from physiological (breath, muscle or peristaltic contractions) or mechanical drifts (tissue disruption and extension following surgery, and exposure to microscope objective as well as temperature and vascular/oxygenation perturbations). Microscopic drifts may limit the ability to keep the focus a long time and could introduce artifacts in the quantification of cell motility. One alternative, validated for several tissues to reduce these technical difficulties, is to work on explanted tissue incubated in a thermostated and oxygenated medium; however, complete disruption of the lymphatic and vascular circulation may be problematic. Intravital imaging of skull bone marrow has several advantages concerning these issues. Firstly, it requires minimal surgical action. Secondly, thickness of the bone in this region allows direct visualization of bone marrow niches without abrasion, thus reducing physiological perturbations. The medullar network can be imaged in the parasagittal region of the bone; however the sinusoids are more visible in the fronto-parietal area where the bone matrix is thinner12,14. 
Intravital imaging relies on the availability of the most accurate fluorescent reporter tagging the population of interest. In vitro labelling of purified cell population before adoptive transfer led to important characterization of hematopoietic stem cell niches 15 or bone marrow endothelial microdomains favouring tumor engraftment 16, and provided several fundamental inputs on key concepts in immunology 17 . However, this approach usually requires hundreds of thousands of cells to get a chance to detect them afterwards in vivo. This could be explained by the high mortality rate following staining, the dilution in the whole body and the change in the activation state, which might lead to biased homing. Endogenous tagging from transgenic mouse system greatly overcomes these limitations and has allowed to image the behaviour of endogenous osteoblast 8, megakaryocytes 18 or myeloid-lineage subsets 6 . Nevertheless, one has to be cautious when considering the specificity of the fluorescent reporter among the studied subset. 
The Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP, called MacBlue mouse 1, is a valuable transgenic system to study medullar monocytes with real time imaging 6. Intravenous injection of high molecular weight rhodamin-dextran distinguishes the medullar parenchyma from the vascular sinusoid network of the bone marrow. Using this approach, it is possible to track the monocyte behaviour in the different medullar compartments in a specific physiopathological context of interest. Furthermore, we propose an additional strategy to compare monocyte dynamics with that of neutrophils through in vivo labelling using a specific antibody.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="824">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:171px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:237px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ketamin</td>
			<td style="width:171px;">Merial</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>100mg/mL, anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Xylazin</td>
			<td style="width:171px;">Bayer HealthCare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>10mg/mL, anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Isofluran</td>
			<td style="width:171px;">Baxter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>2.5%, anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">O2/NO2</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>70/30 mixture, anesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:297px;">Rhodamin-Dextran</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>2MDa, 10mg/mL, Vascular staining</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:297px;">Ly6G-PE</td>
			<td style="width:171px;">Becton-Dickinson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>clone 1A8, neutrophils staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Stereotactic holder</td>
			<td style="width:171px;">Home made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Ethanol 70%</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Sterile scissors and nippers</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Rubber ring</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>18mm diameter, surgery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Glubran 2</td>
			<td style="width:171px;">Queryo Medical</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Surgical Glue, rubber ring fixation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Small gauge needles</td>
			<td style="width:171px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeiss LSM 710 NLO multiphoton microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ti:Sapphire crystal laser&#160;</td>
			<td>Coherent Chameleon Ultra</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>140fs pulses of NIR light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zen 2010</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Acquistion Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imaris Bitplane&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Bitplane</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Analysis Software, 3D automatic tracking</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">PBS 1X</td>
			<td style="width:171px;">D. Dutscher</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>surgery</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Thermostated chamber</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>intravital imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking mouse bone marrow monocytes in vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Mäuseschädelstruktur bietet eine gute Gelegenheit, die Knochenmark Physiologie von Intravital Imaging studieren. Der Knochen dünn um den vorderen Scheitelbereich, ist es möglich, Zugang zur Mark Nischen ohne Abrieb des Knochens zu erhalten. 1 stellt eine breite 2D Bereich des Schädels eines MacBlue transgenen Maus. Die Knochenmatrix wird hauptsächlich aus Kollagen I leicht durch SHG 19 feststellbar. Injektion von Rhodamin-Dextran färbt die Gefäßnetz des Knochenmarks und ermöglicht die Identifizierung von parenchymalen Knochenmark Nischen zwischen der Knochenmatrix und die Gefäße 14. ECFP Zellen werden in den beiden Kammern des Knochenmarks wird, aber fehlen in der Knochenmatrix. Monozyten werden manuell nach ihrer Lage im Gewebe klassifiziert. Gefäß Monozyten wird definiert, wenn die gesamte Zelle ist innerhalb des Gefäßsystems, ungeachtet der Größe des Behälters. Nur große Sammeln Venolen werden von unserem a ausgeschlossennalyse. Parenchymalen Monozyten wird definiert, wenn die Zelle zwischen der Vaskulatur und der Knochenmatrix befindet. Zeitraffer-Bildgebung von spezifischen Interessenbereich (Ergänzungs Video 1 und 2) ermöglicht die Berechnung der einzelnen Zell Trajektorie über die Zeit für entweder Gefäß (2A) oder parenchymalen (2B) Monozyten. Die Streckenlänge zeigt, dass parenchymale Monozyten Display reduziert Verschiebung im Vergleich zu Gefäß Monozyten. Analyse der Verschiebung über die Zeit vergleicht die Durchschnittsgeschwindigkeit von Monozyten in beiden Abteilen (2C). Die mittlere quadratische Verschiebung als eine Funktion der Zeit ist ein Maß für die räumliche Ausdehnung der Zufallsbewegung. Motilität Koeffizient wird durch die Steigung des linearen Teils der Kurve bestimmt und stellt eine bessere Vorstellung von der Zelle Verschiebung (siehe Diskussion Abschnitt). Die Motilität Koeffizienten Gefäß Monozyten (MC = 71μm² / s) höher als der Motilität coefficient parenchymaler Monozyten (MC = 4.4μm² / s). Die Zeitauflösung der Erfassungs müssen der durchschnittliche Zellgeschwindigkeit angepasst werden. Rollgefäß Monozyten können wichtige Verschiebung innerhalb einer kurzen Zeitverzögerung zu machen. Für eine genauere Zellverfolgung ist die Verringerung der Zeitspanne der Übernahme bevorzugt. Figur 3 zeigt eine Darstellung der Monozyten Verfolgung mit zwei verschiedenen Zeitauflösungen. Ein 30 Sekunden Zeitintervall verringert, verglichen mit 10 Sekunden Zeitintervall die Genauigkeit als auch die Länge der Bahnen (grün gestrichelte Linie). Schließlich zeigt 4 die Möglichkeit, eine andere Zellenteilsatz gleichzeitig an Monozyten zu untersuchen. Ly6G ist ein spezifischer Marker für reife Maus-Neutrophilen. Die Injektion von Anti-Ly6G kombiniert mit einem Fluorochrom (in diesem Fall Phyco-Erythrin) 5 min vor der Bildgebungssequenz Flecken Neutrophilen direkt in vivo. Dieser Ansatz bietet eine zusätzliche dimension der Analyse und der Möglichkeit, das Verhalten der verschiedenen Zelluntergruppen zu vergleichen. Ein solches Vorgehen könnte verwendet werden, um Teilmengen in den Monozyten Fächer definieren. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52476/52476fig1highres.jpg" /> Abbildung 1. Breites Feld der Schädelknochenmark-Organisation. In vivo Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie Bild des Schädels stationären Knochenmark aus MacBlue Maus. Gefäßsystem (in rot) wird durch Schwanz vergeblich Injektion 2MDa Rhodamin-Dextran-5 min vor Bildgebungssitzung gefärbt. Der Knochen wird durch die Erzeugung der zweiten Harmonischen (blau) sichtbar gemacht. ECFP + Monozyten (Cyan) innerhalb parenchymal Nischen (dunkle Bereiche zwischen Gefäßen und Knochen) und in den Gefäßen. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52476/52476fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> Abbildung 2. Echtzeit-Tracking-Zelle. Vertreter Spurwege entlang Zeit von Monozyten in (A) des Gefäßsystems und (B) das Parenchym. Tracks (grüne Linie) für jede Zelle werden von der Software automatisch generiert. Rote Flecken stellen die Massenschwerpunkt verfolgt Zellen. (C) mittlere Geschwindigkeit Vergleich zwischen vaskulären und parenchymale Monozyten. Mann-Whitney statistischer Analyse durchgeführt worden ist, stellt *** p &lt;0,001. (D) Mittlere quadratische Verschiebung (msd) als eine Funktion der Zeit für die vaskuläre und parenchymale Monozyten repräsentiert. Asymptotische Kurve zeigt die eingeschränkte Bewegung der Zellen über die Zeit, wohingegen lineare Kurve zeigt Random Walk in einer nicht-eingeschränkten Umgebung. Motilität Koeffizienten zeigt das Ausmaß der Zell Verschiebung und wird von der Neigung der c bestimmt<html> urve durch lineare Regression berechnet. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52476/52476fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52476/52476fig3highres.jpg" /> Abbildung 3. Zeitintervall Auflösung bei der Untersuchung von Roll Monozyten. Vertreter Bildsequenzen zeigen, dass eine erhöhte zeitliche Auflösung verbessert die Genauigkeit der Rollbahn-Zelle. (Up) Bildfolge mit 10 Sekunden Zeitintervalle. (Down) Bildfolge mit 30 Sekunden Zeitintervalle. Die Qualität des Spurbahn wird verbessert und das Risiko der Berücksichtigung zwei verschiedene Zellen für die gleiche oder die entgegengesetzte reduziert. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52476/52476fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> s &quot;&gt; <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52476/52476fig4highres.jpg" /> Abbildung 4. In vivo Colokalisierung medullären Neutrophilen und Monozyten. Diese Figur zeigt die Möglichkeit, eine andere Zell-Untergruppe in vivo gleichzeitig mit Monozyten erkennen, durch Injizieren spezifischer monoklonaler Antikörper in Kombination mit einem Fluorochrom. 2 ug Ly6G-PE-Antikörper wurde 5 min vor Schädelknochenmark-Bildgebung des MacBlue Maus intravenös injiziert. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52476/52476fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> Ergänzende Video 1. Zugverhalten parenchymal Monozyten. In-vivo-3D-Bildgebung des stationären Migrationsaktivität von Monozyten in der Schädelknochenmark Parenchym eines MacBlue Maus. Die ECFP + Signal in Cyan. Migrationspfade für jede Zelle (roter Punkt) erscheint in grün. Ergänzende Video 2. Migrationsverhalten von Gefäß Monozyten. In-vivo-3D-Bildgebung des stationären Migrationsaktivität von Monozyten in der Schädelknochenmark Gefäßsystem eines MacBlue Maus. Die ECFP + Signal in Cyan. (2M &#160; Da) Rhodamin-Dextran wurde vor der Bildgebungssitzung injiziert, um die Knochenmark Vaskulatur (rot) zu unterscheiden. Migrationspfade für jede Zelle (roter Punkt) erscheint in grün.

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Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

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Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

9.5K Aufrufe.  Sorbonne Universités, UPMC Univ Paris 06, CR7. Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism. 

Serie: Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii disseminates as a fast replicating form called the tachyzoite. Tachyzoites convert into a slow-growing encysted form called the bradyzoite by a signaling process that is not well characterized. Within animals, bradyzoite cysts are found in the central nervous system and muscle tissue and represent the chronic stage of infection. Conversion to bradyzoites can be simulated in tissue culture by CO2 starvation, using medium with high a pH, or the addition of interferon gamma (IFN&gamma;). Bradyzoites are characterized by the presence of a cyst wall, to which the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binds. Fluorescently labeled DBA is used to visualize the cyst wall in parasites grown in human foreskin fibroblasts (HFFs) that have been exposed to low CO2 and high pH medium. Similarly, parasites residing in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) display a cyst wall detectable by DBA after the BMMs are activated with IFN&gamma; and lipopolysaccharide (LPS). This protocol will demonstrate how to induce conversion of T. gondii to bradyzoites using a high pH growth medium with low CO2 and activation of BMMs. Host cells will be cultured on coverslips, infected with tachyzoites and either activated with addition of IFN&gamma; and LPS (BMMs) or exposed to a high pH growth medium (HFFs) for three days. Upon completion of infections, host cells will be fixed, permeabilized, and blocked. Cyst walls will be visualized using rhodamine DBA with fluorescence microscopy.

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii converts to a cyst form in response to environmental stresses, which can be mimicked in tissue culture models. This video demonstrates techniques to examine cyst wall formation by activating bone marrow-derived macrophages or changing growth medium pH in fibroblast cells.

Toxoplasma gondii Zystenwand Formation in Activated Knochenmark abgeleiteten Makrophagen und Bradyzoite AGB

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

Erzeugung und Kennzeichnung von Murine Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen mit Qdot Nanokristalle für Tracking-Studien

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice to colitis. If the gene-of-interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells of the host; however, it is possible to differentiate the role of a gene of interest in bone marrow derived cells and non- bone marrow derived cells by bone marrow transplantation technique. To change the bone marrow derived cell genotype of mice, the original bone marrow of recipient mice were destroyed by irradiation and then replaced by new donor bone marrow of different genotype. When wild-type mice donor bone marrow was transplanted to knockout mice, we could generate knockout mice with wild-type gene expression in bone marrow derived cells. Alternatively, when knockout mice donor bone marrow was transplanted to wild-type recipient mice, wild-type mice without gene-of-interest expressing from bone marrow derived cells were produced. However, bone marrow transplantation may not be 100% complete. Therefore, we utilized cluster of differentiation (CD) molecules (CD45.1 and CD45.2) as markers of donor and recipient cells to track the proportion of donor bone marrow derived cells in recipient mice and success of bone marrow transplantation. Wild-type mice with CD45.1 genotype and knockout mice with CD45.2 genotype were used. After irradiation of recipient mice, the donor bone marrow cells of different genotypes were infused into the recipient mice. When the new bone marrow regenerated to take over its immunity, the mice were challenged by chemical agent (dextran sodium sulfate, DSS 5%) to induce colitis. Here we also showed the method to induce colitis in mice and evaluate the role of the gene of interest expressed from bone-marrow derived cells. If the gene-of-interest from the bone derived cells plays an important role in the development of the disease (such as colitis), the phenotype of the recipient mice with bone marrow transplantation can be significantly altered. At the end of colitis experiments, the bone marrow derived cells in blood and bone marrow were labeled with antibodies against CD45.1 and CD45.2 and their quantitative ratio of existence could be used to evaluate the success of bone marrow transplantation by flow cytometry. Successful bone marrow transplantation should show a vast majority of donor genotype (in term of CD molecule marker) over recipient genotype in both the bone marrow and blood of recipient mice.

Bone marrow transplantation provides a way to change the genotype of the bone marrow derived cells. If the gene of interest is expressed in both bone marrow derived cells and non-bone marrow derived cells, bone marrow transplantation can change the bone marrow derived cells to a different genotype without changing the non-bone marrow derived cell genotype.

Differenziert Functional Roles of Gene Expression von Immun-und Nicht-Immunzellen in Mouse Colitis von Bone Marrow Transplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

Untersuchung von Makrophagen-Polarisation mit Knochenmark-Makrophagen

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

Isolierung, Reinigung und Kennzeichnung von Knochenmark der Maus Neutrophile für funktionelle Studien und Experimente adoptiven Transfer

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen-Produktion

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

Isolierung und intravenöse Injektion von Maus-Knochenmark stammenden Monozyten

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Murine Hind Limb Long Bone Dissection and Bone Marrow Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, biomechanics, and stem cell biology. Despite the importance of the bone in healthy and pathologic states, however, it is a largely under-researched organ due to lack of specialized knowledge of bone dissection and bone marrow isolation. Mice are a common model organism to study effects on bone and bone marrow, necessitating a standardized and efficient method for long bone dissection and bone marrow isolation for processing of large experimental cohorts. We describe a straightforward dissection procedure for the removal of the femur and tibia that is suitable for downstream applications, including but not limited to histomorphologic analysis and strength testing. In addition, we outline a rapid procedure for isolation of bone marrow from the long bones via centrifugation with limited handling time, ideal for cell sorting, primary cell culture, or DNA, RNA, and protein extraction. The protocol is streamlined for rapid processing of samples to limit experimental error, and is standardized to minimize user-to-user variability.

Here we present a protocol for the dissection of hind limb long bones (femurs and tibiae) from the laboratory mouse. We further describe a rapid technique for bone marrow isolation from these bones that utilizes centrifugation for removal of bone marrow from the bone marrow space.

Murine Hind Gliedmaßen langen Knochen Dissection und Knochenmark-Isolation

Investigation of the bone and the bone marrow is critical in many research fields including basic bone biology, immunology, hematology, cancer metastasis, ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

Erzeugung und Identifizierung von GM-CSF Abgeleitet Alveolare ähnlichen Makrophagen und dendritische Zellen aus Knochenmark der Maus

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

Femur Fensterkammer Modell für<em&gt; In Vivo</em&gt; Zelltracking im Knochenmark der Maus

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...