תודה לך וילי שמש לקבלת סיוע טכני וד&quot;ר קריס Gellynck על הערות מועילות ושלושה מבקרים האנונימיים על העצה הבונה. עבודה זו מומנה על ידי יוזמת התחדשות השמיעה Sunnybrook

רקמת העכבר הייתה שנקטפו מן Sox2 EGFP -reporter עכברי 12 נשמרו ומורדמים בבהתאם להחלטת מועצה קנדית על הנחיות טיפול בבעלי חיים לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה. 1. Culturing עוברי Cochleae <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשלים הנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) על ידי ערבוב 8.89 מיליליטר של DMEM, 1 מיליליטר של סרום שור העובר (FBS), של 100x תוספת N2 100 μl, ו -10 μl של 10 מ&quot;ג / מיליליטר ציפרופלוקסצין. תוספת מלח הפתרון מאוזן של האנק (HBSS) על ידי ערבוב 495 מיליליטר HBSS עם 5 מיליליטר של HEPES 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מנות תרבות תחתית זכוכית: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזרימה למינרית, resuspend 200 מצע תמצית קרום במרתף μl ב 5 מיליליטר DMEM. הכן מנות תרבות תחתית זכוכית בקוטר 35 מ&quot;מ עם 10 בארות מ&quot;מ. פיפטה מצע / DMEM 150 μl למרכזו של כל כוס תחתית צלחת. ניתן להשתמש בכלים אלה לאחר דגירה 40 דקות, או יכולים לאחסן בCO 2 </sub&gt; חממה ב 35 מעלות צלזיוס במשך שבוע לפחות. הערה: זכוכית תחתית מנות משמשות מהסיבות הבאות: כדי להבטיח כי הבסיס של המנה הוא שקוף ומתאים להדמיה, כדי ליצור גם במרכז הצלחת, המאפשרת explants להתיישב באזור הממוקם בקלות ובסופו של דבר כך שלאחר ניסוי המדגם יכול להיות מעובד לimmunostaining וניתוח שלאחר מכן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תחנת העבודה וכלים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הספסל הנקי הזרימה למינרית, ולרסס למטה עם 70% EtOH ליצור מרחב עבודה נקי. משרים מלקחיים, כפות, וצלחת שחורה 184 אלסטומר סיליקון (תערובת של אלסטומר 184 סיליקון (10 חלקים), סוכן ריפוי (חלק 1) ואבקת פחם (2.5 גר &#39;)) בEtOH 70%. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתחנת העבודה נקייה, עוברי קציר לצורך הניסוי. איסוף עובר מההריון המתאים בקרח HBSS הקר בתוספת 1% HEPES. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע איבר חיצוני או גלוי שידגיםפעילות וכתב לבחון את העוברים באמצעות מיקרוסקופ סטריאו ניאון. לאסוף את העוברים שתערוכת פעילות עיתונאית בקרח HBSS הקר בתוספת HEPES 1% כמו אלה הם הנושא של הניסוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף עצמות זמניות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה במהירות, תוך שימוש במקור אור מגניב ומלקחיים בסדר, לאסוף את ראשי הגורים. דואג לקליפ בחוליות הצוואר ומתחת ללסת כדי למנוע נזק לעצמות הזמניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתוח בזהירות את הגולגולת. הסר את המוח, לקצץ את החלק הקדמי של הראש, ולהעביר את הגולגולת האחורית לHBSS קרח הטרי הקר בתוספת HEPES% 1 בצלחת נקייה. לנתח בזהירות העצמות הזמניות צורת הבוטן מקפידים לשמור על מערכת שיווי המשקל בטקט. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את השבלול: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את העצמות הזמניות לצלחת מצופה אלסטומר סיליקון השחור בקרח HBSS הקר בתוספת 1% HEPES, להצמיד אזור שיווי המשקל של העצם. הכנס סיכות חרקים בזווית אלכסונית כדי לייצב את העצם הטמפורלית וליצור מקום למלקחיים. נעיצה היא צעד מכריע בתהליך כאילו העצם הטמפורלית מותר לנוע יותר מדי קשה מאוד למסוק שבלול בשלמותה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את הסחוס המקיף את שבלול האוזן. הכנס שן אחד המלקחיים לתוך הסחוס בקצה החיצוני של הבסיס של השבלול וקליפ חור בסחוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליפ דש בצד, להכניס את שן של המלקחיים ובעדינות להפריד את הגג של הצינור מהסחוס. קליפ אופקי לרוחב החלק העליון ואלכסון, והרימו בזהירות מהחלק הקדמי של הקפסולה. הכנס שיניים של המלקחיים בין הסחוס שנותר ואת הצינור בעדינות קליפ מהחלק האחרון. משטח הפסגה של השבלול נחשף עכשיו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל בבסיס, לתפוס את האזור שבו הגג של הצינור עומד באפיתל השבלול ולפתוח את צינור השבלול. לקלף בעדינות מהגג, זמירהבעת צורך, עד להסרה מוחלטת. חתוך את כל חלקים של קרום שנותר בצד המדיאלי של הצינור. נקה את הצינור של רקמת mesenchymal עודפת ולנתק את הצינור ממערכת שיווי המשקל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות explants: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח explant, משטח עד לומינל, במרכז צלחת תרבות תחתית זכוכית מצופה מצע, בזהירות לצייר את כל הנוזלים ולהשאיר למשך שתי דקות. להוסיף 150 μl בתוספת DMEM הירידה מבחינת לexplant, נזהר שלא להפריע לו. צריך explant לצוף חופשי, למקם מחדש עם מלקחיים, אבל דואג שexplant ישקע לתחתית הצלחת, כך שהוא יכול לצרף המצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את צלחות זכוכית תחתונה בצלחת פטרי בקוטר 12 סנטימטר עמוקה, עם מנה קטנה של מים סטריליים כדי לשמור על לחות. שים התרבויות לC חממת 35 ° לילה על מנת שexplant לצרף את המצע ולשטח. </li></ol></li></ol> 2. לגור מתאר לעצמיing <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר דגימות explant. השתמש במיקרוסקופ סטריאו ניאון כדי להעריך את מצבו של כל שבלול explanted. לבחור רק explants בי הצינור שלם ומחובר לכוס מבסיס לקודקוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את החממה ב 35 ° C עם 5% CO 2 לרקמת שבלול התרבות. שים תרבויות למיקרוסקופ החממה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב בעדינות את DMEM בתוספת ולהחליף עם לפחות 500 μl תקשורת טרי. עבור הדמיה עד 6 ימים, 1-1.5 מיליליטר הוא טוב יותר. במקרים בהם explants הם מחוברים באופן רופף, פיפטה טבעת של תקשורת סביב הקצה של המנה. נוזל נוסף זה יגרום &quot;תא humidified &#39;זעיר מבלי להפריע explant בזמן שהוא ממשיך לצרף למטריצה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, שימוש צירים צלחת מכסה כדי לפתוח את המכסים ואילו במנה נשאר בשלה ראוי במיקרוסקופ אם ריאגנטים צריכים להיות מוחלפים בהפסקות בין אוספי תמונות. כיסויי צלחת צירים לאפשר המכסים להיותנפתח מבלי להפריע דוגמאות או הסרת המנות מההגדרות שלהם. זה שומר את המיקום המדויק שלהם ללוכדים תמונה שלאחר מכן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הכלים מזכוכית תחתונה המכילים דגימות מתאימות לבעל צלחת מדגם. מיקרוסקופ בדוגמא זו יש פלטפורמה מסתובבת שמחזיקה שמונה מנות מדגם 35 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מכסה המנוע הזרימה למינרית להחליף את מכסי פלסטיק עם מכסי זכוכית והכנס את המנות לבעל צלחת מדגם. הנח את בעל צלחת מדגם בתוך מטפל חממה שלא לעקור את explants מהחלק התחתון של המנה או להפריע לתקשורת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את שגרת ההדמיה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור על המיקרוסקופ, מנורת UV ומצלמה ופתח את תוכנת ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את הדגימות, לאסוף אזור הדמיה, מטוס של מוקד ולהתאים זמני חשיפה לכל מנה ברצף. בחר המטוס של מוקד תלוי לא רק במבט של explant בעת ההתחלה, אבל אלכך בהתחשב באופן שבו הרקמה תעבור וכמה זמן כמובן הזמן ירוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר ערימת Z שבמרכזו מישור המוקד הנבחר בערוץ הקרינה. הגדר את התדירות ואורך הדגימה לצורך הניסוי. תדירות הדגימה תהיה מוגבלת על ידי הזמן שנדרש כדי לאסוף תמונות, כך זה צריך להיקבע לאחר בחירת שדות מבט והגדרת ערימת Z. במקרה זה דגימה מתקיימת בכל 30 דקות על פני חמישה ימים. משך הניסוי יכול להיות עד 14 יום. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור סרט: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתום תקופת הזמן לשגות לפתוח את קבצי תמונה. במקרה זה תוכנת Metamorph שנפתחה נקודות איסוף רציפות משמשת. פריים אחר פריים לבחור את מישור המוקד הטוב ביותר להצגת אוכלוסיית התא של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרת תמונות אלה לקובץ .avi, או לייצא אותם כמונטאז &#39;כדי ליצור סט של תמונות שניתן לפתוח ונותחו בתוכנת עיבוד תמונה או להמרה לפורמה מרובהTS באמצעות תוכנת עיבוד וידאו. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wu, D. K., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+inner+ear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+perspectives+in+biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of inner ear development.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 4, (2012).</li>
<li>Shim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+auditory+sensory+epithelium%3A+the+instrument+of+sound+perception%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The auditory sensory epithelium: the instrument of sound perception.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 38, 1827-1833 (2006).</li>
<li>Van de Water, T., Ruben, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+the+inner+ear+in+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22The+Annals+of+otology%2C+rhinology%2C+and+laryngology%22%5BJournal%5D)">Growth of the inner ear in organ culture.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 83, 1-16 (1974).</li>
<li>Jacques, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+function+for+canonical+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+in+the+developing+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A dual function for canonical Wnt/beta-catenin signaling in the developing mammalian cochlea.</a> Development. 139, 4395-4404 (2012).</li>
<li>Castellano-Munoz, M., Peng, A. W., Salles, F. T., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swept+field+laser+confocal+microscopy+for+enhanced+spatial+and+temporal+resolution+in+live-cell+imaging.+Microscopy+and+microanalysis+%3A+the+official+journal+of+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Society+of+America%2C+Microbeam+Analysis+Society%2C+Microscopical+Society+of+Canada%22%5BJournal%5D)">Swept field laser confocal microscopy for enhanced spatial and temporal resolution in live-cell imaging. Microscopy and microanalysis : the official journal of Microscopy.</a> Society of America, Microbeam Analysis Society, Microscopical Society of Canada. 18, 753-760 (2012).</li>
<li>Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Chadwick, R. S., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thyroid+hormone+increases+fibroblast+growth+factor+receptor+expression+and+disrupts+cell+mechanics+in+the+developing+organ+of+corti%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Thyroid hormone increases fibroblast growth factor receptor expression and disrupts cell mechanics in the developing organ of corti.</a> BMC developmental biology. 13, 6(2013).</li>
<li>Appler, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata3+is+a+critical+regulator+of+cochlear+wiring%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Gata3 is a critical regulator of cochlear wiring.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3679-3691 (2013).</li>
<li>Wibowo, I., Pinto-Teixeira, F., Satou, C., Higashijima, S., Lopez-Schier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+Notch+signaling+sustains+epithelial+mirror+symmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized Notch signaling sustains epithelial mirror symmetry.</a> Development. 138, 1143-1152 (2011).</li>
<li>Hashimoto, S., Kato, N., Saeki, K., Morimoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+high-potential+embryos+by+culture+in+poly%28dimethylsiloxane%29+microwells+and+time-lapse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+sterility%22%5BJournal%5D)">Selection of high-potential embryos by culture in poly(dimethylsiloxane) microwells and time-lapse imaging.</a> Fertility and sterility. 97, 332-337 (2012).</li>
<li>Matsuoka, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology-based+prediction+of+osteogenic+differentiation+potential+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Morphology-based prediction of osteogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cells.</a> PloS one. 8, (2013).</li>
<li>Ma, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.Transforming+growth+factor-beta1+and+-beta2+in+gastric+precancer+and+cancer+and+roles+in+tumor-cell+interactions+with+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">et al.Transforming growth factor-beta1 and -beta2 in gastric precancer and cancer and roles in tumor-cell interactions with peripheral blood mononuclear cells in vitro.</a> PloS one. 8, (2013).</li>
<li>Taranova, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX2+is+a+dose-dependent+regulator+of+retinal+neural+progenitor+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">SOX2 is a dose-dependent regulator of retinal neural progenitor competence.</a> Genes & development. 20, 1187-1202 (2006).</li>
<li>Chen, P., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p27%28Kip1%29+links+cell+proliferation+to+morphogenesis+in+the+developing+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti.</a> Development. , 1581-1590 (1999).</li>
</ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

ישנן מספר נקודות טכניות לשקול בעת תרבויות הוקמו ובהקמת מיקרוסקופ הזמן לשגות במטרה להדמיה לטווח ארוך. אנו משתמשים במטריצת קרום במרתף כמצע לculturing explants שבלול, אבל המצע צריך להיות מותאם לסוג התא. לדוגמא, לתרבויות עצביות תמונה, זה יכול להיות טוב יותר כדי לספק ציפוי פיברונקטין. צריכה להיות גם נבחרו טמפרטורת דגירה ובהרכב גז בהתאם לסוג רקמה. בחירת גיל explant חשובה. אנחנו מתחילים בE13 בבית המוקדם, כי על E12 כיוון הצמיחה הוא פחות צפוי. כפי שהוא חיוני כי explants בתרבית לאורך הלילה לצרף את המצע, יש לתכנן ניסויים להתחיל את היום הבא. אם ניסוי הוא להתחיל בE15 או מבוגר, יש להקי תרבויות על E13 כלאורך זמן הרקמה משתטחת ומתפשטת כל כך התאים קלים יותר לתמונה (ראה איור 3). </p&gt; אם האיבר של קורטי הוא להיות צילם, זה חיוני כי השבלול הוא גזור בזהירות רבה. ניקס בקצה הלטרלי של explant לשבור את המתח הפנימי של הרקמה, ולכן כאשר השבלול עובר שחלופים מורפולוגיים, &quot;לשפוך&quot; תאים דרך הדמעה יוצרת &#39;וי&#39; בצורת בליטת protrusion.This יכול להזיז את האזור של עניין מחוץ לתצוגה . בנוסף, יש להקפיד להסיר כמה שיותר הגג של הצינור בצד המדיאלי ככל האפשר. רקמה זו ממשיכה להתרבות כexplant מתרחב ויכול לגדול מעל לאזור של עניין והסתר אותו מתצוגה. בעת ההגדרה השגרתית ההדמיה, הצמיחה ושינויים במורפולוגיה של השבלול יש לשקול בזהירות. יש לבחור האובייקטיבי מבוסס לא רק על גודלו של האזור להיות צילם, אלא גם לקחת בחשבון אם כי האזור יהיה להעביר או להרחיב. תאים באזור המדיאלישל השבלול (איור 1 ו -2) הפרד ולנוע בתוך אזור מוגבל, ולכן הגדלה גבוהה יכולה לשמש (20X, 40X, 60x). תאים באיבר של קורט או אפיתל לרוחב, לעומת זאת, יעברו כexplant גדל; הגדלה נמוכה (10X או 20X) היא טובה יותר, כפי שהסיכוי שהתאים יישארו בשדה הראייה גבוה יותר. הדמיה של אזורים נייחים של השבלול היא אפשרית בהגדלה גבוהה. בחרנו להשתמש במטרת 10X בסעיף תוצאות הנציג כי אנחנו רוצים להראות לכל explant, וכי תנועת הרקמה היא דינמית בשלבים מוקדמים. הבא הוא לשקול המטוס של מוקד. בהתחשב בכך שexplant יגדל כלפי חוץ ולשטח, סביר להניח כי את מישור המוקד ישתנה באופן דרמטי במהלך הזמן. אם האזור של עניין הוא האיבר של קורטי או אפיתל לרוחב, מצפה זה ומתמקד בתאים הנודדים מexplant יכול לעזור. זהו אלכך טענה לשימוש ביעדי ההגדלה הנמוכות. ניתן להגדיר ערימות Z לשתי הקרינה ודסק&quot;ש. אם התאים של ריבית עלולים לצאת מפוקוס, הקמת ערימת Z של 3-5 מיקרומטר לכל צעד יכול לנטרל את זה, במיוחד אם השלב האחרון הוא במישור של מכסה הזכוכית. זה יכול להיות קשה לבחור את המטוס הנכון בעת ​​הצגת תרבויות ביום אחד, כמו הצפיפות של אריזה של התאים ואור המשתקף מרקמות יכולה למנוע תצוגה ברורה. בעת בדיקת המסגרות ליצירת סרט או מונטאז &#39;מאוחר יותר, בחירה זהירה של Z-מטוסים גם מאפשרת מעקב אחר תנועות תא בשלושה ממדים. הניסוי יכול להיות מושהה בכל נקודה על מנת להתאים את הגדרות הפוקוס אם המדגם נע מחוץ לטווח. הדמיה חיה של explant שבלול יותר משבוע מוסיפה ממד חדש להבנת התפתחות של השבלול שישלים הדמיה חיה confocal. זוהי שיטה מצוינת לשימוש בעת ארוך רחב איברבדיקת -term היא הכרחית, אך לא תחליף הדמיה confocal הגדלה גבוהה ללימודים בתא בודד לטווח קצר. בחירה של טכניקה תלויה בסוג של רקמה להיות צילם וההקשר של הניסוי. טכניקה זו תאפשר לחוקרים לבחון את השינויים במרחב ובזמן בביטוי עיתונאי גן, התפשטות תאים והגירה בזמן אמת ומאפשרים לימוד של תגובת גן הכתב לסוכנים ולכדאיות תרופות של תאים בפירוט רב יותר מאשר בעבר.

השבלול של היונקים הוא איבר מורכב הורה מאוד. בעכבר, בין הופעתה של האוזן הפנימית הפרימיטיבית משלפוחית ​​otic ביום E11 והשלמת התכנית התפתחותית בשלבי לידה מוקדמים, גלים רבים של איתות תא ושינויים מתואמים בביטוי גנים יתקיימו. פועל מבסיס לקודקוד צינור השבלול הוא הצליל זיהוי האפיתל חושית, או איבר של קורטי. פיתוח של האיבר של קורטי נשלט להפליא כך שעד סוף הפיתוח, זה יהיה מורכב משורה אחת של תאי שיער פנימיים, שלוש שורות של תאי שיער חיצוניים וביניהם חמש שורות של תאי תומכים (שתי שורות של תאי עמוד, שלוש שורות של התאים &#39;Deiters) 1. סטייה מתוצאות סדר המדויקת הזה בירידה בשמיעה, heighlighting חשיבות studye הצטברו בראשית ודפוסים של epithemlium החושי 2. בתרבית במבחנה של coch העכבר העוברילאה היא כלי חיוני בחקר המנגנונים של התפתחות של האיבר של קורטי. טכניקה זו הוקמה בשנת 1974 ובמשך 40 השנים האחרונות, נעשתה שימוש כדי להבהיר רבים מהמנגנונים שבאמצעותם האפיתל החושית מצוינת והאיבר של הקורט הוקמו 3. השבלול הוא איבר מורכב עם תהליכים התפתחותיים דינמיים; מניפולציה עשויה להימשך עוד כשבעה ימים כדי להגשים 1. לדוגמא, בעת הוספת מעכבי 3β GSK לתרבות explant שבלול בE13, תקופת הדגירה האופטימלית להתבונן השפעה חזקה של המתחם היא שישה ימים 4. הדמיה חיה של שבלול הפיתוח מאפשרת חקירת שינויים במורפולוגיה של האיבר של קורטי, שינויים בביטוי גנים, מעקב נודד, מתרבים או למות תאים, וזה מאפשר התבוננות בזמן אמת של התוצאות של סוכני תרופות ושיבוש האיתות מסלולים. עד עכשיו, לחיות הדמיה של השבלולבעיקר שבוצע באמצעות מיקרוסקופ confocal לאזורים קטנים תמונה של האיבר של קורטי על פני תקופות זמן קצרות 5-8, אבל טכניקה זו יש מגבלות בשל כדאיות explant. בהדמיה של ההשפעות של מניפולציות לטווח ארוך יותר על תהליכים ההתפתחותיים איטיים, סביבת ההדמיה היא קריטית. בדרך כלל מערכת הדמיה חיה confocal משתמשת קופסא פלסטיק humidified שיושב על המיקרוסקופ. חום ולחות יכולים לברוח דרך הפערים בתיבה דוגרות במפגש שולחן מיקרוסקופ, דרך חלונות הגישה, דרך פתחי צירים ודרך הפערים סביב חלקים שונים של microscope- כגון אובייקטיבי או מקור האור. זה לא אופטימלי לשמירת explants הבריא יותר מימים או שלוש. אנו מגדירים &quot;מיקרוסקופ חממה &#39;כמיקרוסקופ הפוכה אטומה בתוך CO 2 באינקובטור סטנדרטי, ולא חממה שנבנתה סביב מיקרוסקופ. לשעבר מיקרוסקופ החממהנוטה החיים של הניסוי כזה שלא הדמיה על שניים או שלושה ימים, ניתן הדמיה דגימות לתקופה של עד שבועיים. מיקרוסקופ חממה מספק סביבה מצוינת לצמיחה והתמיינות של תאים, עם הפרעה מינימאלית לexplant תרבויות ותנאים סטנדרטיים מבוקר. במחקרים שיתקיימו במשך ימים רבים זה מקובל לפנות לדגימות הדמיה על בסיס יומי על ידי הוצאתם מהחממה ונשא אותם למיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. בעוד גישה זו יכולה לעבוד, הסרת המנות מהחממה גורמת ללחץ על רקמת הפיתוח רגישה. שינויים בחומציות של מדיום התרבית ותנודות טמפרטורה בשל ההסרה מן החממה יכולים לגרום להתפתחות תת אופטימלית ורקמות בריאים. הדמיה באותו האזור באותו מישור המוקד ובאותו כיוון בכל נקודת זמן היא מאוד מאתגרת. על ידי שימוש במערכת אוטומטית בתוך חממה, ניתן לשמור על בריאותרקמה, כדי לאסוף תמונות הנמצאות בנקודתי זמן ולהבטיח כי אותו האזור שנתפס בכל מסגרת. בשנים האחרונות כמה חממות רקמת מיקרוסקופ משולבות פותחו, אלה היו שימושיים לא רק בפרקטיקה קלינית 9 אלא גם בתאי גזע וסרטן מחקר 10,11. כאן אנו מציגים פרוטוקול להדמיה לחיות לטווח הארוך של explants שבלול עכבר העוברי. אנו משתמשים במערכת מיקרוסקופיה אוטומטית בתוך חממת CO 2 סטנדרטית שיש לו את היכולת ללכוד תמונות של דגימות מרובות בנקודות זמן מוגדר. המערכת מורכבת ממיקרוסקופ הפוך להגדיר בתוך חממה. דגימות ממוקמות בבמה מסתובבת המאפשרת הדמיה של דגימות מרובות בכל נקודת זמן. תאורה, לכידת תמונה, והסיבוב של הבמה נשלטות על ידי מערכת אוטומטית המופעלת באמצעות תוכנת Metamorph. על ידי הגדרה שגרתית הדמיה באמצעות תוכנת ההפעלה אנו יכולים להגדיר ניסוי כדי לרוץ עד TWשבועות o עם התערבות אנושית מינימאלית. בדוגמא זו אנו משתמשים הן שדה הקרינה בהירים להציג צמיחה בקנה מידה גדולה וסידור מחדש של השבלול, ובאופן ספציפי, באזור prosensory. בניסוי זה, cochleae יהיה גזור מעכברי כתב Sox2 EGFP ביום עוברי E13. תרבויות במבחנה תוקמנה ולאחר מכן צילם במשך חמישה ימים.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle media</td><td>Gibco</td><td>12430</td><td>Multiple brands manufacture this</td></tr><tr><td>Basement membrane extract&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Matrigel. Alternative similar products are available from other suppliers.&lt;br/&gt; http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellular+Matrix+Proteins+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td>Multiple brands manufacture this&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&amp;amp;resultPage=1&amp;amp;results PerPage=15&amp;amp;autocomplete=</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>5630080</td><td>Multiple brands manufacture this&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&amp;amp;resultPage=1&amp;amp;results PerPage=15&amp;amp;autocomplete=</td></tr><tr><td>100 x N2 supplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>Multiple brands manufacture this&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&amp;amp;resultPage=1&amp;amp;results PerPage=15&amp;amp;autocomplete=</td></tr><tr><td>Ciprofloxacin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17850-5G-F</td><td>Multiple brands manufacture this&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en&amp;amp;region=CA</td></tr><tr><td>Hank&#039;s balanced salt solution</td><td>Gibco</td><td>14170161</td><td>Multiple brands manufacture this. Should be refidgerated before use.&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&amp;amp;ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s</td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11254-20</td><td>Size number 5&lt;br/&gt; http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&amp;amp;CategoryId=29</td></tr><tr><td>Curette&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10080-05</td><td>size 1 mm&amp;nbsp;&lt;br/&gt; http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&amp;amp;CategoryId=118</td></tr><tr><td>Insect Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-35</td><td>Must be stainless Steel&lt;br/&gt; http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124</td></tr><tr><td>50 mm plastic dishes</td><td>Corning/Falcon</td><td>351006</td><td>Multiple brands manufacture this</td></tr><tr><td>charcoal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>05105-250G</td><td>Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en&amp;amp;region=CA</td></tr><tr><td>184 silicone elastomer</td><td>Dow/Corning&amp;nbsp;</td><td>SYLGARD&amp;reg; 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td><td>Dishes are home made several weeks in advance.&amp;nbsp; Silicone elastomer can be from any supplier.&lt;a href=&quot;http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291&quot;&gt;http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Glass bottom dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td>The dimensions of the dish are determined by the specifications of the imaging system.&amp;nbsp; 35 mm diameter, 10mm well, number 0 coverslip fits Olympus Vivaview FL.&lt;br/&gt; http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&amp;amp;cPath= 1_4_15&amp;amp;products_id=2</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Zeiss&amp;nbsp;</td><td>495101-9804-000</td><td>&amp;nbsp;Stemi 2000 model. multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html</td></tr><tr><td>Cold Light Source</td><td>Zeiss</td><td>000000-1063-182</td><td>Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html</td></tr><tr><td>Fluorescent Stereomicroscope&amp;nbsp;</td><td>Leica microsystems</td><td>Contact Leica microsystems</td><td>Leica M165-FC. Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/</td></tr><tr><td>Incubator Microscope +imaging software</td><td>Olympus</td><td>Contact Olympus</td><td>Inverted microcope sealed inside a Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscope with proprietry Metamorpoh imaging software.&lt;br/&gt; http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&amp;amp;c=0</td></tr><tr><td>Clean bench</td><td>Thermo Scientific</td><td>51029701</td><td>Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html</td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>3310</td><td>Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html</td></tr><tr><td>Laminar Flow hood</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026651</td><td>Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html</td></tr></tbody></table>

long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants

כאן אנו מציגים שיטה להדמית הזמן לשגות ארוך טווח של explants שבלול עכבר העוברי בשידור חי. תכנית התפתחותית אחראית על בניית מבנה הורה מאוד, מורכב מתמורת השבלול של יונקים לכעשרה ימים. על מנת ללמוד את השינויים בביטוי הגנים על פני תקופה זו ותגובתם לתרופות או מניפולציה גנטית, הדמיה לטווח ארוך יש צורך. בעבר, הדמיה חיה יש בדרך כלל מוגבלת על ידי יכולת הקיום של רקמת explanted בתא humidified על גבי מיקרוסקופ רגיל. קושי בשמירה על תנאים אופטימליים לצמיחת תרבות בכל קשור ללחות וטמפרטורה יש להציב מגבלות על האורך של ניסויי הדמיה. מיקרוסקופ המשולב בתרבית רקמת חממה שונה מספק סביבה מצוינת להדמיה לטווח ארוכה וחי. בשיטה זו אנו מדגימים כיצד להקים explants שבלול עכבר עוברי וכיצד להשתמש במיקרוסקופ חממה לנהל imagi הזמן לשגותng באמצעות שני שדה בהיר ומיקרוסקופ פלואורסצנטי לבחון את התנהגותו של יום עוברי טיפוסי (E) 13 explant שבלול וSox2, סמן של תאי prosensory של השבלול, מעל 5 ימים.

כאן אנו מראים מונטאז &#39;(איור 1) וסרט (איור 2) המדגים כיצד explant שבלול organotypic טיפוסי יגדל אם מצופה על E13.5. עכבר כתב Sox2 שימש כדי להמחיש את אזור prosensory. הסרט ממחיש כי השבלול עובר צמיחה והתכנסות וסיומת, לא נראים התאים באזור הלטרלי של תחום Sox2 הירוק לחלק כמו הרקמה המקיפה אותה מתרחב. זהו מאפיין של האיבר של קורטי; על E13 האפיתל החושית הפוטנציאלי יוצאת מחזור התא, והוא ידוע בהמשך כאזור של אי-הפצה 13. ניסוי הזמן לשגות שני המתמקד בבסיס באמצע של explant שבלול שונה (איורים 3 ו -4) מוכיח כי כפי שהוא מרחיב, אזור prosensory מצמצם. שימו לב שלאחר שלושה ימים בתרבות הרקמות שטוחות במידה ניכרת כך שאפשר לדמיין indiviתאי fluorescing כפולים, ואילו בתחילת יש אזורים שבם השתקפות הפנימית של האור בשל עובי רקמה מאפשר לזהות אזורים של ביטוי, אבל תאים לא בודדים. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52101/52101fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1:. זמן - תמונות לשגות של רקמת שבלול כתב Sox2 שנאסף במשך חמישה ימים מונטאז &#39;זה מראה את ההתקדמות של גידול explant מתחיל ביום אפס וסיומה ביום חמש, דגימת כל 30 דקות באמצעות מטרת 10X. Explant הוקמה על E13 ותרבותי במשך הלילה לפני ההדמיה. כexplant מתבגר זה גם גדל ועובר תנועות הרחבה מתכנסת. () תמונות רציפות המציגות את היקף צמיחת שבלול ב 12 מרווחי שעה. ערוץ אור הנראה ועליהן גן GFP הקרינהעל פי דירוג של כתב EGFP Sox2. ערוץ GFP הקרינה (ב) בלבד. סרגל קנה מידה מתאים ל200 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52101/52101fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52101/Figure2.f4v" target="_blank">איור 2:.</a> אנימציה זמן לשגות של רקמת שבלול כתב Sox2 שנאסף במשך 5 ימים זה אותו ניסוי explant מצויינים באיור 1, מסגרות זמן זה נבחרו במרווחי זמן של 30 דקות על פני 5 ימים ומשולבים כקובץ .avi ליצור סרט. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52101/52101fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3:. בסיס אמצע עובר תנועות CE ומשטח Sequentiתמונות אל מראים כי אפיתל prosensory של אמצע הבסיס (EGFP) מצמצם, מרחיב ומשתטח במהלך 5 ימים. חצים מצביעים על אזור שהולך וצר. מסגרות שנבחרו מתוך רצף הזמן לשגות 5 יום ב 12 מרווחי שעות באמצעות מטרת 10X. סרגל קנה מידה מתאים ל200 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52101/52101fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52101/Figure4.f4v" target="_blank">איור 4:</a> אנימציה זמן לשגות של בסיס אמצע עובר תנועות CE ומשטח את רצף הזמן לשגות אנימציה מראה התכנסות והרחבה של האפיתל החושית שמוצגת באיור 3 עם מסגרות שנבחרו במרווחי זמן של 30 דקות..

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants at JoVE.com

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

הדמיה חיה של שבלול האוזן של יונקים העובריים היא מאתגרת, כי התהליכים התפתחותיים ביד פועלים על שיפוע זמני על עשרה ימים. כאן אנו מציגים שיטה culturing ולאחר מכן ההדמיה רקמות explant השבלול עוברית שנלקחו מעכבר כתב ניאון בחמישה ימים.

לטווח ארוך זמן פקיעת הדמיה של Explants שבלול העכבר

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

long-term-time-lapse-imaging-of-mouse-cochlear-explants

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.6K Views.  Sunnybrook Research Institute.  הדמיה חיה של שבלול האוזן של יונקים העובריים היא מאתגרת, כי התהליכים התפתחותיים ביד פועלים על שיפוע זמני על עשרה ימים. כאן אנו מציגים שיטה culturing ולאחר מכן ההדמיה רקמות explant השבלול עוברית שנלקחו מעכבר כתב ניאון בחמישה ימים. 

Video: Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג&#39;ין העברה על ידי Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Developmental Biology

Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue function during development and organ homeostasis. It does so by acting via biochemical, biomechanical, and biophysical signaling pathways, such as through the release of bioactive ECM protein fragments, regulating tissue tension, and providing pathways for cell migration. The extracellular matrix of the tumor microenvironment undergoes substantial remodeling, characterized by the degradation, deposition and organization of fibrillar and non-fibrillar matrix proteins. Stromal stiffening of the tumor microenvironment can promote tumor growth and invasion, and cause remodeling of blood and lymphatic vessels. Live imaging of matrix proteins, however, to this point is limited to fibrillar collagens that can be detected by second harmonic generation using multi-photon microscopy, leaving the majority of matrix components largely invisible. Here we describe procedures for tumor inoculation in the thin dorsal ear skin, immunolabeling of extracellular matrix proteins and intravital imaging of the exposed tissue in live mice using epifluorescence and two-photon microscopy. Our intravital imaging method allows for the direct detection of both fibrillar and non-fibrillar matrix proteins in the context of a growing dermal tumor. We show examples of vessel remodeling caused by local matrix contraction. We also found that fibrillar matrix of the tumor detected with the second harmonic generation is spatially distinct from newly deposited matrix components such as tenascin C. We also showed long-term (12 hours) imaging of T-cell interaction with tumor cells and tumor cells migration along the collagen IV of basement membrane. Taken together, this method uniquely allows for the simultaneous detection of tumor cells, their physical microenvironment and the endogenous tissue immune response over time, which may provide important insights into the mechanisms underlying tumor progression and ultimate success or resistance to therapy.

The extracellular matrix undergoes substantial remodeling during wound healing, inflammation and tumorigenesis. We present a novel intravital immunofluorescence microscopy approach to visualize the dynamics of fibrillar as well as mesh-like matrix components with high spatial and temporal resolution using epifluorescence or two-photon microscopy.

לטווח ארוך Intravital Immunofluorescence הדמיה של רקמות מטריקס רכיבים עם Epifluorescence ומיקרוסקופי שני פוטונים

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

Bioengineering

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current regenerative medicine strategies have focused on transplanting stem cells or genetic manipulation of surrounding support cells in the inner ear to encourage replacement of damaged stem cells to correct hearing loss. Yet, the extracellular matrix (ECM) may play a vital role in inducing and maintaining function of hair cells, and has not been well investigated. Using the cochlear ECM as a scaffold to grow adult stem cells may provide unique insights into how the composition and architecture of the extracellular environment aids cells in sustaining hearing function. Here we present a method for isolating and decellularizing cochleae from mice to use as scaffolds accepting perfused adult stem cells. In the current protocol, cochleae are isolated from euthanized mice, decellularized, and decalcified. Afterward, human Wharton&#39;s jelly cells (hWJCs) that were isolated from the umbilical cord were carefully perfused into each cochlea. The cochleae were used as bioreactors, and cells were cultured for 30 days before undergoing processing for analysis. Decellularized cochleae retained identifiable extracellular structures, but did not reveal the presence of cells or noticeable fragments of DNA. Cells perfused into the cochlea invaded most of the interior and exterior of the cochlea and grew without incident over a duration of 30 days. Thus, the current method can be used to study how cochlear ECM affects cell development and behavior.

The goal of this protocol is to demonstrate an effective method to decellularize and decalcify mouse cochleae for utilization as scaffolds for tissue engineering applications.

פרוטוקול עבור Decellularizing Cochleae העכבר עבור הנדסת רקמות האוזן הפנימית

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET remain unknown. Electrophysiological studies of hair cells revealed that the MET channel has a large conductance and is permeable to relatively large fluorescent cationic molecules, including some styryl dyes and Texas Red-labeled aminoglycoside antibiotics. In this protocol, we describe a method to visualize and evaluate the uptake of fluorescent dextrans in hair cells of the organ of Corti explants that can be used to assay for functional MET channels. We found that 3 kDa Texas Red-labeled dextran specifically labels functional auditory hair cells after 1&#8211;2 h incubation. In particular, 3 kDa dextran labels the two shorter stereocilia rows and accumulates in the cell body in a diffuse pattern when functional MET channels are present. An additional vesicle-like pattern of labeling was observed in the cell body of hair cells and surrounding supporting cells. Our data suggest that 3 kDa Texas-Red dextran can be used to visualize and study two pathways for cellular dye uptake; a hair cell-specific entry route through functional MET channels and endocytosis, a pattern also available to larger dextran.

Here, we present a method for visualizing the uptake of 3 kDa Texas Red-labeled dextran in auditory hair cells with functional mechanotransduction channels. In addition, dextrans of 3&#8211;10 kDa can be used to study endocytosis in hair and supporting cells of the organ of Corti.

תיוג דקטרן וספיגת בתאי שיער מורורין בשידור חי ופונקציונלי

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a condition that typically involves damage to or loss of the delicate mechanosensory structures of the inner ear. Sophisticated in vitro and ex vivo assays have emerged in recent years, enabling the screening of an increasing number of potentially therapeutic compounds while minimizing resources and accelerating efforts to develop cures for SNHL. Though homogenous cultures of certain cell types continue to play an important role in current research, many scientists now rely on more complex organotypic cultures of murine inner ears, also known as cochlear explants. The preservation of organized cellular structures within the inner ear facilitates the in situ evaluation of various components of the cochlear infrastructure, including inner and outer hair cells, spiral ganglion neurons, neurites, and supporting cells. Here we present the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The careful preparation of these explants facilitates the identification of mechanisms that contribute to SNHL and constitutes a valuable tool for the hearing research community.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

The goal of this protocol is to demonstrate the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The technique can be utilized as an in vitro screening tool in hearing research.

Neonatal Murine Cochlear Explant טכניקה כמו<em&gt; במבחנה</em&gt; כלי הקרנה במחקר שמיעה

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Medicine

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

הכנה לפני שבלול בעכבר למבוגרים

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia that are arranged in rows of increasing height. When stereocilia are deflected, they tug on tiny (~5 nm in diameter) extracellular tip links interconnecting stereocilia, which convey forces to the mechanosensitive transduction channels. Although mechanotransduction has been studied in live hair cells for decades, the functionally important ultrastructural details of the mechanotransduction machinery at the tips of stereocilia (such as tip link dynamics or transduction-dependent stereocilia remodeling) can still be studied only in dead cells with electron microscopy. Theoretically, scanning probe techniques, such as atomic force microscopy, have enough resolution to visualize the surface of stereocilia. However, independent of imaging mode, even the slightest contact of the atomic force microscopy probe with the stereocilia bundle usually damages the bundle. Here we present a detailed protocol for the hopping probe ion conductance microscopy (HPICM) imaging of live rodent auditory hair cells. This non-contact scanning probe technique allows time lapse imaging of the surface of live cells with a complex topography, like hair cells, with single nanometers resolution and without making physical contact with the sample. The HPICM uses an electrical current passing through the glass nanopipette to detect the cell surface in close vicinity to the pipette, while a 3D-positioning piezoelectric system scans the surface and generates its image. With HPICM, we were able to image stereocilia bundles and the links interconnecting stereocilia in live auditory hair cells for several hours without noticeable damage. We anticipate that the use of HPICM will allow direct exploration of ultrastructural changes in the stereocilia of live hair cells for better understanding of their function.

Here we present a protocol for the Hopping Probe Ion Conductance Microscopy (HPICM), a non-contact scanning probe technique that allows nanoscale imaging of stereocilia bundles in live auditory hair cells.

הדמיית חבילת סטריאוסיליה ברזולוציה ננומטרית בתאי שיער שמיעתיים של יונקים חיים

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia ...

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after co-culture with cochlear epithelium. The organ of Corti was immobilized on a plastic coverslip by pressing a portion of the Reissner's membrane generated during the dissection. MSCs confined by a glass cylinder migrated toward cochlear epithelium when the cylinder was removed. Their predominant localization was observed in the modiolus of the organ of Corti, aligned in a direction similarly to that of the nerve fibers. However, some MSCs were localized in the limbus area and showed a horizontally elongated shape. In addition, migration into the hair cell area was increased, and the morphology of the MSCs changed to various forms after kanamycin treatment. In conclusion, the results of this study indicate that the coculture of MSCs with cochlear epithelium will be useful for the development of therapeutics via cell transplantation and for studies of cell regeneration that can examine various conditions and factors.

In this study, we present a real-time imaging method using confocal microscopy to observe cells moving toward damaged tissue by ex vivo incubation with the cochlear epithelium containing the organ of Corti.

הפריה זמן לשגות הדמיה תא חי כדי לחקור את העברת תאים לכיוון האיבר של קורטי

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

Imaging the Aging Cochlea with Light-Sheet Fluorescence Microscopy

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or presbycusis is a primary cause of sensorineural hearing loss and is characterized by damage to hair cells, spiral ganglion neurons (SGNs), and the stria vascularis. These structures reside within the cochlea, which has a complex, spiral-shaped anatomy of membranous tissues suspended in fluid and surrounded by bone. These properties make it technically difficult to investigate and quantify histopathological changes. To address this need, we developed a light-sheet microscope (TSLIM) that can image and digitize the whole cochlea to facilitate the study of structure-function relationships in the inner ear. Well-aligned serial sections of the whole cochlea result in a stack of images for three-dimensional (3D) volume rendering and segmentation of individual structures for 3D visualization and quantitative analysis (i.e., length, width, surface, volume, and number). Cochleae require minimal processing steps (fixation, decalcification, dehydration, staining, and optical clearing), all of which are compatible with subsequent high-resolution imaging by scanning and transmission electron microscopy. Since all the tissues are present in the stacks, each structure can be assessed individually or relative to other structures. In addition, since imaging uses fluorescent probes, immunohistochemistry and ligand binding can be used to identify specific structures and their 3D volume or distribution within the cochlea. Here we used TSLIM to examine cochleae from aged mice to quantify the loss of hair cells and spiral ganglion neurons. In addition, advanced analyses (e.g., cluster analysis) were used to visualize local reductions of spiral ganglion neurons in Rosenthal&#39;s canal along its 3D volume. These approaches demonstrate TSLIM microscopy&#39;s ability to quantify structure-function relationships within and between cochleae.

A light-sheet microscope was developed to image and digitize whole cochlea.

הדמיה של השבלול המזדקן באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or ...

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is characterized by the cumulative and irreversible loss of sensory hair cells and auditory nerves in the cochlea. Entire and vital cochlear explants are one of the fundamental tools in hearing research to detect hair cell loss and to characterize the molecular mechanisms of the inner ear cells. Many years ago, a protocol for neonatal cochlear isolation was developed, and although it has been modified over time, it still holds potential for improvement. 
This paper presents an optimized protocol for isolating and culturing whole neonatal cochlear explants in multi-well culture chambers that enables the study of hair cells and spiral ganglion neuron cells along the entire length of the cochlea. The protocol was tested using cochlear explants from mice and rats. Healthy cochlear explants were obtained to study the interaction between hair cells, spiral ganglion neuron cells, and the surrounding supporting cells. 
One of the main advantages of this method is that it simplifies the organ culture steps without compromising the quality of the explants. All three turns of the organ of Corti are attached to the bottom of the chamber, which facilitates in vitro experiments and the comprehensive analysis of the explants. We provide some examples of cochlear images from different experiments with live and fixed explants, demonstrating that the explants retain their structure despite exposure to ototoxic drugs. This optimized protocol can be widely used for the integrative analysis of the mammalian cochlea.

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

The current protocol updates previous protocols and incorporates relatively straightforward approaches for culturing high-quality cochlear explants. This provides reliable data acquisition and high-resolution imaging in live and fixed cells. This protocol supports the ongoing trend of studying inner ear cells.

צמחי שבלול שלמים של ילודים כמודל במבחנה

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is ...

לטווח ארוך זמן פקיעת הדמיה של Explants שבלול העכבר

Summary

Explore More Videos

תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג'ין העברה על ידי Electroporation