Wir danken Ihnen, Willy Sun für die technische Unterstützung und Dr. Kris Gellynck für hilfreiche Anmerkungen und drei anonymen Gutachtern für ihre konstruktive Ratschläge. Diese Arbeit wurde von der Sunnybrook Hearing Regeneration Initiative gefördert

Mausgewebe wurde von Sox2 EGFP -reporter Mäusen 12 gehalten und in Übereinstimmung mit Canadian Council on Animal Care Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren eingeschläfert geerntet. 1. Die Kultivierung embryonaler Cochleae <ol><li> Ergänzung Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) durch Mischen 8.89 ml DMEM, 1 ml fötales Rinderserum (FBS), 100 &amp; mgr; l 100x N2 ergänzen, und 10 ul 10 mg / ml Ciprofloxacin. Ergänzung Hank Balanced Salt Solution (HBSS), die durch Mischen von 495 ml HBSS mit 5 ml 100% HEPES. </li><li> Bereiten Glasboden Kulturschalen: <ol><li> In einem Abzug mit laminarer Strömung, resuspendieren 200 ul Basalmembran Extrakt Substrat in 5 ml DMEM. Bereiten 35 mm Durchmesser Glasboden Kulturschalen mit 10 mm-Vertiefungen. Je 150 ul Substrat / DMEM in die Mitte eines jeden Glasbodenschale. Diese Gerichte werden nach 40 min Inkubation verwendet werden, oder kann in einem CO 2 gespeichert </sub&gt; Inkubator bei 35 ° C für mindestens eine Woche. HINWEIS: Glasbodenplatten sind aus den folgenden Gründen verwendet: um sicherzustellen, dass der Boden der Schale ist transparent und eignet sich für die Bildgebung, um einen Brunnen in der Mitte der Schale, die die Explantate in einer leicht lokalisiert Bereich absetzen und schließlich ermöglicht erstellen so daß nach einem Versuch die Probe für eine nachfolgende Analyse und Immunfärbung verarbeitet werden. </li></ol></li><li> Bereiten Sie die Arbeitsstation und Werkzeuge: <ol><li> Schalten Sie die laminare Strömung Sterilbank und abspritzen mit 70% EtOH, um eine saubere Arbeitsfläche zu erstellen. Soak Zangen, Löffel und eine schwarze 184 Siliconelastomer-Spiegel (eine Mischung aus 184 Silikon-Elastomer (10 Teile), Härter (1 Teil) und Holzkohlepulver (2,5 g)) in 70% EtOH. </li></ol></li><li> In der sauberen Arbeitsstation, Ernte Embryonen für das Experiment. Sammeln Embryonen des entsprechenden Schwangerschafts in eiskaltem HBSS ergänzt mit 1% HEPES. <ol><li> Bestimmen Sie eine externe oder sichtbare Organ, das zeigen wirdReporteraktivität und untersuchen die Embryonen mit Hilfe eines Fluoreszenz-Stereomikroskop. Sammeln Sie die Embryonen, die Reporteraktivität zeigen in eiskaltem HBSS mit 1% HEPES da diese ergänzt sind Gegenstand des Experiments. </li></ol></li><li> Sammeln Schläfenbeine: <ol><li> Schnell arbeiten, mit einem kühlen Lichtquelle und einer feinen Pinzette, sammeln die Köpfe der Welpen. Achten Sie darauf, an der Halswirbel und unter dem Kiefer Clip um eine Beschädigung der Schläfenbeine zu vermeiden. </li><li> Öffnen Sie vorsichtig den Schädel. Entfernen Sie das Gehirn, schneiden Sie die Vorderseite des Kopfes, und übertragen Sie die hintere Schädel frisches eiskaltes HBSS mit 1% HEPES in einem sauberen Teller ergänzt. Sorgfältig sezieren Sie die Erdnussförmigen Schläfenbeine darauf achten, dass das Gleichgewichtssystem in Takt zu halten. </li></ol></li><li> Präparieren Sie die Cochlea: <ol><li> Übertragen Sie die Schläfenbeine zu einem schwarzen Silikonelastomer beschichtete Schale in eiskaltem HBSS ergänzt mit 1% HEPES, die vestibulären Bereich des Knochen Pin. Legen Insektenstifte aneinem schrägen Winkel zur Stabilisierung des Schläfenbeins und schaffen Raum für die Zange. Pinning ist ein entscheidender Schritt im Prozess, als ob das Schläfenbein ist erlaubt, zu viel ist es sehr schwierig, eine intakte Cochlea ernten zu bewegen. </li><li> Den Knorpel rund um das Cochlea vorsichtig entfernen. Stecken Sie ein Zinken der Zange in den Knorpel an der Außenkante der Basis der Cochlea und Clip ein Loch in den Knorpel. </li><li> Clip eine Klappe an der Seite, legen Sie die Zinken der Zange und sanft trennen das Dach des Kanals aus dem Knorpel. Horizontal Clip über der Spitze und diagonal, und heben Sie den vorderen Teil der Kapsel. Legen Sie eine Zinke der Zange zwischen den verbleibenden Knorpel und den Kanal und sanft Clip aus dem letzten Abschnitt. Die apikale Oberfläche der Cochlea wird nun ausgesetzt. </li><li> Beginnend an der Basis, fangen die Gegend, wo das Dach des Kanals trifft das Cochlea-Epithel und öffnen Sie den Schneckengang. Ziehen Sie leicht vom Dach, Trimmenwenn notwendig, bis es vollständig entfernt ist. Schneiden Sie alle Teile der Membran nach links auf der medialen Seite des Kanals. Reinigen Sie den Kanal von überschüssigem mesenchymalen Gewebe und lösen Sie den Kanal aus dem Gleichgewichtssystem. </li></ol></li><li> Kultur die Explantate: <ol><li> Ein Explantation, Lumenoberfläche auf, in der Mitte des ein Substrat aufgetragen Glasbodenkulturschale vorsichtig abziehen gesamte Flüssigkeit und lassen Sie für zwei Minuten. In 150 ul ergänzt DMEM tropfenweise zu dem Explantat, kümmert sich nicht um sie zu stören. Sollte der Explantation schweben frei, neu zu positionieren mit einer Pinzette, aber darauf achten, dass das Explantat setzt sich am Boden der Schale, so dass sie auf das Substrat zu befestigen. </li><li> Legen Sie die Glasbodenschalen in eine tiefe 12 cm Durchmesser Petrischale mit einer kleinen Schüssel mit sterilem Wasser auf Feuchtigkeit zu halten. Setzen die Kulturen auf eine 35 ° C-Inkubator über Nacht damit das Explantat auf das Substrat anzubringen und zu glätten. </li></ol></li></ol> 2. Live-Imaging <ol><li> Wählen Explantatproben. Verwenden Sie ein Fluoreszenzstereomikroskop, um den Zustand eines jeden explantiert Cochlea bewerten. Wählen Explantate Nur wo der Kanal ist intakt und vor Glasbasis angebracht bis zur Spitze. </li><li> Gesetzt den Inkubator bei 35 ° C mit 5% CO 2 zur Kultur Cochleagewebe. Setzen Sie die Kulturen in den Brutschrank Mikroskop: <ol><li> Vorsichtig absaugen die ergänzt DMEM und ersetzen mit mindestens 500 &amp; mgr; l frisches Medium. Zur Abbildung von bis zu 6 Tagen ist 1-1,5 ml besser. In Fällen, in denen Explantate lose befestigt, Pipette einen Ring von Medien rund um den Rand der Schale. Diese zusätzliche Flüssigkeit wird eine Miniatur &quot;feuchten Kammer&quot; ohne die Explantation zu stören zu machen, während sie an der Matrix zu befestigen geht weiter. <ol><li> Alternativ frisch Verwendung Teller abdeckt, die Deckel zu öffnen, während die Schale bleibt in seinem Einbau in das Mikroskop, wenn Reagenzien müssen während der Intervalle zwischen Bildsammlungen ausgetauscht werden. Klappbare Schalenabdeckungen ermöglichen die Deckel zu seingeöffnet, ohne zu stören die Proben oder das Entfernen der Gerichte aus deren Einstellungen. Dies hält ihre exakte Position für die nachfolgende Bildaufnahmen. </li></ol></li><li> Legen Sie die Glasbodenschalen mit entsprechenden Proben in den Probenschalenhalter. Das Mikroskop weist in diesem Beispiel eine sich drehende Plattform, die acht 35 mm Probenschalen hält. </li><li> Unter dem Laminarströmungshaube ersetzen die Kunststoffdeckel mit Glasdeckel und legen Sie das Geschirr in die Probenschalenhalter. Platzieren Sie die Probenschale Halter im Inkubator kümmert sich nicht um die Explantate aus dem Boden der Schale zu entfernen oder um die Medien zu stören. </li></ol></li><li> Richten Sie die Imaging-Routine: <ol><li> Schalten Sie das Mikroskop, UV-Lampe und Kamera und öffnen Sie die Bildbearbeitungssoftware. </li><li> Suchen Sie die Proben, wählen Sie ein Imaging-Bereich, Fokusebene und die Belichtungszeiten für jedes Gericht in Folge. Wählen Sie die Fokusebene abhängig nicht nur von der Ansicht der Explantation zu der Zeit des Startens, aber also bedenkt, wie das Gewebe bewegen und wie lange der Zeitverlauf ausgeführt werden soll. </li><li> Legen Sie einen Z-Stack Zentrierung um den ausgewählten Fokusebene im Fluoreszenzkanal. Legen Sie die Häufigkeit und Länge der Probenahme für das Experiment. Die Häufigkeit der Probenahme wird durch die Zeit, um Bilder zu sammeln nimmt begrenzt werden, so sollte dies nach der Auswahl Sichtfelder und Setzen einer Z-Stack bestimmt werden. In diesem Fall nimmt der Probenahme alle 30 min über fünf Tage. Die Versuchsdauer kann bis zu 14 Tagen. </li></ol></li><li> Generieren Sie einen Film: <ol><li> Am Ende des Zeitablauf Periode öffnen Sie die Bilddateien. In diesem Fall Metamorph-Software, die sequentielle Sammelstellen öffnet verwendet. Bild für Bild wählen Sie die beste Brennebene zur Darstellung der Zellpopulation von Interesse. </li><li> Konvertieren Sie diese Bilder zu einer .avi-Datei oder exportieren Sie sie als Montage, um eine Reihe von Bildern, die geöffnet werden können, und analysiert in Bildbearbeitungssoftware oder umgebaut, mehrere forma generierents mit Videobearbeitungssoftware. </li></ol></li></ol>

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	<li>Wu, D. K., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+inner+ear+development.">Molecular mechanisms of inner ear development.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 4, (2012).</li><li>Shim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+auditory+sensory+epithelium:+the+instrument+of+sound+perception.">The auditory sensory epithelium: the instrument of sound perception.</a> The international journal of biochemistry &amp; cell biology. 38, 1827-1833 (2006).</li><li>Van de Water, T., Ruben, R. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gata3+is+a+critical+regulator+of+cochlear+wiring.">Gata3 is a critical regulator of cochlear wiring.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3679-3691 (2013).</li><li>Wibowo, I., Pinto-Teixeira, F., Satou, C., Higashijima, S., Lopez-Schier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Notch+signaling+sustains+epithelial+mirror+symmetry.">Compartmentalized Notch signaling sustains epithelial mirror symmetry.</a> Development. 138, 1143-1152 (2011).</li><li>Hashimoto, S., Kato, N., Saeki, K., Morimoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+high-potential+embryos+by+culture+in+poly(dimethylsiloxane)+microwells+and+time-lapse+imaging.">Selection of high-potential embryos by culture in poly(dimethylsiloxane) microwells and time-lapse imaging.</a> Fertility and sterility. 97, 332-337 (2012).</li><li>Matsuoka, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology-based+prediction+of+osteogenic+differentiation+potential+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Morphology-based prediction of osteogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cells.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Ma, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Transforming+growth+factor-beta1+and+-beta2+in+gastric+precancer+and+cancer+and+roles+in+tumor-cell+interactions+with+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+vitro.">et al.Transforming growth factor-beta1 and -beta2 in gastric precancer and cancer and roles in tumor-cell interactions with peripheral blood mononuclear cells in vitro.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Taranova, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+is+a+dose-dependent+regulator+of+retinal+neural+progenitor+competence.">SOX2 is a dose-dependent regulator of retinal neural progenitor competence.</a> Genes &amp; development. 20, 1187-1202 (2006).</li><li>Chen, P., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p27(Kip1)+links+cell+proliferation+to+morphogenesis+in+the+developing+organ+of+Corti.">p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti.</a> Development. , 1581-1590 (1999).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Es gibt mehrere technische Punkte, die bei Kulturen festgelegt und bei der Einrichtung der Zeitraffer-Mikroskop, um für langfristige Bildgebung. Wir verwenden Basalmembranmatrix als Substrat zum Kultivieren von Cochlea-Explantate, doch sollte das Substrat für den Zelltyp abgestimmt werden. Zum Beispiel, um Bild neuronalen Kulturen, kann es besser sein, eine Fibronectin-Beschichtung bereitzustellen. Inkubation Temperatur und Gaszusammensetzung auch nach Gewebetyp gewählt werden. Wahl des Alters der Explantation ist wichtig. Wir starten auf E13 frühestens denn am E12 die Richtung des Wachstums ist weniger vorhersehbar. Wie es ist wichtig, dass Explantate werden über Nacht kultiviert, um auf das Substrat zu befestigen, sollten Experimente geplant werden, um am nächsten Tag beginnen. Wenn ein Experiment ist es, bei E15 oder älter beginnen, sollten Kulturen auf E13 wie im Laufe der Zeit das Gewebe abflacht und verbreitet so die Zellen sind leichter zu Bild festgelegt werden (siehe Abbildung 3). </p&gt; Wenn das Corti-Organ ist, das abgebildet werden soll, ist es wichtig, daß die Schnecke sehr sorgfältig seziert. Nicks in der Seitenkante der Explantation brechen die innere Spannung des Gewebes, also, wenn das Cochlea erfährt morphologische Umlagerungen, Zellen &#39;spill&#39; durch den Riss Bildung eines &quot;V&quot; geformt protrusion.This Vorsprung kann die Region von Interesse aus der Sicht bewegen . Zusätzlich muß darauf geachtet werden, um so viel von dem Dach des Kanals auf der medialen Seite wie möglich zu entfernen. Dieses Gewebe weiter ausbreitet als das Explantat erweitert und kann über die Oberseite des Bereichs von Interesse aus der Ansicht zu verdunkeln wachsen. Beim Einrichten der Abbildungsroutine muss die Wachstum und Veränderungen in der Morphologie der Cochlea sorgfältig berücksichtigt werden. Das Ziel sollte nicht nur auf die Größe des abzubildenden Bereich, sondern auch unter Berücksichtigung, ob der Bereich bewegt wird oder zu erweitern gewählt werden. Zellen im mittleren Bereichder Cochlea (Abbildung 1 und 2) Teile und bewegen sich innerhalb einer eingegrenzten Fläche, so dass ein hoher Vergrößerung verwendet werden (20X, 40X, 60X). Zellen des Corti-Organs oder der seitlichen Epithel wird jedoch bewegen, wenn das Explantat wächst; eine geringere Vergrößerung (10X oder 20X) besser ist, als die Wahrscheinlichkeit, dass die Zellen in dem Sichtfeld bleibt höher sind. Imaging der stationären Bereiche der Cochlea ist bei hohen Vergrößerungen möglich. Wir entschieden uns, ein 10X-Objektiv in der repräsentativen Ergebnisteil zu verwenden, da wir die ganze Explantat zeigen wollte, und weil das Gewebe Bewegung ist dynamisch in einem frühen Stadium. Weiter zu beachten ist die Fokusebene. Da der Explantation wird nach außen wachsen und glätten, ist es wahrscheinlich, dass der Brennebene wird dramatisch über den Zeitverlauf ändern. Wenn die Region von Interesse ist das Corti-Organ oder laterale Epithel, Antizipation dies und die Konzentration auf den Zellen der Migration aus dem Explantat kann helfen. Dies ist also ein Argument für die Nutzung der Objektive mit geringer Vergrößerung. Es ist möglich, Z Stapel sowohl für Fluoreszenz und DIC eingestellt. Wenn die Zellen von Interesse sind wahrscheinlich aus dem Fokus zu bewegen, die Einrichtung eines Z-Stack von 3-5 &amp; mgr; m pro Schritt kann dem entgegenwirken, vor allem, wenn der letzte Schritt in der Ebene des Deckglases. Es kann schwierig sein, das richtige Flugzeug bei Betrachtung Kulturen am Tag, als die Dichte der Packung der Zellen zu wählen und das reflektierte Licht vom umgebenden Gewebe kann eine klare Sicht zu verhindern. Bei der Überprüfung der Rahmen, um einen Film oder montage später zu erzeugen, ermöglicht eine sorgfältige Auswahl der Z-Ebenen auch Verfolgung von Zellbewegungen in drei Dimensionen. Das Experiment kann an jeder beliebigen Stelle angehalten werden, um die Fokuseinstellungen anpassen, wenn die Probe außerhalb des Bereichs bewegt. Live-Bildgebung eines Cochlea-Explantat mehr als einer Woche eine neue Dimension für das Verständnis der Entwicklung der Cochlea, die konfokale Live-Bildgebung ergänzt werden sollen. Dies ist eine hervorragende Methode, um zu verwenden, wenn Organ breite lang-term Prüfung ist notwendig, aber nicht hohe Vergrößerung konfokale Bildgebung für kurzfristige Einzelzellstudien ersetzen. Wahl der Technik hängt von der Art des Gewebes, das abgebildet werden und im Rahmen des Experiments. Diese Technik erlaubt den Forschern räumlich-zeitlichen Veränderungen in der Reportergen-Expression, Zellproliferation und Migration in Echtzeit zu untersuchen und ermöglicht Studium Reportergens als Reaktion auf Arzneimittel und die Lebensfähigkeit der Zellen genauer als bisher möglich.

Die Säugetier Cochlea ist eine hochgeordnete komplexes Organ. Bei der Maus zwischen der Entstehung des primitiven Innenohr aus dem Ohrbläschen am Tag E11 und die Fertigstellung des Entwicklungsprogramms der frühen postnatalen Stadien, mehrere Wellen der Zellsignalisierung und koordinierte Veränderungen in der Genexpression statt. Laufen von der Basis bis der Ductus cochlearis Apex ist die Geräuscherfassungs Sinnesepithel oder Corti-Organ. Entwicklung des Corti-Organ ist vorzüglich so gesteuert, dass am Ende der Entwicklung, wird es aus einer einzigen Reihe von inneren Haarzellen bestehen, drei Reihen von äußeren Haarzellen mit fünf Reihen von Stützzellen (zwei Reihen von Säulenzellen, drei setzt Reihen von Deiters &#39;Zellen) ein. Abweichung von dieser genauen Reihenfolge ergibt Hörverlust, heighlighting die Bedeutung der studye OFTHE Entstehung und Strukturierung der sensorischen epithemlium 2. In-vitro-Kultivierung von embryonalen Maus cochlea ist ein wichtiges Instrument bei der Untersuchung der Mechanismen der Entwicklung des Corti-Organ. Diese Technik wurde 1974 gegründet und in den letzten 40 Jahren verwendet worden, um viele der Mechanismen, mit denen die sensorische Epithel angegeben ist und der Corti-Organ gegründet 3 aufzuklären. Die Cochlea ist ein komplexes Organ mit dynamischen Entwicklungsprozesse; eine Manipulation kann so lange wie sieben Tage manifestieren 1. Zum Beispiel, wenn das Hinzufügen GSK 3β-Inhibitoren zu einer Cochlea Explantatkultur in E13 die optimale Inkubationszeit zu beobachten, eine robuste Wirkung der Verbindung sechs Tagen 4. Echtzeit-Bildgebung des Entwicklungs Cochlea ermöglicht Untersuchung Veränderungen in der Morphologie des Corti-Organ, Veränderungen in der Genexpression, Verfolgung von Tierwanderung, wuchernden oder sterbenden Zellen und ermöglicht Echtzeit-Beobachtung der Ergebnisse von pharmazeutischen Wirkstoffen und die Störung der Signal Wegen. Bisher leben Bildgebung der Cochleawurde hauptsächlich durchgeführt unter Verwendung der konfokalen Mikroskopie, um Bild kleine Bereiche des Corti-Organ über kurze Zeiträume 5-8, aber diese Technik hat Einschränkungen aufgrund Explantat Lebensfähigkeit. In Abbildung der Auswirkungen von Langzeitmanipulationen an langsame Entwicklungsprozessen ist die Abbildungsumgebung entscheidend. Typischerweise verwendet ein konfokales Live-Bildgebungssystem einen befeuchteten Kunststoffbox, die am Mikroskop sitzt. Hitze und Feuchtigkeit kann durch die Lücken in dem Inkubieren Feld trifft dort auf den Mikroskoptisch, durch den Zugriffsfenstern, durch die Scharnieröffnungen und durch die Lücken um verschiedene Teile des Mikroskop- wie dem Ziel oder der Lichtquelle entweichen. Dies ist nicht optimal für die Gesunderhaltung der Explantate für mehr als zwei oder drei Tage. Wir definieren &quot;Inkubator Mikroskops als invertiertes Mikroskop in einem Standard-CO 2 -Inkubator abgedichtet, anstatt einem Inkubator auf der Mikroskop aufgebaut. Ein Inkubator Mikroskop exneigt die Lebensdauer des Experiments, dass anstatt Abbildungs ​​über zwei oder drei Tage, können die Proben für bis zu zwei Wochen abgebildet werden. Ein Inkubator Mikroskop eine ausgezeichnete Umgebung für das Zellwachstum und Differenzierung, mit minimaler Störung zu Kulturen und Standard kontrollierten Bedingungen Explantation. In Studien, die über mehrere Tage stattfinden, ist es üblich, den Abbildungsproben auf einer täglichen Basis, indem sie aus dem Inkubator entfernt und trägt sie zu einem invertierten Fluoreszenzmikroskop greifen. Während dieser Ansatz funktionieren kann, das Entfernen der Gerichte aus dem Inkubator zufügt Belastung der empfindlichen Entwicklungs Gewebe. Änderungen der Säuregehalt des Kulturmedium und Temperaturschwankungen aufgrund der Entnahme aus dem Inkubator in suboptimalen Entwicklung und ungesunden Gewebes führen. Abbilden der gleichen Region auf der gleichen Brennebene und in der gleichen Orientierung zu jedem Zeitpunkt ist eine große Herausforderung. Durch die Verwendung eines automatisierten Systems in einem Inkubator ist es möglich gesund zu haltenGewebe, um Bilder bei mehreren Zeitpunkten zu sammeln und um sicherzustellen, dass derselbe Bereich in jedem Rahmen erfasst. In den letzten Jahren mehrere integrierte Mikroskop Gewebe Brut entwickelt, diese nicht nur in der klinischen Praxis 9 aber auch in Stammzellen und Krebsforschung 10,11 nützlich. Hier präsentieren wir ein Protokoll für langfristig Live-Bildgebung von embryonalen Maus-Cochlea-Explantate. Wir verwenden eine automatisierte Mikroskopie System innerhalb einer Standard CO 2 Inkubator, die die Fähigkeit, Bilder von mehreren Proben in festgelegten Zeitpunkten zu erfassen hat. Das System besteht aus einem inversen Mikroskop innerhalb Inkubator gesetzt. Proben werden in einem rotierenden Podest, das Bildgebung mehrerer Proben ermöglicht zu jedem Zeitpunkt platziert. Beleuchtung, Bildaufnahme und Drehung des Podiums werden durch ein automatisiertes System durch Metamorph-Software betrieben gesteuert. Durch das Setzen eines bilderzeugenden Routine mit der Bediensoftware können wir einen Versuchsaufbau für bis zu tw laufeno Wochen mit minimaler menschlicher Intervention. In diesem Beispiel verwenden wir sowohl Hellfeld und Fluoreszenz zu großen Wachstum und Umlagerung der Cochlea, und insbesondere die prosensory Region zeigen. In diesem Experiment wird cochleae von Sox2 EGFP Reportermäuse an embryonalen Tag E13 seziert werden. In vitro-Kulturen wird aufgebaut und dann über fünf Tage abgebildet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12430</td>
			<td>Multiple brands manufacture this</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/classical-media/dmem.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane extract&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Matrigel. Alternative similar products are available from other suppliers. 
			http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellular+Matrix+Proteins+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&#38;resultPage=1&#38;results PerPage=15&#38;autocomplete=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5630080</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&#38;resultPage=1&#38;results PerPage=15&#38;autocomplete=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&#38;resultPage=1&#38;results PerPage=15&#38;autocomplete=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>17850-5G-F</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en&#38;region=CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170161</td>
			<td>Multiple brands manufacture this. Should be refidgerated before use. 
			http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&#38;ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Size number 5 
			http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&#38;CategoryId=29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curette&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10080-05</td>
			<td>size 1 mm&#160; 
			http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&#38;CategoryId=118</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26001-35</td>
			<td>Must be stainless Steel 
			http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mm plastic dishes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>351006</td>
			<td>Multiple brands manufacture this</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>charcoal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>05105-250G</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en&#38;region=CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>184 silicone elastomer</td>
			<td>Dow/Corning&#160;</td>
			<td>SYLGARD&#174; 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td>
			<td>Dishes are home made several weeks in advance.&#160; Silicone elastomer can be from any supplier.<a href="http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291">http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>The dimensions of the dish are determined by the specifications of the imaging system.&#160; 35 mm diameter, 10mm well, number 0 coverslip fits Olympus Vivaview FL. 
			http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&#38;cPath= 1_4_15&#38;products_id=2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td>495101-9804-000</td>
			<td>&#160;Stemi 2000 model. multiple brands manufacture similar items 
			http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Light Source</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1063-182</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Stereomicroscope&#160;</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>Contact Leica microsystems</td>
			<td>Leica M165-FC. Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Microscope +imaging software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Contact Olympus</td>
			<td>Inverted microcope sealed inside a Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscope with proprietry Metamorpoh imaging software. 
			http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&#38;c=0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean bench</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51029701</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3310</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026651</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants

Hier präsentieren wir eine Methode zur langfristigen Zeitraffer-Bildgebung von lebenden embryonalen Maus Cochlea Explantate. Das Entwicklungsprogramm für den Bau des hochgeordnete, komplexe Struktur der Säuger Cochlea Erlös für rund 10 Tage verantwortlich. Um Veränderungen in der Genexpression in diesem Zeitraum, und ihre Reaktion auf pharmazeutische oder genetische Manipulation zu untersuchen, ist die Langzeitabbildungs ​​notwendig. Zuvor wurde die Bildgebung in der Regel durch die Lebensfähigkeit von explantierten Gewebes in einer feuchten Kammer auf einem Standardmikroskop beschränkt. Schwierigkeiten bei der Aufrechterhaltung optimaler Bedingungen für das Kulturwachstum in Bezug auf Feuchtigkeit und Temperatur hat Grenzen für die Länge des Abbildungsexperimente platziert. Ein in einen modifizierten Gewebekultur-Inkubator integrierten Mikroskop bietet ein hervorragendes Umfeld für langfristig-Live-Bildgebung. Bei dieser Methode zeigen wir, wie die embryonale Maus Cochlea Explantate zu etablieren und wie man einen Inkubator Mikroskop verwenden, um Zeitraffer Imagi leitenng unter Verwendung sowohl Hellfeld- und Fluoreszenzmikroskopie, um das Verhalten eines typischen embryonalen Tag (E) 13 Cochlea Explantat und Sox2, einem Marker der prosensory Zellen der Cochlea, über 5 Tage zu untersuchen.

Hier zeigen wir eine Montage (Abbildung 1) und einen Film (Abbildung 2) zeigt, wie ein typischer organotypischen Cochlea Explantat wird wachsen, wenn auf E13.5 plattiert. A Sox2 Reporter Maus wurde verwendet, um die prosensory Region zu visualisieren. Der Film zeigt, daß die Cochlea erfährt Wachstum und Konvergenz und Ausdehnung, werden die Zellen in dem seitlichen Bereich des grünen Sox2 Domäne scheint wie das umgebende Gewebe dehnt teilen. Dies ist eine Eigenschaft des Corti-Organ; auf E13 der potenzielle Sinnesepithel verlässt den Zellzyklus und wird anschließend als die Zone der Nichtverbreitung 13 bekannt. Eine zweite Zeitrafferversuch zentriert auf die Mitte des Basis einer anderen Cochlea Explantat (3 und 4) zeigt, daß, da es sich verengt sich die prosensory Region. Beachten Sie, dass nach drei Tagen in Kultur das Gewebe erheblich solchen abgeflachten daß es möglich ist, indivi visualisierenDual fluoreszierende Zellen, während zu Beginn gibt es Regionen, in denen interne Reflexion des Lichts aufgrund von Gewebedicke ist es möglich, Bereiche des Ausdrucks, aber nicht einzelne Zellen zu identifizieren. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52101/52101fig1highres.jpg" width="500" /> Abb. 1: Zeitraffer - Bilder von Sox2 Reporter über fünf Tage gesammelt Cochlea Gewebe Diese Montage zeigt den Fortschritt der Explantation Wachstum, beginnend am Tag Null und endet am fünften Tag, Probenahme alle 30 Minuten mit einer 10X-Objektiv. Das Explantat wurde am E13 etabliert und vor der Bilderzeugung über Nacht kultiviert. Wie das Explantat reift er sowohl wächst und erfährt konvergenten Extensionsbewegungen. (A) aufeinander folgenden Bildern aus denen der Umfang der Cochlea Wachstum bei 12 h Intervallen. Sichtbares Licht Kanal überlagert mit GFP-Fluoreszenz-Genbewertet durch das EGFP Sox2 Reporter. (B) GFP-Fluoreszenz-Kanal nur. Maßstabsbalken entspricht 200 um. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52101/52101fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52101/Figure2.f4v" target="_blank">Abbildung 2</a> :. Zeitraffer-Animation von Sox2 Reporter über 5 Tage gesammelt Cochlea Gewebe Dies ist in Abbildung 1 angegeben gleichen Explantat Experiment werden diese Zeitrahmen bei 30 Minuten-Intervallen über 5 Tage ausgewählt und kombiniert als .avi-Datei zu einem generieren Film. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52101/52101fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3:. Mid Basiszogen CE Bewegungen und Abflachung Sequential Abbildungen zeigen, dass die prosensory Epithel der mittleren Basis (EGFP) verengt, sich abflacht und im Laufe von 5 Tagen haben. Die Pfeile zeigen Region, verengt. Frames bei 12 h Zeitabständen mit einem 10X-Objektiv ausgewählt aus einem 5-tägigen Zeitraffersequenz. Maßstabsbalken entspricht 200 um. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52101/52101fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52101/Figure4.f4v" target="_blank">Abbildung 4</a> : Zeitraffer-Animation der Mitte Basis unterziehen CE Bewegungen und Abflachung Animationszeitraffersequenz zeigt Konvergenz und Erweiterung der in Abbildung 3 mit Rahmen in 30-minütigen Intervallen ausgewählt gezeigt Sinnesepithel..

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Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Echtzeit-Bildgebung des embryonalen Säugetier Cochlea ist eine Herausforderung, weil die Entwicklungsprozesse bei der Hand arbeiten auf einem zeitlichen Gradienten über zehn Tage. Hier präsentieren wir eine Methode zur Kultivierung und dann Abbilden embryonalen Cochlea Explantatgewebe von einem fluoreszierenden Reporter Maus über fünf Tage.

Langfristige Zeitraffer-Imaging von Maus Cochlear Explantate

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

long-term-time-lapse-imaging-of-mouse-cochlear-explants

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.5K Aufrufe.  Sunnybrook Research Institute.  Echtzeit-Bildgebung des embryonalen Säugetier Cochlea ist eine Herausforderung, weil die Entwicklungsprozesse bei der Hand arbeiten auf einem zeitlichen Gradienten über zehn Tage. Hier präsentieren wir eine Methode zur Kultivierung und dann Abbilden embryonalen Cochlea Explantatgewebe von einem fluoreszierenden Reporter Maus über fünf Tage. 

Serie: Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Multiple-Maus Neuroanatomische Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Forschung

Neurowissenschaften

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

Eine polierte und verstärkte ausgedünnten Schädel Fenster für Langzeit-Imaging im Gehirn der Maus

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Zeitraffer-Imaging von Neuroblast Migration in Acute Scheiben von der adulten Maus Vorderhirnneuronen

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

Motor Nervendurchtrennung und Zeitraffer-Imaging von Gliazellen Verhalten im Live Zebrafisch

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

In-vivo-Elektroporation und Postnatale Zeitraffer-Imaging Neuroblast von Migration in Maus Akute Hirnschnitten

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Agarose Mikrokammern für Langzeit Calcium Imaging von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

Zeitraffer-konfokale Bildgebung der Migration von Neuronen in der organotypischen Scheibe Kultur der embryonalen Maus Gehirn mit<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The interstitial cells can be eliminated through two consecutive treatments with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, thus erasing the potential for renewal of the differentiated cells that are derived from the interstitial stem cells. This allows for the generation of Hydra that lack nerve cells. A nerve-free polyp cannot open its mouth to feed, egest, or regulate osmotic pressure. Such animals, however, can survive and be cultured indefinitely in the laboratory if regularly force-fed and burped. The lack of nerve cells allows for studies of the role of the nervous system in regulating animal behavior and regeneration. Previously published protocols for nerve-free Hydra maintenance involve outdated techniques such as mouth-pipetting with hand-pulled micropipette tips to feed and clean the Hydra. Here, an improved protocol for maintenance of nerve-free Hydra is introduced. Fine-tipped forceps are used to force open the mouth and insert freshly killed Artemia. Following force-feeding, the body cavity of the animal is flushed with fresh medium using a syringe and hypodermic needle to remove undigested material, referred to here as "burping". This new method of force-feeding and burping nerve-free Hydra through the use of forceps and syringes eliminates the need for mouth-pipetting using hand-pulled micropipette tips. It thus makes the process safer and significantly more time efficient. To ensure that the nerve cells in the hypostome have been eliminated, immunohistochemistry using anti-tyrosine-tubulin is conducted.

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Through a double treatment with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, nerve-free Hydra vulgaris can be generated. These Hydra cannot feed or egest on their own. This paper describes an improved method for long-term maintenance of nerve free Hydra vulgaris in the laboratory.

Erzeugung und Langzeitpflege von Nervenfreiheit<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning in mice. By permanently wearing a device fixed on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages. Therefore, this protocol readily enables the study of the visual system and multisensory interactions over an extended timeframe that would not be accessible otherwise. In addition to lowering the experimental costs of long-term sensory learning in naturally behaving mice, this approach accommodates the combination of in vivo and in vitro experiments. In the reported example, video-oculography is performed to quantify the vestibulo-ocular reflex (VOR) and optokinetic reflex (OKR) before and after learning. Mice exposed to this long-term sensory conflict between visual and vestibular inputs presented a strong VOR gain decrease but exhibited few OKR changes. Detailed steps of device assembly, animal care, and reflex measurements are hereby reported.

The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning. By permanently wearing a fixed device on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages.

Langfristige sensorischen Konflikt in Mäusen frei Verhalten

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Bewertung der Langzeit-Depressionsinduktion bei erwachsenen Cerebellarscheiben

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...