¡Gracias a Willy Sun para la asistencia técnica y el Dr. Kris Gellynck por sus valiosos comentarios y tres revisores anónimos por sus consejos constructivos. Este trabajo fue financiado por la Iniciativa de Regeneración Audiencia Sunnybrook

Tejido de ratón fue cosechada de Sox2 EGFP -reporter ratones 12 mantenidos y sacrificados de acuerdo con el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio. 1. El cultivo embrionario cochleae <ol><li> Suplemento Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) mediante la mezcla de 8,89 ml de DMEM, 1 ml de suero bovino fetal (FBS), 100 l de 100x suplemento N2, y 10 l de 10 mg / ml de ciprofloxacina. Suplemento solución salina equilibrada de Hank (HBSS) mediante la mezcla de 495 ml de HBSS con 5 ml de HEPES 100%. </li><li> Preparar vidrio placas de cultivo de fondo: <ol><li> En una campana de flujo laminar, resuspender 200 l sótano sustrato extracto de membrana en 5 ml de DMEM. Preparar 35 mm de vidrio de diámetro inferior con placas de cultivo de 10 pozos mm. Pipetear 150 l de sustrato / DMEM en el centro de cada plato de fondo de cristal. Estos platos se pueden utilizar después de 40 min de incubación, o pueden almacenarse en un CO 2 </sub&gt; Incubadora a 35 ° C durante al menos una semana. NOTA: Vidrio de fondo platos se utilizan por las siguientes razones: para asegurarse de que la base del plato es transparente y adecuada para formación de imágenes, para crear un pozo en el centro del plato que permite a los explantes a establecerse en una zona de fácil situado y finalmente de modo que después de un experimento de la muestra se puede procesar para la inmunotinción y el análisis subsiguiente. </li></ol></li><li> Prepare la estación de trabajo y herramientas: <ol><li> Encienda el flujo laminar banco limpio, y rocíe con EtOH al 70% para crear un espacio de trabajo limpio. Remoje pinzas, cucharas y un negro 184 plato de elastómero de silicona (una mezcla de 184 elastómero de silicona (10 partes), agente (1 parte) y polvo de carbón vegetal (2,5 g) de curado) en EtOH al 70%. </li></ol></li><li> En la estación de trabajo limpia, embriones de cosecha para el experimento. Recoger los embriones de la gestación apropiado en hielo frío HBSS suplementado con 1% HEPES. <ol><li> Determinar un órgano externo o visible que demostraráactividad de reportero y examinar los embriones utilizando un microscopio estereoscópico fluorescente. Recoger los embriones que presentan actividad de reportero en el hielo frío HBSS suplementado con 1% de HEPES como éstos son objeto del experimento. </li></ol></li><li> Recoger los huesos temporales: <ol><li> Trabajando rápidamente, utilizando una fuente de luz fría y unas pinzas finas, recoger las cabezas de los cachorros. Tenga cuidado de clip en las vértebras cervicales y debajo de la mandíbula para evitar daños a los huesos temporales. </li><li> Abra cuidadosamente el cráneo. Retire el cerebro, recortar la parte delantera de la cabeza, y transferir el cráneo posterior a hielo fresco HBSS frío suplementado con 1% de HEPES en un plato limpio. Diseccionar cuidadosamente los huesos temporales con forma de maní, teniendo cuidado de mantener el sistema vestibular en el tacto. </li></ol></li><li> Diseccionar la cóclea: <ol><li> La transferencia de los huesos temporales a un plato recubierto de elastómero de silicona negro en el hielo frío HBSS suplementado con 1% de HEPES, el pin de la región vestibular del hueso. Inserte clavijas de insectos enun ángulo oblicuo con el fin de estabilizar el hueso temporal y crear espacio para los fórceps. Prender con alfileres es un paso crucial en el proceso como si se permite que el hueso temporal para moverse demasiado, es muy difícil de cosechar una cóclea intacta. </li><li> Retire con cuidado el cartílago que rodea la cóclea. Inserte una púa de las pinzas en el cartílago en el borde exterior de la base de la cóclea y el clip de un agujero en el cartílago. </li><li> Clip una solapa hacia arriba el lado, inserte el diente de las pinzas y separar suavemente el techo del conducto desde el cartílago. Clip horizontalmente a través de la parte superior y en diagonal, y levante con cuidado la sección delantera de la cápsula. Inserte una punta de las pinzas en entre el cartílago restante y el conducto y el clip suavemente de la última sección. La superficie apical de la cóclea está ahora expuesto. </li><li> Comenzando en la base, coger el área donde el techo del conducto coclear se encuentra con el epitelio y abra el conducto coclear. Tienes que despegar de la azotea, el recortecuando sea necesario, hasta que se elimina por completo. Se quita porciones de membrana izquierda en el lado medial del conducto. Limpiar el conducto de exceso de tejido mesenquimal y separar el conducto desde el sistema vestibular. </li></ol></li><li> Cultura de los explantes: <ol><li> Publicar un explante, luminal superficie hacia arriba, en el centro de una placa de cultivo de vidrio recubierta inferior sustrato, cuidadosamente extrayendo todo el líquido y dejar actuar durante dos minutos. Añadir 150 ml de DMEM complementado gota a gota para el explante, teniendo cuidado de no molestar a ella. Si el explante flotar libremente, vuelva a colocar con pinzas, pero tener cuidado de que el explante se deposita en el fondo del plato de manera que se puede unir al sustrato. </li><li> Coloque los platos de fondo de cristal en un profundo 12 cm placa de Petri de diámetro, con un pequeño plato de agua estéril para mantener la humedad. Ponga las culturas en las que un 35 ° C incubadora durante la noche para que el explante para adjuntar al sustrato y aplanar. </li></ol></li></ol> 2. Vivo ImagING <ol><li> Seleccionar muestras de explantes. Utilice un microscopio estereoscópico de fluorescencia para evaluar la condición de cada cóclea explantado. Sólo seleccione explantes donde el conducto está intacto y unido al cristal de la base al ápice. </li><li> Ajuste la incubadora a 35 ° C con 5% de CO 2 al tejido coclear cultura. Ponga las culturas en el microscopio incubadora: <ol><li> Aspirar suavemente la DMEM suplementado y reemplazar con al menos 500 l de medio nuevo. Para obtener imágenes de hasta 6 días, 1-1,5 ml es mejor. En los casos en los explantes están vagamente conectados, una pipeta un anillo de los medios de comunicación alrededor del borde del plato. Este líquido adicional hará una &#39;cámara de humidificado&#39; miniatura sin perturbar el explante mientras se sigue concediendo a la matriz. <ol><li> Como alternativa, el uso de bisagras plato cubre para abrir los párpados, mientras que el plato se mantiene en su adaptación en el microscopio si los reactivos deben ser intercambiados durante los intervalos entre las colecciones de imágenes. Tapas de platos de bisagras permiten que las tapas seanabierto sin molestar a las muestras o la eliminación de los platos de su configuración. Esto mantiene su posición exacta para capturas de imágenes posteriores. </li></ol></li><li> Inserte los platos de cristal inferior que contienen muestras adecuadas en el soporte de plato de muestra. El microscopio en este ejemplo tiene una plataforma giratoria que tiene ocho platos de 35 mm de la muestra. </li><li> En virtud de la campana de flujo laminar reemplazar las tapas de plástico con tapas de vidrio e insertar los platos en el soporte de plato de muestra. Coloque el soporte de platos de la muestra dentro de la incubadora teniendo cuidado de no desalojar los explantes de la parte inferior del plato o molestar a los medios de comunicación. </li></ol></li><li> Establecer la rutina de imagen: <ol><li> Encienda el microscopio, lámpara UV y la cámara y abra el software de imágenes. </li><li> Busque las muestras, escoger un área de imagen, el plano de enfoque y ajustar los tiempos de exposición para cada plato en secuencia. Elija el plano de enfoque dependiendo no sólo de la vista del explante en el momento de partida, pero alpor lo que teniendo en cuenta cómo el tejido se moverá y el tiempo que el curso del tiempo se ejecutará. </li><li> Establecer una pila Z centrado alrededor del plano focal seleccionada en el canal de fluorescencia. Ajuste la frecuencia y la duración de la toma de muestras para el experimento. La frecuencia de muestreo será limitado por el tiempo que se necesita para recoger imágenes, por lo que esta debe determinarse después de seleccionar campos de visión y el establecimiento de una pila Z. En este caso, el muestreo se lleva a cabo cada 30 minutos durante cinco días. La duración del experimento puede ser de hasta 14 días. </li></ol></li><li> Generar una película: <ol><li> Al final del período de tiempo transcurrido abrir los archivos de imagen. En este caso el software Metamorph que se abre puntos de recogida secuenciales se utiliza. Cuadro por cuadro elegir el mejor plano focal para mostrar la población celular de interés. </li><li> Convertir estas imágenes en un archivo .avi o exportarlos como un montaje para generar un conjunto de imágenes que se pueden abrir y analizados en el software de procesamiento de imágenes o convertir en múltiple-formats utilizando el software de procesamiento de vídeo. </li></ol></li></ol>

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	<li>Wu, D. K., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+inner+ear+development.">Molecular mechanisms of inner ear development.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 4, (2012).</li><li>Shim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+auditory+sensory+epithelium:+the+instrument+of+sound+perception.">The auditory sensory epithelium: the instrument of sound perception.</a> The international journal of biochemistry &amp; cell biology. 38, 1827-1833 (2006).</li><li>Van de Water, T., Ruben, R. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gata3+is+a+critical+regulator+of+cochlear+wiring.">Gata3 is a critical regulator of cochlear wiring.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3679-3691 (2013).</li><li>Wibowo, I., Pinto-Teixeira, F., Satou, C., Higashijima, S., Lopez-Schier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Notch+signaling+sustains+epithelial+mirror+symmetry.">Compartmentalized Notch signaling sustains epithelial mirror symmetry.</a> Development. 138, 1143-1152 (2011).</li><li>Hashimoto, S., Kato, N., Saeki, K., Morimoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+high-potential+embryos+by+culture+in+poly(dimethylsiloxane)+microwells+and+time-lapse+imaging.">Selection of high-potential embryos by culture in poly(dimethylsiloxane) microwells and time-lapse imaging.</a> Fertility and sterility. 97, 332-337 (2012).</li><li>Matsuoka, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology-based+prediction+of+osteogenic+differentiation+potential+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Morphology-based prediction of osteogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cells.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Ma, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Transforming+growth+factor-beta1+and+-beta2+in+gastric+precancer+and+cancer+and+roles+in+tumor-cell+interactions+with+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+vitro.">et al.Transforming growth factor-beta1 and -beta2 in gastric precancer and cancer and roles in tumor-cell interactions with peripheral blood mononuclear cells in vitro.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Taranova, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+is+a+dose-dependent+regulator+of+retinal+neural+progenitor+competence.">SOX2 is a dose-dependent regulator of retinal neural progenitor competence.</a> Genes &amp; development. 20, 1187-1202 (2006).</li><li>Chen, P., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p27(Kip1)+links+cell+proliferation+to+morphogenesis+in+the+developing+organ+of+Corti.">p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti.</a> Development. , 1581-1590 (1999).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hay varios puntos técnicos a tener en cuenta cuando se establecen las culturas y en la creación del microscopio de lapso de tiempo para que la imagen a largo plazo. Utilizamos matriz de membrana basal como sustrato para el cultivo de explantes cocleares, pero el sustrato debe corresponder al tipo de células. Por ejemplo, para cultivos neuronales de la imagen, puede ser mejor para proporcionar un revestimiento fibronectina. La temperatura de incubación y la composición de gas también deben ser elegidos según el tipo de tejido. La elección de la edad del explante es importante. Comenzamos en E13 en la primera porque en E12 la dirección del crecimiento es menos predecible. Como es esencial que los explantes se cultivan durante la noche para unir al sustrato, los experimentos deben ser planificadas para comenzar el día siguiente. Si un experimento es comenzar a E15 o más viejos, los cultivos deben establecerse sobre E13 como el tiempo, el tejido se aplana y se extiende de modo que las células son más fáciles de imagen (véase la Figura 3). </p&gt; Si el órgano de Corti es en ser fotografiado, es esencial que la cóclea se diseca cuidadosamente. Nicks en el borde lateral del explante romper la tensión interna del tejido, por lo tanto, cuando la cóclea sufre reordenamientos morfológicas, derrame &#39;&#39; las células a través de la formación de una &#39;v&#39; protrusion.This protuberancia en forma de lágrima puede mover la región de interés fuera de la vista . Además, se debe tener cuidado para eliminar la mayor cantidad de la cubierta del conducto en el lado medial como sea posible. Este tejido continúa proliferando como el explante se expande y puede crecer sobre la parte superior de la región de interés ocultando de la vista. Al configurar la rutina de imágenes, el crecimiento y los cambios en la morfología de la cóclea se deben considerar cuidadosamente. El objetivo debe ser elegido sobre la base no sólo del tamaño de la región para obtener imágenes, sino también teniendo en cuenta si esa región se moverá o ampliar. Las células en la región medialde la cóclea (Figura 1 y 2) se dividen y se mueven dentro de un área confinada, por lo que una gran ampliación puede ser utilizado (20X, 40X, 60X). Las células en el órgano de Corti o el epitelio lateral, sin embargo, se moverán como el explante crece; un aumento menor (10X o 20X) es mejor, ya que las posibilidades de que las células permanecerá en el campo de visión son más altos. Obtención de imágenes de regiones fijas de la cóclea es posible a altas magnificaciones. Elegimos utilizar un objetivo de 10X en la sección de resultados representativos porque hemos querido mostrar todo el explante, y debido a que el movimiento de los tejidos es dinámica en las primeras etapas. Siguiente a considerar es el plano de enfoque. Dado que el explante crecerá hacia el exterior y aplanar, es probable que el plano focal va a cambiar dramáticamente en el transcurso del tiempo. Si la región de interés es el órgano de Corti o epitelio lateral, anticipando esto y centrarse en las células que migran fuera del explante puede ayudar. Esto es alpor lo que un argumento para el uso de los objetivos de aumento más bajo. Es posible establecer pilas Z, tanto para fluorescencia y DIC. Si las células de interés son probable que se mueva fuera de foco, la creación de una pila Z de 3-5 micras por paso puede contrarrestar esto, especialmente si el último paso es en el plano de la cubierta de vidrio. Puede ser difícil elegir el plano correcto durante la visualización de las culturas en el día uno, como la densidad de empaquetamiento de las células y la luz del tejido circundante puede prevenir una visión clara reflejada. Al revisar los marcos para generar una película o montaje más tarde, la selección cuidadosa de Z-planos también permite el seguimiento de los movimientos de las células en tres dimensiones. El experimento se puede detener en cualquier momento para ajustar los ajustes de enfoque si la muestra se mueve fuera de rango. Imágenes en vivo de un explante coclear más de una semana añade una nueva dimensión a la comprensión del desarrollo de la cóclea que complementará imágenes en vivo confocal. Este es un método excelente para usar cuando el órgano de ancho de largo-término examen es necesario, pero no sustituirá a alta magnificación de imagen confocal para estudios de células solo a corto plazo. Elección de la técnica depende del tipo de tejido a la imagen y el contexto del experimento. Esta técnica permitirá a los investigadores para examinar los cambios espacio-temporales en la expresión del gen indicador, la proliferación celular y la migración en tiempo real y permiten el estudio de la respuesta del gen reportero a los agentes farmacéuticos y viabilidad de las células con más detalle que antes era posible.

La cóclea de los mamíferos es un órgano complejo altamente ordenada. En el ratón, entre la aparición del oído interno primitiva de la vesícula ótica en el día E11 y la finalización del programa de desarrollo en las etapas postnatales tempranas, múltiples oleadas de la señalización celular y los cambios coordinados en la expresión génica se llevan a cabo. Que va desde la base al ápice del conducto coclear es el sonido detectar epitelio sensorial, o el órgano de Corti. Desarrollo del órgano de Corti está exquisitamente controlada de tal manera que al final del desarrollo, que consistirá en una sola fila de células ciliadas internas, tres filas de células ciliadas externas intercalados con cinco filas de células de apoyo (dos filas de células pilar, tres hileras de células Deiters &#39;) 1. La desviación de esta precisos resultados de orden en la pérdida de audición, heighlighting la importancia de studye deEl génesis y el patrón de la epithemlium sensorial 2. En el cultivo in vitro de la coch ratón embrionariolea es una herramienta esencial en el estudio de los mecanismos de desarrollo del órgano de Corti. Esta técnica fue establecida en 1974 y en los últimos 40 años, ha sido utilizado para dilucidar muchos de los mecanismos por los que se especifica el epitelio sensorial y el órgano de Corti estableció 3. La cóclea es un órgano complejo con los procesos de desarrollo dinámicos; una manipulación puede llegar a tardar hasta siete días para manifestar 1. Por ejemplo, cuando la adición de inhibidores de GSK 3β a un cultivo de explantes cocleares en E13, el período de incubación óptimo para observar un efecto robusta del compuesto es de seis días 4. Imágenes en vivo de la cóclea permite el desarrollo de investigación sobre los cambios en la morfología del órgano de Corti, los cambios en la expresión génica, el seguimiento de la migración, proliferación o células que mueren, y que permite la observación en tiempo real de los resultados de los agentes farmacéuticos y la alteración de la señalización vías. Hasta ahora, la imagen en directo de la cócleaprincipalmente se ha realizado utilizando microscopía confocal para pequeñas áreas de imagen del órgano de Corti en períodos de tiempo cortos 5-8, pero esta técnica tiene limitaciones debido a la viabilidad de explante. En las imágenes de los efectos de las manipulaciones a largo plazo sobre los procesos de desarrollo lento, el entorno de imagen es crucial. Normalmente, un sistema de imagen confocal en vivo utiliza una caja de plástico humidificado que se sienta en el microscopio. El calor y la humedad pueden escapar a través de los huecos en el cuadro de la incubación de donde se encuentra con la mesa del microscopio, a través de las ventanas de acceso, a través de las aberturas de bisagra y a través de los huecos alrededor de varias partes de la Microscopio- tales como el objetivo o la fuente de luz. Este no es óptimo para el mantenimiento de explantes sanos durante más de dos o tres días. Definimos &#39;microscopio incubadora&#39; como un microscopio invertido sellado dentro de un incubador de CO2 estándar, en lugar de una incubadora construida alrededor del microscopio. Un microscopio incubadora extiende la vida del experimento de tal manera que en lugar de formación de imágenes de más de dos o tres días, las muestras se pueden obtener imágenes de hasta dos semanas. Un microscopio incubadora ofrece un excelente ambiente para el crecimiento y la diferenciación celular, con el menor trastorno posible a explante culturas y condiciones estándar controlado. En los estudios que se llevan a cabo a través de múltiples día es común que recurrir a muestras de formación de imágenes sobre una base diaria por la eliminación de ellos de la incubadora y llevándolos a un microscopio de fluorescencia invertido. Si bien este enfoque puede funcionar, la eliminación de los platos de la incubadora inflige presión sobre el tejido en desarrollo sensible. Los cambios en la acidez del medio de cultivo y las fluctuaciones en la temperatura debido a la eliminación de la incubadora pueden resultar en el desarrollo subóptima y tejido enfermo. Imágenes de la misma región en el mismo plano focal y en la misma orientación en cada punto de tiempo es extremadamente difícil. Mediante el uso de un sistema automatizado dentro de una incubadora, es posible mantener saludabletejido, para recoger imágenes en más puntos de tiempo y para garantizar que la misma área es capturada en cada fotograma. En los últimos años se han desarrollado varias incubadoras de tejido microscopio integrados, estos han sido útiles no sólo en la práctica clínica 9, sino también en células madre y la investigación del cáncer 10,11. Aquí se presenta un protocolo para obtener imágenes en vivo a largo plazo de explantes cocleares embrionarias de ratón. Utilizamos un sistema de microscopía automatizada dentro de un incubador de CO2 estándar que tiene la capacidad de capturar imágenes de múltiples muestras en los puntos de tiempo establecidos. El sistema consta de un microscopio invertido conjunto dentro de una incubadora. Las muestras se colocan en una tarima giratoria que permite obtener imágenes de múltiples muestras en cada punto de tiempo. La iluminación, la captura de imágenes, y la rotación de la tarima están controlados por un sistema automatizado operado a través de software Metamorph. Al establecer una rutina de imágenes utilizando el software de funcionamiento podemos establecer un experimento para funcionar durante un máximo de two semanas, con mínima intervención humana. En este ejemplo usamos tanto de campo claro y fluorescencia para mostrar el crecimiento a gran escala y la reordenación de la cóclea, y en concreto, la región prosensorial. En este experimento, cochleae será disecado de ratones reportero EGFP Sox2 en el día embrionario E13. Se establecerá cultivos in vitro y luego fotografiada durante cinco días.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12430</td>
			<td>Multiple brands manufacture this</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/classical-media/dmem.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement membrane extract&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Matrigel. Alternative similar products are available from other suppliers. 
			http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellular+Matrix+Proteins+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&#38;resultPage=1&#38;results PerPage=15&#38;autocomplete=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>5630080</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&#38;resultPage=1&#38;results PerPage=15&#38;autocomplete=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x N2 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&#38;resultPage=1&#38;results PerPage=15&#38;autocomplete=</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ciprofloxacin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>17850-5G-F</td>
			<td>Multiple brands manufacture this 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en&#38;region=CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balanced salt solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170161</td>
			<td>Multiple brands manufacture this. Should be refidgerated before use. 
			http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&#38;ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>Size number 5 
			http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&#38;CategoryId=29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curette&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10080-05</td>
			<td>size 1 mm&#160; 
			http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&#38;CategoryId=118</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect Pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26001-35</td>
			<td>Must be stainless Steel 
			http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mm plastic dishes</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>351006</td>
			<td>Multiple brands manufacture this</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>charcoal</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>05105-250G</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en&#38;region=CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>184 silicone elastomer</td>
			<td>Dow/Corning&#160;</td>
			<td>SYLGARD&#174; 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td>
			<td>Dishes are home made several weeks in advance.&#160; Silicone elastomer can be from any supplier.<a href="http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291">http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>The dimensions of the dish are determined by the specifications of the imaging system.&#160; 35 mm diameter, 10mm well, number 0 coverslip fits Olympus Vivaview FL. 
			http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&#38;cPath= 1_4_15&#38;products_id=2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss&#160;</td>
			<td>495101-9804-000</td>
			<td>&#160;Stemi 2000 model. multiple brands manufacture similar items 
			http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Light Source</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>000000-1063-182</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Stereomicroscope&#160;</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>Contact Leica microsystems</td>
			<td>Leica M165-FC. Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator Microscope +imaging software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Contact Olympus</td>
			<td>Inverted microcope sealed inside a Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscope with proprietry Metamorpoh imaging software. 
			http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&#38;c=0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean bench</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51029701</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3310</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026651</td>
			<td>Multiple brands manufacture similar items 
			http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants

Aquí presentamos un método para obtener imágenes de lapso de tiempo a largo plazo de los explantes cocleares de ratón embrionarias en vivo. El programa de desarrollo responsable de la construcción de la muy ordenada, compleja estructura de los ingresos cóclea de mamíferos durante unos diez días. Con el fin de estudiar los cambios en la expresión génica durante este período y su respuesta a farmacéutico o la manipulación genética, de formación de imágenes a largo plazo es necesario. Anteriormente, imágenes en vivo ha sido típicamente limitada por la viabilidad del tejido explantado en una cámara humidificada encima de un microscopio estándar. Dificultad en el mantenimiento de las condiciones óptimas para el crecimiento del cultivo con respecto a la humedad y la temperatura ha puesto límites en la longitud de los experimentos de imagen. Un microscopio integrado en una incubadora de cultivo de tejidos modificados ofrece un excelente ambiente para la formación de imágenes a largo plazo en directo. En este método se demuestra cómo establecer ratón embrionario explantes cocleares y cómo utilizar un microscopio incubadora para realizar Imagi lapso de tiempong utilizando tanto de campo brillante y microscopía fluorescente para examinar el comportamiento de un día típico embrionario (E) 13 explante coclear y Sox2, un marcador de las células prosensoriales de la cóclea, durante 5 días.

Aquí mostramos un montaje (Figura 1) y una película (Figura 2) que demuestra cómo una típica explante coclear organotípico crecerá si chapado en E13.5. Un reportero del ratón Sox2 se utiliza para visualizar la región prosensorial. La película ilustra que la cóclea se somete a crecimiento y la convergencia y la extensión, las células en la región lateral del dominio Sox2 verde no parecen dividir como el tejido circundante se expande. Esta es una característica del órgano de Corti; E13 en el epitelio sensorial prospectivo sale del ciclo celular y posteriormente se conoce como la zona de la no proliferación 13. Un segundo experimento de lapso de tiempo centrado en la base de un explante mediados coclear diferente (Figuras 3 y 4) demuestra que la medida que se extiende, la región prosensorial se estrecha. Tenga en cuenta que después de tres días en cultivo del tejido se ha aplanado considerablemente de tal manera que es posible visualizar indivicélulas fluorescentes duales, mientras que al principio hay regiones donde la reflexión interna de la luz debido al espesor del tejido hacen posible identificar regiones de expresión, pero no las células individuales. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52101/52101fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1:. Tiempo - imágenes de lapso de tejido coclear reportero Sox2 recogido más de cinco días Este montaje muestra el progreso del crecimiento del explante de partida en el día cero y terminando en el quinto día, el muestreo cada 30 minutos utilizando un objetivo de 10X. El explante se estableció el E13 y se cultivaron durante la noche antes de la imagen. A medida que el explante madura que tanto crece y se somete a los movimientos de extensión convergentes. (A) imágenes secuenciales que muestran el grado de crecimiento coclear a intervalos de 12 h. Canal de luz visible cubrió de gen GFP fluorescenciacalificado por el reportero EGFP Sox2. canal de fluorescencia (B) sólo GFP. La barra de escala corresponde a 200 micras. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52101/52101fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52101/Figure2.f4v" target="_blank">Figura 2</a> :. animación de lapso de tiempo de tejido coclear reportero Sox2 recogido más de 5 días Este es el mismo experimento explante indica en la Figura 1, esta vez los marcos se seleccionan a intervalos de 30 min durante 5 días y se combinaron como un archivo .avi para generar una película. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52101/52101fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3:. Mediados de someterse a base de movimientos de CE y aplanamiento SequentiAL imágenes que muestran que el epitelio prosensorial de la base de MID (EGFP) se estrecha, se extiende y se aplana en el transcurso de 5 días. Las flechas indican región que se estrecha. Marcos seleccionados a partir de una secuencia de lapso de tiempo de 5 días en intervalos de 12 h utilizando un objetivo de 10X. La barra de escala corresponde a 200 micras. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52101/52101fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52101/Figure4.f4v" target="_blank">Figura 4</a> : animación Time-lapse de la base de mediados de someterse a los movimientos de la CE y el aplanamiento secuencia de lapso de tiempo de animación que muestra la convergencia y la extensión del epitelio sensorial se muestra en la Figura 3 con cuadros seleccionados en intervalos de 30 min..

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Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Imágenes en vivo de la cóclea de mamíferos embrionario es un reto porque los procesos de desarrollo en la mano operan en un gradiente temporal de más de diez días. Aquí presentamos un método para cultivar y luego la formación de imágenes de embriones tejido explante coclear tomado de un ratón reportero fluorescente en cinco días.

A largo plazo Lapso de tiempo de imágenes de Ratón cocleares explantes

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

long-term-time-lapse-imaging-of-mouse-cochlear-explants

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.5K vistas.  Sunnybrook Research Institute.  Imágenes en vivo de la cóclea de mamíferos embrionario es un reto porque los procesos de desarrollo en la mano operan en un gradiente temporal de más de diez días. Aquí presentamos un método para cultivar y luego la formación de imágenes de embriones tejido explante coclear tomado de un ratón reportero fluorescente en cinco días. 

Video: Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Múltiples imágenes del ratón neuroanatómicos de Resonancia Magnética

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Investigación

Neurociencias

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

Un pulido y reforzado Diluido cráneo-Ventana para a largo plazo de imágenes del cerebro de ratón

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Time-lapse de imágenes de Migración neuroblasto en rodajas agudas del cerebro anterior ratón adulto

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

Motor transección del nervio y Time-lapse de imágenes de Conductas de células gliales en el pez cebra en vivo

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

In vivo Postnatal electroporación y time-lapse de Neuroblast Migración en rodajas de cerebro de ratón aguda

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microcámaras de agarosa para Imagen de calcio a largo plazo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

Time-lapse Imágenes confocales de las neuronas migratorias en la cultura organotípica en rebanadas de cerebro de ratón embrionario<em&gt; En Utero</em&gt; Electroporación

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The interstitial cells can be eliminated through two consecutive treatments with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, thus erasing the potential for renewal of the differentiated cells that are derived from the interstitial stem cells. This allows for the generation of Hydra that lack nerve cells. A nerve-free polyp cannot open its mouth to feed, egest, or regulate osmotic pressure. Such animals, however, can survive and be cultured indefinitely in the laboratory if regularly force-fed and burped. The lack of nerve cells allows for studies of the role of the nervous system in regulating animal behavior and regeneration. Previously published protocols for nerve-free Hydra maintenance involve outdated techniques such as mouth-pipetting with hand-pulled micropipette tips to feed and clean the Hydra. Here, an improved protocol for maintenance of nerve-free Hydra is introduced. Fine-tipped forceps are used to force open the mouth and insert freshly killed Artemia. Following force-feeding, the body cavity of the animal is flushed with fresh medium using a syringe and hypodermic needle to remove undigested material, referred to here as "burping". This new method of force-feeding and burping nerve-free Hydra through the use of forceps and syringes eliminates the need for mouth-pipetting using hand-pulled micropipette tips. It thus makes the process safer and significantly more time efficient. To ensure that the nerve cells in the hypostome have been eliminated, immunohistochemistry using anti-tyrosine-tubulin is conducted.

Generation and Long-term Maintenance of Nerve-free Hydra

Through a double treatment with colchicine, a plant-derived toxin that kills dividing cells, nerve-free Hydra vulgaris can be generated. These Hydra cannot feed or egest on their own. This paper describes an improved method for long-term maintenance of nerve free Hydra vulgaris in the laboratory.

Generación y Mantenimiento a Largo Plazo de Nervios<em&gt; Hydra</em

The interstitial cell lineage of Hydra includes multipotent stem cells, and their derivatives: gland cells, nematocytes, germ cells, and nerve cells. The ...

Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning in mice. By permanently wearing a device fixed on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages. Therefore, this protocol readily enables the study of the visual system and multisensory interactions over an extended timeframe that would not be accessible otherwise. In addition to lowering the experimental costs of long-term sensory learning in naturally behaving mice, this approach accommodates the combination of in vivo and in vitro experiments. In the reported example, video-oculography is performed to quantify the vestibulo-ocular reflex (VOR) and optokinetic reflex (OKR) before and after learning. Mice exposed to this long-term sensory conflict between visual and vestibular inputs presented a strong VOR gain decrease but exhibited few OKR changes. Detailed steps of device assembly, animal care, and reflex measurements are hereby reported.

The presented protocol produces a persistent sensory conflict for experiments aimed at studying long-term learning. By permanently wearing a fixed device on their heads, mice are continuously exposed to a sensory mismatch between visual and vestibular inputs while freely moving in home cages.

A largo plazo conflicto sensorial en comportarse libremente ratones

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from parallel fibers (PF) to Purkinje cells (PC) is considered the basis for motor learning, and deficiencies of both LTD and motor learning are observed in various gene-manipulated animals. Common motor learning sets, such as adaptation of the optokinetic reflex (OKR), the vestibular-ocular reflex (VOR), and rotarod test were used for evaluation of motor learning ability. However, results obtained from the GluA2-carboxy terminus modified knock-in mice demonstrated normal adaptation of the VOR and the OKR, despite lacking PF-LTD. In that report, induction of LTD was only attempted using one type of stimulation protocol at room temperature. Thus, conditions to induce cerebellar LTD were explored in the same knock-in mutants using various protocols at near physiological temperature. Finally, we found stimulation protocols, by which LTD could be induced in these gene-manipulated mice. In this study, a set of protocols are proposed to evaluate LTD-induction, which will more accurately allow examination of the causal relationship between LTD and motor learning. In conclusion, experimental conditions are crucial when evaluating LTD in gene-manipulated mice.

In some gene-manipulated animals, using a single protocol may fail to induce LTD in cerebellar Purkinje cells, and there may be a discrepancy between LTD and motor learning. Multiple protocols are necessary to assess LTD-induction in gene-manipulated animals. Standard protocols are shown.

Evaluación de la inducción a largo plazo de la depresión en rodajas de cerebelosores adultos

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...