רוב העבודה וכוח האדם המעורב נתמכו על ידי NIH מענק NS060677 ובחלקו על ידי מענקי NIH MH099559 וMH104069 (לBSK). חלק מהעבודה נתמכת גם על ידי קרן CHDI.

כל הפרוטוקולים של בעלי החיים היו בהתאם למכוני בריאות הלאומי של ארה&quot;ב מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים והשימוש ב- UCLA. 1.1) הכן טוען Micropipette וAAV2 / 5 וירוס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש micropipettes זכוכית בורוסיליקט קנס על הזריקה של הנגיף. משוך את micropipette באמצעות תכנית מושכת בשני שלבים עם חולץ אנכי. פוע פיפטה בזווית של 40 מעלות על ידי שימוש במטחנת פיפטה. פיפטה כי הוא אידיאלי לשימוש תהיה בקוטר טיפ של 20 - 40 מיקרומטר ואורך שוק של 6 - 7 מ&quot;מ. החיטוי פיפטה ומכשירי ניתוח. התרגיל מעוקר על ידי מנגב עם 70% אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הווירוס AAV2 / 5-GfaABC 1 D.cyto-GCaMP3.SV40 (1.5 x 10 13 GC / ml), ב -80 מעלות צלזיוס ב 10 aliquots μl. רק לפני הניתוח, להוציא את aliquots מהמקפיא ולאחסן על קרח עד משמש למילוי הmicropipette דואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את micropipette עם וירוס באמצעות משאבת מזרק. בחוזקה חבר קצה אחד של פיסת הצינור, דרך דחיסת צינורות בגודל מתאימה הולמת, למזרק זכוכית עם בוכנה מחוזקת. צרף micropipette autoclaved לקצה השני של פיסת הצינור דרך דחיסת מחט נשלף בגודל מתאים מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני טעינת וקטור ויראלי, להסיר בועות אוויר ממערכת השאיבה כולל צינורות, מזרק וmicropipette על ידי מילוי המערכת עם שמן מינרלים צבעוניים עם IV סודאן האדום (~ 1 מ&quot;ג / 50 מיליליטר) במזרק 1 מיליליטר עם מחט (27 G ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים חתיכה נקייה של parafilm תחת זכוכית micropipette, ולוותר על 5 - 10 μl של וקטור ויראלי על parafilm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למצוץ וקטור ויראלי על ידי הזזת הבוכנה של המזרק לאחור על 0.5 μl / דקה, ולסמן את הגבול בין הווקטור והשמן על פיפטה הזכוכית. </li></ol> 1.2) הרדמה, חיתוך שיער, HEAD קיבוע והכנה לCraniotomy <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים עכבר (P49-63, C57BL / 6) לתוך התא מלא בN 2 O ו- O 2, וisoflurane 5%. להעריך את עומק ההרדמה על ידי אובדן של תנועה תכליתית ושיעור האטת נשימה (~ 60-90 / min). לגזור את שיער על הראש כאשר העכבר הוא הרדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את העכבר במסגרת stereotaxic, עם הראש שלה מובטח בארים בוטים אוזן ואפה להציב לתוך מערכת הרדמה והנשמה. לשמור isoflurane הרציף של 2 - 3%. החל משחה דמעות מלאכותיות לשתי העיניים מאז עכברים לאבד רפלקס המצמוץ שלהם תחת הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נהל 0.05 מיליליטר של עצירות (0.1 מ&quot;ג / מיליליטר) על ידי הזרקה תת עורית להקלה על כאב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזור נקי כירורגית עם 10% יוד povidone ושלוש פעמים אלכוהול 70%, לסירוגין בין שני הפתרונות ומתחיל עם יוד povidone. התחל מהחזית ולנגב לכיוון האחורי כדי להסיר את כל שערות כבר חתכו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך בעור על o העליונהf הראש שמתחיל בין העיניים ומסתיים בין האוזניים. </li></ol> 1.3) Craniotomy וmicroinjections <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קרום העצם על ידי והעביר עם מקלון צמר גפן ולאחר מכן לייבש את פני השטח של הגולגולת עם כדורי צמר גפן שיניים. להטביע את חותמו סביב אתר ההזרקה, ולקדוח מסביב לקצה של הסימן באמצעות Burr פלדה קטן מופעל על ידי תרגיל במהירות גבוהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העצם ולנקות את השטח עם מי מלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את פיפטה לתוך הגב עזב לרוחב סטריאטום עם הקואורדינטות הבאות (מ&quot;מ): 0.8 קדמי, אחורי, המדיאלי-צדדיות: 2.0, גב-הגחון מהשטח pial: -2.4 13. שים לב שהקואורדינטות אלה אומרת שקצה מחט microinjection יושב בדיוק מעל סטריאטום דורסולטרלי (איור 1 א, ב &#39;), מה שאומר שרק מעט חודר בתוך גרעין זה. הימנע מכלי דם מזיקים. אם פיפטה קורה להיות ממש על כלי דם, מעט להתאיםקואורדינטות על ידי ~ 0.1-0.2 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל הזרקה עם שיעור הזרקה נקבע על 0.2 μl / דקה, ובדרך כלל להזריק 1 עד 1.5 μl של וירוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את פיפטה במקום לאחר ההזרקה במשך 10 דקות, ולאחר מכן למשוך את פיפטה לאט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיים על ידי סגירת פצע הניתוח עם תפר ניילון חיצוני תפר מתמשך. </li></ol> 1.4 שחזור) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את העכבר בכלוב נקי על כרית חימום למשך 24 שעות. אל תחזור עכבר שעבר ניתוח לחברתם של בעלי חיים אחרים, עד שהתאושש באופן מלא. אל תשאיר ללא השגחה העכבר עד שהוא שב להכרתו מספיק כדי לשמור על שכיבה sternal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף Trimethoprim Sulfamethoxiazole (5 מ&quot;ל לכל 500 מיליליטר מים, המכיל 40 trimethoprim מ&quot;ג ו -200 sulfamethoxiazole מ&quot;ג) במים במשך שבוע. לנהל עצירות שתי פעמים ביום לתקופה של עד 3 ימים לאחר ניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את העכבר על מחזור אור-חושך 12 שעות, האכיל והשקה יומי,nd משוקלל פעם אחת ביום עד לעד 3 ימים לאחר ניתוח. ב 3 הימים האלה, כל עכבר להפסד של יותר מ -10% במשקל גוף נחשב כסכנה, ויהיה מורדמים במקום להיות נתון לניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנפרד, לשנות את כלוב העכבר פעמיים בשבוע, ולפקח על בריאות כללית לפחות פעם ביום. בדרך כלל, העכבר משמש בתוך 2 - 3 שבועות לאחר microinjections stereotaxic. </li></ol> 2. חריף מוח Slice הכנת הדמיה 2 + Confocal Ca 2.1) עריכת חיתוך ופתרונות הקלטה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיתוך פתרון כולל (מ&quot;מ): 194 סוכרוז, 30 NaCl, KCl 4.5, 10 D-גלוקוז, 1 MgCl 2, 1.2 לאא 2 PO 4, ו -26 NaHCO 3, רווי עם 95% O 2, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון הקלטה הכולל (מ&quot;מ): 124 NaCl, KCl 4.5, 1 MgCl 2, 10 D-גלוקוז, 2 CaCl 2, 1.2 לאא 2 PO 4 </תת&gt;, ו -26 NaHCO 3; pH 7.3-7.4, 290-295 mOsm, רווי עם 95% O 2, 5% CO 2. כשמלא את כוס פרוסת המוח מחזיקה ביחד עם פתרון הקלטה, ולשמור אותו על 34 מעלות צלזיוס. </li></ol> 2.2) חיתוך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבועות עד שלושה שבועות לאחר microinjections stereotaxic, עמוק וסופנים להרדים את העכבר, ולאחר מכן לערוף אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את המוח, ולהשתמש בלהב כדי להסיר את האונה הימנית uninjected, והר נותר אחד על מגש vibratome באמצעות דבק סופר. מלא את מגש vibratome עם חיץ חיתוך קר כקרח, ולשמור להרוות אותו עם 95% O 2, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים פרוסות מוח striatal העטרה או sagittal ב 300 עובי מיקרומטר. בדרך כלל, 4 - העטרה 5, או 6 - 7 פרוסות striatal sagittal ניתן לאסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הפרוסות לכוס מחזיקה פרוסה חיממה על 34 מעלות צלזיוס, ולשמור אותם שם למשך 30 דקות לפני אחסונם בטמפרטורת חדר למשך recordi הבאng. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את פרוסות המוח במאגר הקלטה מחומצן בטמפרטורת חדר למשך לפחות 30 דקות לפני ההדמיה i [Ca 2 +]. </li></ol> 3. אימונוהיסטוכימיה (IHC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבועיים לאחר הזרקת וירוס, תנקב את העכבר transcardially עם PBS ואחריו פורמלין 10% ב- PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר, לאחר לתקן לילה, וcryoprotect המוח בסוכרוז 30% שנאגרו במשך לפחות 2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 40 מיקרומטר חלקים באמצעות microtome cryostat. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הסעיפים 3 פעמים עם PBS ב -10 מרווח דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה סעיפים עבור שעה 1 ב- PBS עם סרום עיזים 10% נורמלים ועם 0.5% Triton X-100. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה סעיפי הלילה ב 4 ° C בנוגדן ראשוני שהוכן ב- PBS עם 0.5% Triton X-100. הנוגדנים העיקריים בשימוש היו כדלקמן: עוף אנטי GFP 1: 1,000, העכבר אנטי S100β 1: 400, עכבר אנטי NeuN 1: 600, synthetase אנטי-גלוטמין עכבר 1: 300. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את סעיפים 3 פעמים עם PBS על 10 מ &#39;במרווחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה סעיפים עם הנוגדנים משני שהוכנו ב- PBS עם 10% עזים בסרום נורמלי עבור שעה 2 בטמפרטורת חדר. הנוגדנים שני היו כדלקמן: עז אנטי עכבר Alexa546 1: 500, עז נגד עוף Alexa488 1: 500. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר את הסעיפים על שקופיות זכוכית, יבשות ולהחיל כמה טיפות של antifade הרכבה בינוני, ואז לכסות באיטיות את החלקים עם coverslip זכוכית. אחסן את השקופיות על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונות במיקרוסקופ confocal עם עדשת טבילת שמן 40X עם צמצם מספרי של 1.3. </li></ol> 4. Confocal הדמיה i [Ca 2 +] הערה: [Ca 2 +] i הדמיה נעשתה באמצעות מיקרוסקופ confocal עם עדשה אובייקטיבית 40X טבילה במים עם צמצם מספרי של 0.8. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בין 1 ל 5 שעות לאחר חיתוך, פרוסה מקום בחדר ההקלטה וSuperfuse עם חיץ הקלטה מחומצן בטמפרטורת חדר עם קצב זרימה של 1 - 2 מ&quot;ל לדקות. ואז למקם את נבל פלטינה עם מיתרי ניילון על גבי הפרוסה כדי למזער את התנועה במהלך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו ולאתר את סטריאטום הגב עם הארה שדה בהירה תחת מטרת טבילה במי 10X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור לעדשה האובייקטיבית 40X טבילה במים, ולהפעיל את קו 488 ננומטר של לייזר ארגון. על ידי שינוי מישור המוקד, למצוא תאים הממוקמים כ -20 מיקרומטר מתחת לפני השטח הפרוסה, בו מוצגות הקרינה בסיסית בסומה, סניפים וbranchlets. שימו לב, תאים שנפגעו בדרך כלל להציג רמת הקרינה מעל הממוצע, אשר יש להימנע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במצב &#39;סריקת מסגרת &quot;כדי להתחיל בסריקה. בדרך כלל, את עוצמת הלייזר המותאמת ל0.5-5% מהתפוקה המקסימלית די תמונה [Ca 2 +] i עם ציטומגלווירוס-GCaMP3. לניטור אני דינמיקה [Ca 2 +] בשטח של האסטרוציטים כל, &#39;סריקת המסגרת&#39; עם קצב סריקה של 1 שניות לכל מסגרת או מהיר יותר היא recommended, אבל זה צריך להיות החליט בהתאם לניסוי בשאלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת צורך, לתמונה [Ca 2 +] אני בתהליכים, להשתמש בהגדלה דיגיטלית של 2 - 3 פי לפקח 1 - 2 האסטרוציטים בכל שדה הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להימנע מפיקסלים רוויים במהלך הקלטה, להשתמש במצב בדיקת &#39;חילו&#39; לPseudocolor התאים. תמיד להתחיל עם &quot;הקלטת פיילוט&quot; למשך כ -5 דקות, כדי לבדוק אם צבע אדום מופיע כאינדיקציה לרוויה. אם כך, להפחית את תפוקת לייזר הכח, או להקטין את PMT / רווח / קיזוז ערכים ולבצע הקלטת טייס אחרת על מנת לבחון את ערכי פיקסל הם בטווח בלתי רווי. בדרך כלל, בשילוב הפרמטרים המשמשים לastrocyte הדמיה [Ca 2 +] i בסטריאטום היא כדלקמן: פלט כוח לייזר 0.5-5% (10 mW), PMT 550-650 וולט, רווח 2.0 - 3.5x, ולקזז 0 - 5%. </li></ol>

<ol>
	<li>Agulhon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+role+of+astrocyte+calcium+in+neurophysiology.">What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology.</a> Neuron. 59, 932-946 (2008).</li><li>Khakh, B. S., North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromodulation+by+extracellular+ATP+and+P2X+receptors+in+the+CNS.">Neuromodulation by extracellular ATP and P2X receptors in the CNS.</a> Neuron. 76, 51-69 (2012).</li><li>Gourine, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+control+breathing+through+pH-dependent+release+of+ATP.">Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP.</a> Science. 329, 571-575 (2010).</li><li>Florian, C., Vecsey, C. G., Halassa, M. M., Haydon, P. G., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte-derived+adenosine+and+A1+receptor+activity+contribute+to+sleep+loss-induced+deficits+in+hippocampal+synaptic+plasticity+and+memory+in+mice.">Astrocyte-derived adenosine and A1 receptor activity contribute to sleep loss-induced deficits in hippocampal synaptic plasticity and memory in mice.</a> J Neurosci. 31, 6956-6962 (2011).</li><li>Shigetomi, E., Jackson-Weaver, O., Huckstepp, R. T., O'Dell, T. J., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPA1+channels+are+regulators+of+astrocyte+basal+calcium+levels+and+long-term+potentiation+via+constitutive+D-serine+release.">TRPA1 channels are regulators of astrocyte basal calcium levels and long-term potentiation via constitutive D-serine release.</a> J Neurosci. 33, 10143-10153 (2013).</li><li>Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+and+astrocyte+calcium+microdomains.">Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains.</a> Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).</li><li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes.">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nat Neurosci. 13, 759-766 (2010).</li><li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses.">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J Gen Physiol. 141, 633-647 (2013).</li><li>Shigetomi, E., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+near+plasma+membrane+and+global+intracellular+calcium+dynamics+in+astrocytes.">Measuring near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics in astrocytes.</a> J Vis Exp. 26, (2009).</li><li>Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bulk+loading+of+calcium+indicator+dyes+to+study+astrocyte+physiology:+key+limitations+and+improvements+using+morphological+maps.">Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps.</a> J Neurosci. 31, 9353-9358 (2011).</li><li>Li, D. D., Agulhon, C., Schmidt, E., Oheim, M., Ropert, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+investigating+astrocyte-to-neuron+communication.">New tools for investigating astrocyte-to-neuron communication.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).</li><li>Davila, D., Thibault, K., Fiacco, T. A., Agulhon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+molecular+approaches+to+understanding+astrocyte+function+in+vivo.">Recent molecular approaches to understanding astrocyte function in vivo.</a> Front Cell Neurosci. 7, 272 (2013).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2012).</li><li>Perea, G., Yang, A., Boyden, E. S., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+astrocyte+activation+modulates+response+selectivity+of+visual+cortex+neurons+in+vivo.">Optogenetic astrocyte activation modulates response selectivity of visual cortex neurons in vivo.</a> Nat Commun. 5, 3262 (2014).</li><li>Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes:+biology+and+pathology.">Astrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119, 7-35 (2010).</li><li>Eid, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+glutamine+synthetase+in+the+human+epileptogenic+hippocampus:+possible+mechanism+for+raised+extracellular+glutamate+in+mesial+temporal+lobe+epilepsy.">Loss of glutamine synthetase in the human epileptogenic hippocampus: possible mechanism for raised extracellular glutamate in mesial temporal lobe epilepsy.</a> Lancet. 363, 28-37 (2004).</li><li>Eid, T., Williamson, A., Lee, T. S., Petroff, O. A., de Lanerolle, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+and+astrocytes--key+players+in+human+mesial+temporal+lobe+epilepsy.">Glutamate and astrocytes--key players in human mesial temporal lobe epilepsy.</a> Epilepsia. 49 Suppl 2, 42-52 (2008).</li><li>Tong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+Kir4.1+ion+channel+deficits+contribute+to+neuronal+dysfunction+in+Huntington's+disease+model+mice.">Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice.</a> Nat Neurosci. 17, 694-703 (2014).</li><li>Ortinski, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+induction+of+astrocytic+gliosis+generates+deficits+in+neuronal+inhibition.">Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition.</a> Nat Neurosci. 13, 584-591 (2010).</li><li>Zhang, Y., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+heterogeneity:+an+underappreciated+topic+in+neurobiology.">Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology.</a> Curr Opin Neurobiol. 20, 588-594 (2010).</li><li>Reimsnider, S., Manfredsson, F. P., Muzyczka, N., Mandel, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+transgene+expression+after+intrastriatal+pseudotyped+rAAV2/1,+rAAV2/2,+rAAV2/5,+and+rAAV2/8+transduction+in+the+rat.">Time course of transgene expression after intrastriatal pseudotyped rAAV2/1, rAAV2/2, rAAV2/5, and rAAV2/8 transduction in the rat.</a> Mol Ther. 15, 1504-1511 (2007).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

השיטות שתוארו במסמך זה אפשרו לנו להביע את ציטומגלווירוס-GCaMP3 בהאסטרוציטים striatal in vivo להדמיה הבאה [Ca 2 +] i באתר. לשיטה זו יתרונות על פני שימוש במהונדס או עכברים לדפוק ב, כוללים ביטוי חזק של החלבון, המהירות ממוקדת וגמישות של יישום ניסיוני וספציפיות אנטומיים. הביטוי של GCaMP3 באמצעות AAV2 / 5 נמצא להיות ספציפי וחזק. השילוב של אמרגן 1 D GFAP GfaABC עם AAV של סרוטיפ 5 הוא קריטי כדי להשיג את הספציפיות. מגבלה אחת של הטכניקה המתוארת כאן היא שזיהום בנגיף והליך ניתוח עלול לגרום לתגובתיות astrocyte, במיוחד עם וירוסים גבוה כייל 19. חשוב לציין, במחקר הנוכחי, AAV2 / 5 microinjections עם כייל נמוך יחסי לא גרם לירידה בGS שהיה קשור בתגובתיות astrocyte 19. בקרות דומות דווחו לhippהאסטרוציטים ocampal 8. עם זאת, חשוב להדגיש את הצורך בבקרות אלה עבור כל אזור במוח כדי להיחקר, לא מעט בגלל האסטרוציטים הם 20 הטרוגנית, וכי הם צפויים לבצע פעולות שונות באזורים שונים של המוח. אחד הגורמים החשובים שעשויים להשפיע על חוסנו של ביטוי גנים הממוקד באמצעות microinjection וירוס הוא הקואורדינטות בשימוש, אשר משתנה בין זנים שונים עכבר ושינויים לאורך ההתפתחות של בעלי החיים. רק C57BL / 6 עכברים של ~ 8 שבועות היו בשימוש לאורך מחקר זה. זה כבר הראה גם כי ביטוי הנגיפי של ה- GFP בתאי עצב ותאים הכוכביים striatal בחולדות ניתן היה לזהות לאחר הזרקה 4 ימים, הגיע לרמה של 2 - 4 שבועות לאחר הזרקה, ולאחר מכן נשאר יציב במשך 9 חודשי ההזרקה ההודעה 21. כמובן ביטוי ציטומגלווירוס-GCaMP3 הזמן עדיין לא נקבעו בדיוק כאן, אבל לפחות שבועיים לביטוי וירוסמומלץ. הגישה של שימוש AAV2 / 5 ביטוי בתיווך של GECIs בהאסטרוציטים striatal כעת ניתן להשתמש כדי להבין טוב יותר astrocyte [Ca 2 +] i איתות בסטריאטום. באופן ספציפי, רמת ביטוי ציטומגלווירוס-GCaMP3 היא גבוהה מספיק כדי לאפשר הדמיה של i אותות [Ca 2 +] באוכלוסיות קטנות של האסטרוציטים (~ 10 תאים) ובתוך כל השטחים של האסטרוציטים יחידים. הניתוח מפורט של i אותות [Ca 2 +] עדיין נמשך, אך עד כה [Ca 2 +] i אותות זוהו מתהליכי דיסטלי ככל ~ 50 מיקרומטר מסומה (איור 4). ניסויים מפורטים על astrocyte אני אותות [Ca 2 +] ופונקציות הגומלות וסבתם בתוך סטריאטום הם ריאלי. בעתיד, גישות מעודנות (כלומר, יזמים) יש צורך לספק GECIs לאוכלוסיות מוגדרות גנטי של האסטרוציטים, כך שאחד יכוללחקור איתות סידן בתוך אוכלוסיות מגוונות של האסטרוציטים 20.

האסטרוציטים הם תאי גליה נמצאים בכל מקום ובשפע של המוח. היא מבוססת היטב כי האסטרוציטים לשמש תמיכה חיונית ותפקידים ההומיאוסטטית כוללים חציצה של K + ריכוז במרחב החוץ תאי, ספיגה של מוליכים עצביים כמו גם חומרים מזינים מתן. עם זאת, המחקרים אחרונים מראים שהם גם להציג אני אותות [Ca 2 +], אשר מתרחשים באופן ספונטני ועלו בפעילות עצבית 1. קיומו של astrocyte [Ca 2 +] איתות אני כבר חשב יותר ויותר כדי לעורר את התקשורת שלהם עם תאי עצב, ולפיכך, היה להתפרש כסוג של &quot;רגישות Ca 2 +&quot; בתוך האסטרוציטים. הנתונים הזמינים בשני העשורים האחרונים מצביעים על שתי הגדרות שבי האסטרוציטים ונוירונים רשאיות להתקשר, אולי באופן דו-כיווני. ראשית, האסטרוציטים מגיבים לעתים קרובות בעלייה ב[ Ca 2 +] i כאשר מופעלת על ידי נוירוטרנסמיטורים וneuromodulators שוחררה מתא העצב 2. שנית, [Ca 2 +] אני עולה בתוך האסטרוציטים לגרום לשחרור של מולקולות איתות מהאסטרוציטים שבתורו יכול להשפיע נוירונים וכלי דם. ראיות עולה כי מולקולות שוחררו מהאסטרוציטים להביא לשינויים בפונקציות של סינפסות, מעגלים וסופו של דבר התנהגות 3-5 באמצעות איתות astrocyte לנוירון. עם זאת, זה עדיין תחום מחקר המתפתח במהירות, וזה כבר טען שיש צורך בהבנה טובה יותר ומפורטת של astrocyte [Ca 2 +] i כדי לפתור חלק מאי הוודאות הנוכחי 6. בעבודה האחרונה, זה היה הראה כי טעינה בתפזורת של צבעי מחוון אורגניים Ca 2 + לתוך האסטרוציטים לא מצליחה לזהות באופן אמין [Ca 2 +] i אותות בתוך האסטרוציטים כל בתרבות ובאתרו 7-10. ממצאים אלה נדונו על ידינו ואחרים 6,11,12. Emerginתמונת g היא ש[ Ca 2 +] i אותות בתוך תהליכי astrocyte (למשל, ענפים וbranchlets), המהווים את האתרים העיקריים לאינטראקציות עם תאי עצב וכלי דם, כמעט שלא נחקר בפירוט. לאחרונה, השימוש באינדיקטורים מקודד גנטי סידן (GECIs) כגון GCaMP3 cytosolic, GCaMP5G וGCaMP6 וקרום פלזמה גרסאות קשורות (למשל, LCK-GCaMP3) התיר למחקר שלי אותות [Ca 2 +] בתאים קטנים של האסטרוציטים כזה רזים כמו תהליכים, ליד קרום הפלזמה ובתוך טריטוריות שלמות 7,8. עם זאת, יש לי GECIs חסרון אחד על פני צבעי מחוון אורגניים Ca 2 + וזה הדרישה לשיטות גנטיות כדי לספק את הגנים מקודדות באופן סלקטיבי לתאים כוכביים in vivo לתקופות של שבועות לGECIs להיות כראוי הביע. ביטוי in vivo מושגת בדרך כלל באמצעות עכברים מהונדסים, לדפוק בעכברים או באפליקצית משלוח מבוסס וירוסמקקים. במאמר יופיטר הנוכחי אנו מדווחים שיטות ונהלים מועסקים כדי לספק GECIs להאסטרוציטים striatal באמצעות adeno הקשורים וירוסים. אנו מתמקדים בציטומגלווירוס-GCaMP3 כדוגמא, אבל באותו ההליך בסיסי עובד עבור כל Geci אחר או כתב חלבון פלואורסצנטי מבוסס.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td >Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>704506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass Capillaries</td>
			<td >World Precision Instruments</td>
			<td >1B100-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette puller</td>
			<td >Narishige</td>
			<td >PC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micropipette grinder</td>
			<td >Narishige</td>
			<td >EG-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3</td>
			<td >Addgene</td>
			<td>44331</td>
			<td >a plasmid sent to UPenn Vector Core for virus packaging</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >I mL syringe</td>
			<td >BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >syringe needle</td>
			<td >BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AAV2/5 virus</td>
			<td >UPenn vector core</td>
			<td >NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sudan red IV</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >67386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mineral oil</td>
			<td >CVS Pharmacy</td>
			<td>152355</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cryostat</td>
			<td >Leica</td>
			<td>CM3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stereotaxic instrument</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td >900LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >High Speed Rotary Micromotor Kit</td>
			<td >FOREDOM</td>
			<td >K.1070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde</td>
			<td >Santa cruz biotechnology</td>
			<td >sc-281692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Super Glue</td>
			<td>Krazy&#174;Glue</td>
			<td>KG925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microslicer</td>
			<td >Ted Pella</td>
			<td >DTK-Zero 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Confocal microscopes</td>
			<td >Olympus</td>
			<td >FV300 and FV1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Normal goat serum</td>
			<td >Vector</td>
			<td >S-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >chicken anti-GFP</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >ab13970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mouse anti-s100&#946;</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >S2532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mouse anti-NeuN</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >MAB377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >mouse anti-glutamine synthetase</td>
			<td >Millipore</td>
			<td >MAB302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >goat anti-mouse-Alexa546</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A11003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >goat anti-chicken-Alexa488</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td >A11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microscope Slides</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Cover Glass</td>
			<td >Fisher Scientific</td>
			<td >12-548-5J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mounting Medium</td>
			<td >Vector</td>
			<td >H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging intracellular ca2+ signals in striatal astrocytes from adult mice using genetically-encoded calcium indicators

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with enhanced [Ca2+]i signals. It has been proposed that astrocytes in turn regulate neurons and blood vessels through calcium-dependent mechanisms, such as the release of signaling molecules. However, [Ca2+]i imaging in entire astrocytes has only recently become feasible with genetically encoded calcium indicators (GECIs) such as the GCaMP series. The use of GECIs in astrocytes now provides opportunities to study astrocyte [Ca2+]i signals in detail within model microcircuits such as the striatum, which is the largest nucleus of the basal ganglia. In the present report, detailed surgical methods to express GECIs in astrocytes in vivo, and confocal imaging approaches to record [Ca2+]i signals in striatal astrocytes in situ, are described. We highlight precautions, necessary controls and tests to determine if GECI expression is selective for astrocytes and to evaluate signs of overt astrocyte reactivity. We also describe brain slice and imaging conditions in detail that permit reliable [Ca2+]i imaging in striatal astrocytes in situ. The use of these approaches revealed the entire territories of single striatal astrocytes and spontaneous [Ca2+]i signals within their somata, branches and branchlets. The further use and expansion of these approaches in the striatum will allow for the detailed study of astrocyte [Ca2+]i signals in the striatal microcircuitry.

לביטוי ספציפי astrocyte של ציטומגלווירוס-GCaMP3 בסטריאטום, היינו וירוס adeno הקשורים (AAV) של סרוטיפ 5, ואמרגן D 1 GFAP GfaABC (איור 1 א), שהוכח בעבר לנהוג GCaMP3 חזק וגן הכתב ביטוי בהיפוקמפוס והאסטרוציטים בקליפת המוח 8,14. שבועיים לאחר microinjection הווירוס לסטריאטום העכבר, העכבר (~ 10 שבועות) היה perfused וIHC בוצע על חלקים במוח דקים להעריך ביטוי ציטומגלווירוס-GCaMP3 בסטריאטום (איור 1). אנחנו הבחנו ציטומגלווירוס-GCaMP3 באמצעות נוגדני GFP וגם הכתימו את הפרוסות עם סמן astrocyte ידוע, S100β. ביטוי ציטומגלווירוס-GCaMP3 נמצא רק בתאים חיוביים S100β. אין ביטוי נמצא בתאי עצב דמיינו עם NeuN (איור 2 א ו -2 ב), המצביע על ביטוי ספציפי astrocyte. חשוב לציין, ביטוי ציטומגלווירוס-GCaMP3 זוהה ב~ 60% מתאים חיוביים S100β (Figure 2C). האסטרוציטים להגיב לעלבונות מוח כגון פגיעה, איסכמיה וזיהום על ידי הצגת שינויים שהפכו המכונה תגובתיות astrocyte, המייצגת את ספקטרום של שינויים אפשריים בין מתון עד 15 חמורים. אנו ביקשנו להעריך אם microinjection הנגיף גרם תגובתיות astrocyte גלויה. זה היה הראה בעבר כי רמות ביטוי מופחתות של גלוטמין synthetase (GS) היו קשורות עם האסטרוציטים תגובת 16,17. לכן, ביטוי GS בסטריאטום של WT ועכברים וירוס שהוחדר הושווה. לא מצאנו שינויים משמעותיים בביטוי GS בהאסטרוציטים striatal לאחר הזרקת וירוס (איור 3 א - ג), המציין אין תגובתיות astrocyte גלויה באמצעות רמות GS כמדד. זו גישה כללית יכולה להיות מורחבת בעבודה בעתיד כדי להעריך תגובתיות astrocyte באמצעות סמנים אחרים של תגובתיות. עם זאת, שימו לב כי רמות GFAP לא יכולות להיות דרך מתאימה למדידת תגובתיות בstriatהאסטרוציטים אל, כי GFAP לא בא לידי ביטוי ברמות לגילוי ברוב האסטרוציטים striatal בתנאים בסיסיים 18. לסיכום, על ידי שימוש בIHC אנו מסיקים ביטוי ציטומגלווירוס-GCaMP3 היה חזק וספציפי להאסטרוציטים בסטריאטום, וכי הזרקת הווירוס לא גרמה לתגובתיות astrocyte כפי שהוערכה על ידי שינויים ברמת ביטוי GS. אנחנו הבאים הכנו פרוסות מוח חריפות מעכברים שהוזרקו וירוס לתמונה [Ca 2 +] i בהאסטרוציטים striatal. 300 מיקרומטר פרוסות sagittal או העטרה עבות חריפות הוכנו, ולאחר תקופת ההחלמה את הפרוסות הונחו בתא הקלטה על מיקרוסקופ confocal ל[ Ca 2 +] i הדמיה באמצעות קו 488 ננומטר של לייזר ארגון. האסטרוציטים striatal להביע את ציטומגלווירוס-GCaMP3 בקלות יכולים להיות מזוהים ברוב (בדרך כלל כולם) של פרוסות striatal (~ 6 - 7 פרוסות לכל עכבר), כפי שהם הראו הקרינה ירוקה נראית לעין בתאים עם מורפולוגיה בבירור עבה (איור 4 </stronז&gt;). 5 דקות טיפוסיות הקלטה ברץ 1 משדה נציג מוצגת באיור 4 א; לפחות 10 האסטרוציטים בו מוצגות ציטומגלווירוס-GCaMP3 יכולים להיות צילמו והם זממו באיור 4 א כאזורים של העניין (ROI). הדמיה בהגדלה גבוהה יותר עם ​​זום דיגיטלי נוסף של 2.0-3.0 הייתה צורך לזהות האסטרוציטים יחידים (איור 4). בנסיבות אלה, שטחי astrocyte כל נחשפו על ידי ביטוי ציטומגלווירוס-GCaMP3, כפי שמוצגים באיור 4. Ca 2 + אותות ספונטניים נמדדו בקלות בsomata כמו גם בסניפים ובbranchlets של האסטרוציטים 6. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/51972/51972fig1highres.jpg" /> איור 1: משלוח ויראלי של GECIs (למשל ציטומגלווירוס-GCaMP3) על ידי AAV2 / 5 לסטריאטום העכבר המבוגר. א סכמטי ממחיש את הפרוטוקול לAAV2 / 5 microinjections לסטריאטום דורסולטרלי.ב &#39;מציג את המיקום המשוער של מחט microinjection ביחס לסטריאטום ואת הקואורדינטות המשמשות לזריקות stereotaxic. התמונה של פרוסה צבעונית Nissl בלוח ב &#39;הורדה מALLEN מוח האטלס. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/51972/51972fig2highres.jpg" /> איור 2: ביטוי Cyto-GCaMP3 היה ספציפי להאסטרוציטים striatal. - תמונות ב נציג מראים כי ביטוי ציטומגלווירוס-GCaMP3 colocalizes עם סמן להאסטרוציטים (S100β) (ב), אך לא עם סמן לתאי עצב (NeuN) (א) גרף עמודות סיכום ג לניסויי colocalization כמו אלה שמוצגים. A ו- B. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/51972/51972fig3highres.jpg" /> איור 3: ביטוי Cyto-GCaMP3 בתוך האסטרוציטים striatal לא לגרום לשינויים בביטוי של GS.- תמונות ב נציג GCaMP3 וGS IHC מעכברים שקיבלו AAV2 / 5 לGCaMP3. תמונות לעכברים שהוזרקו ללא שליטה גם מוצגות. גרף בר ג מסכם תוצאות מניסויים כגון אלו בA ו- B (NS מציין לא משמעותי באמצעות הבדיקה של סטודנטים מזווגים t, p &lt;0.05). <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/51972/51972fig4highres.jpg" /> איור 4: דוגמאות מייצגות של i אותות [Ca 2 +] שנרשמו מהאסטרוציטים striatal עם ציטומגלווירוס-GCaMP3. א שטוח תמונת Z- מחסנית מראה 10 האסטרוציטים (ממוספרים 1 - 10) .the עקבות להלן תכנית [Ca 2 +] i אותות שנרשמו ב -5 דקות מ-10 התאים שמוצגים בב &#39;שטוחה וzoomed- בz. תמונת -stack לastrocyte.The יחיד עקבות להלן תכנית [Ca 2 +] iאותות שנרשמו ב -5 דקות לתא הבודד שמוצג בB.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators at JoVE.com

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ.

ההדמיה תאית Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בstriatal האסטרוציטים מעכברים בוגרים באמצעות אינדיקטורים סידן מבחינה גנטית מקודדים

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

imaging-intracellular-ca2-signals-striatal-astrocytes-from-adult-mice

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

14.7K Views.  University of California Los Angeles. The properties and functions of astrocyte intracellular Ca2+ signals in the striatum remain incompletely explored. We describe methods to express genetically encoded calcium indicators in striatal astrocytes using adeno-associated viruses of serotype 2/5 (AAV2/5), as well as procedures to reliably image Ca2+ signals within striatal astrocytes in situ. 

Video: Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Imaging Neuronal Responses in Slice Preparations of Vomeronasal Organ Expressing a Genetically Encoded Calcium Sensor

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within the same species 1,2. These intraspecies signals, the pheromones, as well as signals from some predators 3, activate the vomeronasal sensory neurons (VSNs) with high levels of specificity and sensitivity 4. At least three distinct families of G-protein coupled receptors, V1R, V2R and FPR 5-14, are expressed in VNO neurons to mediate the detection of the chemosensory cues. To understand how pheromone information is encoded by the VNO, it is critical to analyze the response profiles of individual VSNs to various stimuli and identify the specific receptors that mediate these responses.
The neuroepithelia of VNO are enclosed in a pair of vomer bones. The semi-blind tubular structure of VNO has one open end (the vomeronasal duct) connecting to the nasal cavity. VSNs extend their dendrites to the lumen part of the VNO, where the pheromone cues are in contact with the receptors expressed at the dendritic knobs. The cell bodies of the VSNs form pseudo-stratified layers with V1R and V2R expressed in the apical and basal layers respectively 6-8. Several techniques have been utilized to monitor responses of VSNs to sensory stimuli 4,12,15-19. Among these techniques, acute slice preparation offers several advantages. First, compared to dissociated VSNs 3,17, slice preparations maintain the neurons in their native morphology and the dendrites of the cells stay relatively intact. Second, the cell bodies of the VSNs are easily accessible in coronal slice of the VNO to allow electrophysiology studies and imaging experiments as compared to whole epithelium and whole-mount preparations 12,20. Third, this method can be combined with molecular cloning techniques to allow receptor identification.
Sensory stimulation elicits strong Ca2+ influx in VSNs that is indicative of receptor activation 4,21. We thus develop transgenic mice that express G-CaMP2 in the olfactory sensory neurons, including the VSNs 15,22. The sensitivity and the genetic nature of the probe greatly facilitate Ca2+ imaging experiments. This method has eliminated the dye loading process used in previous studies 4,21. We also employ a ligand delivery system that enables application of various stimuli to the VNO slices. The combination of the two techniques allows us to monitor multiple neurons simultaneously in response to large numbers of stimuli. Finally, we have established a semi-automated analysis pipeline to assist image processing.

The vomeronasal organ (VNO) detects intraspecies chemical signals that convey social and reproductive information. We have performed Ca2+ imaging experiments using transgenic mice expressing G-CaMP2 in VNO tissue. This approach allows us to analyze the complicated response patterns of the vomeronasal neurons to large numbers of pheromone stimuli.

התגובות הדמיה העצבית ההכנות Slice של איברים Vomeronasal הבעת חיישן סידן מקודד גנטית

The vomeronasal organ (VNO) detects chemosensory signals that carry information about the social, sexual and reproductive status of the individuals within ...

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease pathogenesis and their utility for preclinical drug development. In order to design a better model system for these applications, phenotypically wild-type cortical astrocytes and neural stem cells (NSC) from conditional, genetically engineered mice (GEM) that harbor various combinations of floxed oncogenic alleles were harvested and grown in culture. Genetic recombination was induced in vitro using adenoviral Cre-mediated recombination, resulting in expression of mutated oncogenes and deletion of tumor suppressor genes. The phenotypic consequences of these mutations were defined by measuring proliferation, transformation, and drug response in vitro. Orthotopic allograft models, whereby transformed cells are stereotactically injected into the brains of immune-competent, syngeneic littermates, were developed to define the role of oncogenic mutations and cell type on tumorigenesis in vivo. Unlike most established human glioblastoma cell line xenografts, injection of transformed GEM-derived cortical astrocytes into the brains of immune-competent littermates produced astrocytomas, including the most aggressive subtype, glioblastoma, that recapitulated the histopathological hallmarks of human astrocytomas, including diffuse invasion of normal brain parenchyma. Bioluminescence imaging of orthotopic allografts from transformed astrocytes engineered to express luciferase was utilized to monitor in vivo tumor growth over time. Thus, astrocytoma models using astrocytes and NSC harvested from GEM with conditional oncogenic alleles provide an integrated system to study the genetics and cell biology of astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo and may be useful in preclinical drug development for these devastating diseases.

Modeling Astrocytoma Pathogenesis In Vitro and In Vivo Using Cortical Astrocytes or Neural Stem Cells from Conditional, Genetically Engineered Mice

Phenotypically wild-type astrocytes and neural stem cells harvested from mice engineered with floxed, conditional oncogenic alleles and transformed via viral Cre-mediated recombination can be used to model astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo by orthotopic injection of transformed cells into brains of syngeneic, immune-competent littermates.

דוגמנות אסטרוציטומה פתוגנזה<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; שימוש בקליפת מוח האסטרוציטים או בתאי גזע עצביים מעכברים מותנים, מהונדסים גנטי

Current astrocytoma models are limited in their ability to define the roles of oncogenic mutations in specific brain cell types during disease ...

Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate goal is to image neuronal activity in vivo, one must be able to image activity of a single cell to ensure successful in vivo preparations. This procedure will describe how to image membrane potential in a single cell to provide a foundation to eventually image in vivo. Here we describe methods for imaging GEVIs consisting of a voltage-sensing domain fused to either a single fluorescent protein (FP) or two fluorescent proteins capable of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) in vitro. Using an image splitter enables the projection of images created by two different wavelengths onto the same charge-coupled device (CCD) camera simultaneously. The image splitter positions a second filter cube in the light path. This second filter cube consists of a dichroic and two emission filters to separate the donor and acceptor fluorescent wavelengths depending on the FPs of the GEVI. This setup enables the simultaneous recording of both the acceptor and donor fluorescent partners while the membrane potential is manipulated via whole cell patch clamp configuration. When using a GEVI consisting of a single FP, the second filter cube can be removed allowing the mirrors in the image splitter to project a single image onto the CCD camera.

A method for imaging changes in membrane potential using genetically encoded voltage indicators is described.

ממברנה הדמיה פוטנציאלית עם שני סוגי חיישני מתח פלורסנט מקודדים גנטיים

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate ...

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to photo-regulate endogenous proteins expressed in their native environment. Here, we present an approach to optically control the function of a neuronal protein directly in neurons using a genetically encoded unnatural amino acid (Uaa). By using an orthogonal tRNA/aminoacyl-tRNA synthetase pair to suppress the amber codon, a photo-reactive Uaa 4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyl-cysteine (Cmn) is site-specifically incorporated in the pore of a neuronal protein Kir2.1, an inwardly rectifying potassium channel. The bulky Cmn physically blocks the channel pore, rendering Kir2.1 non-conducting. Light illumination instantaneously converts Cmn into a smaller natural amino acid Cys, activating Kir2.1 channel function. We express these photo-inducible inwardly rectifying potassium (PIRK) channels in rat hippocampal primary neurons, and demonstrate that light-activation of PIRK ceases the neuronal firing due to the outflux of K+ current through the activated Kir2.1 channels. Using in utero electroporation, we also express PIRK in the embryonic mouse neocortex in vivo, showing the light-activation of PIRK in neocortical neurons. Genetically encoding Uaa imposes no restrictions on target protein type or cellular location, and a family of photoreactive Uaas is available for modulating different natural amino acid residues. This technique thus has the potential to be generally applied to many neuronal proteins to achieve optical regulation of different processes in brains. The current protocol presents an accessible procedure for intricate Uaa incorporation in neurons in vitro and in vivo to achieve photo control of neuronal protein activity on the molecular level.

Here, a procedure to selectively activate a neuronal protein with a short pulse of light by genetically encoding a photo-reactive unnatural amino acid into a target neuronal protein expressed in neurons in culture or in vivo is presented.

שליטה אופטית של חלבון עצבי באמצעות חומצות אמינו לא טבעי מקודדים גנטיים בנוירונים

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The coordination of two Ca2+ signal sources&#8212;&#8220;Ca2+ influx&#8221; from outside the cell and &#8220;Ca2+ release&#8221; from the intracellular Ca2+ store endoplasmic reticulum (ER)&#8212;is considered to underlie the diverse spatio-temporal patterns of Ca2+ signals that cause multiple biological functions in cells. The purpose of this protocol is to describe a new Ca2+ imaging method that enables monitoring of the very moment of &#8220;Ca2+ influx&#8221; and &#8220;Ca2+ release&#8221;. OER-GCaMP6f is a genetically encoded Ca2+ indicator (GECI) comprising GCaMP6f, which is targeted to the ER outer membrane. OER-GCaMP6f can monitor Ca2+ release at a higher temporal resolution than conventional GCaMP6f. Combined with plasma membrane-targeted GECIs, the spatio-temporal Ca2+ signal pattern can be described at a subcellular resolution. The subcellular-targeted Ca2+ indicators described here are, in principle, available for all cell types, even for the in vivo imaging of Caenorhabditis elegans neurons. In this protocol, we introduce Ca2+ imaging in cells from cell lines, neurons, and glial cells in dissociated primary cultures, and describe the preparation of frozen stock of rat cortical neurons.

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Here we present a protocol for Ca2+ imaging in neurons and glial cells, which enables the dissection of Ca2+ signals at subcellular resolution. This process is applicable to all cell types that allow the expression of genetically encoded Ca2+ indicators.

דיסקציה של Ca מקומי2 + אותות בתאים בתרבית על ידי קרום, ממוקדות Ca2 + אינדיקטורים

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

Visualizing and Analyzing Intracellular Transport of Organelles and Other Cargos in Astrocytes

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in brain homeostasis, astrocytes supply neurons with vital metabolites and buffer extracellular water, ions, and glutamate. An integral component of the &#8220;tri-partite&#8221; synapse, astrocytes are also critical in the formation, pruning, maintenance, and modulation of synapses. To enable these highly interactive functions, astrocytes communicate among themselves and with other glial cells, neurons, the brain vasculature, and the extracellular environment through a multitude of specialized membrane proteins that include cell adhesion molecules, aquaporins, ion channels, neurotransmitter transporters, and gap junction molecules. To support this dynamic flux, astrocytes, like neurons, rely on tightly coordinated and efficient intracellular transport. Unlike neurons,&#160;where intracellular trafficking has been extensively delineated, microtubule-based transport in astrocytes has been less studied. Nonetheless, exo- and endocytic trafficking of cell membrane proteins and intracellular organelle transport orchestrates astrocytes&#8217; normal biology, and these processes are often affected in disease or in response to injury. Here we present a straightforward protocol to culture high quality murine astrocytes, to fluorescently label astrocytic proteins and organelles of interest, and to record their intracellular transport dynamics using time-lapse confocal microscopy. We also demonstrate how to extract and quantify relevant transport parameters from the acquired movies using available image analysis software (i.e., ImageJ/FIJI) plugins.

Here we describe an in vitro live-imaging method to visualize intracellular transport of organelles and trafficking of plasma membrane proteins in murine astrocytes. This protocol also presents an image analysis methodology to determine cargo transport itineraries and kinetics.

המחשה וניתוח של תחבורה תאיים של אורגלים וcargos אחרים באסטרוציטים

Astrocytes are among the most abundant cell types in the adult brain, where they play key roles in a multiplicity of functions. As a central player in ...

Minimizing Hypoxia in Hippocampal Slices from Adult and Aging Mice

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high fidelity. Exploration of LTP and LTD mechanisms, single neuron dendritic computation, and experience-dependent changes in circuitry, would not have been possible without this classical preparation. However, with a few exceptions, most basic research using acute hippocampal slices has been performed using slices from rodents of relatively young ages, ~P20-P40, even though synaptic and intrinsic excitability mechanisms have a long developmental tail that reaches past P60. The main appeal of using young hippocampal slices is preservation of neuronal health aided by higher tolerance to hypoxic damage. However, there is a need to understand neuronal function at more mature stages of development, further accentuated by the development of various animal models of neurodegenerative diseases that require an aging brain preparation. Here we describe a modification to an acute hippocampal slice preparation that reliably delivers healthy slices from adult and aging mouse hippocampi. The protocol&#8217;s critical steps are transcardial perfusion and cutting with ice-cold sodium-free NMDG-aSCF. Together, these steps attenuate the hypoxia-induced drop in ATP upon decapitation, as well as cytotoxic edema caused by passive sodium fluxes. We demonstrate how to cut transversal slices of hippocampus plus cortex using a vibrating microtome. Acute hippocampal slices obtained in this way are reliably healthy over many hours of recording, and are appropriate for both field-recordings and targeted patch-clamp recordings, including targeting of fluorescently labeled neurons.

This is a protocol for acute slice preparation from adult and aging mouse hippocampi that takes advantage of transcardial perfusion and slice cutting with ice-cold NMDG-aCSF to reduce hypoxic damage to the tissue. The resulting slices stay healthy over many hours, and are suitable for long-term patch-clamp and field-recordings.

מזעור היפוקסיה בפרוסות היפוקמפוס מעכברים מבוגרים ומזדקנים

Acute hippocampal slices have enabled generations of neuroscientists to explore synaptic, neuronal, and circuit properties in detail and with high ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

אין ויוו הדמיית סידן בעכבר זית נחות

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to correlate this with local hemodynamics. This protocol uses transgenic mice that have been prepared with a chronic cranial window and express the genetically encoded calcium indicator, RCaMP1.07, under the &#945;-smooth muscle actin promoter to specifically label mural cells, such as vascular smooth muscle cells and ensheathing pericytes. Steps are outlined on how to prepare a tail vein catheter for intravenous injection of fluorescent dyes to trace blood flow, as well as how to measure brain pericyte calcium and local blood vessel hemodynamics (diameter, red blood cell velocity, etc.) by two photon microscopy in vivo through the cranial window in ketamine/xylazine anesthetized mice. Finally, details are provided for the analysis of calcium fluctuations and blood flow movies via the image processing algorithms developed by Barrett et al. 2018, with an emphasis on how these processes can be adapted to other cellular imaging data.

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

This protocol presents steps to acquire and analyze fluorescent calcium images from brain ensheathing pericytes and blood flow data from nearby blood vessels in anesthetized mice. These techniques are useful for studies of mural cell physiology and can be adapted to investigate calcium transients in any cell type.

דימות פריסייט במוח והדמיה המודינמית בעכברים מהונדסים ב- Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators (GECIs)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of mitochondrial Ca2+ contributes to various pathological conditions, including neurodegeneration and apoptotic cell death in neurological diseases. Here we present a cell-type specific and mitochondria targeting molecular approach for mitochondrial Ca2+ imaging in astrocytes and neurons in vitro and in vivo. We constructed DNA plasmids encoding mitochondria-targeting genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) GCaMP5G or GCaMP6s (GCaMP5G/6s) with astrocyte- and neuron-specific promoters gfaABC1D and CaMKII and mitochondria-targeting sequence (mito-). For in vitro mitochondrial Ca2+ imaging, the plasmids were transfected in cultured astrocytes and neurons to express GCaMP5G/6s. For in vivo mitochondrial Ca2+ imaging, adeno-associated viral vectors (AAVs) were prepared and injected into the mouse brains to express GCaMP5G/6s in mitochondria in astrocytes and neurons. Our approach provides a useful means to image mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes and neurons to study the relationship between cytosolic and mitochondrial Ca2+ signaling, as well as astrocyte-neuron interactions.

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators GECIs

This proctocol aims to provide a method for in vitro and in vivo mitochondrial Ca2+ imaging in astrocytes and neurons.

הדמיה מיטוכונדריאלית Ca2 + ספיגה אסטרוציטים ונוירונים באמצעות אינדיקטורים Ca2+ מקודדים גנטית (GECIs)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of ...