המחברים מודים לCore פתולוגיה המולקולרית וההדמיה של מרכז NIDDK UPenn מולקולרית מחקרים בעיכול ומחלות כבד (DK50306 P30) לקבלת סיוע בהדמיה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (R01 DK-092,111) ומפרד וסוזן Biesecker ילדים מרכז כבד (לRGW) ועל ידי מענק מרשת ילדות מחלת הכבד מחקר והחינוך (לSK).

התהליך כולו מתבצע בטמפרטורת חדר, אלא אם כן צוין אחרת. כל העבודה של בעלי החיים צריכה להתבצע בתנאים אנושיים תחת פרוטוקול שאושר על ידי הוועדה המקומית בבעלי חיים מוסדיים טיפול ושימוש (IACUC). 1. הכנת הציוד ופתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את השולחן כירורגית העכבר בסמיכות למכסת המנוע בתרבית הרקמה והחממה (איור 1 א). הערה: ציוד הנדרש כולל מיקרוסקופ לנתח, מקור אור, איריס מספריים ארוכה וישרה 12.5 סנטימטר, מלקחיים 6 אינץ שאינו משוננים מעוגלים עם טיפים בסדר, ו4 אינץ מלקחיים משוננים, עם קצוות מעוגלים (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום מכשירים מעוקרים בכוס זכוכית של אלכוהול 70% על שולחן הניתוחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא שלוש 60 מ&quot;מ צלחות פטרי סטרילית עם תקשורת בידוד סטרילי (טבלת 1); הנח שתי על שולחן ניתוחים ואחד בשכונה, כולם על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח קולגן זנב חולדה,תמיסת מלח סטרילית 10x פוספט (PBS), מים סטריליים, סטרילי N NaOH 1 ותאים אפיתל מרה תקשורת (BEC) (טבלת 1) במכסת המנוע בתרבית הרקמה. הערה: קולגן צריך להיות על קרח. </li></ol> 2. בידוד המרה Duct ותרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים ילודים בין 0-3 ימים של חיים, על ידי חשיפה לפחמן דו חמצני עד אבדן הכרה ואחריו נקע בצוואר הרחם, על פי הנחיות IACUC (תרשים 1C). הערה: ניתן להשתמש בעכברים מבוגרים בהתאם לצרכימים של ניסוי ספציפיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח לבעלי חיים במצב שכיבה ולעשות חתך אופקי קטן שחצה את קו האמצע באזור של האגן. הרחב את החתך הזה רוחבי ואת שני הצדדים של הבטן, ויצר דש בצורת U. הפעל דש כדי לחשוף את איברי הבטן. ברגע שהבטן פתוחה, לנוע בזהירות את המעיים מתוך חלל הבטן לכיוון צד ימין של בעלי החיים להדמיה טובה יותר של צינור הכבד ומרה משותפת. הערה: ייתכן שיהיה צורך להאריך את החתכים הרוחב לתוך בית החזה כדי לקבל זיהוי טוב יותר של הכבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לנתח, לזהות את צינור מרה המשותפת, כבד ומעיים. זהה את צינור המרה המשותף ראשון (1D איור), תוך שימוש בזהירות, כמבנים הם מאוד עדינים. עם מלקחיים המשוננים המשוננים ולא, בקפדנות נקייה ולאסוף את רקמות חיבור כולל שומן המקיף את המרה. השתמש באחד מלקחיים להחזיק את הצינור ואחר לניקוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בטכניקה דומה כדי לנקות את כיס המרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את הצינוריות וכיס המרה ניקו לתוך הצלחת הראשונה של מדיה בידוד על קרח. לעסות בעדינות את המבנים עם המלקחיים משוננים שאינו בזמן בתקשורת כדי להסיר עוד יותר רקמות חיבור ולהסיר מרה מן כיס המרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הצינורות וכיס מרה למנה השנייה של תקשורת בידוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הבידוד של צינורות וכיס מרה מ5 בעלי חיים, להעביר אתחתיכות לצלחת פטרי השלישית, במכסת המנוע. הערה: אם תאים הם להיות מבודדים יותר מ 5 בעלי חיים, לעשות בקבוצות, תוך שימוש בפתרונות מפתיעים לכל קבוצה של 5 בעלי חיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ג&#39;לי קולגן עבה במכסת המנוע בתרבית רקמה: הערה: כל מנה בגודל ניתן להשתמש. צלחת תרבות 60 מ&quot;מ עם נפח סופי של 3 מיליליטר קולגן לכל קבוצה של 5 ילודים עובדת היטב. זה צריך להיות מוכן טרי בעת הטבעת צינורות מבודדים טרי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח קולגן עכברוש זנב, תמיסת מלח סטרילית 10x פוספט (10x PBS), סטרילי DH 2 O, וסטרילי N NaOH 1 על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הכמויות של DH 2 0, 10x PBS, NaOH, וקולגן הנדרש לג&#39;לי עם ריכוז סופי של 2 קולגן מ&quot;ג / מיליליטר ב 1x PBS, באמצעות נפח של 1 N NaOH שווה 0.023 פעמים הנפח של קולגן, הוסיף. הערה: אם מקור חלופי של קולגן משמש, בצע את הוראות היצרן לנטרול והיווצרות ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים יחד DH 2 0, 10x PBS, ו1 N NaOH, ולאחר מכן להוסיף קולגן וגם פיפטה כדי להבטיח גם ערבוב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שפתרון קולגן התעבה לג&#39;ל כמו עקביות בטמפרטורת חדר, כדי לשבץ באופן מיידי את הצינורות בקולגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום בחממה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 30 דקות כדי לאפשר קולגן כדי לחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע ג&#39;ל יש הקרושה (שינויי צבע מברורים ללבן), כיסוי עם 3.5 מיליליטר של תקשורת BEC (טבלת 1) ו לדגור על 37 ° C CO, 2 5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר תקשורת BEC 3 פעמים בשבוע ולהחליף עם תקשורת טרי 3.5 מיליליטר. </li></ol> 3. בידוד Cholangiocytes הראשי מהעבה קולגן ג&#39;ל הערה: תוך 3 שבועות, גיליונות של cholangiocytes (תאים עם גרעינים גדולים הארכה ישירות מצינורות מוטבעים) יהיו גלויים בקולגן העבה. אם יש מספר גדול של fibroblasts בצלחת, זה צריך להיות מושלך. אם יש כמה אזורים של המנהגידול פיברובלסטים, אלה ניתן לגזור עם אזמל ולהסיר לפני פיצול cholangiocytes. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ג&#39;לי קולגן דק: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל קולגן לריכוז של 1 מ&quot;ג / מיליליטר עם PBS סטרילית. שים לב: שימוש 1 מיליליטר ל100 צלחת מ&quot;מ; להתאים בהתאם לכלים בגודל אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מורחים את פתרון קולגן באופן שווה עם מפזר תא (מנות גדולות) או קצה פיפטה (מנות קטנות), ולאחר מכן משאיר בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה צלחת עם DMEM/F12 ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחת מן החממה ולשטוף עם 1x PBS. מייד לשאוב PBS 1X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל עם שכבה שנייה דקה של קולגן, מתפשטת על ידי החלפה של הצלחת או הצבת צלחת על שייקר. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קולגן יש הקרושה, כיסוי צלחת עם DMEM/F12 ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 30 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול תאים מהג&#39;ל קולגן איכס: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מרית תרבית תאים או מגרד תא, לגרד ג&#39;ל קולגן בעדינות מהצלחת, כך שהוא צף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון collagenase על ידי דילול collagenase סוג XI (ראה רשימת חומרים) ל10 מ&quot;ג / מיליליטר עם DMEM/F12. מערבבים היטב וסינון סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מיליליטר של תמיסת collagenase (לעיל) ל60 מנה מ&quot;מ של תאים בקולגן העבה. אל תסיר את תקשורת BEC (שאמורה להיות 3 מיליליטר). דגירה צלחת ל30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר תמיסה המכילה תאים, ואת המקום ב15 מיליליטר צינור חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה ב2,200 XG במשך 5 דקות. בטל supernatant מחדש להשעות גלולה בנפח דומה של DMEM/F12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין פתרון שוב ב2,200 XG במשך 5 דקות. הסר supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 3 מיליליטר של טריפסין 0.5%, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 5 דקות. לאחר דגירה, פיפטה הפתרון למעלה ולמטה כדי לשבור את הגיליונות של cholangiocytes. הוסף 5 מיליליטר של תקשורת BECפתרון ספין nd ב1,500 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant, וגלול resuspend ב DMEM/F12, אז ספין פתרון ב1,500 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant מחדש להשעות גלולה בתקשורת BEC (טבלת 1). פלייט תאים על ג&#39;ל קולגן הדק שנעשה בעבר. </li></ol></li></ol> 4. מעבר ואחסון של תאים הערה: תאים על ג&#39;ל קולגן הדק ניתן לפצל לפי צורך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף צלחות עם PBS סטרילי לפני דוגרים בטריפסין 0.25% ב37 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל עם נפח שווה של מדיה BEC, וגלולה ב1,500 XG במשך 5 דקות. יש לשטוף גלולה עם DMEM/F12, ולאחר מכן גלולה ב1,500 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי resuspend בתקשורת BEC לחלוקה לצלחות תרבית תאי קולגן מצופים. הערה: לחלופין, ניתן resuspended תאים באמצעי אחסון ומאוחסנים במקפיא -80 ° C או חנקן נוזלי (טבלה 1). </li></ol>

<ol>
	<li>Paradis, K., Sharp, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+duct-like+structure+formation+after+isolation+of+bile+ductular+cells+from+a+murine+model.">In vitro duct-like structure formation after isolation of bile ductular cells from a murine model.</a> J. Lab. Clin. Med. 113 (6), 689-694 (1989).</li><li>Vroman, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+polarized+primary+cultures+of+rat+intrahepatic+bile+duct+epithelial+cells.">Development and characterization of polarized primary cultures of rat intrahepatic bile duct epithelial cells.</a> Lab. Invest. 74 (1), 303-313 (1996).</li><li>Kumar, U., Jordan, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+biliary+epithelial+cells+from+the+biliary+tract+fraction+of+normal+rats.">Isolation and culture of biliary epithelial cells from the biliary tract fraction of normal rats.</a> Liver. 6 (6), 369-378 (1986).</li><li>Ishii, M., Vromen, B., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+morphologic+characterization+of+bile+duct+epithelial+cells+from+normal+rat+liver.">Isolation and morphologic characterization of bile duct epithelial cells from normal rat liver.</a> Gastroenterology. 97 (5), 1236-1247 (1989).</li><li>Strazzabosco, M., Fabris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+bile+ducts:+Essentials+for+the+clinical+hepatologist.">Development of the bile ducts: Essentials for the clinical hepatologist.</a> J. Hepatol. 56 (5), 1159-1170 (2012).</li><li>Carpentier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+ductal+plate+cells+give+rise+to+cholangiocytes,+periportal+hepatocytes,+and+adult+liver+progenitor+cells.">Embryonic ductal plate cells give rise to cholangiocytes, periportal hepatocytes, and adult liver progenitor cells.</a> Gastroenterology. 141 (4), 1432-1438 (2011).</li><li>Cho, W. K., Mennon, A., Boyer, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+functional+polarized+bile+duct+units+from+mouse+liver.">Isolation of functional polarized bile duct units from mouse liver.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 280 (2), (2001).</li><li>Karjoo, S., Hand, N. J., Loarca, L., Russo, P. A., Friedman, J. R., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extra-hepatic+cholangiocyte+cilia+are+abnormal+in+biliary+atresia.">Extra-hepatic cholangiocyte cilia are abnormal in biliary atresia.</a> J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 57 (1), 96-101 (2013).</li><li>Sutton, M. E., op den Dries, S., Koster, M. H., Lisman, T., Gouw, A. S., Porte, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+human+extrahepatic+biliary+epithelium:+the+peribiliary+glands+as+progenitor+cell+compartment.">Regeneration of human extrahepatic biliary epithelium: the peribiliary glands as progenitor cell compartment.</a> Liver Int. 32 (4), 554-559 (2012).</li><li>Cardinale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotent+stem/progenitor+cells+in+human+biliary+tree+give+rise+to+hepatocytes,+cholangiocytes,+and+pancreatic+islets.">Multipotent stem/progenitor cells in human biliary tree give rise to hepatocytes, cholangiocytes, and pancreatic islets.</a> Hepatology. 54 (6), 2159-2172 (2011).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

שתואר כאן הוא טכניקה לבודד cholangiocytes הטהור מדרכי המרה extrahepatic של עכברים של עכברים בכל הגילים, כולל תינוקות. הטכניקה מציעה את היתרון שניתן ללמוד cholangiocytes extrahepatic בנפרד מcholangiocytes intrahepatic, ועשויה להקל על מחקרים כדי לזהות את ההבדלים עיקריים בין האוכלוסיות של תאים אלה. אנו פורסמו לאחרונה מחקר אשר הוכיח ירידת cilia בcholangiocytes extrahepatic מבודדת בשיטה זו ונגועה בrotavirus רזוס 8. חסרונות כוללים שהטכניקה היא עבודה אינטנסיבית, והנתיחה מדוקדקת נדרשת על מנת למנוע זיהום פיברובלסטים; בנוסף, תוצאה ולפחות 3 שבועות בתרבות נדרשים להשיג תאים מספיק עבור רוב הניסויים. לכן, תאים אלה עשויים לשקף שינויים הקשורים לשתי תרבות ממדית. זה טרם נקבע אם אוכלוסיות התאים שהושגו כוללות מספרים משמעותיים של תאי גזע או תאיםים מבלוטות peribiliary 9,10. אנחנו ניסינו להשתמש בשיטה זו כדי לבודד cholangiocytes extrahepatic מחולדות; עם זאת, תאים לא הצליחו לגדול בתרבות. בין אם גורם צמיחה מרכזי חסר בתקשורת והתרבות, או אם תנאים אחרים שיהיה הצורך לשנות הוא כעת תחת חקירה. סופו של דבר, בשיטה זו כדי לבודד cholangiocytes extrahepatic עשויה לתרום להבנת הבדלים בצורות הפנים וextrahepatic של סיסטיק מרה, כמו גם הבדלים בין תאי יילודים ומבוגרים.

המקור וההתפתחות של cholangiocytes הפנים וextrahepatic הם שונים במידה ניכרת. הכבד מתפתח מdiverticulum של האנדודרם המעי הקדמי הגחון 5. אזור הזנב של diverticulum מהווה את עץ המרה extrahepatic, ואילו באזור הגולגולת יוצר עץ המרה intrahepatic 5. cholangiocytes צינור intrahepatic נגזרים מתאים סביב צלחת ductal באזורי פורטל פרי 6. תאים אלה היכולת להתמיין גם hepatocytes או cholangiocytes 6. יש לכך השלכות קליניות משמעותיות בהתחשב בעובדה שcholangiopathies עשוי במיוחד למטרת קטגוריה אחת של cholangiocytes. לדוגמא, atresia מרה בתחילה משפיע על צינוריות extrahepatic של הילוד, בעוד Alagille תסמונת משפיעה על צינוריות intrahepatic. יש תיאורים רבים של הבידוד של cholangiocytes intrahepatic ויחידות צינור מרה מעכברים וחולדות. בתוךvestigators הצליח לבודד תאים בודדים על ידי בידוד צינור ותוצאה שלאחר מכן, או על ידי עיכול כבד ונוגדנים לנתץ של cholangiocytes להביע סמנים פני תא ספציפיים 1-4. יחידות צינור מרה פונקציונליות ומקוטבות היו מבודדות על ידי עיכול כבד וסינון גודל 7. יחידות צינור מרה הן מסוגלים להגיב לגירויי הפרשה ולהפגין הפרשת נוזלי 7, בעוד cholangiocytes המבודד הוכחו לפתח מבני ductular במבחנה 1,2. מגבלות של שיטות אלה כוללים את הצורך במומחיות מיוחדת טכנית וציוד מיוחד לזלוף כבד עם אנזימי עיכול. בנוסף, קיים סיכון של זיהום עם תאי mesenchymal 3. שיטה לבודד cholangiocytes צינור המרה extrahepatic, במיוחד מצינורות מרה extrahepatic בילוד, לא תוארה בעבר. מאמר זה מתאר טכניקה פשוטה לבודד בילודזה גם תאי צינור המרה extrahepatic מבוגרים ברמות גבוהות של טוהר. טכניקה זו תאפשר המחקר של הבדלים בין cholangiocytes ומחקר במנגנונים של מחלות כמו atresia מרה שכוללות צינורות extrahepatic הפנים וextrahepatic.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11320-033</td><td>500 ml, used in BEC media</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>25 ml, used in BEC media</td></tr><tr><td>MEM with non-essential amino acids</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11140-019</td><td>5 ml, used in BEC media</td></tr><tr><td>Insulin-transferrin-selenium</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>51300-044</td><td>5 ml, used in BEC media</td></tr><tr><td>Na Pyruvate</td><td>Cellgro</td><td>25-000-CL</td><td>5 ml, used in BEC media</td></tr><tr><td>Chemically-defined lipid concentrate</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11905-031</td><td>5 ml, used in BEC media</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>5 ml, used in BEC media and 500 &amp;#956;l in the isolation</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>15750-060</td><td>0.2 ml, used in BEC media and 500 &amp;#956;l in the isolation</td></tr><tr><td>Ethanolamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9508-100ml</td><td>0.13 ml, used in BEC media</td></tr><tr><td>MEM vitamin solution</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11120-052</td><td>5 ml, used in BEC media</td></tr><tr><td>Soybean trypsin inhibitor</td><td>Biowhittaker</td><td>17-605E</td><td>5 ml, used in BEC media. Solvent is PBS, mix to 5 mg/ml stock concentration</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Cellgro</td><td>25-005-CL</td><td>5 ml, used in BEC media</td></tr><tr><td>Bovine pituitary extract</td><td>Gemini</td><td>500-102</td><td>1.1 ml, used in BEC media</td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td>0.5 ml, used in BEC media, Stock conc 393 &amp;#956;g/ml dilute with ethanol</td></tr><tr><td>3 3&#039;,5-triiodo-L-thyronine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6397</td><td>0.5 ml, used in BEC media, Stock conc 3.4 mg/ml dilute with ethanol</td></tr><tr><td>Epidermal growth factor</td><td>Millipore</td><td>01-101</td><td>0.5 ml, used in BEC media, 25 &amp;#956;g/ml dilute with DMEM F12+1%BSA</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886</td><td>5 ml, used in BEC media, use at stock concentration of 0.411 mg/ml and dilute with DMSO</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>15290-018</td><td>1 ml, used in BEC media and 500 &amp;#956;l in the isolation</td></tr><tr><td>Rat-tail collagen</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td>variable depending on concentration of collagen</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>USB Corporation</td><td>75889</td><td>use at 10x, sterlie, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration</td></tr><tr><td>dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration</td></tr><tr><td>NaOH 10 N</td><td>Fischer Scientific</td><td>ss255-1</td><td>Dilute to 1 N, sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration</td></tr><tr><td>collagenase type XI from Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7657</td><td>dilute in DMEM and sterile filter before use</td></tr><tr><td>trypsin-EDTA (1x) 0.25%</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>25200-056</td><td>3 ml, incubate max 10 min</td></tr><tr><td>trypsin-EDTA (10x) 0.5%</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>15400-054</td><td>3 ml, incubate max 10 min</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td>Other models acceptable</td></tr><tr><td>Light source (fiberoptic illuminator)</td><td>Schott-Fostec</td><td>Ace EKE LR 92240</td><td>Other models acceptable</td></tr><tr><td>12.5 cm straight iris scissors</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td>Other models acceptable</td></tr><tr><td>6&quot; non-serrated curved forceps with fine tips</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td></td><td>Other models acceptable</td></tr><tr><td>4&quot; serrated stainless forceps with fine tips</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td></td><td>Other models acceptable</td></tr></tbody></table>

isolation of neonatal extrahepatic cholangiocytes

דרכי מרת התוך וextrahepatic של הכבד הן התפתחותית מובהקת, ועשויה להיות מושפע באופן דיפרנציאלי על ידי מחלות מסוימות. עם זאת, הבדלים בין cholangiocytes הפנים וextrahepatic, ובין תאי יילודים ומבוגרים, אינם מובנה היטב. שיטות לבידוד של cholangiocytes מצינורות המרה intrahepatic מבוססים היטב 1-4. בידוד של תאי ductal extrahepatic, במיוחד מהילוד, עדיין לא תאר, אם כי זה יהיה יתרון גדול בהבנת ההבדלים בין אוכלוסיות שונות וcholangiocyte בחקר מחלות כמו atresia מרה המופיעות למקד את צינוריות extrahepatic. שתואר כאן הוא טכניקה מותאמת לבודד תאי צינור המרה extrahepatic שני יילודים ועכבר מבוגר. טכניקה זו מניבה אוכלוסיית תא טהורה עם זיהום מינימאלי מתאי mesenchymal כמו fibroblasts. metho זהד מבוסס על הסרת צינוריות extrahepatic וכיס המרה, ואחריו לנתיחה קפדנית וגירוד כדי להסיר שכבות שומן ופיברובלסטים. מבנים מוטבעים בשכבות עבות של קולגן ותרבית למשך כ 3 שבועות כדי לאפשר תולדה של cholangiocytes בmonolayers, אשר לאחר מכן ניתן trypsinized ומחדש מצופים לשימוש ניסיוני.

השימוש בתוצאות פרוטוקול זה בבידודה של אוכלוסייה של cholangiocytes ילוד עכבר extrahepatic עם טוהר מעולה, כפי שהודגם על ידי מכתים immunofluorescence K19 (2A דמויות ו2B); אנו משיגים תוצאות דומות לבודד תאים מעכברים בוגרים. יש לנו ציינו כי זה לוקח 3 שבועות לתאים מצינורות מרה מבודדים טרי כדי ליצור monolayers על ג&#39;לי קולגן עבה. Cholangiocytes לגדול בצורה ליניארית לאורך קולגן העבה, ויוצר יריעות של תאים מהצינורות המבודדים. יש לפצל תאים מחדש מצופים על ג&#39;ל קולגן הדק לפני monolayers להיות מגודל, שכן חורים מופיעים בגיליונות של תאים אם תרבויות לא לפצל לפני 3 שבועות. לצמיחת תאים אופטימלית וכדי למזער את הזיהום פיברובלסטים, חשוב להסיר את רקמות חיבור המקיפות את צינורות extrahepatic העדינים בזהירות ובקפדנות במהלך שלבי נתיחה וניקוי (2.3, 2.4). אם יש צמיחה של סיביתקיעות, הסרת האזור הנגוע של קולגן העבה עם אזמל או שאיבה עדינה יכולות להפחית את ההעברה של fibroblasts לפני תאי פיצול. תאים אלה מתחלקים במהירות במהלך שלושת הקטעים הראשונים, אבל בנקודות מעבר גבוהות יותר, קצב הצמיחה מואט, והתאים הופכים לגדולים יותר וvacuolated. יש לנו קפוא בהצלחה דגימות של cholangiocytes, ומחדש בציפוים בתקופות מאוחרות יותר עם כדאיות מצוינת; cholangiocytes מופשר, לעומת זאת, לא לשכפל מהר ככל מבודד טרי ותאים מפוצלים. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51621/51621fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51621/51621fig1.jpg" /> 1. ציוד כירורגי איור יש להגדיר בסמיכות למנגנון בתרבית רקמה. () מקור אור ממוקם מאחורי מיקרוסקופ לנתח. (ב) ציוד כירורגי כולל sc החדissors, hemostat, פינצטה משוננת מעוקלת, ופינצטה מעוקלת בלתי משוננת (ג);.. גודל של עכבר 3 ימים ישן המשמש לבידודים (ד &#39;) מלקחיים מחזיקים את צינור מרה המשותף בעכבר בילוד. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51621/51621fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51621/51621fig2.jpg" /> איור 2. אוכלוסיות טהורה של cholangiocytes extrahepatic מבודדות עם זיהום מינימאלי עם תאי mesenchymal. Cholangiocytes הוכתמו K19 (ירוק) עם ההדמיה DAPI גרעינית (כחולה). ברים סולם, 25 מיקרומטר. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:243px;"> כלי תקשורת </td><td style="width:227px;"> רכיב </td><td style="width:177px;"> הסכום </td></tr><tr height="21"><td height="84"rowspan = בסגנון &quot;4&quot; = &quot;גובה: 84px; רוחב: 243px;&quot;&gt; מדיה בידוד </td><td style="width:227px;"> גנטמיצין </td><td style="width:177px;"> 0.5 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> פניצילין, סטרפטומיצין </td><td style="width:177px;"> 0.5 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> Fungizone </td><td style="width:177px;"> 0.5 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> DMEM/F12 (1:1) </td><td style="width:177px;"> 5 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="398" rowspan="18" style="height:398px;width:243px;"> תא המרה אפיתל (BEC) מדיה </td><td style="width:227px;"> FBS </td><td style="width:177px;"> 25 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> DMEM/F12 (1:1) </td><td style="width:177px;"> 500 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> M<html> EM חומצות אמינו לא חיוניות </td><td style="width:177px;"> 5 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> אינסולין transferrin-סלניום </td><td style="width:177px;"> 5 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> Na פירובט </td><td style="width:177px;"> 5 מיליליטר </td></tr><tr height="41"><td height="41" style="height:41px;width:227px;"> תרכיז שומנים כימי מוגדר </td><td style="width:177px;"> 5 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> פניצילין, סטרפטומיצין </td><td style="width:177px;"> 5 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> גנטמיצין </td><td style="width:177px;"> 0.2 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> Ethanolamine </td><td style="width:177px;"> 0.13 מיליליטר </td></tr><tr height="21">רוחב: 227px; &quot;&gt; פתרון ויטמין MEM </td><td style="width:177px;"> 5 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> מעכבי טריפסין הסויה * </td><td style="width:177px;"> 5 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> L-גלוטמין </td><td style="width:177px;"> 5 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> תמצית בלוטת יותרת המוח שור </td><td style="width:177px;"> 1.1 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> * דקסאמתאזון </td><td style="width:177px;"> 0.5 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> 3,3 &#39;,5-triiodo-L-thyronine * </td><td style="width:177px;"> 0.5 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> גורם הגדילה באפידרמיס * </td><td style="width:177px;"> 0.5 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21"style = &quot;גובה: 21px; רוחב: 227px;&quot;&gt; Forskolin * </td><td style="width:177px;"> 5 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> Fungizone </td><td style="width:177px;"> 1 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="63" rowspan="3" style="height:63px;width:243px;"> מדיית אחסון (להקפאת תאים) </td><td style="width:227px;"> תא המרה אפיתל תקשורת (BEC) </td><td style="width:177px;"> 7 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> DMSO </td><td style="width:177px;"> 1 מיליליטר </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> FBS סטרילי </td><td style="width:177px;"> 2 מיליליטר </td></tr><tr height="100"><td colspan="3" height="100" style="height:100px;width:647px;"> * מצרכים צריכים להיות מוכנים לריכוזים מתאימים לפני הוספה לתקשורת. עיין ברשימת חומר להוראה נוספת. </td></tr><tr height="100"><td colspan="3"סגנון height = &quot;100&quot; &quot;גובה: 100px; רוחב: 647px;&quot; =&gt; ** לאחר המרכיבים מעורבבים, מדיה סינון סטרילי וaliquot. אפשר להקפיא את מדיה עד 6 חודשים ב-- 20 ˚ C. </td></tr></tbody></table> טבלת 1. רכיבי מדיה.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes at JoVE.com

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

טכניקה לבודד cholangiocytes מצינורות המרה extrahepatic של עכברים בילוד מתוארת. הצינורות בקפדנות הם גזורים, ולאחר מכן תאים מבודדים על ידי תולדה בג&#39;ל קולגן העבה. שיטה זו מספקת כלים שימושיים ללימוד פיתוח extrahepatic מרה צינור ופתולוגיה.

בידוד של ילודים extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

isolation-of-neonatal-extrahepatic-cholangiocytes

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.2K Views.  The Children's Hospital of Philadelphia.  טכניקה לבודד cholangiocytes מצינורות המרה extrahepatic של עכברים בילוד מתוארת. הצינורות בקפדנות הם גזורים, ולאחר מכן תאים מבודדים על ידי תולדה בג'ל קולגן העבה. שיטה זו מספקת כלים שימושיים ללימוד פיתוח extrahepatic מרה צינור ופתולוגיה. 

Video: Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories due to the large size of the pancreatic duct that allows for ready collagenase injection and subsequent tissue perfusion. In contrast, islet isolation from small pancreata, like that of neonatal mice, is challenging because perfusion is not readily achievable in the small pancreata. Here we describe a detailed simple procedure that recovers substantial numbers of islets from newly born mice with visual assistance. Freshly dissected whole pancreata were digested with 0.5 mg/mL collagenase IV dissolved in Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) at 37 &#176;C, in microcentrifuge tubes. Tubes were tapped regularly to aid tissue dispersal. When most of the tissue was dispersed to small clusters around 1 mm, lysates were washed three to four times with culture media with 10% fetal bovine serum (FBS). Islet clusters, devoid of recognizable acinar tissues, can then be recovered under dissecting stereoscope. This method recovers 20 - 80 small- to large-sized islets per pancreas of newly born mouse. These islets are suitable for most conceivable downstream assays, including insulin secretion, gene expression, and culture. An example of insulin secretion assay is presented to validate the isolation process. The genetic background and degree of digestion are the largest factors determining the yield. Freshly made collagenase solution with high activity is preferred, as it aids in endocrine-exocrine isolation. The presence of cations [calcium (Ca2+) and magnesium (Mg2+)] in all solutions and fetal bovine serum in the wash/picking media are necessary for good yield of islets with proper integrity. A dissecting scope with good contrast and magnification will also help.

We describe a protocol herein for isolating intact islets from neonatal mice. Pancreata were partially digested with collagenase, followed by washing and hand picking. 20 - 80 islet clusters can be obtained per pancreas from newly born mice, which are suitable for several islet studies.

בידוד יעיל של איי פונקציונלית מן היילודים עכבר לבלב

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

Developmental Biology

Isolation and Enrichment of Liver Progenitor Subsets Identified by a Novel Surface Marker Combination

During chronic liver injuries, progenitor cells expand in a process called ductular reaction, which also entails the appearance of inflammatory cellular infiltrate and epithelial cell activation. The progenitor cell population during such inflammatory reactions has mostly been investigated using single surface markers, either by histological analysis or by flow cytometry-based techniques. However, novel surface markers identified various functionally distinct subsets within the liver progenitor/stem cell compartment. The method presented here describes the isolation and detailed flow cytometry analysis of progenitor subsets using novel surface marker combinations. Moreover, it demonstrates how the various progenitor cell subsets can be isolated with high purity using automated magnetic and FACS sorting-based methods. Importantly, novel and simplified enzymatic dissociation of the liver allows for the isolation of these rare cell populations with a high viability that is superior in comparison to other existing methods. This is especially relevant for further studying progenitor cells in vitro or for isolating high-quality RNA to analyze the gene expression profile.

Liver injuries are accompanied by progenitor cell expansion that represents a heterogeneous cell population. Novel classification of this cellular compartment allows for the distinguishing of multiple subsets. The method described here illustrates the flow cytometry analysis and high purity isolation of various subsets that can be used for further assays.

בידוד והעשרה של קבוצות משנה כבדים ובתאים המזוהים על ידי שילוב מרקר Surface Novel

During chronic liver injuries, progenitor cells expand in a process called ductular reaction, which also entails the appearance of inflammatory cellular ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have no effective therapeutic options. Tools to study EHBD are very limited. Our purpose was to develop an organ-specific, versatile, adult stem cell-derived, preclinical cholangiocyte model that can be easily generated from wild type and genetically engineered mice. Thus, we report on the novel technique of developing an EHBD organoid (EHBDO) culture system from adult mouse EHBDs. The model is cost-efficient, able to be readily analyzed, and has multiple downstream applications. Specifically, we describe the methodology of mouse EHBD isolation and single cell dissociation, organoid culture initiation, propagation, and long-term maintenance and storage. This manuscript also describes EHBDO processing for immunohistochemistry, fluorescent microscopy, and mRNA abundance quantitation by real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). This protocol has significant advantages in addition to producing EHBD-specific organoids. The use of a conditioned medium from L-WRN cells significantly reduces the cost of this model. The use of mouse EHBDs provides almost unlimited tissue for culture generation, unlike human tissue. Generated mouse EHBDOs contain a pure population of epithelial cells with markers of endodermal progenitor and differentiated biliary cells. Cultured organoids maintain homogenous morphology through multiple passages and can be recovered after a long-term storage period in liquid nitrogen. The model allows for the study of biliary progenitor cell proliferation, can be manipulated pharmacologically, and may be generated from genetically engineered mice. Future studies are needed to optimize culture conditions in order to increase plating efficiency, evaluate functional cell maturity, and direct cell differentiation. Development of co-culture models and a more biologically neutral extracellular matrix are also desirable.

This protocol describes the production of a mouse extrahepatic bile duct 3-dimensional organoid system. These biliary organoids can be maintained in culture to study cholangiocyte biology. Biliary organoids express markers of both progenitor and biliary cells and are composed of polarized epithelial cells.

דור של Organoids של צינורות המרה Extrahepatic העכבר

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the uremic milieu, oxidative stress, endotoxemia and the decreased clearance of circulating proinflammatory cytokines by producing a large number of acute-phase reactants. Experimental tools to study inflammation and the underlying role of hepatocytes are crucial to understand the regulation and contribution of hepatic cytokines to a systemic acute phase response and a prolonged pro-inflammatory scenario, especially in an intricate setting such as chronic kidney disease. Since studying complex mechanisms of inflammation in vivo remains challenging, resource-intensive and usually requires the usage of transgenic animals, primary isolated hepatocytes provide a robust tool to gain mechanistic insights into the hepatic acute-phase response. Since this in vitro technique features moderate costs, high reproducibility and common technical knowledge, primary isolated hepatocytes can also be easily used as a screening approach. Here, we describe an enzymatic-based method to isolate primary murine hepatocytes, and we describe the assessment of an inflammatory response in these cells using ELISA and quantitative real-time PCR.

Here, we show an enzymatic approach to isolate primary hepatocytes from adult mice, and we describe the quantification of an inflammatory response using ELISA and real-time PCR.

אינדוקציה של תגובה דלקתית בתרבויות Hepatocyte הראשי מעכברים

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

Immunology and Infection

Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In addition, liver stem cells are hypothesized to be the precursors for a subset of liver cancer, Hepatocellular carcinoma. One of the primary challenges to stem cell work in any solid organ like the liver is the isolation of a rare population of cells for detailed analysis. For example, the vast majority of cells in the liver are hepatocytes (parenchymal fraction), which are significantly larger than non-parenchymal cells. By enriching the specific cellular compartments of the liver (i.e. parenchymal and non-parenchymal fractions), and selecting for CD45 negative cells, we are able to enrich the starting population of stem cells by over 600-fold.The proceduresdetailed in this report allow for a relatively rare population of cells from a solid organ to be sorted efficiently. This process can be utilized to isolateliver stem cells from normal murine liver as well as chronic liver injury models, which demonstrate increased liver stem cell proliferation. This method has clear advantages over standard immunohistochemistry of frozen or formalin fixed liver as functional studies using live cells can be performed after initial co-localization experiments. To accomplish the procedure outlined in this report, a working relationship with a research based flow-cytometry core is strongly encouraged as the details of FACS isolation are highly dependent on specialized instrumentation and a strong working knowledge of basic flow-cytometry procedures. The specific goal of this process is to isolate a population of liver stem cells that can be clonally expanded in vitro.

Here we describe the isolation of CD133 expressing liver stem cells and cancer stem cells from whole murine liver, a process that requires tissue digestion, cell enrichment, and flow cytometry isolation. We include methods for advanced single cell isolation and clonal expansion.

בידוד של הכבד CD133 + בתאי גזע משובטים עבור הרחבת

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In ...

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic Stellate cells (HSC). Two-dimensional (2D) culture of primary human hepatocyte (PHH) is still considered as the &#34;gold standard&#34; for in vitro testing of drug metabolism and hepatotoxicity. It is well-known that the 2D monoculture of PHH suffers from dedifferentiation and loss of function. Recently it was shown that hepatic NPC play a central role in liver (patho-) physiology and the maintenance of PHH functions. Current research focuses on the reconstruction of in vivo tissue architecture by 3D- and co-culture models to overcome the limitations of 2D monocultures. Previously we published a method to isolate human liver cells and investigated the suitability of these cells for their use in cell cultures in Experimental Biology and Medicine1. Based on the broad interest in this technique the aim of this article was to provide a more detailed protocol for the liver cell isolation process including a video, which will allow an easy reproduction of this technique.
Human liver cells were isolated from human liver tissue samples of surgical interventions by a two-step EGTA/collagenase P perfusion technique. PHH were separated from the NPC by an initial centrifugation at 50 x g. Density gradient centrifugation steps were used for removal of dead cells. Individual liver cell populations were isolated from the enriched NPC fraction using specific cell properties and cell sorting procedures. Beside the PHH isolation we were able to separate KC, LEC and HSC for further cultivation.
Taken together, the presented protocol allows the isolation of PHH and NPC in high quality and quantity from one donor tissue sample. The access to purified liver cell populations could allow the creation of in vivo like human liver models.

A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

פרוטוקול הבידוד של hepatocytes האדם הראשי הקביל סרן אוכלוסיות של תאים בכבד ללא parenchymal

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Extrahepatic Bile Duct and Gall Bladder Dissection in Nine-Day-Old Mouse Neonates

The dissection of murine neonatal bile ducts has been described as difficult. The main aim of the described standard operating procedure is the isolation of the extrahepatic bile duct (EBD) in mouse neonates without damaging the bile duct during preparation. Because of its exceptionally close preparation compared to the cholangiocytes cell line and harvesting of the entire extrahepatic bile duct system (EBDS), the described approach is extremely useful in researching animal models of newborn bile duct disorders, such as biliary atresia. After euthanasia, the peritoneal cavity was accessed, and the bile duct system, duodenum, and liver were extracted with the unique En-bloc-Resection (EbR). The extracted sample is placed on a foam mat, and the EBD is dissected from contaminating cells atraumatically without necessary touch. The dissection of the entire EBDS is a significant advantage of this method. Caution must be taken due to the small size and amount of bile duct tissue. Using the described technique, there is no damage to the cholangiocytes. Further, the purity of the technique is reproducible (n = 10). Therefore, optimally comparable samples can be harvested. Furthermore, no bile duct tissue is harmed, because any contact with the bile duct system can be avoided during preparation, leaving the bile fluid inside the gall bladder. Most importantly, while performing the final gall bladder and bile duct dissection, atraumatic microinstruments were used only slightly lateral of the bile duct without squeezing it. This is the key to a clean and intact sample, and essential for further histological investigation or the isolation of cholangiocytes. To summarize, the described innovative dissection technique enables especially inexperienced operators with the necessary equipment to isolate the EBDS as cleanly as possible.

For the observation of murine neonatal bile duct disorders, an intact bile duct and efficient preparation are required. Therefore, a new approach for isolating the entire extrahepatic bile duct system in murine neonates was successfully developed while maintaining the integrity of the bile duct.

דיסקציה של צינור המרה החוץ-כבדי וכיס המרה בניודים של עכברים בני תשעה ימים

The dissection of murine neonatal bile ducts has been described as difficult. The main aim of the described standard operating procedure is the isolation ...

Medicine

Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream single-cell applications is challenging. A marked accumulation of lipids within regenerating hepatocytes is observed during the first 2 days of normal liver regeneration in mice. This so-called transient regeneration-associated steatosis (TRAS) is temporary but partially overlaps the major proliferative phase. Density-gradient purification is the backbone of most existing protocols for the isolation of primary hepatocytes. As gradient purification relies on the density and size of cells, it separates non-steatotic from steatotic hepatocyte populations. Therefore, fatty hepatocytes often are lost, yielding non-representative hepatocyte fractions. 
The presented protocol describes an easy and reliable method for the in vivo isolation of regenerating hepatocytes regardless of their lipid content. Hepatocytes from male C57BL/6 mice are isolated 24-48 h after hepatectomy by a classic two-step collagenase perfusion approach. A standard peristaltic pump drives the warmed solutions via the catheterized inferior vena cava into the remnant, using a retrograde perfusion technique with outflow through the portal vein. Hepatocytes are dissociated by collagenase for their release from the Glisson's capsule. After washing and careful centrifugation, the hepatocytes can be used for any downstream analyses. In conclusion, this paper describes a straightforward and reproducible technique for the isolation of a representative population of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice. The method may also aid the study of fatty liver disease.

Lipid-laden hepatocytes are inherent to liver regeneration but are usually lost upon density-gradient centrifugation. Here, we present an optimized cell isolation protocol that retains steatotic hepatocytes, yielding representative populations of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice.

בידוד של הפטוציטים מתחדשים לאחר כריתת כבד חלקית בעכברים

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream ...

Isolation and 3D Collagen Sandwich Culture of Primary Mouse Hepatocytes to Study the Role of Cytoskeleton in Bile Canalicular Formation In Vitro

Hepatocytes are the central cells of the liver responsible for its metabolic function. As such, they form a uniquely polarized epithelium, in which two or more hepatocytes contribute apical membranes to form a bile canalicular network through which bile is secreted. Hepatocyte polarization is essential for correct canalicular formation and depends on interactions between the hepatocyte cytoskeleton, cell-cell contacts, and the extracellular matrix. In vitro studies of hepatocyte cytoskeleton involvement in canaliculi formation and its response to pathological situations are handicapped by the lack of cell culture, which would closely resemble the canaliculi network structure in vivo. Described here is a protocol for the isolation of mouse hepatocytes from the adult mouse liver using a modified collagenase perfusion technique. Also described is the production of culture in a 3D collagen sandwich setting, which is used for immunolabeling of cytoskeletal components to study bile canalicular formation and its response to treatments in vitro. It is shown that hepatocyte 3D collagen sandwich cultures respond to treatments with toxins (ethanol) or actin cytoskeleton altering drugs (e.g., blebbistatin) and serve as a valuable tool for in vitro studies of bile canaliculi formation and function.

Presented here is a protocol for the isolation of mouse hepatocytes from adult mouse livers using a modified collagenase perfusion technique. Also described is the long-term culture of hepatocytes in a 3D collagen sandwich setting as well as immunolabeling of the cytoskeletal components to study bile canalicular formation and its response to treatment.

בידוד וכריך קולגן 3D תרבות של העכבר הראשי Hepatocytes כדי ללמוד את התפקיד של שלד ציטוזה היווצרות של המרה בתוך מחוץ לגופית

Hepatocytes are the central cells of the liver responsible for its metabolic function. As such, they form a uniquely polarized epithelium, in which two or ...

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure for primary hepatocyte isolation is technically challenging, especially in portal vein cannulation. The procedure is also prone to occasional contamination and variations in perfusion conditions due to difficulties in the assembly, optimization, or maintenance of the perfusion setup. Here, a detailed protocol for an improved two-step collagenase perfusion procedure with multiparameter perfusion control is presented. Primary rat hepatocytes were successfully and reliably isolated by taking the necessary technical precautions at critical steps of the procedure, and by reducing the operational difficulty and mitigating the variability of perfusion parameters through the adoption of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control, and real-time monitoring and alarm system. The isolated primary rat hepatocytes consistently exhibit high cell viability (85%-95%), yield (2-5 x 108 cells per 200-300 g rat) and functionality (albumin, urea and CYP activity). The procedure was complemented by an integrated perfusion system, which is compact enough to be set up in the laminar flow hood to ensure aseptic operation.

This protocol details the use of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control complemented by real-time monitoring, and an alarm system for two-step collagenase perfusion procedure to improve the consistency in the viability, yield, and functionality of isolated primary rat hepatocytes.

בידוד של הפטוציטים ראשוניים של חולדות עם בקרת זלוף רב-פרמטרית

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...