Die Autoren danken der Molekularpathologie und Bildgebung Kern der UPenn NIDDK-Centrum für Molekulare Studien in Verdauungs-und Lebererkrankungen (P30 DK50306) für die Unterstützung bei Bildgebung. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (R01 DK-092111) und von der Fred und Suzanne Biesecker Pediatric Liver Center (zu RGW) und durch eine Gemeinschaft aus der Kindheit Liver Disease Research and Education Network (SK) unterstützt.

Das gesamte Verfahren wird bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Alle Tier Arbeit sollte unter menschenwürdigen Bedingungen, unter einem Protokoll von der örtlichen Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) zugelassen sind. 1. Herstellung von Ausrüstung und Lösungen <ol><li> Richten Sie die Maus OP-Tisch in der Nähe der Gewebekultur Kapuze und Inkubator (Abbildung 1A). Hinweis: Erforderliche Ausrüstung umfasst ein Binokular, eine Lichtquelle, 12,5 cm lange, gerade Iris Schere, 6 Zoll nicht gezackten gebogenen Pinzette mit feinen Spitzen, und 4-Zoll-gezähnt Zange mit gebogenen Spitzen (Abbildung 1B). </li><li> Platzieren sterilisierten Instrumente in einem Becherglas von 70% Alkohol auf dem Operationstisch. </li><li> In drei sterile 60 mm Petrischalen mit sterilen Isolationsmedien (Tabelle 1); legen Sie zwei am OP-Tisch und eine Kapuze, die alle auf dem Eis. </li><li> Zeigen Rattenschwanz Kollagen,sterile 10 x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), sterilem Wasser, steriler 1 N NaOH und Gallen Epithelzellen (BEC)-Medien (Tabelle 1) in der Gewebekultur Haube. Hinweis: Das Kollagen sollte auf Eis. </li></ol> 2. Gallenwegs Isolierung und Kultur <ol><li> Euthanize neugeborenen Mäusen zwischen 0-3 Tagen des Lebens, durch die Einwirkung von Kohlendioxid bis zum Unbewussten durch Genickbruch, pro IACUC Richtlinien (1C), gefolgt. Hinweis: ältere Mäuse können in Abhängigkeit von bestimmten experimentellen Anforderungen verwendet werden. </li><li> Zeigen Tier in Rückenlage und machen einen kleinen horizontalen Schnitt Überqueren der Mittellinie im Bereich des Beckens. Erweitern Sie dieses Schnitt seitlich und bis beide Seiten des Bauches, bilden eine U-förmige Klappe. Schalten Klappe bis die Bauchorgane aus. Sobald das Abdomen geöffnet ist, vorsichtig bewegen die Eingeweide aus der Bauchhöhle in Richtung der rechten Seite des Tieres zur besseren Visualisierung der Leber und der Gallengang. Hinweis: es kann notwendig sein, um die seitlichen Einschnitte in den Brustkorb zu verlängern, um eine bessere Identifikation der Leber zu erhalten. </li><li> Verwendung der Präpariermikroskop mit den gemeinsamen Gallengang, Leber und Darm. Identifizieren Sie den Gallengang erste (1D), mit Vorsicht, da die Strukturen sind sehr empfindlich. Mit den gezackten und nicht gezackten Zangen, akribisch sauber und holen Sie das Bindegewebe, einschließlich Fett rund um die Galle. Verwenden Sie eine Zange, um den Kanal und die andere zu reinigen halten. </li><li> Verwenden Sie eine ähnliche Technik, um die Gallenblase zu reinigen. </li><li> Legen Sie die gereinigten Produkte und Gallenblase in den ersten Teller der Isolationsmedien auf Eis. Massieren Sie die Strukturen mit den nicht gezahnten Pinzette während in den Medien, um weiter zu entfernen Bindegewebe und Galle aus der Gallenblase zu entfernen. </li><li> Übertragen Kanäle und Gallenblase in die zweite Schale der Isolation Medien. </li><li> Nach der Isolierung von Leitungen und Gallenblasen aus 5 Tieren, übertragen Sie dieStücke mit dem dritten Petrischale, in der Haube. Hinweis: Wenn Zellen von mehr als 5 Tieren isoliert werden sollen, tun in den Reihen, die mit frischen Lösungen für jede Gruppe von 5 Tieren. </li><li> Bereiten dicken Kollagengelen in der Gewebekultur Haube: Hinweis: jeder Größe Gericht verwendet werden können. Eine 60-mm-Kulturschale mit einem Endvolumen von 3 ml Kollagen für jede Gruppe von 5 Neugeborenen funktioniert gut. Dies sollte frisch zubereitet werden, zum Zeitpunkt der Einbettung frisch isolierten Leitungen. <ol><li> Platzieren Rattenschwanzkollagen, sterile 10 x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (10x PBS), steril dH 2 O und 1 N NaOH sterile auf Eis. </li><li> Berechnung der Volumina von dH 2 0, 10x PBS, NaOH und Kollagen für Gele mit einer Endkonzentration von 2 mg / ml Kollagen in 1 × PBS erforderlich, mit einem Volumen von 1 N NaOH gleich 0,023 mal dem Volumen des Kollagens zugesetzt. Hinweis: Wenn alternative Quelle von Kollagen verwendet wird, befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für die Neutralisation und Gel-Bildung. </li><li> Mix zusammen dH 2 0, 10x PBS und 1 N NaOH, dann fügen Kollagen und Pipette auch, um sicherzustellen, sogar Vermischung. </li></ol></li><li> Sobald Kollagenlösung hat zu einer gelartigen Konsistenz bei Raumtemperatur verdickt, die sofort einbetten Kanäle im Kollagen. </li><li> Legen in den Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2 für 30 min, um das Kollagen zu ermöglichen sich zu verfestigen. </li><li> Sobald Gel (Farbwechsel von klar bis weiß), Überlagerung mit 3,5 ml BEC Medien (Tabelle 1) verfestigt und bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> BEC Medien entfernen 3 mal pro Woche und ersetzen mit 3,5 ml frischem Medium. </li></ol> 3. Isolaprimär Cholangiozyten von Dick Kollagengele Hinweis: innerhalb von 3 Wochen, werden Blätter Cholangiozyten (Zellen mit großen Kernen, die sich direkt von Embedded-Kanäle) in der dicken Kollagen sichtbar sein. Wenn es eine große Zahl von Fibroblasten in die Schüssel, sollte sie verworfen werden. Wenn ein paar Regionen der Schüssel habenFibroblasten-Wachstums, können diese mit einem Skalpell geschnitten und vor der Aufspaltung der Cholangiozyten entfernt werden. <ol><li> Bereiten dünnen Kollagengelen: <ol><li> Verdünnen Kollagen in einer Konzentration von 1 mg / ml mit steriler PBS. Hinweis: Verwenden Sie 1 ml für 100-mm-Platte; entsprechend für andere Gerichte Größe anpassen. </li><li> Verbreiten Sie die Kollagenlösung gleichmäßig mit einer Zelle Treuer (große Geschirr) oder Pipettenspitze (kleine Gerichte), dann lassen bei Raumtemperatur für 10 min. </li><li> Platte mit DMEM/F12 und bei 37 ° C, 5% CO 2 für 10 min. </li><li> Entfernen Platte von Inkubator und waschen mit 1x PBS. Unmittelbar absaugen 1x PBS. </li><li> Mantel mit einem zweiten dünnen Schicht aus Kollagen, die Verbreitung durch Drehen der Platte oder Platzierung Platte auf einem Schüttler. Bei 37 ° C, 5% CO 2 für 10 min. </li><li> Nach Kollagen verfestigt hat, Abdeckplatte mit DMEM/F12 und bei 37 ° C, 5% CO 2 für 30 min. </li></ol></li><li> Split-Zellen von thick Kollagengelen: <ol><li> Mit Zellkulturzellschaber oder Spachtel, kratzen Kollagengel vorsichtig von der Platte, so daß sie schwimmt. </li><li> Bereiten Collagenase-Lösung durch Verdünnen Typ XI Kollagenase (siehe Materialliste) auf 10 mg / ml mit DMEM/F12. Gut mischen und Sterilfilter. </li><li> 1 ml der Collagenase-Lösung (oben) pro 60 mm-Schale von Zellen in dicken Kollagen. Die BEC-Medien (3 ml, das sollte sein) nicht entfernen. Inkubieren Schale für 30 min bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Entfernen Lösung, die Zellen und legen in 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Spin down bei 2.200 xg für 5 min. Überstand verwerfen und Pellet erneut aussetzen ähnliches Volumen von DMEM/F12. </li><li> Spinnlösung erneut bei 2200 · g für 5 min. Überstand entfernen. </li><li> Pellet in 3 ml 0,5% Trypsin und Inkubation bei 37 ° C, 5% CO 2 für 5 min. Nach der Inkubation Pipette die Lösung auf und ab, brechen die Blätter Cholangiozyten. 5 ml BEC Medien einnd Spinnlösung bei 1.500 × g für 5 min. </li><li> Überstand entfernen und Pellet in DMEM/F12, dann spinnen Lösung bei 1.500 xg für 5 min. </li><li> Überstand entfernen und Pellet erneut aussetzen BEC Medien (Tabelle 1). Teller Zellen auf bisherigen dünnen Kollagen Gele. </li></ol></li></ol> 4. Passage und Lagerung von Zellen Hinweis: bei Bedarf können die Zellen auf dünnen Kollagengelen aufgeteilt werden. <ol><li> Vor der Inkubation in 0,25% Trypsin bei 37 ° C für 10-15 min waschen Platten mit sterilem PBS. </li><li> Neutralisieren mit einem gleichen Volumen von BEC Medien und pelletieren bei 1.500 × g für 5 min. Mit DMEM/F12 spülen Pellet, dann pelletieren bei 1.500 × g für 5 min. </li><li> Die Zellen in BEC Medien für die Verteilung an Kollagen beschichtete Zellkulturschalen. Hinweis: Alternativ können die Zellen in Speichermedien resuspendiert und in einem -80 ° C Gefrierschrank oder flüssiger Stickstoff (Tabelle 1) gespeichert werden. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine Interessen haben.

Beschrieben wird hier eine Technik, um reine Cholangiozyten aus den extrahepatischen Gallenwege von Mäusen Mäuse aller Altersgruppen, einschließlich Neugeborenen zu isolieren. Die Technik bietet den Vorteil, dass extrahepatischen Cholangiozyten getrennt von intrahepatischen Cholangiozyten untersucht werden, und können Studien zu wichtigen Unterschiede zwischen diesen Populationen von Zellen identifizieren zu erleichtern. Wir haben vor kurzem eine Studie veröffentlicht, demonstrieren verringert Flimmerhärchen in extrahepatischen Cholangiozyten durch dieses Verfahren isoliert und mit Rhesusrotavirus 8 infiziert. Nachteile sind, dass die Technik ist arbeitsintensiv, und sorgfältige Präparation erforderlich ist, um Fibroblasten-Kontamination zu verhindern; Zusätzlich Auswuchs und mindestens 3 Wochen in Kultur erforderlich sind, um genügend Zellen für die meisten Experimente erhalten. So können diese Zellen mit Veränderungen zweidimensionalen Kultur auftreten können. Es ist noch nicht bestimmt worden, ob die erhaltenen Zellpopulationen enthalten erhebliche Zahl von Stammzellen oder Zells aus peribiliären Drüsen 9,10. Wir haben versucht, diese Methode zu verwenden, um extrahepatische Cholangiozyten von Ratten isolieren; jedoch fehlerhaften Zellen in Kultur zu wachsen. Ob ein wesentlicher Wachstumsfaktor im Kulturmedium fehlt oder ob andere Bedingungen geändert werden müssen, wird derzeit untersucht. Letztlich kann diese Methode zu extrahepatischen Cholangiozyten zu isolieren, um zu verstehen, Unterschiede in der intra-und extrahepatischen Gallen Formen der Fibrose, sowie Unterschiede zwischen Neugeborenen und Erwachsenen-Zellen beitragen.

Die Entstehung und Entwicklung der intra-und extrahepatischen Cholangiozyten unterscheiden sich deutlich. Die Leber entwickelt sich aus einer Divertikel des ventralen Vorderdarm Endoderm 5. Die Schwanzbereich der Divertikel bildet die extrahepatischen Gallenwege, während der Oberkopf erzeugt die intrahepatischen Gallenwege 5. Intrahepatische Kanal Cholangiozyten werden aus Vorläuferzellen rund um den duktalen Platte in den peri-Portal Bereiche 6 abgeleitet. Diese Zellen haben die Fähigkeit, entweder in Hepatozyten und Cholangiozyten 6 unterscheiden. Dies hat erhebliche klinische Implikationen da cholangiopathies kann gezielt eine Kategorie von Cholangiozyten. Zum Beispiel Gallengangsatresie betrifft zunächst die extrahepatischen Kanäle des Neugeborenen, während Alagille Syndrom betrifft intrahepatischen Gänge. Es gibt mehrere Beschreibungen der Isolierung der intrahepatischen Gallengänge und Cholangiozyten Einheiten von Mäusen und Ratten. Investigators haben einzelne Zellen durch Kanaltrennung und anschließender Auswuchs isoliert oder durch Leber und Verdauung Antikörper nach unten ziehen von Cholangiozyten Expression spezifischer Zelloberflächenmarker 4.1. Funktionelle und polarisiert Gallengang-Einheiten wurden von Leber Verdauung und Größe 7 Filtration isoliert. Gallengang-Einheiten in der Lage sind zu reagieren auf Reize sekretorischen und zeigen Fluidsekretion 7, während isoliert Cholangiozyten wurde gezeigt, ductularen Strukturen in vitro 1,2 zu entwickeln. Einschränkungen dieser Methoden sind die Notwendigkeit für spezialisierte technische Expertise und spezielle Ausrüstung für Leberperfusion mit Verdauungsenzymen. Darüber hinaus gibt es ein Risiko der Kontamination mit mesenchymalen Zellen 3. Verfahren extrahepatische Gallengang Cholangiozyten zu isolieren, und zwar von Neugeborenen extrahepatischen Gallenwege, ist bisher nicht beschrieben worden. Dieses Papier skizziert eine vereinfachte Methode für die Neugeborenen eine isolierens sowie erwachsene extrahepatischen Gallengangzellen bei hoher Reinheit. Diese Technik wird die Untersuchung der Unterschiede zwischen den intra-und extrahepatischen Cholangiozyten und Forschung in Mechanismen von Krankheiten wie biliäre Atresie, die extrahepatischen Kanäle beinhalten erleichtern.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11320-033</td><td>500 ml, used in BEC media</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>25 ml, used in BEC media</td></tr><tr><td>MEM with non-essential amino acids</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11140-019</td><td>5 ml, used in BEC media</td></tr><tr><td>Insulin-transferrin-selenium</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>51300-044</td><td>5 ml, used in BEC media</td></tr><tr><td>Na Pyruvate</td><td>Cellgro</td><td>25-000-CL</td><td>5 ml, used in BEC media</td></tr><tr><td>Chemically-defined lipid concentrate</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11905-031</td><td>5 ml, used in BEC media</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td>5 ml, used in BEC media and 500 &amp;#956;l in the isolation</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>15750-060</td><td>0.2 ml, used in BEC media and 500 &amp;#956;l in the isolation</td></tr><tr><td>Ethanolamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9508-100ml</td><td>0.13 ml, used in BEC media</td></tr><tr><td>MEM vitamin solution</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>11120-052</td><td>5 ml, used in BEC media</td></tr><tr><td>Soybean trypsin inhibitor</td><td>Biowhittaker</td><td>17-605E</td><td>5 ml, used in BEC media. Solvent is PBS, mix to 5 mg/ml stock concentration</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Cellgro</td><td>25-005-CL</td><td>5 ml, used in BEC media</td></tr><tr><td>Bovine pituitary extract</td><td>Gemini</td><td>500-102</td><td>1.1 ml, used in BEC media</td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td>0.5 ml, used in BEC media, Stock conc 393 &amp;#956;g/ml dilute with ethanol</td></tr><tr><td>3 3&#039;,5-triiodo-L-thyronine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6397</td><td>0.5 ml, used in BEC media, Stock conc 3.4 mg/ml dilute with ethanol</td></tr><tr><td>Epidermal growth factor</td><td>Millipore</td><td>01-101</td><td>0.5 ml, used in BEC media, 25 &amp;#956;g/ml dilute with DMEM F12+1%BSA</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886</td><td>5 ml, used in BEC media, use at stock concentration of 0.411 mg/ml and dilute with DMSO</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>15290-018</td><td>1 ml, used in BEC media and 500 &amp;#956;l in the isolation</td></tr><tr><td>Rat-tail collagen</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td>variable depending on concentration of collagen</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>USB Corporation</td><td>75889</td><td>use at 10x, sterlie, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration</td></tr><tr><td>dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration</td></tr><tr><td>NaOH 10 N</td><td>Fischer Scientific</td><td>ss255-1</td><td>Dilute to 1 N, sterile, used to make collagen, amount used depends on collagen concentration</td></tr><tr><td>collagenase type XI from Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7657</td><td>dilute in DMEM and sterile filter before use</td></tr><tr><td>trypsin-EDTA (1x) 0.25%</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>25200-056</td><td>3 ml, incubate max 10 min</td></tr><tr><td>trypsin-EDTA (10x) 0.5%</td><td>Gibco/ Life technologies</td><td>15400-054</td><td>3 ml, incubate max 10 min</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td>Other models acceptable</td></tr><tr><td>Light source (fiberoptic illuminator)</td><td>Schott-Fostec</td><td>Ace EKE LR 92240</td><td>Other models acceptable</td></tr><tr><td>12.5 cm straight iris scissors</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td>Other models acceptable</td></tr><tr><td>6&quot; non-serrated curved forceps with fine tips</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td></td><td>Other models acceptable</td></tr><tr><td>4&quot; serrated stainless forceps with fine tips</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td></td><td>Other models acceptable</td></tr></tbody></table>

isolation of neonatal extrahepatic cholangiocytes

Die intra-und extrahepatischen Gallengänge in der Leber sind entwicklungspolitisch deutlich und differentiell durch bestimmte Krankheiten betroffen sein. Jedoch Unterschiede zwischen intra-und extrahepatischen Cholangiozyten und zwischen Neugeborenen und Erwachsenen-Zellen, sind nicht gut verstanden. Methoden zur Isolierung von Cholangiozyten von intrahepatischen Gallengänge sind gut etabliert 1-4. Isolierung von extrahepatischen Gangzellen, insbesondere aus der Neugeborenen ist noch nicht beschrieben worden, obwohl dies von großem Nutzen für das Verständnis der Unterschiede zwischen verschiedenen Bevölkerungsgruppen und Cholangiozyten bei der Untersuchung von Krankheiten wie Gallengangsatresie, die die extrahepatischen Zielkanäle erscheinen. Beschrieben wird hier eine optimierte Technik, um sowohl Neugeborenen und Erwachsenen Maus extrahepatischen Gallengangzellen zu isolieren. Diese Technik ergibt eine reine Zellpopulation mit minimaler Verunreinigung aus mesenchymalen Zellen wie Fibroblasten. Diese method ist auf die Beseitigung der extrahepatischen Gallengänge und, gefolgt von sorgfältige Dissektion und Schaben, Fett und Fibroblastenschichten zu entfernen basiert. Strukturen werden in dicken Schichten von Kollagen und kultiviert für ca. 3 Wochen eingebettet Auswuchs Cholangiozyten in Monoschichten, die dann mit Trypsin behandelt werden kann und wieder überzogen für den experimentellen Einsatz zu ermöglichen.

Die Verwendung dieses Protokoll Ergebnisse bei der Isolierung von einer Bevölkerung von neonatalen Maus extrahepatischen Cholangiozyten mit ausgezeichneter Reinheit, wie von K19 Immunfluoreszenzfärbung nachgewiesen (2A und 2B); wir ähnliche Ergebnisse erzielen Isolierung von Zellen aus erwachsenen Mäusen. Wir haben beobachtet, dass es dauert 3 Wochen für Zellen aus frisch isolierten Gallengänge zu Monoschichten auf dicken Kollagen-Gele bilden. Die Cholangiozyten wachsen in einer linearen Weise in der ganzen dicken Kollagen, Blattbildung von Zellen aus den isolierten Kanälen. Zellen sollten geteilt und werden auf dünnen Kollagengelen Re-Monoschichten überzogen, bevor überwuchert, da Löcher in den Blättern erscheinen von Zellen, wenn Kulturen nicht vor 3 Wochen aufgeteilt. Für ein optimales Zellwachstum und Fibroblasten Verunreinigung zu minimieren, ist es wichtig, die rund um die empfindlichen extrahepatischen Kanäle sorgfältig und genau während der Präparation und Reinigung der Schritte (2.3, 2.4) Bindegewebe zu entfernen. Wenn es das Wachstum von FibroblastenBlasten, die Entfernung von den betroffenen Bereich des dicken Kollagen mit einem Skalpell oder sanfte Absaugen kann die Übertragung von Fibroblasten vor der Aufspaltung Zellen zu reduzieren. Diese Zellen teilen sich schnell während der ersten drei Durchgänge bei höheren Durchtrittsstellen, verlangsamt sich die Wachstumsrate und die Zellen größer und Vakuolen werden. Wir haben erfolgreich eingefroren Proben Cholangiozyten und erneut plattiert sie zu einem späteren Zeitpunkt mit ausgezeichneter Durchführbarkeit; Cholangiozyten aufgetaut, aber nicht so schnell wie frisch isolierte und getrennte Zellen replizieren. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51621/51621fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51621/51621fig1.jpg" /> Abbildung 1. Chirurgische Ausrüstung sollte in der Nähe der Gewebekultur Gerät (A) eingestellt werden. Lichtquelle hinter dem Binokular gelegt. (B) Chirurgische Ausrüstung umfasst scharfe scissors, Gefäßklemme, eine gekrümmte Wellenschliff Pinzette, und eine gekrümmte un-gezahnten Pinzette (C);.. Größe einer 3 Tage alten Maus für Isolierungen verwendet (D) Pinzette halten den Gallengang in der Neugeborenen-Maus. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51621/51621fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51621/51621fig2.jpg" /> Abbildung 2. Reine Populationen von extrahepatischen Cholangiozyten mit minimaler Kontamination mit mesenchymalen Zellen isoliert. Cholangiozyten wurden mit K19 (grün) mit DAPI Kerndarstellung (blau) gefärbt. Maßstabsbalken, 25 um. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" ><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:243px;"> Medien </td><td style="width:227px;"> Komponente </td><td style="width:177px;"> Menge </td></tr><tr height="21"><td height="84"rowspan = &quot;4&quot; style = &quot;height: 84px; width: 243px;&quot;&gt; Isolation Medien </td><td style="width:227px;"> Gentamicin </td><td style="width:177px;"> 0,5 ml </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> Penicillin-Streptomycin </td><td style="width:177px;"> 0,5 ml </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> Fungizone </td><td style="width:177px;"> 0,5 ml </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> DMEM/F12 (1:1) </td><td style="width:177px;"> 5 ml </td></tr><tr height="21"><td height="398" rowspan="18" style="height:398px;width:243px;"> Biliäre Epithelzellen (BEC) Medien </td><td style="width:227px;"> FBS </td><td style="width:177px;"> 25 ml </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> DMEM/F12 (1:1) </td><td style="width:177px;"> 500 ml </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> M<html> EM nicht-essentielle Aminosäuren </td><td style="width:177px;"> 5 ml </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> Insulin-Transferrin-Selen </td><td style="width:177px;"> 5 ml </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> Na Pyruvat </td><td style="width:177px;"> 5 ml </td></tr><tr height="41"><td height="41" style="height:41px;width:227px;"> Chemisch definierte Lipidkonzentrat </td><td style="width:177px;"> 5 ml </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> Penicillin-Streptomycin </td><td style="width:177px;"> 5 ml </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> Gentamicin </td><td style="width:177px;"> 0,2 ml </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> Ethanolamine </td><td style="width:177px;"> 0,13 ml </td></tr><tr height="21">width: 227px; &quot;&gt; MEM Vitaminlösung </td><td style="width:177px;"> 5 ml </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor * </td><td style="width:177px;"> 5 ml </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> L-Glutamin </td><td style="width:177px;"> 5 ml </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> Rinderhypophysenextrakt </td><td style="width:177px;"> 1,1 ml </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> Dexamethason * </td><td style="width:177px;"> 0,5 ml </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> 3,3 &#39;,5-Triiod-L-Thyronin * </td><td style="width:177px;"> 0,5 ml </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> Epidermalen Wachstumsfaktor * </td><td style="width:177px;"> 0,5 ml </td></tr><tr height="21"><td height="21"style = &quot;height: 21px; width: 227px;&quot;&gt; Forskolin * </td><td style="width:177px;"> 5 ml </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> Fungizone </td><td style="width:177px;"> 1 ml </td></tr><tr height="21"><td height="63" rowspan="3" style="height:63px;width:243px;"> Speichermedien (zum Einfrieren von Zellen) </td><td style="width:227px;"> Biliäre Epithelzellen (BEC) Medien </td><td style="width:177px;"> 7 ml </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> DMSO </td><td style="width:177px;"> 1 ml </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:227px;"> Sterile FBS </td><td style="width:177px;"> 2 ml </td></tr><tr height="100"><td colspan="3" height="100" style="height:100px;width:647px;"> * Zutaten müssen auf geeignete Konzentrationen vor der Zugabe in Medien vorbereitet werden. Siehe Materialliste für weitere Anweisungen. </td></tr><tr height="100"><td colspan="3"height = &quot;100&quot; style = &quot;height: 100px; width: 647px;&quot;&gt; ** Nach Zutaten gemischt sind, sterile Filtermedien und aliquoten. 20 ˚ C - Medien können bis zu 6 Monate im eingefroren werden </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Media-Komponenten.

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Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

Eine Technik, um Cholangiozyten aus den extrahepatischen Gallengänge von neugeborenen Mäusen zu isolieren, wird beschrieben. Die Kanäle sind sorgfältig seziert und dann Zellen werden durch Auswuchs in dicken Kollagen-Gelen isoliert. Diese Methode bietet ein nützliches Werkzeug für das Studium extrahepatischen Gallengang Entwicklung und Pathologie.

Isolierung von Neugeborenen Extrahepatische Cholangiozyten

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

isolation-of-neonatal-extrahepatic-cholangiocytes

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.2K Aufrufe.  The Children's Hospital of Philadelphia.  Eine Technik, um Cholangiozyten aus den extrahepatischen Gallengänge von neugeborenen Mäusen zu isolieren, wird beschrieben. Die Kanäle sind sorgfältig seziert und dann Zellen werden durch Auswuchs in dicken Kollagen-Gelen isoliert. Diese Methode bietet ein nützliches Werkzeug für das Studium extrahepatischen Gallengang Entwicklung und Pathologie. 

Serie: Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories due to the large size of the pancreatic duct that allows for ready collagenase injection and subsequent tissue perfusion. In contrast, islet isolation from small pancreata, like that of neonatal mice, is challenging because perfusion is not readily achievable in the small pancreata. Here we describe a detailed simple procedure that recovers substantial numbers of islets from newly born mice with visual assistance. Freshly dissected whole pancreata were digested with 0.5 mg/mL collagenase IV dissolved in Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) at 37 &#176;C, in microcentrifuge tubes. Tubes were tapped regularly to aid tissue dispersal. When most of the tissue was dispersed to small clusters around 1 mm, lysates were washed three to four times with culture media with 10% fetal bovine serum (FBS). Islet clusters, devoid of recognizable acinar tissues, can then be recovered under dissecting stereoscope. This method recovers 20 - 80 small- to large-sized islets per pancreas of newly born mouse. These islets are suitable for most conceivable downstream assays, including insulin secretion, gene expression, and culture. An example of insulin secretion assay is presented to validate the isolation process. The genetic background and degree of digestion are the largest factors determining the yield. Freshly made collagenase solution with high activity is preferred, as it aids in endocrine-exocrine isolation. The presence of cations [calcium (Ca2+) and magnesium (Mg2+)] in all solutions and fetal bovine serum in the wash/picking media are necessary for good yield of islets with proper integrity. A dissecting scope with good contrast and magnification will also help.

We describe a protocol herein for isolating intact islets from neonatal mice. Pancreata were partially digested with collagenase, followed by washing and hand picking. 20 - 80 islet clusters can be obtained per pancreas from newly born mice, which are suitable for several islet studies.

Effektive Isolation von funktionellen Inselchen von Neonatal Maus Pancreas

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Isolation and Enrichment of Liver Progenitor Subsets Identified by a Novel Surface Marker Combination

During chronic liver injuries, progenitor cells expand in a process called ductular reaction, which also entails the appearance of inflammatory cellular infiltrate and epithelial cell activation. The progenitor cell population during such inflammatory reactions has mostly been investigated using single surface markers, either by histological analysis or by flow cytometry-based techniques. However, novel surface markers identified various functionally distinct subsets within the liver progenitor/stem cell compartment. The method presented here describes the isolation and detailed flow cytometry analysis of progenitor subsets using novel surface marker combinations. Moreover, it demonstrates how the various progenitor cell subsets can be isolated with high purity using automated magnetic and FACS sorting-based methods. Importantly, novel and simplified enzymatic dissociation of the liver allows for the isolation of these rare cell populations with a high viability that is superior in comparison to other existing methods. This is especially relevant for further studying progenitor cells in vitro or for isolating high-quality RNA to analyze the gene expression profile.

Liver injuries are accompanied by progenitor cell expansion that represents a heterogeneous cell population. Novel classification of this cellular compartment allows for the distinguishing of multiple subsets. The method described here illustrates the flow cytometry analysis and high purity isolation of various subsets that can be used for further assays.

Isolierung und Anreicherung von Progenitor-Subsets Leber identifiziert durch eine neuartige Oberflächenmarkerkombination

During chronic liver injuries, progenitor cells expand in a process called ductular reaction, which also entails the appearance of inflammatory cellular ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have no effective therapeutic options. Tools to study EHBD are very limited. Our purpose was to develop an organ-specific, versatile, adult stem cell-derived, preclinical cholangiocyte model that can be easily generated from wild type and genetically engineered mice. Thus, we report on the novel technique of developing an EHBD organoid (EHBDO) culture system from adult mouse EHBDs. The model is cost-efficient, able to be readily analyzed, and has multiple downstream applications. Specifically, we describe the methodology of mouse EHBD isolation and single cell dissociation, organoid culture initiation, propagation, and long-term maintenance and storage. This manuscript also describes EHBDO processing for immunohistochemistry, fluorescent microscopy, and mRNA abundance quantitation by real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). This protocol has significant advantages in addition to producing EHBD-specific organoids. The use of a conditioned medium from L-WRN cells significantly reduces the cost of this model. The use of mouse EHBDs provides almost unlimited tissue for culture generation, unlike human tissue. Generated mouse EHBDOs contain a pure population of epithelial cells with markers of endodermal progenitor and differentiated biliary cells. Cultured organoids maintain homogenous morphology through multiple passages and can be recovered after a long-term storage period in liquid nitrogen. The model allows for the study of biliary progenitor cell proliferation, can be manipulated pharmacologically, and may be generated from genetically engineered mice. Future studies are needed to optimize culture conditions in order to increase plating efficiency, evaluate functional cell maturity, and direct cell differentiation. Development of co-culture models and a more biologically neutral extracellular matrix are also desirable.

This protocol describes the production of a mouse extrahepatic bile duct 3-dimensional organoid system. These biliary organoids can be maintained in culture to study cholangiocyte biology. Biliary organoids express markers of both progenitor and biliary cells and are composed of polarized epithelial cells.

Generation von Organellen von Maus extrahepatische Gallenwege

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the uremic milieu, oxidative stress, endotoxemia and the decreased clearance of circulating proinflammatory cytokines by producing a large number of acute-phase reactants. Experimental tools to study inflammation and the underlying role of hepatocytes are crucial to understand the regulation and contribution of hepatic cytokines to a systemic acute phase response and a prolonged pro-inflammatory scenario, especially in an intricate setting such as chronic kidney disease. Since studying complex mechanisms of inflammation in vivo remains challenging, resource-intensive and usually requires the usage of transgenic animals, primary isolated hepatocytes provide a robust tool to gain mechanistic insights into the hepatic acute-phase response. Since this in vitro technique features moderate costs, high reproducibility and common technical knowledge, primary isolated hepatocytes can also be easily used as a screening approach. Here, we describe an enzymatic-based method to isolate primary murine hepatocytes, and we describe the assessment of an inflammatory response in these cells using ELISA and quantitative real-time PCR.

Here, we show an enzymatic approach to isolate primary hepatocytes from adult mice, and we describe the quantification of an inflammatory response using ELISA and real-time PCR.

Die Induktion einer entzündlichen Reaktion in der Primär Hepatozyten-Kulturen von Mäusen

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

Immunologie und Infektion

Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In addition, liver stem cells are hypothesized to be the precursors for a subset of liver cancer, Hepatocellular carcinoma. One of the primary challenges to stem cell work in any solid organ like the liver is the isolation of a rare population of cells for detailed analysis. For example, the vast majority of cells in the liver are hepatocytes (parenchymal fraction), which are significantly larger than non-parenchymal cells. By enriching the specific cellular compartments of the liver (i.e. parenchymal and non-parenchymal fractions), and selecting for CD45 negative cells, we are able to enrich the starting population of stem cells by over 600-fold.The proceduresdetailed in this report allow for a relatively rare population of cells from a solid organ to be sorted efficiently. This process can be utilized to isolateliver stem cells from normal murine liver as well as chronic liver injury models, which demonstrate increased liver stem cell proliferation. This method has clear advantages over standard immunohistochemistry of frozen or formalin fixed liver as functional studies using live cells can be performed after initial co-localization experiments. To accomplish the procedure outlined in this report, a working relationship with a research based flow-cytometry core is strongly encouraged as the details of FACS isolation are highly dependent on specialized instrumentation and a strong working knowledge of basic flow-cytometry procedures. The specific goal of this process is to isolate a population of liver stem cells that can be clonally expanded in vitro.

Here we describe the isolation of CD133 expressing liver stem cells and cancer stem cells from whole murine liver, a process that requires tissue digestion, cell enrichment, and flow cytometry isolation. We include methods for advanced single cell isolation and clonal expansion.

Isolierung von CD133 + Leber-Stammzellen für die klonale Expansion

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In ...

Biologie

Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic Stellate cells (HSC). Two-dimensional (2D) culture of primary human hepatocyte (PHH) is still considered as the &#34;gold standard&#34; for in vitro testing of drug metabolism and hepatotoxicity. It is well-known that the 2D monoculture of PHH suffers from dedifferentiation and loss of function. Recently it was shown that hepatic NPC play a central role in liver (patho-) physiology and the maintenance of PHH functions. Current research focuses on the reconstruction of in vivo tissue architecture by 3D- and co-culture models to overcome the limitations of 2D monocultures. Previously we published a method to isolate human liver cells and investigated the suitability of these cells for their use in cell cultures in Experimental Biology and Medicine1. Based on the broad interest in this technique the aim of this article was to provide a more detailed protocol for the liver cell isolation process including a video, which will allow an easy reproduction of this technique.
Human liver cells were isolated from human liver tissue samples of surgical interventions by a two-step EGTA/collagenase P perfusion technique. PHH were separated from the NPC by an initial centrifugation at 50 x g. Density gradient centrifugation steps were used for removal of dead cells. Individual liver cell populations were isolated from the enriched NPC fraction using specific cell properties and cell sorting procedures. Beside the PHH isolation we were able to separate KC, LEC and HSC for further cultivation.
Taken together, the presented protocol allows the isolation of PHH and NPC in high quality and quantity from one donor tissue sample. The access to purified liver cell populations could allow the creation of in vivo like human liver models.

A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

Protokoll für die Isolierung von primären humanen Hepatozyten und entsprechende Hauptpopulationen von Nicht-parenchymale Leberzellen

Beside parenchymal hepatocytes, the liver consists of non-parenchymal cells (NPC) namely Kupffer cells (KC), liver endothelial cells (LEC) and hepatic ...

Extrahepatic Bile Duct and Gall Bladder Dissection in Nine-Day-Old Mouse Neonates

The dissection of murine neonatal bile ducts has been described as difficult. The main aim of the described standard operating procedure is the isolation of the extrahepatic bile duct (EBD) in mouse neonates without damaging the bile duct during preparation. Because of its exceptionally close preparation compared to the cholangiocytes cell line and harvesting of the entire extrahepatic bile duct system (EBDS), the described approach is extremely useful in researching animal models of newborn bile duct disorders, such as biliary atresia. After euthanasia, the peritoneal cavity was accessed, and the bile duct system, duodenum, and liver were extracted with the unique En-bloc-Resection (EbR). The extracted sample is placed on a foam mat, and the EBD is dissected from contaminating cells atraumatically without necessary touch. The dissection of the entire EBDS is a significant advantage of this method. Caution must be taken due to the small size and amount of bile duct tissue. Using the described technique, there is no damage to the cholangiocytes. Further, the purity of the technique is reproducible (n = 10). Therefore, optimally comparable samples can be harvested. Furthermore, no bile duct tissue is harmed, because any contact with the bile duct system can be avoided during preparation, leaving the bile fluid inside the gall bladder. Most importantly, while performing the final gall bladder and bile duct dissection, atraumatic microinstruments were used only slightly lateral of the bile duct without squeezing it. This is the key to a clean and intact sample, and essential for further histological investigation or the isolation of cholangiocytes. To summarize, the described innovative dissection technique enables especially inexperienced operators with the necessary equipment to isolate the EBDS as cleanly as possible.

For the observation of murine neonatal bile duct disorders, an intact bile duct and efficient preparation are required. Therefore, a new approach for isolating the entire extrahepatic bile duct system in murine neonates was successfully developed while maintaining the integrity of the bile duct.

Extrahepatische Gallengangs- und Gallenblasendissektion bei neun Tage alten Maus-Neugeborenen

The dissection of murine neonatal bile ducts has been described as difficult. The main aim of the described standard operating procedure is the isolation ...

Medizin

Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream single-cell applications is challenging. A marked accumulation of lipids within regenerating hepatocytes is observed during the first 2 days of normal liver regeneration in mice. This so-called transient regeneration-associated steatosis (TRAS) is temporary but partially overlaps the major proliferative phase. Density-gradient purification is the backbone of most existing protocols for the isolation of primary hepatocytes. As gradient purification relies on the density and size of cells, it separates non-steatotic from steatotic hepatocyte populations. Therefore, fatty hepatocytes often are lost, yielding non-representative hepatocyte fractions. 
The presented protocol describes an easy and reliable method for the in vivo isolation of regenerating hepatocytes regardless of their lipid content. Hepatocytes from male C57BL/6 mice are isolated 24-48 h after hepatectomy by a classic two-step collagenase perfusion approach. A standard peristaltic pump drives the warmed solutions via the catheterized inferior vena cava into the remnant, using a retrograde perfusion technique with outflow through the portal vein. Hepatocytes are dissociated by collagenase for their release from the Glisson's capsule. After washing and careful centrifugation, the hepatocytes can be used for any downstream analyses. In conclusion, this paper describes a straightforward and reproducible technique for the isolation of a representative population of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice. The method may also aid the study of fatty liver disease.

Lipid-laden hepatocytes are inherent to liver regeneration but are usually lost upon density-gradient centrifugation. Here, we present an optimized cell isolation protocol that retains steatotic hepatocytes, yielding representative populations of regenerating hepatocytes after partial hepatectomy in mice.

Isolierung regenerierender Hepatozyten nach partieller Hepatektomie bei Mäusen

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream ...

Isolation and 3D Collagen Sandwich Culture of Primary Mouse Hepatocytes to Study the Role of Cytoskeleton in Bile Canalicular Formation In Vitro

Hepatocytes are the central cells of the liver responsible for its metabolic function. As such, they form a uniquely polarized epithelium, in which two or more hepatocytes contribute apical membranes to form a bile canalicular network through which bile is secreted. Hepatocyte polarization is essential for correct canalicular formation and depends on interactions between the hepatocyte cytoskeleton, cell-cell contacts, and the extracellular matrix. In vitro studies of hepatocyte cytoskeleton involvement in canaliculi formation and its response to pathological situations are handicapped by the lack of cell culture, which would closely resemble the canaliculi network structure in vivo. Described here is a protocol for the isolation of mouse hepatocytes from the adult mouse liver using a modified collagenase perfusion technique. Also described is the production of culture in a 3D collagen sandwich setting, which is used for immunolabeling of cytoskeletal components to study bile canalicular formation and its response to treatments in vitro. It is shown that hepatocyte 3D collagen sandwich cultures respond to treatments with toxins (ethanol) or actin cytoskeleton altering drugs (e.g., blebbistatin) and serve as a valuable tool for in vitro studies of bile canaliculi formation and function.

Presented here is a protocol for the isolation of mouse hepatocytes from adult mouse livers using a modified collagenase perfusion technique. Also described is the long-term culture of hepatocytes in a 3D collagen sandwich setting as well as immunolabeling of the cytoskeletal components to study bile canalicular formation and its response to treatment.

Isolation und 3D Kollagen Sandwich Kultur der primären Maus Hepatozyten, um die Rolle des Zytoskeletts in Bile Canalicular Formation In Vitro zu studieren

Hepatocytes are the central cells of the liver responsible for its metabolic function. As such, they form a uniquely polarized epithelium, in which two or ...

Isolation of Primary Rat Hepatocytes with Multiparameter Perfusion Control

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure for primary hepatocyte isolation is technically challenging, especially in portal vein cannulation. The procedure is also prone to occasional contamination and variations in perfusion conditions due to difficulties in the assembly, optimization, or maintenance of the perfusion setup. Here, a detailed protocol for an improved two-step collagenase perfusion procedure with multiparameter perfusion control is presented. Primary rat hepatocytes were successfully and reliably isolated by taking the necessary technical precautions at critical steps of the procedure, and by reducing the operational difficulty and mitigating the variability of perfusion parameters through the adoption of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control, and real-time monitoring and alarm system. The isolated primary rat hepatocytes consistently exhibit high cell viability (85%-95%), yield (2-5 x 108 cells per 200-300 g rat) and functionality (albumin, urea and CYP activity). The procedure was complemented by an integrated perfusion system, which is compact enough to be set up in the laminar flow hood to ensure aseptic operation.

This protocol details the use of a special intravenous catheter, standardized sterile disposable tubing, temperature control complemented by real-time monitoring, and an alarm system for two-step collagenase perfusion procedure to improve the consistency in the viability, yield, and functionality of isolated primary rat hepatocytes.

Isolierung primärer Rattenhepatozyten mit Multiparameter-Perfusionskontrolle

Primary hepatocytes are widely used in basic research on liver diseases and for toxicity testing in vitro. The two-step collagenase perfusion procedure ...