These experiments have been supported by research grants from Merck and Co. and Summit, PLC.

1. בידוד C. difficile ממקורות סביבתיים או קליניים שונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד סביבתי: שימוש במדד כותנה טרום מעוקרים (רטוב קלות עם 0.85% NaCl), ספוג את פני השטח של כל תחום עניין (קומה, דלת, ידית, מדף וכו &#39; ). 8 הקפד ללבוש כפפות סטריליות במקום ספוגית צינור מעוקר לאחר השלמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבודד קליני (שרפרף): צלחת 10 עד 100 מ&quot;ג של דגימות צואה קלינית על cefoxitin-cycloserine-fructose אגר (CCFA) באמצעות לולאה חיסון ו דגירה בתנאים אנאירוביים מחמירים עבור 48 - 72 שעות. חנות מושבות מבודדות של מניות C. difficile cryovials ב -80 מעלות צלזיוס לניתוחים נוספים. 7 , 9 , 10 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעשיר את דגימות ספוגית הסביבה במוח הלב עירוי (BHI) מרק עם 0.05% taurocholate נתרן מקום בחדר אנאירובית ב 37 מעלות צלזיוסבמשך 5 ימים. צנטריפוגה 1 מ&quot;ל של התרבות ב XG 10,000 ו resuspend גלולה μL 100 של אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט התאים resuspended (50 μL) על cycloserinecefoxitin אגר fructose (CCFA) צלחות דגירה בחדר אנאירובית ב 37 מעלות צלזיוס במשך 40 - 48 שעות. חנות מושבות מבודדות של מניות C. difficile cryovials ב -80 מעלות צלזיוס לניתוחים נוספים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחן חשודים מושבות C. difficile באמצעות מגיב לטקס לטקס או PCR. </li></ol> 2. Culturing C. difficile והרג תהליכים קינטיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול מטוהרים סביבתיים או קליניים C. זנים difficile על צלחות אגר דם בחדר אנאירובית ב 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח מושבה בודדת אחת עם לולאה חיסון, להעביר אותו 5 בינוני מ&quot;ל BHI בצינור 15 מ&quot;ל, ולגדול במשך 24 שעות בתא אנאירובית ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את תרבויות מראש 1: 100 עד כ 10 6 מושבה להרכיב יחידהS (CFU) / מ&quot;ל ​​ב BHIS טריים מופחת מראש (BHI בתוספת 5 גרם / L תמצית שמרים 1% L- ציסטאין) בתוספת 0.1% נתרן taurocholate ואת הריכוז המתאים של אנטיביוטיקה (T0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף מדגם 1 מ&quot;ל עם פיפטה בכל נקודת זמן (T0, T6, T24, T48) ו צלחת / להפיץ aliquot קטן (100 μL בדילול סדרתי) על צלחת אגר דם. בואו התאים לגדול על צלחת אגר דם במשך 48 שעות בתא אנאירובית ב 37 ° C ולספור את מספר המתקבל של מושבות לקבוע CFU. </li></ol> הכנת דוגמאות עבור סריקת מיקרוסקופית אלקטרונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף 1 מ&quot;ל של תאים מנקודת זמן בכל צינורות microcentrifuge ו צנטריפוגה ב XG 10,000 במשך 10 דקות. מחק את supernatant תאים לשטוף PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות ב XG 10,000 במשך 10 דקות שוב להשליך supernatant. מחדש לדלל תאים 1 מ&quot;ל של paraformaldehyde 4% ו דגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות שוב 10 דקות ב 10,000 xg וזורקים supernatant. לשטוף תאים פעמיים עם מים מזוקקים ו redillute ב 100 μL של מים מזוקקים. התאם את עוצמת הקול בהתאם עכירות של הפתרון. הערה: ביצוע דילולים סדרתי מרובים הוא רעיון טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית coverslips ולהוסיף 40 μL של המדגם על זה. לדגור במשך 15 דקות במנוע הזרימה להתאדות הנוזל ולאפשר לתאים לדבוק coverslip. אם הנוזל עדיין קיים, השתמשו במפוח כדי להסיר את הנוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום coverslips שכותרתו עם תאים בשולחן מכונת המקרטעת ואת הקלטת למטה. זהב טהור מאובטח במכונה המקרטעת. הפעל את המכונה והתחל לדהור בלחץ נמוך (50 mTorr). תאים מעיל עבור 30 s ב 80 mA, אשר מתרגמת 20 ננומטר של ציפוי זהב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תאים מצופים אל מיקרוסקופ אלקטרונים סורק. </li></ol> 4. הדמיה ג תאים difficile על מיקרוסקופ אלקטרונים סורק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) כראוי על ידי יחסי ציבורEssing את לחצן הפתיחה על תוכנת המחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות קלטת פחמן, מאובטח coverslips מצופה על במת מתכת. לאחר SEM הוא פרקו, הדלת צריכה לפתוח בקלות. נעל את הבמה המתכת לתוך תא SEM ידי דופק אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על לחצן PUMP בתוכנת המחשב. SEM יהיה שמיש כאשר המערכת קוראת &quot;אישור OK&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על גלאי SE תחת הכרטיסייה גלאים. הפעל את הקורה על ידי לחיצה על הלחצן המציג את המתח. התחל הדמיה במתח נמוך (5 קילו וולט) לפני המתח הגובר (עד 15 קילו וולט). תמונה תופיע לאחר שהקורה מופעלת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פונקציית המעקב, למצוא שטח על coverslips מצופה לתמונה. זום לתוך האזור ולמצוא מבנים בצורת מוט; אלה הם clustridium difficile . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקרב והתמקד בתמונה כדי לכייל את המערכת. זה צריך להיעשות במרחקים עבודה מרובות: 15, 9 ו - 5 מ&quot;מ. תמונה במרחק עבודה של 5 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את ULtra מצב הדמיה ברזולוציה גבוהה ולהתחיל להתמקד לייעל אסטיגמציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל להתמקד בהגדלה גבוהה. השתמש להתמקד גס עדין עבור זה. התאם אסטיגמציה גם כדי לקבל תמונה ברורה יותר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם אסטיגמציה בהגדלה גבוהה. כדי לעשות זאת, להתאים את אסטיגמטיזם מחליף (הם נראים דומים קנס / להתמקד מחוספס להתמקד) ולבדוק את התמונה לבהירות דיגיטלית על ידי התקרבות על תוכנת המחשב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Se את פונקציית סריקה איטית לאסוף תמונה באיכות גבוהה. שמור את התמונה שנאספה כקובץ TIFF, שישמש לניתוח. ודא את שורת הנתונים נבחרה אם המדידות ייעשה במהלך הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תמונות בזוויות שונות (עד 52 ° על ידי הפיכת באופן ידני את הזווית ישירות על SEM. תמונות זווית נוטים לחשוף מידע עומק יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי מתח קרן בהתאם לתאים כי הם הדמיה. שמור את זה בעיקר בין 5-15 kV לכל הניסויים. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההדמיה הושלמה, להפוך את קרן ולהעלות את המרחק עובד 20 מ&quot;מ. החדר יכול אז להיות vented ואת הבמה ניתן להסיר. להעתיק את כל התמונות על הכונן לניתוח נוסף. </li></ol> 5. עיבוד תמונה וניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הורד והתקן את התוכנה הזמינה באופן חופשי, FIJI (http://fiji.sc), אל המחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את קובץ התמונה ב- FIJI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פונקציית הקו, עקוב בדיוק אחר סרגל הסולם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכרטיסייה ניתוח בתוכנית FIJI ולבסוף לבחור את הפונקציה בחר סולם. יופיע חלון שיידרש את הגדרת המרחק הידוע בהתבסס על סרגל הסולם. לשנות את יחידת אורך גם כן ולחץ על אישור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו כי התוכנית מכויל למרחק, להשתמש בפונקציה הקו למדוד אורך התא. כדי להשיג את אורך, להשתמש בפונקציה הקו כדי לעקוב אחר התא בשלמותו. בחר שוב בכרטיסייה ניתוח ולאחר מכן לחץ על מדידה. אורך צריך Appהאוזן ביחידות שצוין קודם לכן. </li></ol>

<ol>
	<li>Lessa, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burden+of+Clostridium+difficile+infection+in+the+United+States.">Burden of Clostridium difficile infection in the United States.</a> N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).</li><li>Vickers, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ridinilazole:+a+novel+therapy+for+Clostridium+difficile+infection.">Ridinilazole: a novel therapy for Clostridium difficile infection.</a> Int J Antimicrob Agents. 48 (2), 137-143 (2016).</li><li>Shah, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+difficile+infection:+update+on+emerging+antibiotic+treatment+options+and+antibiotic+resistance.">Clostridium difficile infection: update on emerging antibiotic treatment options and antibiotic resistance.</a> Expert Rev Anti Infect Ther. 8 (5), 555-564 (2010).</li><li>Ambrose, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+EMA+guideline+for+antimicrobial+development.">New EMA guideline for antimicrobial development.</a> Lancet Infect Dis. 12 (4), 265-266 (2012).</li><li>Bass&#232;res, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+on+toxin+production+and+cell+morphology+in+Clostridium+difficile+by+ridinilazole+(SMT19969),+a+novel+treatment+for+C.+difficile+infection.">Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection.</a> J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).</li><li>Endres, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+imaging+the+pharmacological+effects+of+antibiotic+treatment+on+Clostridium+difficile.">A novel method for imaging the pharmacological effects of antibiotic treatment on Clostridium difficile.</a> Anaerobe. 40, 10-14 (2016).</li><li>Endres, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+Effects+of+Surotomycin+Treatment+on+Clostridium+difficile+Toxin+A+and+B+Production,+Immune+Response,+and+Morphological+Changes.">Evaluating the Effects of Surotomycin Treatment on Clostridium difficile Toxin A and B Production, Immune Response, and Morphological Changes.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60 (6), 3519-3523 (2016).</li><li>Alam, M. J., Anu, A., Walk, S. T., Garey, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+potentially+pathogenic+Clostridium+difficile+contamination+in+household+environs.">Investigation of potentially pathogenic Clostridium difficile contamination in household environs.</a> Anaerobe. 27, 31-33 (2014).</li><li>Aitken, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+the+Endemic+Setting,+Clostridium+difficile+Ribotype+027+Is+Virulent+But+Not+Hypervirulent.">In the Endemic Setting, Clostridium difficile Ribotype 027 Is Virulent But Not Hypervirulent.</a> Infect Control Hosp Epidemiol. , 1-6 (2015).</li><li>Basseres, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+on+toxin+production+and+cell+morphology+in+Clostridium+difficile+by+ridinilazole+(SMT19969),+a+novel+treatment+for+C.+difficile+infection.">Impact on toxin production and cell morphology in Clostridium difficile by ridinilazole (SMT19969), a novel treatment for C. difficile infection.</a> J Antimicrob Chemother. 71 (5), 1245-1251 (2016).</li><li>Walters, B. A., Roberts, R., Stafford, R., Seneviratne, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relapse+of+antibiotic+associated+colitis:+endogenous+persistence+of+Clostridium+difficile+during+vancomycin+therapy.">Relapse of antibiotic associated colitis: endogenous persistence of Clostridium difficile during vancomycin therapy.</a> Gut. 24 (3), 206-212 (1983).</li><li>Chilton, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+effect+of+oritavancin+on+Clostridium+difficile+spore+germination,+outgrowth+and+recovery.">Evaluation of the effect of oritavancin on Clostridium difficile spore germination, outgrowth and recovery.</a> J Antimicrob Chemother. 68 (9), 2078-2082 (2013).</li><li>Ofosu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clostridium+difficile+infection:+a+review+of+current+and+emerging+therapies.">Clostridium difficile infection: a review of current and emerging therapies.</a> Ann Gastroenterol. 29 (2), 147-154 (2016).</li><li>McDonald, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epidemic,+toxin+gene-variant+strain+of+Clostridium+difficile.">An epidemic, toxin gene-variant strain of Clostridium difficile.</a> New Eng J Med. 353 (23), 2433-2441 (2005).</li></ol>

KWG has received past and current research support from Merck &amp; Co. and Summit, PLC.

מטרת המחקר הנוכחי הייתה ליצור שיטת תפוקה גבוהה לבידוד C. difficile ובדיקת רגישות אנטיביוטית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) כאמצעי לאפיון יסודי יותר של הפעולה הפרמקולוגית של האנטיביוטיקה. באמצעות הפרוטוקולים המפורטים כאן, הוכחנו כי הדמיה התגובה הפנוטיפית של התא לטיפול אנטיביוטי יכול לחשוף תובנה הפעולה הפרמקולוגית של התרופה. בסך הכל, החלק הדמיה של פרוטוקול זה לוקח בערך 2 שעות משך לאחר איסוף התאים, אבל יכול להיות הרבה יותר מפלה מאשר הרג טיפוסי מחקרים קינטיים לבד. בעוד הלמידה להשתמש SEM יכול להיות תובעני מבחינה טכנית, הכנת דגימות היא פשוטה יחסית ומהירה. אנו מאמינים כי הפרוטוקולים המפורטים כאן יספקו גישה אובייקטיבית להערכת הפעולה הפרמקולוגית של טיפול אנטיביוטי. בהתחשב הדמיון בין tהוא עקומות הרג אנטיביוטי ( איור 2 ), ביקשנו לקבוע אם יש הבדלים בין התגובה של התא לטיפול תרופתי. באמצעות SEM, קבענו כי metronidazole היו השפעות על אורך התא בריכוז supraMIC של התרופה. בעוד שפנוטיפים אלה לא דווחו בעבר, הם עולים בקנה אחד עם מנגנוני הפעולה של האנטיביוטיקה ומציעים השפעה על חילוף החומרים והתאים של תאים. לעומת זאת, לונקומיצין היו השפעות משמעותיות על דופן התא, אשר גם עקבית עם מנגנון הפעולה שלה. 13 אמנם יש קווי דמיון בין קינטיקה להרוג בין אנטיביוטיקה אלה, זה נראה מן התמונות SEM כי ישנם הבדלים פנוטיפיים משמעותיים. יצירת ספריית פנוטיפ אנטיביוטי יאפשר אפיון יסודי יותר של תרופות שעשויות שלא להיות מנגנון ברור של פעולה מזוהה, כמו במקרה של ridinilazole. becausשיטה זו היא מאתגרת מבחינה טכנית, שינויים ייתכן שיהיה צורך על מנת לענות על השאלה המדעית כולל התא הכנה עקבית ושינויים ב sputtering של ציפוי זהב. ציפוי רב מדי עלול לטשטש את כל ההשפעות החיצוניות של התאים, אבל לא ציפוי מספיק יכול לגרום לחייב את קרן ו לסלף את התמונות. כדי למנוע זאת, להכין דוגמאות עם כמויות שונות של ציפוי זהב כדי לייעל את הזמן המקרטעת. לבסוף, מתודולוגיה עקבית בין המחקרים תאפשר השוואות בין-ניסיוניות. מגבלה של שימוש ב- SEM היא כי הוא מוגבל לתצפיות מורפולוגיה התא התא; לפיכך, יש צורך במחקרים פונקציונליים כדי לאשר כל תגובה חשודה. בגלל זה, אנו מאמינים כי פרוטוקול הדמיה זה יכול לשמש כאמצעי לבימוי מחקרים תפקודיים. למרות הגבלה זו, תיוג immunogold יכול להיעשות באמצעות SEM לאשר כל השינויים החשודים בסחר בחלבון או צבירה;עם זאת, עדיין לא ערכנו ניסויים אלה. בשל צינור פעיל של אנטיביוטיקה חדשה לטיפול C. difficile, הערכה יסודית יותר של פעילות סמים הוא הכרחי. כפי שמוצג כאן, SEM מציעה ייחודי, תפוקה גבוהה, הזדמנות אמינה לאפיין פעילות תרופתי. על ידי הדמיה של השפעות אנטיביוטיות שונות בין זנים שונים של C. difficile , נוכל להבין מדוע אנטיביוטיקה מסוימים יעילים יותר מאחרים כנגד זנים פתוגניים ספציפיים כמו המתח ב- 027 / NAP1 / BI. 14 יתר על כן, ניתוח SEM עשוי להיות מועיל להפלות השפעות אנטיביוטיות בין ribotypes או זנים יכול לשמש כדי לחקור מינים חיידקים אחרים הוכחת תחולת רחבה שלה.

Clostridium difficile הוא חיידק החיידק החיידקי , הגורם לגרימת כ -500,000 זיהומים בשנה בארה&quot;ב ונחשב לאיום פתולוגי דחוף לאיום על ידי המרכזים לבקרת מחלות ומניעתן (CDC), רמת הסיכון הגבוהה ביותר. 1 בעשור האחרון חלה התפתחות משמעותית של תרופות במיקרוביאלים עם פעילות נגד C. difficile . 2 , 3 במבחנה הלימודים הם מרכיב הכרחי של תהליך הפיתוח של התרופה. 4 באופן מסורתי, רגישות במבחנה והזמן להרוג מחקרים משמשים כדי לאמת בעתיד חיה ואחרים במחקר vivo . בעוד ששיטות אלה משמשות תפקיד חשוב בהערכת פעולת הריגה, הן אינן קולטות את התגובה הפנוטיפית של התאים לטיפול תרופתי. על ידי שילוב מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) עם standarD הריגת מחקרים קינטיים, אפיון יסודי יותר של ההשפעות הישירות של אנטיביוטיקה אפשרי. 5 , 6 , 7 כאן, אנו מציגים שיטה שבה SEM משמש כאמצעי פרופיל פרופיל היעילות של טיפול אנטיביוטי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>cotton gauze&#160;</td>
			<td>Caring</td>
			<td>PRM21408C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Macron</td>
			<td>7532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion (BHI)&#160;</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C5141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A10389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium taurocholate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A18346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anaerobic chamber</td>
			<td>Coy</td>
			<td></td>
			<td>vinyl anaerobic chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cycloserinecefoxitin fructose agar (CCFA) plates</td>
			<td>Anaerobe systems</td>
			<td>AS-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blood agar plates</td>
			<td>Hardy diagnostics</td>
			<td>A-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>latex agglutination reagent</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>DR1107A</td>
			<td>C. diff test kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>222363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-259-98</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides</td>
			<td>J. Melvin freed brand</td>
			<td>7525M</td>
			<td>75x25mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flow hood</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>Class II type A2&#160;</td>
			<td>biosafety cabinet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desk sputtering machine</td>
			<td>Denton Vacuum</td>
			<td>Desk II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tape</td>
			<td>Plastic Core</td>
			<td>05072-AB</td>
			<td>SPI Double Sided Adhesive Carbon Tape</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gold</td>
			<td>Denton Vacuum</td>
			<td>TAR001-0158</td>
			<td>2.375&#8221; Diameter x .002&#8221; Thick Gold foil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scanning electron microscope</td>
			<td>FEI</td>
			<td>XL-30</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protocol to characterize the morphological changes of clostridium difficile in response to antibiotic treatment

הערכה של פעילות אנטיביוטית עם פיתוח תרופות חדשות מכוונת נגד חיידקים אנאירוביים קשה ותובענית מבחינה טכנית. כדי לקבל תובנה אפשרי MOA, שינויים מורפולוגיים הקשורים לחשיפה אנטיביוטיקה ניתן דמיינו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM). שילוב הדמיה SEM עם עקומות להרוג מסורתיים עשוי לשפר את התובנה שלנו לתוך הפעולה סמים לקדם את תהליך הפיתוח של התרופה. כדי לבדוק את הנחת היסוד, להרוג עקומות ומחקרים SEM בוצעו באמצעות תרופות עם ידוע אך שונה MOA (vancomycin ו metronidazole). ג תאים difficile (R20291) גדלו עם או ללא נוכחות של אנטיביוטיקה עד 48 שעות. במהלך 48 שעות המרווח, תאים נאספו בנקודות זמן מרובות כדי לקבוע יעילות אנטיביוטיקה עבור הדמיה על SEM. בהתאם לדו&quot;חות קודמים, vancomycin ו- metronidazole היו בעלי פעילות חיידקית משמעותית לאחר 24 שעות של טיפול, כפי שנמדד על ידי היחידה להרכיב מושבות (CFU)טינג. באמצעות הדמיה SEM קבענו כי metronidazole היו השפעות משמעותיות על אורך התא (&gt; ירידה של 50% באורך התא עבור כל אנטיביוטיקה, P &lt;0.05) לעומת בקרים ו ונקומיצין. בעוד התגובה הפנוטיפית לטיפול תרופתי לא תועדה בעבר באופן זה, הם עולים בקנה אחד עם MOA של התרופה המדגימה את הרבגוניות והאמינות של ההדמיה והמדידות ואת היישום של טכניקה זו עבור תרכובות ניסיוניות אחרות.

Clostridium difficile הוא חיידק להרכיב נבג ולכן חשוב לקבוע את ההבדלים מורפולוגיה בין תאים צמחיים ו נבג לפני ניתוח פונקציונלי. איור 1 מציג תמונות מייצגות של תאים צמחיים שנתפסו במהלך השלב המעריכי של עקומת הצמיחה ותאי נבג. כפי שמתואר, תאים צמחיים הם מבנים ארוכים, חלקה, בצורת מוט, ואילו נבגים הם מבנים קטנים, סגלגל בעל החיצוני מחוספס. מבחינה תפקודית, תאים צמחיים לגדול ולהתחלק במהירות אחראים על ארסיות של זיהומים C. difficile ידי הפרשת רעלים, בעוד נבגים הם רדומים בדרך כלל עם מעט פעילות. לפיכך, אנטיביוטיקה פעילה בעיקר נגד תאים צמחיים, בעוד נבגים הם בדרך כלל עמיד בפני טיפול בסמים, בשל מספר שכבות להגן על הליבה עם DNA, וחוסר פעילות פיזיולוגית. בשל עובדות אלה, הרובשל הניתוח המורפולוגי מתמקד בתאי הצומח. 11 , 12 עקומת הריגה אנטיביוטית היא המתודולוגיה הסטנדרטית להפגין יעילות אנטיביוטית נגד חיידקים גוברת. ריכוזים המשמשים עם C. difficile זן R20291 היו מבוססים על ערכי MIC, 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​עבור vancomycin ו 0.51 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​עבור metronidazole. 10 כפי שמוצג בתרשים 2 , תאי הבקרה גדלים ומגיעים למישור, בעוד שהתאים המטופלים יורדים ביחידות להרכבת המושבה הכוללת (CFU) עד לגבול של גילוי (LOD) הממחיש אפקט של חיידק. כפי שהוכח, vancomycin ( איור 2 א ) ו metronidazole ( איור 2 ב ) הם יעילים על הריגת C. difficile בריכוז supraMIC (4xMIC). ניתן להבחין כי עקומות הרג אנטיביוטי נראה דומה, אך לתרופות יש מנגנונים שונים של acTion (vancomycin מונע סינתזה קיר התא בעת metronidazole משפיע על שכפול דנ&quot;א). לכן, אנו מציעים כי עקומות הרג אנטיביוטי לא יכול להיות מספיק כוח מפלה לספק הבדלים מפורטים בין אנטיביוטיקה אלה. השתמשנו במיקרוסקופ כדי לספק יותר אפליה. בגלל הגודל המיקרוסקופי שלה, C. difficile לא ניתן תמונה ללא הגדלה גבוהה. זה סיפק הזדמנות לשימוש במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM), שיטת הדמיה שיכולה לקבל רזולוציה בקנה מידה ננומטר, כדי להעריך את ההשפעות המפורטות של טיפול אנטיביוטי ישירות על התאים. כדי להדגים את התועלת של גישה זו, תאים היו צילמו לפני ואחרי טיפול תרופתי כדי לקבוע כיצד השתנתה המורפולוגיה ( איור 3 א ). כפי שהוכח, חלק מקירות התאים נפגעו, כמו במקרה של ואנקומיצין, וחלק מהתאים היו קטנים יותר,כפי שהיה המקרה של metronidazole. כדי לבדוק אם גודל התא הושפע, ניתחנו אורך התא באמצעות FIJI התוכנית. גודל תא צמחי יכול להשתנות חלק במקרה שליטה, אבל רובם הם בערך 6 מיקרומטר אורך ( איור 3 ב ). כאשר בוחנים תאים רבים מן הבקרה והגדרות מטופלים, ניתן להבחין במהירות כי אורך התא מושפע מועדף metronidazole אבל לא מושפע טיפול vancomycin ( איור 3 ג ). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55383/55383fig1.jpg" /> איור 1: הבחנה בין סוגי תאים על ידי סריקת מיקרוסקופית אלקטרונים. המוצגים הם תמונות נציג של תאים Clostridium difficile difficile ו נבג. תאים צמחיים הם מבנים מוטות כי הם ארוכים דגל. לעומת זאת, תאי הנבגים קטנים ויש להם מעיל גס ומחוספס. נבגים הם בצבע פסאודו אדום עבור התמונה purpoSes בלבד. סרגלי סולם מוצגים בתמונות. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55383/55383fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55383/55383fig2.jpg" /> איור 2: אנטיביוטי זמן להרוג קורבס. עקומות הריגה SupraMIC בוצעו עבור ארבעה אנטיביוטיקה שונים: vancomycin (A) , metronidazole (B) . אנטיביוטיקה אלו היו פעולות הרג משמעותי נגד C. difficile זן R20291 והתקרב לגבול של זיהוי (LOD) לספירת יחידות המושבה להרכיב (CFU). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55383/55383fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55383/55383fig3.jpg" /> איור 3: בחינת ההשפעות הפרמקולוגיות של טיפול אנטיביוטי. תמונות של תאים מטופלים ולא מטופלים נלקחו בנקודות זמן מרובות במהלך הריגת מחקרים קינטיים (A) . המוצג הוא דוגמא מייצגת של תא גדילי בקרה שנמדד לאורך (B) . תאים מטופלים ולא מטופלים נמדדו והשוו (C) . הניסויים בוצעו לפחות לשכפל ו&gt; 17 תאים נמדדו לכל קבוצה. * P &lt;0.05 בהשוואה לקבוצות טיפול ווונקומיצין. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55383/55383fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment at JoVE.com

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

פרוטוקול לאפיין את השינויים המורפולוגיים של<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; בתגובה לטיפול אנטיביוטי

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

a-protocol-to-characterize-morphological-changes-clostridium

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

8.9K Views.  University of Houston College of Pharmacy. Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

Video: A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

שימוש בינוני כיח מלאכותית לבדיקת יעילות אנטיביוטי נגד<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; בתנאי רלוונטיים יותר ריאות סיסטיק פיברוזיס

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

גישה השוואתית כדי לאפיין את הנוף של אינטראקציות בין חלבונים מאכסן לפתוגן

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Clostridium difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is a significant nosocomial pathogen. C. difficile is notoriously difficult to isolate and cultivate and is extremely sensitive to even low levels of oxygen in the environment. Here, methods for isolating C. difficile from fecal samples and subsequently culturing C. difficile for preparation of glycerol stocks for long-term storage are presented. Techniques for preparing and enumerating spore stocks in the laboratory for a variety of downstream applications including microscopy and animal studies are also described. These techniques necessitate an anaerobic chamber, which maintains a consistent anaerobic environment to ensure proper conditions for optimal C. difficile growth. We provide protocols for transferring materials in and out of the chamber without causing significant oxygen contamination along with suggestions for regular maintenance required to sustain the appropriate anaerobic environment for efficient and consistent C. difficile cultivation.

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Clostridium difficile is a pathogenic bacterium that is a strict anaerobe and causes antibiotic associated diarrhea (AAD). Here, methods for isolating, culturing and maintaining C. difficile vegetative cells and spores are described. These techniques necessitate an anaerobic chamber, which requires regular maintenance to ensure proper conditions for optimal C. difficile cultivation.

Culturing ושמירה<em&gt; Difficile Clostridium</em&gt; בסביבת אנאירובית

Clostridium  difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium  that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

בניתוח חוץ גופייה של תיווך Myd88 הסלולרי תגובה החיסונית לוירוס הנילוס המערבי זיהום הזנים Mutant

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Phenomics הפאג: גישות פיזיולוגיות לאפיין חלבונים חדשים ויראלי

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

חומרי Biomimetic לאפיין אינטראקציות חיידקים-מארח

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and consequently poses an urgent threat to public health. Recurrence of a C. difficile infection (CDI) after successful treatment with antibiotics is high, occurring in 20-30% of patients, thus necessitating the discovery of novel therapeutics against this pathogen. Current animal models of CDI result in high mortality rates and thus do not approximate the chronic, insidious disease manifestations seen in humans with CDI. To evaluate therapeutics against C. difficile, a mouse model approximating human disease utilizing a clinically-relevant strain is needed. This protocol outlines the cefoperazone mouse model of CDI using a clinically-relevant and genetically-tractable strain, R20291. Techniques for clinical disease monitoring, C. difficile bacterial enumeration, toxin cytotoxicity, and histopathological changes throughout CDI in a mouse model are detailed in the protocol. Compared to other mouse models of CDI, this model is not uniformly lethal at the dose administered, allowing for the observation of a prolonged clinical course of infection concordant with the human disease. Therefore, this cefoperazone mouse model of CDI proves a valuable experimental platform to assess the effects of novel therapeutics on the amelioration of clinical disease and on the restoration of colonization resistance against C. difficile.

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

This protocol outlines the cefoperazone mouse model of Clostridium difficile infection (CDI) using a clinically-relevant and genetically-tractable strain, R20291. Emphasis on clinical disease monitoring, C. difficile bacterial enumeration, toxin cytotoxicity, and histopathological changes throughout CDI in a mouse model are detailed in the protocol.

Cefoperazone שטופל עכבר דגם של קליני רלוונטי<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; R20291 הזנים

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and ...

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host microbiome community diversity and alter the microbial community composition. Many diseases such as antibiotic-associated enterocolitis, inflammatory bowel disease, and metabolic disorders have been linked to a disrupted microbiota. The complex interplay between host, microbiome, and antibiotics needs a tractable model for studying host-microbiome interactions. Our freshwater vertebrate fish serves as a useful model for investigating the universal aspects of mucosal microbiome structure and function as well as analyzing consequential host effects from altering the microbial community. Methods include host challenges such as infection by a known fish pathogen, exposure to fecal or soil microbes, osmotic stress, nitrate toxicity, growth analysis, and measurement of gut motility. These techniques demonstrate a flexible and useful model system for rapid determination of host phenotypes.

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

This study involves methods to reveal effects on a model fish host following alteration of the skin and gut microbiome communities&#160;composition by an antibiotic.

בחינת פנוטיפים מארח ב<em&gt; Affinis Gambusia</em&gt; בעקבות טיפול אנטיביוטי

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

הקרנת מבחני לאפיין הרגולטורים אנדותל הרומן מעורבים בתגובה דלקתית

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Overexpression וטיהור האדם<em&gt; Cis</em&gt; פרנליטרונפרפרז ב<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...