We are grateful to Dr. Jos&#233; Luis Daniotti for comments. We thank the assistance to Dr. J. Arturo Pimentel and the Laboratorio Nacional de Microscop&#236;a Avanzada-UNAM for acquisition of confocal images. I.M.-D. and T.M.V.C. were supported by grants 157634 and 253596 from Consejo Nacional de Ciencia y Tecnolog&#236;a (CONACYT), Sociedad Latinoamericana de Glicobiolog&#236;a, A.C. T.M.V.-C. is recipient of a scholarship (245192) from CONACYT. We also thank the support of the Red Tem&#225;tica Glicociencia en Salud - CONACYT (253596).

דם היקפיים מתורמים זכר בריא הושג עם הסכמה מדעת ואישור ועדת הביו-אתיקה של Centro de Investigaciòn en Dinámica Celular- Universidad האוטונומית del Estado de Morelos. בידוד הפעלת 1. הנאיבי האדם CD4 + T תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף 2 מ&quot;ל של דם היקפיים נגזר מתורמים אדם בריא באמצעות הסכמה מדעת לדלל עם 2 מ&quot;ל של PBS-EDTA סטרילי (בופר פוספט 1x (PBS), 2 מ&quot;מ EDTA, pH 7.4). מוסיפים את דם מדולל לאט על גבי 3 מ&quot;ל של תמיסת סוכרוז עם 1.077 צפיפות כפי שתואר לעיל 8. הערה: הגירה דיפרנציאלי במהלך צנטריפוגה הנגרמת על ידי הבדלים בצפיפות תגרום אריתרוציטים משקעים לחלוטין שכבה של תאי mononuclear צפופים פחות תהווה לעיל. 2 מ&quot;ל של דם היקפיים יעבד כ 0.5 x 10 6 תאים מסוג CD4 + T נאיבי לאחר purificatiעל צעדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 30 דקות ב 250 XG ב 21 ° C (הרוטור לשימוש עבור צינורות תחתית עגולה עם בזווית קבועה של 30 מ&quot;מ) ללא הפסקה כדי ליצור שיפוע של תאי דם היקפיים mononuclear (PBMCs). לאחר צנטריפוגה, PBMCs ניתן להבחין בבירור כמו טבעת לבנה. אסוף את PBMCs עם טפטפת להעביר צינור סטרילי לרחצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שלושה שוטף עם פתרון PBS-EDTA ב 250 XG במשך 10 דקות והמשך טיהור של תאים מסוג CD4 + T נאיבי. שיטות מיון או מספר סוגים של ערכות טיהור זמינות למטרה זו. רצוי, להשתמש&gt; 1 x 10 7 PBMCs לטיהור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר נאיבי תאים מסוג CD4 + T על ידי סלקציה שלילית עם חרוזים מגנטיים. בצע סלקציה שלילית עם אנטי CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, אנטי TCRγ / δ, אנטי-HLA-DR, ו CD235a (א glycophorin) נוגדנים. להעריך את אחוז טוהר על ידי קביעת CD4 + CD45RA + תאים עד Fcytometry נמוכה. הערה: אם תרצה, תוכל להמשיך הדגירה של PBMCs לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עם צפיפות של 1 x 10 מ&quot;ל 6 תאים / ב 10 מ&quot;ל של מדיום בתוספת לקדם דבקות מונוציטים ולהמשיך עם טיהור תא נאיבי CD4 + T. ההתאוששות היעילה של תאים מהסוג CD4 + T נאיביים מדם היקפי תלויה במידה רבה על מערכת הטיהור. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן צלחות תרבית תאי 24 גם על ידי הוספת 250 μl לכל טוב של PBS עם 5 מיקרוגרם / מיליליטר נוגדנים חד שבטיים CD3 אנטי דגירה במשך שעה לפחות 2 ב 37 מעלות צלזיוס. הערה: צלחות עם 96 בארות ניתן להשתמש כאשר מספר קטן יותר מתאי CD4 + T נאיביים משמש (למשל, 2 x10 4 -1 x 10 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את דילול נוגדן CD3 אנטי מ -24 היטב או 96 צלחות היטב ולשטוף את הצלחות פעמיים באמצעות PBS 1x סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את תאי CD4 + T הנאיביים עם&gt; 95% של טוהר (CD4 +CD45RA +) לצפיפות של 1 x 10 מ&quot;ל 6 תאים / במדיום מתקדמים RPMI 1640 בתוספת 3% בסרום שור העובר (או RPMI בתוספת 10% נסיוב), 2 מ&quot;מ גלוטמין ואנטיביוטיקה (1 U / פניצילין מ&quot;ל, 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​סטרפטומיצין). הערה: אם לוקליזציה ganglioside נדרשת PBMCs, לעקוב אחר פרוטוקול זהה עבור דילול וגירוי כמתואר להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של דילול התא לבארות אנטי מצופה CD3 ו לבארות הלא מצופה (תאי שליטה) ב 24 את הצלחת היטב. לחלופין, להוסיף 100 μl של דילול התא אל הבארות של 96 את הצלחת היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלם את התנאים גירוי של תאים נאיביים CD4 + T בבארות אנטי CD3 מצופה על ידי הוספת 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל של נוגדן CD28 אנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאים מסוג CD4 + T נח כמו שליטה הבארות הלא מצופה ללא תוספת של נוגדנים CD28 אנטי. CD4 + T תא דגירה להשראה והופעל עבור 0 כדי 72 שעות בתנאים סטנדרטיים של 37 מעלותC ו 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאמת הפעלה נאותה להעריך על ידי זרימת cytometry הביטוי של סמן ההפעלה מוקדם CD69 (16 שעות שלאחר הפעלה) או סמן הפעלה מאוחר CD25 (48 שעות שלאחר הפעלה) ב מנוחה והופעל תאי CD4 + T נאיביים וטופחו על 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO 2 ב היעדרותם ונוכחותם של CD3 אנטי / נוגדנים CD28 9,10. </li></ol> דבקות 2. של מנוחה הופעלו תאים הנאיביים CD4 + T <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר 12 מ&quot;מ עגול coverslips ידי מעוקר וחשיפה לאור UV למשך 15 דקות לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום coverslips צלחות תרבית תאים סטריליים 24 גם. הערה: עבור תרבויות עם פחות מ 1 x 10 5 תאים עדיף להשתמש בתאי שקופיות עם בארות קטנות המותאמות למנוע פיזור של תאים coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslips מעיל (או תא שקופיות) עם 200 μl של פולי- L- ליזין (MW 150-300 KDA) 0.1% (w / v) פתרון דגירה במשך 5 דקות ב rטמפרטורת אום (RT), להסיר ויבש לפחות שעה 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבב בזהירות ולאסוף להשראה והופעל תאי CD4 + T נאיביים מצלחות 24 גם. ספירת התאים ובמידת הצורך להתאים עם המדיום השלימו טריים להעביר 1 x 10 5 תאים על coverslips מצופה פולי- L- ליזין. דגירה התאים למשך תקופה מינימלית של 6 שעות ב 37 מעלות צלסיוס ו 5% CO 2. </li></ol> 3. איסוף קיבוע של מנוחה הופעלו הנאיבית CD4 + T תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את מדיום מנוחה תרבותית והופעלו תאי CD4 + T נאיביים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של RT סטרילי PBS לאט. הערה: בנוסף זהירות והסרת פתרונות מבארות מונע ניתוק של תאים מן coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל PBS ולהוסיף עוד 500 μl PBS להסיר תקשורת ותרבות ביסודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים על ידי תוספת של 500 μl מסוננים 4% paraformaldehyde (filtמנת מסיר microparticles שיכול להפריע ניתוח מיקרוסקופיה) דגירה במשך 30 דקות ב RT (מועדף) או הלילה ב 4 מעלות צלזיוס. זהירות: Paraformaldehyde הוא תרכובת רעילה ונפיצה. זה ידוע להיות קרצינוגן אדם. השתמש בזהירות עם פרוטוקול בטיחות מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מקבע ולשטוף לפחות פעמיים עם PBS ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לשלב הבא או לשמור על בארות צלחת עם 500 μl של PBS על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים עד מכתים. הערה: עקרות במהלך תהליך זה עוזר למנוע צמיחה מיקרואורגניזם. </li></ol> 4. מכתים, הרכבה ויזואליזציה ידי מיקרוסקופית Confocal <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PBS מהבארות. הוסף 500 μl של חיץ חסימה קר (PBS 1x, 0.5% אלבומין בסרום תקן כיתה שור, 1% pH בסרום שור עוברי 7.4). דגירה במשך 20 דקות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חוצץ החסימה בזהירות ולהוסיף הנוגדנים הראשוניים (R24 שיבוט אנטי gangliosides GD3, שיבוט GD2 14G2a),PE מצומדות CD25 אנטי APC מצומדות אנטי TCR ו isotypes שולטת מדולל חסימת חיץ 2.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 2 שעות על הקרח או לילה ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: התסיסה מסלולית איטית עדיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הנוגדן בזהירות ולהוסיף לאט 500 μl של PBS. חזור פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את נוגדנים משני (IgG3 אנטי מצומדות FITC עבור GD3 R24 אנטי, Alexa פלואוריד 488 מצומדות או אלקסה פלואוריד 647 מצומדות IgG2a אנטי עבור 14G2a אנטי GD2) מדולל חסימת חיץ 0.1 מיקרוגרם / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך שעה 1 על הקרח בחושך בלי לרעוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שלוש פעמים PBS כמתואר 4.4). שמור את הבארות עם מספיק PBS כדי למנוע התייבשות של דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף Hoechst 333,258 כתם מדולל PBS ל 0.1 מיקרוגרם / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 15 דקות ב RT ולהסיר. לשטוף שלוש פעמים PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופיות על מגבת נייר ולהוסיף 20 μl של פתרון גובר (גליצרול 50% ב- PBS) או פתרון גובר מסחריים כדי למנוע דהייה מרווה ממדגמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להרים את coverslip עם פינצטה בסדר ומניח אותו על הפתרון הגובר. ודא שהצד של coverslip שבו התאים מחוברים נמצא בקשר עם הפתרון. חותם את coverslips עם לק ולנתח באמצעות קרינה או confocal. </li></ol> בידוד 5. של RNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן נוגדני CD3 אנטי (5 מיקרוגרם / מיליליטר) מצופה 96-גם צלחות. דגירה 4 x 10 4 תאים מסוג CD4 + T נאיבי / גם ב 100 μl של המדיום תרבות בתוספת נוגדנים CD28 אנטי (1 מיקרוגרם / מ&quot;ל) כדי להשלים את הגירוי. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור 0 כדי 72 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פעמים שלאחר הפעלה שונות למקם את התאים לתוך צינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של PBS ו צנטריפוגות ב 250 XG במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ולהוסיף מגיב Trizol 1ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 5 דקות ב RT ולשמור המדגם ב -8076; C במשך שעה 24 לפחות. המשך עם בידוד RNA בעת הצורך. הערה: השארת המדגם ב -80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 24 שעות משפרת תשואת RNA. כמו כן, שימוש בכפפות יד חיוני כדי למנוע שפלת RNA על ידי RNases. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשר את המדגם על ידי דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 כלורופורם μl ולנער במרץ ביד במשך 30 שניות (כדי למנוע ערבוב אגרסיבי של RNA על ידי vortexing). דגירה 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 15 דקות ב XG 12,000 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את השלב המימי לתוך צינור microcentrifuge חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl isopropanol ו להפוך את הצינור שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 10 דקות ב RT ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב XG 12,000 ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant על ידי היפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של אתנול 75% קר קרח 10 דקות צנטריפוגות ב XG 12,000 ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגמרי לבטל את supernatant ומייבשים גלולה RNA על ידי השארת את הכובע של הצינור פתוח. לֹאדואר: בשלב זה הגלול, אינו ברור. המשך בכל זאת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 20 μl של מי כיתה מולקולריים. חשב את הריכוז וטוהר של חומצות גרעין על ידי מדידת ספיגת 260 ננומטר ו -280 ננומטר באמצעות nanodrop. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך בזהירות סינתזה של cDNA באמצעות כל ערכת transcriptase הפוכה קונבנציונלית בעקבות פרוטוקול manufacturer&#39;s. הערה: כ 0.5-2 מיקרוגרם RNA מתקבל 4 x 10 4 תאים מסוג CD4 + T נאיבי. cDNA ניתן synthetized מ 100 ננוגרם של רנ&quot;א המשמש PCR תגובות בזמן אמת ללא צורך ערכות קלט RNA הנמוך. </li></ol>

<ol>
	<li>Mazzon, C., Viola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+tango+to+quadrilla:+current+views+of+the+immunological+synapse.">From tango to quadrilla: current views of the immunological synapse.</a> Cell Adh Migr. 1 (1), 7-12 (2007).</li><li>Hamann, D., Pa Baars, ., Hooibrink, B., van Lier, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+the+human+CD4++T-cell+population:+two+distinct+CD4++T-cell+subsets+characterized+by+coexpression+of+CD45RA+and+CD45RO+isoforms.">Heterogeneity of the human CD4+ T-cell population: two distinct CD4+ T-cell subsets characterized by coexpression of CD45RA and CD45RO isoforms.</a> Blood. 88 (9), 3513-3521 (1996).</li><li>Zhong, L., Zhang, Z., Lu, X., Liu, S., Chen, C. Y., Chen, Z. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NSOM+/+QD-Based+Visualization+of+GM1+Serving+as+Platforms+for+TCR+/+CD3+Mediated+T-Cell+Activation.">NSOM / QD-Based Visualization of GM1 Serving as Platforms for TCR / CD3 Mediated T-Cell Activation.</a> Biomed Res Int. , 276498 (2013).</li><li>Nagafuku, M., Okuyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PNAS+Plus:+CD4+and+CD8+T+cells+require+different+membrane+gangliosides+for+activation.">PNAS Plus: CD4 and CD8 T cells require different membrane gangliosides for activation.</a> Procs Natl Acad Sci USA. 109 (6), E336-E342 (2012).</li><li>Schnaar, R. L., Gerardy-Schahn, R., Hildebrandt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sialic+acids+in+the+brain:+gangliosides+and+polysialic+acid+in+nervous+system+development,+stability,+disease,+and+regeneration.">Sialic acids in the brain: gangliosides and polysialic acid in nervous system development, stability, disease, and regeneration.</a> Physiol Rev. 94, 461-518 (2014).</li><li>Villanueva-Cabello, T. M., Mollicone, R., Cruz-Mu&#241;oz, M. E., L&#242;pez-Guerrero, D. V., Mart&#236;nez-Duncker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+human+na&#239;ve+Th+cells+increases+surface+expression+of+GD3+and+induces+neoexpression+of+GD2+that+colocalize+with+TCR+clusters.">Activation of human na&#239;ve Th cells increases surface expression of GD3 and induces neoexpression of GD2 that colocalize with TCR clusters.</a> Glycobiology. 25 (12), 1454-1464 (2015).</li><li>M&#252;thing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TLC+in+structure+and+recognition+studies+of+glycosphingolipids.">TLC in structure and recognition studies of glycosphingolipids.</a> Methods Mol Biol. 76 (17), 183-195 (1998).</li><li>de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+human+peripheral+blood+monocyte+isolation.">A simple method for human peripheral blood monocyte isolation.</a> Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).</li><li>O'Neil-Andersen, N. J., Lawrence, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+modulation+of+surface+and+intracellular+protein+expression+by+T+cells+after+stimulation+in+the+presence+of+monensin+or+brefeldin+A.">Differential modulation of surface and intracellular protein expression by T cells after stimulation in the presence of monensin or brefeldin A.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 9 (2), 243-250 (2002).</li><li>Mannering, S. I., Zhong, J., Cheers, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+activation,+proliferation+and+apoptosis+in+primary+Listeria+monocytogenes+infection.">T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection.</a> Immunology. 106 (1), 87-95 (2002).</li><li>Marconi, S., Acler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-GD2-like+IgM+autoreactivity+in+multiple+sclerosis+patients.">Anti-GD2-like IgM autoreactivity in multiple sclerosis patients.</a> Mult Scler. 12 (3), 302-308 (2006).</li><li>Park, J. E., Wu, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+specificity+of+natural+killer+T+cells+against+GD3+ganglioside+and+identification+of+GM3+as+an+inhibitory+natural+killer+T-cell+ligand.">Fine specificity of natural killer T cells against GD3 ganglioside and identification of GM3 as an inhibitory natural killer T-cell ligand.</a> Immunology. 123 (1), 145-155 (2008).</li><li>Simon, B. M., Malisan, F., Testi, R., Nicotera, P., Leist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disialoganglioside+GD3+is+released+by+microglia+and+induces+oligodendrocyte+apoptosis.">Disialoganglioside GD3 is released by microglia and induces oligodendrocyte apoptosis.</a> Cell Death Differ. 9 (7), 758-767 (2002).</li><li>Beske, O., Reichelt, M., Taylor, M. P., Kirkegaard, K., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poliovirus+infection+blocks+ERGIC-to-Golgi+trafficking+and+induces+microtubule-dependent+disruption+of+the+Golgi+complex.">Poliovirus infection blocks ERGIC-to-Golgi trafficking and induces microtubule-dependent disruption of the Golgi complex.</a> J Cell Sci. 120 (18), 3207-3218 (2007).</li><li>Zuber, C., Spiro, M. J., Guhl, B., Spiro, R. G., Roth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+apparatus+immunolocalization+of+endomannosidase+suggests+post-endoplasmic+reticulum+glucose+trimming:+implications+for+quality+control.">Golgi apparatus immunolocalization of endomannosidase suggests post-endoplasmic reticulum glucose trimming: implications for quality control.</a> Mol Biol Cell. 11 (12), 4227-4240 (2000).</li><li>Yamashiro, S., Okada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+(GD3+synthase)+gene+in+human+cancer+cell+lines:+high+level+expression+in+melanomas+and+up-regulation+in+activated+T+lymphocytes.">Expression of (GD3 synthase) gene in human cancer cell lines: high level expression in melanomas and up-regulation in activated T lymphocytes.</a> Glycoconj J. 12 (6), 894-900 (1995).</li><li>Wipfler, D., Srinivasan, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentially+regulated+expression+of+9-O-acetyl+GD3+(CD60b)+and+7-O-acetyl-GD3+(CD60c)+during+differentiation+and+maturation+of+human+T+and+B+lymphocytes.">Differentially regulated expression of 9-O-acetyl GD3 (CD60b) and 7-O-acetyl-GD3 (CD60c) during differentiation and maturation of human T and B lymphocytes.</a> Glycobiology. 21 (9), 1161-1172 (2011).</li><li>Pukel, C. S., Lloyd, K. O., Travassos, L. R., Dippold, W. G., Oettgen, H. F., Old, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GD3,+a+prominent+ganglioside+of+human+melanoma.+Detection+and+characterisation+by+mouse+monoclonal+antibody.">GD3, a prominent ganglioside of human melanoma. Detection and characterisation by mouse monoclonal antibody.</a> J Exp Med. 155 (4), 1133-1147 (1982).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

הפרוטוקול המתואר יכול לשמש כדי לבצע לוקליזציה gangliosides או חלבונים השעיות התא של תאי CD4 + T או תאי חיסון אחרים (למשל, PMBCs, איור 5) החל ממספר קטן של תאים. בגלל גודלו הקטן של תאי T ומאפיינים לא חסידים, רכישת תוצאות תמונות מיקרוסקופיות קרינת מידע עני או באיכות נמוכה אם התאים לא ימולאו כראוי. פרוטוקול זה בשילוב עם ניתוח מיקרוסקופיה confocal באיכות טובה הוא יתרון מרכזי על פני השימוש בטכניקות כגון כרומטוגרפיה בשכבה דקה לגילוי gangliosides משום שהוא חושף את הלוקליזציה מרחבית ודינמיקה של gangliosides במהלך הטיפול (למשל, הפעלת תא T), מה שמוביל רכישת 11,12,13 נתונים רלוונטיים ביולוגי. כמו כן, פרוטוקול זה מאפשר הערכה של ביטוי ganglioside החל ממספר קטן של תאי CD4 + T (2 x 10 4) כי הוא שימושי עבור אופטימיזציה של מספר המשכפל או מבחנים שונים 6. הטיפול הזהיר במהלך שוטף מכתים נוגדן לאחר ההידבקות הוא חיוני כדי לשמור על מספר תא ויושרה. בגלל הכריכה החלשה של תאים מסוג CD4 + T כדי coverslip, זה גם חשוב מאוד להוסיף בזהירות ולהסיר פתרונות; אחרת צמצום מספר הסלולרי ופסולת פלורסנט גדל יהיה נתקל. כאשר העריכו באמצעות מיקרוסקופיה confocal, את immunostaining של gangliosides מקנה מידע נוסף כגון לוקליזציה מרחבית או שיתוף לוקליזציה עם מולקולות אחרות קרום הפלזמה או תאים תאיים. לוקליזציה subcellular מחייבת שימוש סמני subcellular 14, 15. בנוסף, קבוע טרי ולא תאים מסוג CD4 + T צריך לשמש מכתים בעת קביעת ביטוי ganglioside מוגבל פני התא. למרות קיבעון של CD4 + T ceLLS עוזר לשמר את המדגם עבור לפחות 5 ימים, הוא נושא את הסיכון של permeabilization והכתים תאיים. עם זאת, בגלל הדמיון המבני בין gangliosides, זה תמיד רצוי לקחת בחשבון את הספציפיות של נוגדנים בשימוש. מספר של נוגדנים חד שבטיים נגד ganglioside זמינים מסחרית ניתן להשתמש ועבור חלקם הספציפיות כבר נחקר על ידי ELISA, TLC, וכו &#39;16,17,18. עבודות קודמות להוכיח כי אפשר לקבל מידע לגבי לוקליזציה ביטוי gangliosides GD3 ו GD2 מ 2 x 10 4 תאים / לכל מצב 6. כמו כן, פרוטוקול זה מתאר את היכולת של ביצוע ניסויי פרופיל גנים בין 4 x 10 4 תאים, המאפשר אופטימיזציה של השתקת ניסויים כגון אלו המבוססים חלקיקי lentiviral 6.

תאי CD4 + T לתזמר את התגובה החיסונית באמצעות פונקציות המפעיל שלהם לאחר הפעלה על ידי תאי מציגי אנטיגן 1. המחקר של המנגנונים התאיים הם מווסתים במהלך ההפעלה מאפשר תובנה תהליך בסיסי של תפקוד מערכת חיסון. עם זאת, המחקר של תאי CD4 + T נאיבי יכול להיות מסובך, כי הם מייצגים אוכלוסייה קטנה מאוד של תאים בפריפריה דם 2. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מספר דיווחים לומדים את הלוקליזציה של מולקולות שונות מעורבים הפעיל תא T מסוג CD4 +, בעיקר חלבונים הקשורים קרום הפלזמה 3. Gangliosides הם המכילים חומצה sialic glycosphingolipids ולמרות שהם נחקרו רבות בתאי עצב היכן הם נמצאים בשפע, תאים אחרים כגון תאי מערכת החיסון גם להביע gangliosides עם פונקציות רלוונטיות מבחינה ביולוגית 4,5. בעבר דיווחנו that במהלך ההפעלה של תאים אנושיים נאיבי CD4 + T קיימת הגברת הביטוי של α2,8 sialyltransferase ST8Sia 1 (synthase GD3) ואת synthase GM2 / GD2, כי לגרום neoexpression משטח משמעותי GD2 ואת הגברת הביטוי של GD3 ganglioside 6. מחקר נוסף של GD3, GD2 ו gangliosides האחר בתאי מערכת חיסוניים יש צורך להשלים נוף חלק המבוסס על חלבונים של תפקוד מערכת חיסון. בדרך כלל, המחקר הביטוי ganglioside מבוסס על טכניקות כגון כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) 7, אבל טכניקה זו אינה מאפשרת לוקליזציה המרחבי של gangliosides על הממברנה פלזמה או בתאים subcellular, הגבלת ניתוח ביולוגי. בעבודה זו, אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי בתיווך נוגדנים ולוקליזציה של gangliosides GD3 ו GD2 בתאים אנושיים נאיבי CD4 + T ו PBMCs לאחר הפעלת אנטי CD3 / אנטי CD28. עם i זה בפרוטוקול זהגם אפשרי לנתח את הגן והביטוי המולקולרי של gangliosides במספר נמוך של התאים בתרחיף, עם הרכישה של תמונות באיכות גבוהה 6, בהתחשב בגודל קטן של לימפוציטים (9 מיקרומטר).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1052">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:481px;">Advanced RPMI 1640&#160;</td>
			<td style="width:241px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">12633-012</td>
			<td style="width:193px;">Suplemented with 3% FBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse anti human CD3 antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>16-0037-81</td>
			<td>OKT3 clone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse anti human CD28 antibody</td>
			<td>ebioscience</td>
			<td>16-0288-81</td>
			<td>CD28.6 clone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse anti human GD3&#160; antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11779</td>
			<td>R24 clone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse anti human GD2 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-53831</td>
			<td>14G2a clone</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:481px;">FITC-conjugated anti-mouse IgG3 
			antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab97259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 conjugated antimouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scieni&#161;tific</td>
			<td>A-21131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgG2a antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 647 conjugated antimouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scieni&#161;tific</td>
			<td>A-21241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IgG2a antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 333258</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>861405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Ficoll Paque-Plus</td>
			<td>GE</td>
			<td>17-1440-02&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trizol Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-094-131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD FACSAria II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Sorting&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc Lab-tek chamber slide system</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus)&#160;</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Upright BX61WI and IX81&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forward sequence primer GD3 synthase</td>
			<td>5&#180;-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3&#180;</td>
			<td></td>
			<td>Ref. 7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reverse sequence primer GD3 synthase</td>
			<td>5&#180;-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3&#180;</td>
			<td></td>
			<td>Ref. 7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forward sequence primer GM2/GD2 synthase</td>
			<td>5&#180;-CAACACAGCAGACACAGTCC-3&#180;</td>
			<td></td>
			<td>Ref. 7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase</td>
			<td>5&#180;-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3&#180;</td>
			<td></td>
			<td>Ref. 7</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of cd4+ t cells for analysis of gd3 and gd2 ganglioside membrane expression by microscopy

השיטות שתוארו לעיל לצורך הפעלה של תאים נאיביים CD4 + T השעיה ואת דבקותם ב coverslips לניתוח מיקרוסקופיה confocal לאפשר לוקליזציה מרחבים ובראייה של gangliosides מעורב הפעלת תא CD4 + T, כי ביטוי המשלים פרופיל ניסויים כגון cytometry זרימה, מערבי סופג או בזמן אמת PCR. כימות של ביטוי ganglioside דרך cytometry זרימת לוקליזציה הסלולר שלהם באמצעות מיקרוסקופיה ניתן להשיג על ידי השימוש של נוגדנים נגד ganglioside עם זיקה גבוהה וספציפי. עם זאת, גידול טיפול הולם של תאים בתרחיף כרוך בטיפול צלחות התרבות לקדם את דבקות הנדרשות עבור קרינה או רכישת מיקרוסקופיה confocal. בעבודה זו, אנו מתארים פרוטוקול לקביעת ביטוי ganglioside GD3 ו GD2 ו colocalization עם TCR במהלך הפעלת CD4 + T תאים נאיבית. כמו כן, אמת tIME PCR ניסויים באמצעות &lt;40,000 תאים מתוארים ביחס קביעת GD3 ו GM2 / GD2 גני synthase, הוכחה כי ניסויים בניתוח גנטי יכול להתבצע עם מספר נמוך של תאים וללא הצורך של ערכות RNA הקלט נמוכות נוספות.

הפרוטוקול המתואר בכתב היד הזה הופך באיכות טובה של בתרבית ולנוח דבקה והופעלו תאים אנושיים נאיביים CD4 + T (איור 1). התאים מופעל CD4 + T להראות את פרופיל שגשוג מאפיין (איור 1B) בהשוואה למצב המנוחה (איור 1 א). סמן ההפעלה מאוחר CD25 הוא שימושי כדי להעריך את ההפעלה היעילה 72 שעות נצפו על ידי מיקרוסקופ confocal (איור 1 ג). סמן CD69 משמש כיום כסמן הפעלה מוקדם על ידי זרימת cytometry או מיקרוסקופ. דבקות של המנוחה והופעל תאי CD4 + T נאיבי כדי coverslip מצופה פולי- L- ליזין שימושיים ללמוד הביטוי ולוקליזציה של GD3 ו TCR הראה על ידי תיוג כפול עם GD3 אנטי ונוגדנים TCR אנטי (איור 2). כפי שדיווחנו בעבר, הפעלה מלווה לשפץing של GD3 ו GD2 gangliosides בתאים משטח 6. בנוסף, כימות ביטוי גנים של synthases GD3 ו GM2 / GD2 מתבצע מתוך 4 x 10 4 תאים (איורים 2 ו -3). The-ביטוי ניאו של ganglioside GD2 ו colocalization TCR הוא ציין נאה על ידי מיקרוסקופיה confocal, הוכחת תפקיד אפשרי של GD2 באשכולות TCR במהלך הפעלה (איור 3). איור 4 מראה את הלוקליזציה של ganglioside GD3 ו GD2 מוכתם במקביל CD4 מופעל + תאי T. בנוסף, הופעל PBMCs הוכתמו GD3 אנטי ונוגדנים GD2 אנטי מראה כי פרוטוקול זה יכול לשמש אוכלוסיות תאים חיסוניים אחרים שנמצאו PMBCs, במיוחד GD2 שנמצאה להתבטא בכל PMBCs מופעל (איור 5). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54569/54569fig1.jpg" /> איור 1: ויזואליזציה של תאים מסוג CD4 + T נאיבי לאחר הדבקות ויעיל אנטי CD3 / אנטי CD28 ההפעלה (א) Resting CD4 + T התאים ב 72 שעות שלאחר ההפעלה המצורפת coverslip פולי- L- ליזין מטופלים הם נצפו על ידי brightfield. מיקרוסקופיה. (ב) הופעל CD4 + T תאים ב 72 שעות מצורפות coverslip מטופלי פולי- L- ליזין. (ג) ביטוי סמן CD25 (אדום) ו Hoechst 333,258 גרעינים מוכתמים (כחול) של תאים אנטי CD3 / אנטי CD28 מופעלים CD4 + T ב 72 שעות אחרות-הפעלה. בר סולם = 50 מיקרומטר. תמונות התקבלו על ידי מיקרוסקופיה confocal עם מטרה שמן 60X S / 1.3 עם זום דיגיטלי 2X. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54569/54569fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54569/54569fig2.jpg"/&gt; איור 2: ganglioside GD3 ו TCR כתם במיקרוסקופ לוקליזציה המנוחה והופעל תאי CD4 + T נאיבי ב 72 שעות אחר-הפעלה Resting CD4 + T תאים עם (א) גרעינים מגואלות Hoechst 333,258, (B) לוקליזציה ganglioside GD3, (. C) מיזוג של הגרעינים ואת ganglioside GD3. CD4 + T תאים הופעל עם (D) גרעינים מגואלות Hoechst 333,258, (E) לוקליזציה ganglioside GD3 ו (F) מיזוג של הגרעינים ואת ganglioside GD3. (G) (H) TCR המופע ganglioside GD3 ב נח תאים מסוג CD4 + T נאיבי. (J ו- K) תואם מכתים ganglioside TCR ו GD3 בתאים מופעלים CD4 + T. תמונות Confocal של TCR (אדום) ו ganglioside GD3 (ירוק) לוקליזציה נח תאים מסוג CD4 + T נאיבי (א &#39;)אנטי CD3 / CD28 הופעל תאי CD4 + T נאיבי 72 שעות שלאחר ההפעלה (L). GD3, כתם TCR וגרעינים הוערך על ידי מיקרוסקופ confocal מערמה אחת עם 60X S / 1.3 אובייקטיבית שמן עם זום דיגיטלי 2X. (ז) הגרף מראה את ביטוי הגנים עבור synthase GD3 שקבע בזמן אמת PCR מבוטא שינוי קיפול מ 4 x 10 4 נח (Rest) והופעל (חוק) תאי CD4 + T נאיבי ב 72 שעות אחר-הפעלה. נתונים הם ממוצעים ± סטיית תקן משלושה תורמים עצמאיים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54569/54569fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54569/54569fig3.jpg" /> איור 3: ganglioside GD2 כתם TCR ולוקליזציה מיקרוסקופיה ב מנוחה והופעלו תאים נאיביים CD4 + T ב 72 שעות אחרות-הפעלה. </CD4 + T תאים strong&gt; נח עם (א) גרעינים מגואלות Hoechst 333,258, (B) לוקליזציה ganglioside GD2, (C) מיזוג של הגרעינים ואת ganglioside GD2. CD4 + T תאים הופעל עם (D) גרעינים מגואלות Hoechst 333,258, (E) לוקליזציה ganglioside GD2 ו (F) מיזוג של הגרעינים ואת ganglioside GD2. (G ו- H) TCR המופע ganglioside GD2 ב נח תאים נאיביים CD4 + T. (J ו- K) תואם מכתים ganglioside TCR ו GD2 בתאים מופעלים CD4 + T. תמונות Confocal של TCR (אדום) ו ganglioside GD2 (ירוקה) לוקליזציה נח תאים + T מסוג CD4 נאיביים (אני) ו CD3 אנטי / CD28 הופעלו תאי CD4 + T נאיביים 72 שעות שלאחר הפעלה (L). GD2, כתם TCR וגרעינים הוערך על ידי מיקרוסקופ confocal מערמה אחת עם60X S / 1.3 אובייקטיבי שמן עם זום דיגיטלי 2X. (ז) הגרף מראה את ביטוי הגנים עבור synthase GM2 / GD2 שקבע בזמן אמת PCR מבוטא שינוי קיפול מ 4 x 10 4 נח (Rest) והופעל (חוק) תאי CD4 + T נאיבי ב 72 שעות אחר-הפעלה. נתונים הם ממוצעים ± סטיית תקן משלושה תורמים עצמאיים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54569/54569fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54569/54569fig4.jpg" /> איור 4:. כתם זוגי עם אנטי GD3 ונוגדנים אנטי GD2 ללוקליזציה gangliosides GD3 ו GD2 (א) ganglioside GD3 מזוהה עם נוגדן R24 אנטי GD3 בתאי T מסוג CD4 + הפעלה מראה לוקליזציה תאית קרום. (ב) ganglioside GD2 מזוהה עם 14G2נוגדן GD2 אנטי בתאים מופעלים CD4 + T מציג לוקליזציה קרום פלזמה בלבד. (C) מיקרוסקופיה Brightfield מ מופעל תאים מסוג CD4 + T. כתם GD3 ו GD2 הוערך על ידי מיקרוסקופ confocal מערמה אחת עם מטרת שמן 60X S / 1.3 עם זום דיגיטלי 2X. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54569/54569fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54569/54569fig5.jpg" /> איור 5:. GD3 ו GD2 לוקליזציה ganglioside ב PBMCs מופעל (א) ganglioside GD2 זוהה עם 14G2a אנטי GD2 הנוגדן כיסוי אנטי CD3 / אנטי CD28 72 שעות המופעל פוסט PBMCs עם מיקרוסקופיה brightfield, (ב) הביטוי ganglioside GD2 ו- (ג ganglioside וגרעינים) GD2 למזג. (ד) ganglios GD3IDE מוכתם כיסוי נוגדן R24 אנטי GD3 עם brightfield, (E) GD3 ביטוי ganglioside ו (F) GD3 ganglioside וגרעינים למזג. GD3, כתם GD2 וגרעינים הוערך על ידי מיקרוסקופ confocal מערמה אחת עם 60X S / 1.3 אובייקטיבית שמן עם זום דיגיטלי 2X. סרגל קנה מידה = 45 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54569/54569fig5large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy at JoVE.com

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

אנו מתארים פרוטוקול מכתים נוגדן תקן לשימוש במיקרוסקופ כדי לקבוע את ביטוי הקרום ולוקליזציה של gangliosides ב מנוחה ותאי T מסוג CD4 + נאיביים אדם הופעל. כמו כן תארו הם ניסויים בזמן אמת באמצעות PCR &lt;40,000 תאים שאינם דורשים ערכות RNA הקלט נמוכות נוספות.

הכנת CD4<sup&gt; +</sup&gt; T תאים עבור ניתוח של ביטוי GD3 ו GD2 ganglioside ממברנה ידי מיקרוסקופית

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

preparation-cd4-t-cells-for-analysis-gd3-gd2-ganglioside-membrane

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

8.4K Views.  Universidad Autónoma del Estado de Morelos.  אנו מתארים פרוטוקול מכתים נוגדן תקן לשימוש במיקרוסקופ כדי לקבוע את ביטוי הקרום ולוקליזציה של gangliosides ב מנוחה ותאי T מסוג CD4 + נאיביים אדם הופעל. כמו כן תארו הם ניסויים בזמן אמת באמצעות PCR 

Video: Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

הכנה ושימוש של HIV-1 CD4 ראשי מאשרום + T-תאים כמו תאים היעד של טבע Cell מבחני Killer ציטוטוקסיות

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of human Type 1 diabetes (T1D). Cell transfer studies in irradiated recipient mice have established that T cells are pivotal in T1D pathogenesis in this model. We describe herein a simple method to rapidly induce T1D by adoptive transfer of purified, primary CD4+ T cells from pre-diabetic NOD mice transgenic for the islet-specific T cell receptor (TCR) BDC2.5 into NOD.SCID recipient mice. The major advantages of this technique are that isolation and adoptive transfer of diabetogenic T cells can be completed within the same day, irradiation of the recipients is not required, and a high incidence of T1D is elicited within 2 weeks after T cell transfer. Thus, studies of pathogenesis and therapeutic interventions in T1D can proceed at a faster rate than with methods that rely on heterogenous T cell populations or clones derived from diabetic NOD mice.

We provide a reproducible method to induce type 1 diabetes (T1D) in mice within two weeks by the adoptive transfer of islet antigen-specific, primary CD4+ T cells.

אינדוקציה מואצת סוכרת סוג 1 בעכברים על ידי העברת המאמצת של CD4 + T תאי Diabetogenic

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 T cells in vitro with TCR- and co-stimulation in the presence of TGF&beta; and IL-2. This bears enormous potential for future therapies, however, the molecules and signaling pathways that control differentiation are largely unknown.
Primary T cells can be manipulated through ectopic gene expression, but common methods fail to target the most important naive state of the T cell prior to primary antigen recognition. Here, we provide a protocol to express ectopic genes in naive CD4 T cells in vitro before inducing Treg differentiation. It applies transduction with the replication-deficient adenovirus and explains its generation and production. The adenovirus can take up large inserts (up to 7 kb) and can be equipped with promoters to achieve high and transient overexpression in T cells. It effectively transduces naive mouse T cells if they express a transgenic Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Importantly, after infection the T cells remain naive (CD44low, CD62Lhigh) and resting (CD25-, CD69-) and can be activated and differentiated into Tregs similar to non-infected cells. Thus, this method enables manipulation of CD4 T cell differentiation from its very beginning. It ensures that ectopic gene expression is already in place when early signaling events of the initial TCR stimulation induces cellular changes that eventually lead into Treg differentiation.

Adenoviral gene transfer into naive CD4 T cells with transgenic expression of the Coxsackie adenovirus receptor enables the molecular analysis of regulatory T cell differentiation in vitro.

התמרה adenoviral של CD4 תמימים תאי T ללמוד בידול Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

בידוד ובידול של Th17 הנאיביים T מסוג CD4 לימפוציטים

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

הערכת חישה המולדת של CD4 הנגוע ב- HIV-1<sup&gt; +</sup&gt; T תאים על ידי תאים דנדריטים Plasmacytoid שימוש<em&gt; Ex vivo</em&gt; עמית תרבות מערכת.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

אינדוקציה של Murine דלקת מעיים על ידי העברת המאמצת של מפעיל CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; גבוה</sup&gt; תאי T לעכברי immunodeficient

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

הדמית תא CD4 T גירת ביניים בדרמיס המוסת

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell interaction known as the immunological synapse. F-actin is also speculated to play a role in regulating molecular distributions at the membrane of cells including sub-membranous vesicle dynamics and protein clustering. While standard light microscope techniques allow generalized and diffraction-limited observations to be made, many cellular and molecular events including clustering and molecular flow occur in populations at length-scales far below the resolving power of standard light microscopy. By combining total internal reflection fluorescence with the super resolution imaging method structured illumination microscopy, the two-dimensional molecular flow of F-actin at the immune synapse of T cells was recorded. Spatio-temporal image correlation spectroscopy (STICS) was then applied, which generates quantifiable results in the form of velocity histograms and vector maps representing flow directionality and magnitude. This protocol describes the combination of super-resolution imaging and STICS techniques to generate flow vectors at sub-diffraction levels of detail. This technique was used to confirm an actin flow that is symmetrically retrograde and centripetal throughout the periphery of T cells upon synapse formation.

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

קליפת המוח אקטין זרימה בתאי T לכמת ידי מתאם תמונת ספקטרוסקופיה מרחב ובזמן של תאורה מיקרוסקופית נתונים מובנים

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes. 
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human na&#239;ve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-&#946; plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR. 
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained. 
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-&#946; plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.

This protocol describes the reproducible generation and phenotyping of human induced regulatory T cells (iTregs) from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro. Different protocols for FOXP3 induction allow for the study of specific iTreg phenotypes obtained with respective protocols.

במבחנה בידול של האדם CD4 + FOXP3 + מושרה תקינה בתאי T (iTregs) מ נאיבית CD4 + T תאים באמצעות פרוטוקול TGF-β-המכיל

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Single-cell analysis is an important tool for dissecting heterogeneous populations of cells. The identification and isolation of rare cells can be difficult. To overcome this challenge, a methodology combining indexed flow cytometry and high-throughput multiplexed quantitative polymerase chain reaction (qPCR) was developed. The objective was to identify and characterize simian immunodeficiency virus (SIV)-infected cells present within rhesus macaques. Through quantitation of surface protein by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and mRNA by qPCR, virus-infected cells are identified by viral gene expression, which is combined with host gene and protein measurements to create a multidimensional profile. We term the approach, targeted Single-Cell Proteo-transcriptional Evaluation, or tSCEPTRE. To perform the method, viable cells are stained with fluorescent antibodies specific for surface markers used for FACS isolation of a cell subset and/or downstream phenotypic analysis. Single cells are sorted followed by immediate lysis, multiplex reverse transcription (RT), PCR pre-amplification, and high throughput qPCR of up to 96 transcripts. FACS measurements are recorded at the time of sorting and subsequently linked to the gene expression data by well position to create a combined protein and transcriptional profile. To study SIV-infected cells directly ex vivo, cells were identified by qPCR detection of multiple viral RNA species. The combination of viral transcripts and the quantity of each provide a framework for classifying cells into distinct stages of the viral life cycle (e.g., productive versus non-productive). Moreover, tSCEPTRE of SIV+ cells were compared to uninfected cells isolated from the same specimen to assess differentially expressed host genes and proteins. The analysis revealed previously unappreciated viral RNA expression heterogeneity among infected cells as well as in vivo SIV-mediated post-transcriptional gene regulation with single-cell resolution. The tSCEPTRE method is relevant for the analysis of any cell population amenable to identification by expression of surface protein marker(s), host or pathogen gene(s), or combinations thereof.

Single-cell Quantitation of mRNA and Surface Protein Expression in Simian Immunodeficiency Virus-infected CD4+ T Cells Isolated from Rhesus macaques

Described is a methodology to quantitate the expression of 96 genes and 18 surface proteins by single cells ex vivo, allowing for the identification of differentially expressed genes and proteins in virus-infected cells relative to uninfected cells. We apply the approach to study SIV-infected CD4+ T cells isolated from rhesus macaques.