מחקר זה מומן על ידי המועצה למחקר השוודי (K2008-57X-20 676-01-3).

<ol>
	<li>Pan, B. -. T., Johnstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+of+the+transferrin+receptor+during+maturation+of+sheep+reticulocytes+in+vitro:+Selective+externalization+of+the+receptor.">Fate of the transferrin receptor during maturation of sheep reticulocytes in vitro: Selective externalization of the receptor.</a> Cell. 33, 967-978 (1983).</li><li>Chaput, N., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+immune+properties+and+potential+clinical+implementations.">Exosomes: immune properties and potential clinical implementations.</a> Semin. Immunopathol. , 10-1007 (2010).</li><li>L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-containing+exosomes+in+human+nasal+secretions.">RNA-containing exosomes in human nasal secretions.</a> Am. J. Rhinol. Allergy. 25, 89-93 (2011).</li><li>Caby, M. -. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal-like+vesicles+are+present+in+human+blood+plasma.">Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma.</a> Int. Immunol. 17, 879-887 (2005).</li><li>Palanisamy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanostructural+and+Transcriptomic+Analyses+of+Human+Saliva+Derived+Exosomes.">Nanostructural and Transcriptomic Analyses of Human Saliva Derived Exosomes.</a> PLoS ONE. 5, e8577-e8577 (2010).</li><li>Admyre, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+with+Immune+Modulatory+Features+Are+Present+in+Human+Breast+Milk.">Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk.</a> J. Immunol. 179, 1969-1978 (2007).</li><li>Almqvist, N., L&#246;nnqvist, A., Hultkrantz, S., Rask, C., Telemo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-derived+exosomes+from+antigen-fed+mice+prevent+allergic+sensitization+in+a+model+of+allergic+asthma.">Serum-derived exosomes from antigen-fed mice prevent allergic sensitization in a model of allergic asthma.</a> Immunology. 125, 21-27 (2008).</li><li>Prado, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+from+Bronchoalveolar+Fluid+of+Tolerized+Mice+Prevent+Allergic+Reaction.">Exosomes from Bronchoalveolar Fluid of Tolerized Mice Prevent Allergic Reaction.</a> J. Immunol. 181, 1519-1525 (2008).</li><li>Zitvogel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eradication+of+established+murine+tumors+using+a+novel+cell-free+vaccine:+dendritic+cell-derived+exosomes.">Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell-derived exosomes.</a> Nature. Medicine. 4, 594-600 (1998).</li><li>Ashiru, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Killer+Cell+Cytotoxicity+Is+Suppressed+by+Exposure+to+the+Human+NKG2D+Ligand+MICA*008+That+Is+Shed+by+Tumor+Cells+in+Exosomes.">Natural Killer Cell Cytotoxicity Is Suppressed by Exposure to the Human NKG2D Ligand MICA*008 That Is Shed by Tumor Cells in Exosomes.</a> Cancer. Research. 70, 481-489 (2010).</li><li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Mammary+Carcinoma+Exosomes+Promote+Tumor+Growth+by+Suppression+of+NK+Cell+Function.">Murine Mammary Carcinoma Exosomes Promote Tumor Growth by Suppression of NK Cell Function.</a> The Journal of Immunology. 176, 1375-1385 (2006).</li><li>Viaud, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Cell-Derived+Exosomes+Promote+Natural+Killer+Cell+Activation+and+Proliferation:+A+Role+for+NKG2D+Ligands+and+IL-15R&#945;.">Dendritic Cell-Derived Exosomes Promote Natural Killer Cell Activation and Proliferation: A Role for NKG2D Ligands and IL-15R&#945;.</a> PLoS ONE. 4, e4942-e4942 (2009).</li><li>Szajnik, M., Czystowska, M., Szczepanski, M. J., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-Derived+Microvesicles+Induce,+Expand+and+Up-Regulate+Biological+Activities+of+Human+Regulatory+T+Cells+(Treg).">Tumor-Derived Microvesicles Induce, Expand and Up-Regulate Biological Activities of Human Regulatory T Cells (Treg).</a> PLoS ONE. 5, e11469-e11469 (2010).</li><li>Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes+secrete+antigen-presenting+vesicles.">B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles.</a> J. Exp. Med. 183, 1161-1172 (1996).</li><li>Abusamra, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+exosomes+expressing+Fas+ligand+mediate+CD8++T-cell+apoptosis.">Tumor exosomes expressing Fas ligand mediate CD8+ T-cell apoptosis.</a> Blood Cells, Molecules, and Diseases. 35, 169-173 (2005).</li><li>Valadi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-mediated+transfer+of+mRNAs+and+microRNAs+is+a+novel+mechanism+of+genetic+exchange+between+cells.">Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells.</a> Nat. Cell Biol. 9, 654-659 (2007).</li><li>Eldh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+communicate+protective+messages+during+oxidative+stress;+possible+role+of+exosomal+shuttle+RNA.">Exosomes communicate protective messages during oxidative stress; possible role of exosomal shuttle RNA.</a> PLoS One. 5, e15353-e15353 (2010).</li><li>L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+saliva,+plasma+and+breast+milk+exosomes+contain+RNA:+uptake+by+macrophages.">Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages.</a> J. Transl. Med. 9, 9-9 (2011).</li></ol>

JL היא הבעלים במשותף של פטנט הקשור לניצול exosomes כמו וקטורים להעברת RNA לתאים.

כאשר לומדים את תוכן מולקולרית ו / או פונקציה של exosomes, חשוב להשתמש באיכות גבוהה בידוד שיטה המספק תשואה המתאים את מידת הנמוך ביותר האפשרי של זיהום. המתודולוגיה המתוארת במאמר זה היא גישה מבוססת היטב לבידוד exosomes וללמוד תוכן RNA שלהם פונקציה ביולוגית. יתר על כן, החשיבות של אפיון של exosomes מבודד, על ידי שילוב של שיטות שונות, כולל מיקרוסקופ אלקטרונים, cytometry זרימה, ואת כתם המערבי, הוא הדגיש. כאשר בידוד exosomes, צנטריפוגה בשלב הראשון (300 XG) משמש גלולה תאים שעלולים להיות נוכח ההשעיה תא או נוזל ביולוגי למד. צנטריפוגה השני 16 500 XG צריך להיות חזק מספיק כדי גלולה תאים מתים, פסולת גדולים, גופים אפופטוטיים, אברונים אחרים. לאחר צנטריפוגה זה, פרוטוקולים מסוימים כוללים צעד ננו סינון, אבל כמה Investigators יש נשלל על שלב זה. עם זאת, אנו מדגישים את החשיבות של שברי בביעור ועל שלפוחית ​​גדול יותר מאשר 200 ננומטר, ולכן ממליצים כולל בשלב הסינון. אם בידוד מחמירים יותר יש צורך מסננים 100 ננומטר ניתן להשתמש, אבל שים לב כי אם נוזלי צמיג משמשים, מסננים אלה יכולים בקלות להיות חסום חומר exosomal אבוד. כמו כן, סינון 100 ננומטר עשוי להשפיע על המורפולוגיה של exosomes יתר על כן, אם exosomes הם בקנה מידה גדול יותר הם עלולים ללכת לאיבוד. לפיכך, 200 ננומטר מסננים נראה מתאים בידוד exosome. לאחר סינון, ultracentrifugation המנדט ב XG 120,000 משמש גלולה exosomes. Exosomes ניתן לכבס נוסף עם PBS, חייב חרוזים מצופים נוגדן ורחץ, או דגש על צבע סוכרוז להסיר חלבונים זיהום. עם זאת, זה יכול להיות תהליך מאוד משאב רב אנו טוענים כי לא יהיה צורך בכך, במיוחד אם היקף המדגם המוצא היא קטנה ו / או תוכן o-RNAf exosomes הוא נמוך, כמו צעדים נוספים באופן משמעותי להקטין את חומר נוסף. עם זאת, שוב, אופיו של שלפוחית ​​מבודד צריך להיות מוכח על ידי נוכחות והיעדרות של חלבונים מסוימים. עד כה, סמן לא חלבון ייחודי לחלוטין exosomes זוהתה כדי לוודא כי המדגם מכיל exosomes ולא שום דבר אחר. כתוצאה מכך, שילוב של שיטות נדרשים לאפיין את exosomes, כולל קביעת גודל ומורפולוגיה של exosomes על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים. כמו כן, טוהר המדגם ניתן לקבוע באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, כמו שיטה זו יכולה לספק סקירה של רמת הזיהום של המדגם, למשל עם שלפוחיות גדולות יותר, כגון microparticles, גופים אפופטוטיים או פסולת התא. יתר על כן, התוכן של חלבון exosomes ניתן לקבוע על ידי cytometry זרימה כתם המערבי, ואת השילוב של שני אלה התוצאות שיטות ניתוח של הממברנה הן קשורות (למשל, CD63 וCD81) ו הפנימו חלבונים (למשל Tsg101 ואליקס) של exosomes. זיהוי של חלבונים מועשר exosomes, כגון CD63, Tsg101 ואליקס, והעדר של חלבונים, כגון חלבון endoplasmic reticulum calnexin, אינדיקציה כי exosome מועשר גלולה אכן exosomes ולא שלפוחית ​​לזהם מתוך תאים אחרים של התא. הפרופיל של RNA כי הוא זוהה exosomes הוא שונה במהותו לזה של RNA נמצא בתאים שלמים. לפיכך, RNA exosomal ונותחו על ידי Bioanalyzer או ג&#39;ל מבוססי RNA גישות ניתוח חוסר שתי פסגות של 18S rRNA ו -28 יחידות משנה, אשר הבולטים בניתוח של רנ&quot;א הסלולר. לפיכך, אנו טוענים כי גילוי של כל כמויות משמעותיות של rRNA במדגם מצביעה על כך RNA הכולל חילוץ הוא לא מוצא exosomal לבד, ולכן כי שיטת הבידוד צריך להיות שיפור איכות מובטחת.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> הערות (אופציונלי) </td></tr><tr><td> Exosome בידוד </td></tr><tr><td> אופטימה L-90k ultracentrifuge </td><td> Beckman Coulter </td><td> 65670 </td><td></td></tr><tr><td> מהיר חותם ultracentrifuge צינורות </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td> בהתאם הרוטור צינורות שונים המשמשים נדרשים. Ti70 (342,414), Ti45 (345776) </td></tr><tr><td> Quick-Tube חותם Cordless טופר ערכת </td><td> Beckman Coulter </td><td> 358312 </td><td></td></tr><tr><td> Filtropur מזרק מסנן 0.20μm </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1826.001 </td><td> עבור נוזלים ויסקוזה ו / או בכמויות גדולות, מערכת סינון אבק, 0.2 מיקרומטר, מן VWR הבינלאומי יכול לשמש במקום (514-0600). </td></tr><tr><td> במיקרוסקופ אלקטרונים </td></tr><tr><td> Formvar / פחמן מצופה ניקל רשתות </td><td> טד פלה Inc </td><td> 1GN200 </td><td></td></tr><tr><td> עכבר אנטי אנושי CD63 </td><td> Bioscience BD </td><td> 556019 </td><td> קונצרט כלשהו סופי: 0.05μg/μl </td></tr><tr><td> השליטה אלוטיפ; IgG1κ (MOPC 21) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M9269 </td><td> קונצרט כלשהו סופי: 0.05μg/μl </td></tr><tr><td> Anti-IgG עכבר זהב המצומד, 10 ננומטר </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7777 </td><td> קונצרט כלשהו סופי: 1% </td></tr><tr><td> ליאו 912AB אומגה מיקרוסקופ אלקטרונים </td><td> Carl Zeiss NTS </td><td></td><td> או ציוד שווה ערך. </td></tr><tr><td> תזרים cytometry </td></tr><tr><td> 4μm aldehyd / סולפט לטקס חרוזים </td><td> Interfacial Dynamics </td><td> 12-4000 </td><td></td></tr><tr><td> נוגדן לציפוי של חרוזים לטקס </td><td></td><td></td><td> לדוגמה אנטי CD63 מ BD Bioscience (556019) </td></tr><tr><td> האינטליגנטי מיקסר RM-2L </td><td> ELMI </td><td></td><td> או ציוד שווה ערך. </td></tr><tr><td> IgG בסרום של אדם </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I4506 </td><td></td></tr><tr><td> נוגדנים לאיתור </td><td> Bioscience BD </td><td></td><td> לדוגמה: PE אנטי CD63 (556,020) PE אנטי CD9 (555,372) PE אנטי CD81 (555,676) שליטה אלוטיפ (555749) </td></tr><tr><td> BD FACSAria </td><td> Bioscience BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> כתם המערבי </td></tr><tr><td> Transsonic T 490 DH </td><td> Elma </td><td></td><td> או ציוד שווה ערך. </td></tr><tr><td> בידוד של RNA ו-RNA exosomal ניתוח </td></tr><tr><td> miRCURY RNA בידוד Kit </td><td> Exiqon A / S </td><td> 300110 </td><td></td></tr><tr><td> Agilent 2100 Bioanalyzer </td><td> Agilent Technologies </td><td> G2939A </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and characterization of rna-containing exosomes

תחום המחקר exosome הוא המתרחב במהירות, עם גידול דרמטי הפרסומים בשנים האחרונות. בועיות אלו קטנות (3-10 ננומטר) ממוצא endocytic הוצעו הראשון לתפקד כדרך reticulocytes למגר את הקולטן transferrin תוך התבגרות לתוך אריתרוציטים 1, נקראו מאוחר יותר exosomes. Exosomes נוצרות על ידי ניצני פנימה של המנוח endosomes, ייצור גופי multivesicular (MVBs), והן מתפזרות בסביבה על ידי איחוי של MVBs עם קרום הפלזמה 2. מאז הגילוי הראשון של exosomes, מגוון רחב של תאים הוכחו לשחרר אלה שלפוחיות. Exosomes יש גם זוהה נוזלים ביולוגיים, ובהם רוק פלזמה, האף נוזל שטיפה ו חלב 3-6. יתר על כן, הוכח כי התוכן והתפקוד של exosomes תלוי בתא שמקורם ואת התנאים שבהם הם מיוצרים. מגוון פונקציות כבר שדיםtrated עבור exosomes, כגון אינדוקציה של סובלנות נגד 7,8 אלרגן, מיגור של גידולים הוקמה בשנת 9 עכברים, עיכוב והפעלה של תאים הרוצח הטבעי 10-12, קידום התמיינות לתאי T רגולטוריים 13, גירוי של התפשטות תאים T ו - 14 אינדוקציה של תא T אפופטוזיס 15. שנת 2007 הראינו כי exosomes שוחרר מתאי הפיטום מכילים RNA שליח (mRNA) ו microRNA (מירנה), וכי RNA יכול להיות דילג מתא אחד למשנהו באמצעות exosomes. בתוך התאים הנמען, mRNA דילג על ידי exosomes הוצגה להיות מתורגם לחלבון, דבר המצביע על תפקיד הרגולציה של ה-RNA להעביר 16. יתר על כן, אנו הראו גם כי exosomes מתאי צמח תחת סטרס חמצוני יכול לגרום ללחץ נוסף סובלנות נגד בתאים הנמען ובכך להציע הפונקציה הביולוגית של המעבורת exosomal RNA 17. תרבית תאים מדיה ביולוגית שיתוף נוזליםntain תערובת של שלפוחית ​​ולשפוך שברים. באיכות גבוהה בידוד שיטה exosomes, ואחריו אפיון וזיהוי של exosomes ואת התוכן שלהם, לכן חיוני להבחין בין שלפוחית ​​exosomes וחלקיקים אחרים. כאן, אנו מציגים שיטה הבידוד של exosomes ממדיום שני תאים תרבות נוזלי הגוף. שיטה זו מבוססת על בידוד צנטריפוגה חוזרות צעדים סינון, ואחריו צעד ultracentrifugation הסופית שבה exosomes הם pelleted. שיטות חשוב לזהות את exosomes ולאפיין את המורפולוגיה exosomal ואת תכולת החלבון מודגשים, לרבות במיקרוסקופ אלקטרונים, cytometry זרימה כתם המערבי. טיהור של RNA exosomal הכולל מבוסס על כרומטוגרפיה בעמודה ספין התשואה exosomal RNA והפצה גודל מנותח באמצעות Bioanalyzer.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes at JoVE.com

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

מסמך זה מדגים שיטות לטיהור בידוד וזיהוי של exosomes, כמו גם טכניקות לניתוח של התוכן המולקולרי שלהם. שיטות אלה להתאמה עבור בידוד exosome משני תרבות התקשורת התא נוזלים ביולוגיים, והוא יכול מעבר ניתוח של התוכן המולקולרי להיות שימושית גם במחקרים תפקודית.

בידוד ואפיון של RNA המכיל Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

isolation-and-characterization-of-rna-containing-exosomes

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

99.2K Views.  University of Gothenburg. מסמך זה מדגים שיטות לטיהור בידוד וזיהוי של exosomes, כמו גם טכניקות לניתוח של התוכן המולקולרי שלהם. שיטות אלה להתאמה עבור בידוד exosome משני תרבות התקשורת התא נוזלים ביולוגיים, והוא יכול מעבר ניתוח של התוכן המולקולרי להיות שימושית גם במחקרים תפקודית.

Video: Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

הדור של RNA / DNA כלאיים ב-DNA הגנום על ידי טרנספורמציה באמצעות RNA המכיל oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor formation. Taken together these studies suggest that resident lung MSC play a role during pulmonary tissue homeostasis, injury and repair during diseases such as pulmonary fibrosis (PF) and arterial hypertension (PAH). Here we describe a technology to define a population of resident lung MSC. The definition of this population in vivo pulmonary tissue using a define set of markers facilitates the repeated isolation of a well-characterized stem cell population by flow cytometry and the study of a specific cell type and function.

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

In this article we demonstrate the isolation of murine resident lung mesenchymal stem cells (lung MSC), their expansion, characterization and analysis of immunomodulatory properties.

בידוד &amp; אפיון Hoechst נמוך CD45 שלילי עכבר mesenchymal ריאות בתאי גזע

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

בידוד, תרבות ואפיון פונקציונלי של Cardiomyoctyes מאוס למבוגרים

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived microvesicles (MVs, diameter &#62; 100 nm) is a fundamental cellular process that occurs in all living cells. These vesicles transport proteins, lipids and nucleic acids specific for their cell of origin and in vitro studies have highlighted their importance as mediators of intercellular communication. EVs have been successfully isolated from various body fluids and especially EVs in blood have been identified as promising biomarkers for cancer or infectious diseases. In order to allow the study of MV subpopulations in blood, we present a protocol for the standardized isolation and characterization of MVs from peripheral blood samples. MVs are pelleted from EDTA-anticoagulated plasma samples by differential centrifugation and typically possess a diameter of 100 - 600 nm. Due to their larger size, they can easily be studied by flow cytometry, a technique that is routinely used in clinical diagnostics and available in most laboratories. Several examples for quality control assays of the isolated MVs will be given and markers that can be used for the discrimination of different MV subpopulations in blood will be presented.

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

בידוד ואפיון של Microvesicles מן הדם היקפי

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead myocardium after MI. Although several strategies have been used to regenerate myocardium, stem cell therapy remains a major approach to replenish the dead myocardium of an MI heart. Accumulating evidence suggests the presence of resident cardiac stem cells (CSCs) in the adult heart and their endocrine and/or paracrine effects on cardiac regeneration. However, CSC isolation and their characterization and differentiation toward myocardial cells, especially cardiomyocytes, remains a technical challenge. In the present study, we provided a simple method for the isolation, characterization, and differentiation of CSCs from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient method for the isolation of CSCs, where the heart is digested by a 0.2% collagenase II solution. To characterize the isolated CSCs, we evaluated the expression of CSCs/cardiac markers Sca-1, NKX2-5, and GATA4, and pluripotency/stemness markers OCT4, SOX2, and Nanog. We also determined the proliferation potential of isolated CSCs by culturing them in a Petri dish and assessing the expression of the proliferation marker Ki-67. For evaluating the differentiation potential of CSCs, we selected seven- to ten-days cultured CSCs. We transferred them to a new plate with a cardiomyocyte differentiation medium. They are incubated in a cell culture incubator for 12 days, while the differentiation medium is changed every three days. The differentiated CSCs express cardiomyocyte-specific markers: actinin and troponin I. Thus, CSCs isolated with this protocol have stemness and cardiac markers, and they have a potential for proliferation and differentiation toward cardiomyocyte lineage.

The overall goal of this article is to standardize the protocol for the isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells (CSCs) from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient centrifugation method to isolate murine CSCs and elaborated methods for CSC culture, proliferation, and differentiation into cardiomyocytes.

בידוד, אפיון, התמיינות של תאי גזע הלב מהלב העכבר למבוגרים

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

בידוד ואפיון של מבוגרים ופיברותקיעות לב ומיופיברופיצוצים

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the isolation of these vesicles, including ultracentrifugation, ultrafiltration, and size exclusion chromatography. However, not all are suitable for large scale exosome purification and characterization. Outlined here is a protocol for establishing cultures of primary fibroblasts isolated from adult mouse skeletal muscles, followed by purification and characterization of exosomes from the culture media of these cells. The method is based on the use of sequential centrifugation steps followed by sucrose density gradients. Purity of the exosomal preparations is then validated by western blot analyses using a battery of canonical markers (i.e., Alix, CD9, and CD81). The protocol describes how to isolate and concentrate bioactive exosomes for electron microscopy, mass spectrometry, and uptake experiments for functional studies. It can easily be scaled up or down and adapted for exosome isolation from different cell types, tissues, and biological fluids.

This protocol illustrates the 1) the isolation and culture of primary fibroblasts from the adult mouse gastrocnemius muscle as well as 2) purification and characterization of exosomes using a differential ultracentrifugation method combined with sucrose density gradients followed by western blot analyses.

בידוד ואפיון אקסוזומים מפיברובלסטים של שרירי השלד

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

בידוד ואפיון של תאי אנדותל סינוסואידליים ראשוניים בכבד של עכבר

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. Studying the structure and composition of phycobilisome is of great interest to scientists because it reveals the evolution and divergence of photosynthesis in cyanobacteria. This protocol provides a detailed and optimized method to break cyanobacterial cells at low cost by a bead-beater efficiently. The intact phycobilisome can then be isolated from the cell extract by sucrose gradient ultracentrifugation. This method has demonstrated being suitable for both model and non-model cyanobacteria with different cell types. A step-by-step procedure is also provided to confirm the integrity and property of phycobiliproteins by 77K fluorescence spectroscopy and SDS-PAGE stained by zinc sulfate and Coomassie Blue. The isolated phycobilisome can also be subjected to further structural and compositional analyses. Overall, this protocol provides a helpful starting guide that allows researchers unfamiliar with cyanobacteria to quickly isolate and characterize intact phycobilisome.

The current protocol details the isolation of phycobilisomes from cyanobacteria by centrifugation through a discontinuous sucrose density gradient. The fractions of intact phycobilisomes are confirmed by 77K fluorescent emission spectrum and SDS-PAGE analysis. The resulting phycobilisome fractions are suitable for negative staining of TEM and mass spectrometry analysis.

בידוד ואפיון של פיקוביליזום שלם בציאנובקטריה

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential biotechnology models. Recent work has demonstrated that both marine and freshwater cyanobacteria produce extracellular vesicles -&#160;small membrane-bound structures released from the outer surface of the microbes. While vesicles likely contribute to diverse biological processes, their specific functional roles in cyanobacterial biology remain largely unknown. To encourage and advance research in this area, a detailed protocol is presented for isolating, concentrating, and purifying cyanobacterial extracellular vesicles. The current work discusses methodologies that have successfully isolated vesicles from large cultures of Prochlorococcus, Synechococcus, and Synechocystis. Methods for quantifying and characterizing vesicle samples from these strains are presented. Approaches for isolating vesicles from aquatic field samples are also described. Finally, typical challenges encountered with cyanobacterial vesicle purification, methodological considerations for different downstream applications, and the trade-offs between approaches are also discussed.

The present protocol providesdetailed descriptions for isolation, concentration,and characterization of extracellular vesicles from cyanobacterial cultures. Approaches for purifying vesicles from cultures at different scales, trade-offs among methodologies, and considerations for working with field samples are also discussed.