Este estudio fue financiado por el Consejo Sueco de Investigación (K2008-57X-20 676-01-3).

1. Aislamiento exosoma <ol><li> Se cultivan las células en un medio con exosoma libre de suero. Por lo tanto, cualquier suero añadido al medio de cultivo celular deberá ser agotado de exosomas por ultracentrifugación a 120 000 xg durante la noche a 4 ° C antes de su uso. </li><li> Transferencia de la suspensión celular a tubos cónicos. </li><li> Centrifugar a 300 g durante 10 minutos a 4 ° C para que sedimenten las células. </li><li> Transferir el sobrenadante a tubos de ultracentrífuga y si no está completamente lleno PBS agrega. </li><li> Centrifugar la muestra a 16 500 g durante 20 minutos a 4 ° C para eliminar más células y restos celulares. </li><li> Filtrar el sobrenadante a través de un filtro de 0,2 micras para eliminar las partículas mayores de 200 nm. </li><li> Transferir el sobrenadante se filtra a los tubos de ultracentrífuga nuevo y sellado de los tubos antes de ultracentrifugación a 120 000 xg durante 70 minutos a 4 ° C para que sedimenten las exosomas. </li><li> Eliminar el sobrenadante. </li><li> Para la recuperación de exosoma máximo, volver a suspender el enriquecimiento exosomaed pellet en varias ocasiones en un volumen pequeño (3 x 50 l) de una solución amortiguadora. Este buffer depende de los experimentos posteriores previstas tras el aislamiento exosoma. Por ejemplo, un tampón de lisis se utiliza para la proteína y el aislamiento de ARN, PBS se utiliza para la microscopía electrónica y citometría de flujo y por medio de los estudios funcionales pueden ser preferibles. </li></ol> Nota: exosomas también se puede aislar de diferentes fluidos corporales, tales como el plasma, utilizando el mismo procedimiento que para los medios de cultivo celular. Para fluidos viscosos, puede ser necesario diluir la muestra con PBS antes de la centrifugación y filtración. En relación con la velocidad de centrifugación para el punto 5, se puede aumentar a 29 500 xg, y la ultracentrifugación en el punto 7 se puede ampliar a 90 minutos 18. Si la muestra tiene que ser purificado el exosoma pellet se puede flotar en un gradiente de sacarosa y de los exosomas principalmente se encuentra en la fracción representing una densidad de 1,13-1,19 g / ml 2. 2. Identificación exosoma por microscopía electrónica <ol><li> A fin de eliminar las proteínas contaminantes, resuspender el pellet exosoma enriquecido en PBS y ultracentrifugación a 120 000 xg durante 70 minutos a 4 ° C para volver a precipitar las exosomas. </li><li> Tome una pequeña alícuota de la muestra para el aislamiento de la proteína y la medición de proteínas totales. Asegúrese de que sólo una pequeña parte de la muestra se lisaron y se utiliza para la medición de la proteína y mantener intacta la exosomas, resuelto en PBS, por separado o en el hielo a -80 ° C para experimentos adicionales. </li><li> Ponga una gota, aproximadamente 10 g de proteína exosomal de los exosomas intacta resuspendido en PBS, en una Parafilm. Luego, con pinzas, suavemente la posición de una rejilla de carbono recubiertos de níquel formvar en la parte superior de cada gota durante 30-60 minutos. Asegurar que la red se coloca con el lado frente a la caída de recubrimiento que contiene exosomas. </li><li> Coloque tres gotas, cada 30 l de PBS en tque Parafilm y lavar la red de forma secuencial el posicionamiento de la rejilla en la parte superior de las gotas de PBS, y el uso de un papel absorbente en el medio. Utilice el papel absorbente con cuidado sólo por la celebración de cerca a un lado de la red, sin hacer contacto con la superficie recubierta. </li><li> Fijar la muestra a través de depósito una caída de 2% de paraformaldehído en el Parafilm y el lugar de la red en la parte superior de la gota durante 10 minutos. </li><li> Repita el paso de lavado en el punto 4, antes de la inmunotinción con un anticuerpo apropiado. Anticuerpos utilizados son anti-CD63 y anti-MHC de clase II. La microscopía electrónica también se puede realizar sin inmunotinción como exosomas se pueden identificar exclusivamente en función del tamaño y morfología. Sin embargo, se recomienda para evaluar el tamaño, la morfología y la presencia de una proteína de membrana para una validación más concluyentes. </li><li> Transferencia de la red a una caída de 30 l del anticuerpo primario de elección y se incuba durante 40 minutos. Lavar a repetir el punto 4, pero el uso de 0,1% de albúmina sérica bovina en PBS en lugar de PBS. </li><li> Repita el punto 7, pero con los 10 nm de oro y anticuerpo secundario marcado y lavar con PBS solo. </li><li> Después de fijar la muestra mediante la adición de una caída de 2,5% de glutaraldehído al Parafilm e incube la rejilla en la parte superior de la gota durante 10 minutos. Repita el lavado en el punto 4, pero el uso de cinco gotas de agua desionizada en lugar de tres gotas de PBS. </li><li> Contraste de la muestra mediante la adición de una gota de acetato de uranilo al 2% a la Parafilm e incube la red en la parte superior de la caída durante 15 minutos. </li><li> Integrar la muestra mediante la adición de una gota de metilcelulosa al 0,13% y el 0,4% de acetato de uranilo al Parafilm e incube la red en la parte superior de la gota durante 10 minutos. </li><li> Retire el exceso de líquido con cuidado utilizando un papel absorbente, antes de colocar la rejilla en un papel con la cara cubierta y dejar secar al aire durante 5 minutos. </li><li> Examinar las preparaciones con un microscopio electrónico o tienda de las redes en una celda de la malla para el trabajo futuro. </li></ol> 3.Caracterización exosoma por citometría de flujo Como exosomas son demasiado pequeños para ser detectados por el equipo actual de la citometría de flujo, es necesario unir primero los exosomas a cuentas recubiertas de anticuerpos (Figura 1). Estas cuentas pueden ser adquiridos como un producto ya hecho o en el laboratorio con el anticuerpo de elección. Dependiendo del origen celular exosomal, diferentes anticuerpos se pueden acoplar a los granos que pueden ser de carácter magnético o al látex. En la actualidad el uso anti-MHC de clase II o anti-CD63 bolas recubiertas de este análisis. <ol><li> Para el uso de los granos &quot;casera&quot; recubiertas de anticuerpos, utilizamos cuatro bolas de látex recubiertas con anticuerpos anti m-CD63 anticuerpos. Lavar 25 l 4 bolas de látex m (30 x 10 6 bolas) dos veces en 100 l tampón MES, 3 000 g durante 15-20 minutos y disolver el precipitado en 100 l tampón MES. Prepare la mezcla de anticuerpos que contiene un volumen igual de anticuerpo 12,5 mg con el mismo volumen de tampón MES. Agregue elcuentas a la mezcla de anticuerpos e incubar con agitación durante la noche a temperatura ambiente. Lave las cuentas recubiertas de anticuerpos tres veces con PBS (3 000 g durante 20 minutos) y disolver el precipitado en 100 l de buffer de almacenamiento (con una concentración final de 300 000 cuentas / l). </li><li> Para cada muestra (cada anticuerpo), continuar con un volumen equivalente a un mínimo de 30 g de proteína exosomal (de los exosomas intacta resuelto en PBS) por ~ 100 000 perlas recubiertas de anticuerpos. </li><li> Incubar exosomas y cuentas, en un volumen total de 300 l de PBS, durante la noche a 4 ° C en el movimiento suave. </li><li> Bloque mediante la adición de 300 l de 200 mM glicina y se incuba durante 30 minutos. </li><li> Lavar los complejos exosoma de perlas dos veces en tampón de lavado (suero de 1-3% en PBS), 600 g durante 10 minutos. </li><li> Incubar los complejos exosoma de perlas con 50 l de anticuerpos IgG a 4 ° C. Lavar los complejos exosoma de perlas dos veces en tampón de lavado como se describe en el paso 5. </li><li> Añadir 90 l de solución de lavado y 10 lanticuerpos de la elección (lo ideal es anti-CD9 y anti CD63-CD81 o anti-) a los complejos exosoma de perlas y se incuba durante 40 minutos con movimientos suaves. Lavar los complejos exosoma de perlas dos veces en tampón de lavado como se describe en el paso 5. </li><li> Añadir 300 l de solución de lavado y adquirir datos mediante citometría de flujo. </li></ol> Como se discutió cuentas anteriores, se pueden utilizar diferentes, tales como bolas de látex como se describe en el protocolo o partículas magnéticas. Si las bolas magnéticas se utilizan en su lugar, tenga en cuenta, que el protocolo es un poco diferente. El paso de bloqueo (punto 4) no es necesaria y el lavado se realiza colocando el tubo en un soporte magnético en lugar de una centrifugación. El buffer de almacenamiento utilizadas para las cuentas de &quot;fabricación casera&quot; recubiertas de anticuerpos, contiene 0,1% de glicina y sodio al 0,1% azid en PBS, con un pH de 7,2. Importante, asegúrese de utilizar el suero exosoma agotadas para el buffer de flujo de lavado de citometría de flujo (1-3% de suero en PBS), para evitar cualquierexosomas suero contaminantes en el análisis. Nota: al realizar la caracterización mediante el uso de anticuerpos exosoma cuentas junto es importante reconocer que es sólo una subpoblación específica, específica para los anticuerpos utilizados, es decir, aislado y caracterizado. 4. Detección exosoma por Western blot Western blot es un método bien establecido y no vamos a entrar en detalles sobre el método en sí, sino que se centran en la importancia de un adecuado aislamiento de las proteínas antes de la Western blot y los diferentes anticuerpos utilizados. <ol><li> Disolver la pastilla exosoma en el tampón de lisis de proteínas de la elección y pipeteo fondo, seguido por vórtice de mezclas. A fin de lisar los exosomas, sonicar la muestra en un baño de agua de 3 x 5 minutos con el vórtice de mezcla en el medio. Finalmente centrifugación de la muestra, 13 000 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente, y la transferencia del sobrenadante a un nuevo tubo Eppendorf. </li><li> Measuvolver a la proteína total por el método de elección y la carga de 20-50 g de proteína por cada pozo. </li><li> Separada y la transferencia de las proteínas mediante electroforesis en gel y electrotransferencia. </li><li> Bloquear y lavar la membrana antes de realizar la inmunotinción frente a las proteínas enriquecido en exosomas. </li><li> Detectar la proteína específica por quimioluminiscencia, sistema de imagen digital y software de análisis. </li></ol> Como no hay marcadores específicos exosoma, las proteínas que se enriquecen en los exosomas, de todos los orígenes celulares diferentes, se utilizan comúnmente para la detección de exosomas. Estas son las proteínas, tales como tetraspaninas (por ejemplo, CD9, CD63 y CD81), proteína del citoesqueleto asociados (por ejemplo, Ezrin) y proteínas implicadas en la biogénesis multivesiculares (por ejemplo, Tsg101 y Alix). Otras proteínas que también son comúnmente detectado en los exosomas son Flotillin, Hsc70 y diferentes proteínas Rab, etc Sin embargo, también hay células proteínas específicas que se encuentran en los exosomas como A33 (células epiteliales del intestino), CD3(Células T) y el MHC de clase II (células presentadoras de antígenos). Así, dependiendo de qué tipo de células a partir de los exosomas son liberados de los marcadores para la detección puede variar. Como otros compartimientos de la célula también puede producir vesículas, se recomienda también para determinar la presencia de proteínas de estos compartimentos como el retículo endoplasmático (por ejemplo, calnexina y grp78) y el aparato de Golgi (por ejemplo, GM130). Por lo tanto, la falta de estas proteínas indica poca o ninguna contaminación de las vesículas de otros compartimentos de la muestra estudiada. 5. El aislamiento de ARN exosomal y análisis de ARN <ol><li> Disolver la pastilla exosoma en el tampón de lisis de ARN de la elección y llevar a cabo la extracción de RNA. Diferentes kits de aislamiento de ARN se pueden utilizar dependiendo de los experimentos posteriores, pero los métodos basados ​​en la columna proporciona muestras con un espectro más amplio de la ARN. Actualmente estamos utilizando miRCURY kit de aislamiento de ARN Exiqon, pero otros equipos pueden ser adecuados en función de la scientific cuestión que nos ocupa. </li><li> Al realizar el aislamiento de ARN es importante trabajar en un ambiente libre de RNasa. Por lo tanto el uso de ácidos nucleicos y nucleasa consejos gratis pipeta y limpie tanto banquillo y el equipo libre de contaminantes y RNasas. </li><li> Para el aislamiento de ARN, mediante el uso de miRCURY kit de aislamiento de ARN, disolver el exosoma pellet en 350 l de solución de lisis y realizar vórtice de la mezcla durante 15 segundos. </li><li> Añadir 200 l de etanol al 95% y agitar la mezcla durante 10 segundos. </li><li> Coloque una columna en un tubo de recogida y transferencia de los exosomas lisis de la columna y centrifugar 1 minuto a 14 g. 000 x </li><li> Lavar tres veces añadiendo 400 l de solución de lavado a la columna que contiene el ARN exosomal y centrifugar durante 1 minuto a 14 g. 000 x </li><li> Centrifugar la columna durante 2 minutos a 14 000 xg para asegurarse de que la columna se seque y coloque la columna seca en un tubo libre de RNasa eppendorf. </li><li> Añadir 50 l de Tampón de Elución de la columna y centrifugar durante 2<html> minutos a 200 xg, seguido por 1 minuto a 14 g. 000 x </li><li> Continuar con el ARN aislado o almacenarlo en -80 ° C. </li></ol> Para la detección y análisis de la ARN extraído exosomal total, use un Agilent 2100 Bioanalyzer con el ARN Nano 6000 o Kit ARN 6000 Pico. El análisis muestra que el rendimiento exosomal ARN y distribución de tamaño. 6. Resultados representante Los exosomas son demasiado pequeños para ser detectados por los métodos disponibles de citometría de flujo, y por lo tanto unido al anticuerpo revestida de piedras antes de ser analizados (Figura 1). Como exosoma de perlas complejos puede agregar la citometría de flujo diagrama de dispersión puede contener diferentes poblaciones de cuentas individuales, dobles y triples (Figura 2A). La flecha indica las cuentas individuales que se analizan más. A CD63 positivo solo grano-exosoma población en comparación con su control de isotipo se muestra en la Figura 2B. e_content &quot;&gt; Debido al pequeño tamaño de los exosomas, que sólo se pueden visualizar directamente con el microscopio electrónico, y no por microscopía de luz. típicas características morfológicas de los exosomas son de forma redonda y 30-100 nm de tamaño vesículas de membrana. En la figura 3, la microscopía electrónica fotografías muestran exosomas immunostained (A) con el oro-anticuerpo marcado para CD63 (indicado por la flecha) y no immunostained exosomas (B). Para determinar que las vesículas aisladas son de hecho los exosomas y para caracterizar las proteínas exosomal, Western blot se usa comúnmente. La figura 4 muestra la ausencia de calnexina, un marcador de retículo endoplásmico. Esto indica poca contaminación de las vesículas del retículo endoplasmático. Por otra parte, la Figura 4 se muestra la presencia de CD81 en los exosomas, que es un tetraspanin comúnmente enriquecidos en exosomas. ARN celular contienen principalmentes del RNA ribosomal (rRNA), visto como los dos picos prominentes para el 18S y 28S rRNA subunidades en un análisis de Bioanalyzer (Figura 5). Sin embargo, el ARN exosomal difieren en su perfil como exosomas carecen de los dos picos rRNA (18S y 28S) y se enriquecen en el ARN corto como ARNm y miRNA (Figura 5). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig1.jpg" /> Figura 1. Debido al pequeño tamaño de los exosomas (30-100 nm), que no se puede distinguir el ruido de fondo y cuando se analizaron por citometría de flujo. Por lo tanto, es necesario para la fijación de perlas recubiertas de anticuerpos antes de los exosomas son analizadas, lo que puede ser visualizado por el láser. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig2.jpg" /> Figura 2. Las cuentas exosoma complejo puede agregar con cuentas dobles y triples entre sí y la forma (A). La flecha está demostrando el único cordón-exo<html> algunos grupos de población que está cerrada y se utiliza para su posterior análisis. Esta población se pueden comparar directamente a un control de isotipo (gris lleno de pico) para determinar la presencia de moléculas de la membrana de los exosomas. CD63 positivo exosomas (pico abierto negro) se muestran en la figura B. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig3.jpg" /> Figura 3. Micrografías electrónicas de exosomas con la morfología y el tamaño típico (40-80 nm) (A y B). La flecha en el gráfico A se indica la partícula de oro de la secundaria de anticuerpos, verificando que esta exosoma han CD63 en la superficie de la membrana. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig4.jpg" /> Figura 4. Western blot resultados que demuestren la ausencia de la proteína del retículo endoplásmico calnexina pero la presencia de la proteína común enriquecido en los exosomas, tetraspanin CD81. ve_content &quot;&gt; <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3037/3037fig5.jpg" /> Figura 5. Bioanalyzer resultados muestran la presencia de ARN en las células (A) y exosomas (B). Las flechas indican el 18S y 28S rRNA subunidades presentes en las células. Como exosomal varonil ARN contienen ARN pequeños rRNA poco o nada se identifica en los exosomas.

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JL es una co-propietario de una patente relacionada con la utilización de los exosomas como vectores para la transferencia de ARN en las células.

Al estudiar el contenido molecular y / o la función de los exosomas, es fundamental utilizar un método de aislamiento de alta calidad que proporciona un rendimiento adecuado y el grado más bajo posible de la contaminación. La metodología descrita en este trabajo es un enfoque bien establecido para aislar los exosomas y estudiar su contenido de ARN y función biológica. Por otra parte, la importancia de la caracterización de los exosomas aislados, por una combinación de diferentes métodos, incluyendo la microscopía electrónica, citometría de flujo y Western blot, se pone de relieve. Al aislar los exosomas, en la primera centrifugación (300 xg) se utiliza para precipitar las células que pueden estar presentes en la suspensión de células o el líquido estudiado biológica. La segunda centrifugación a 16 500 xg necesita ser lo suficientemente fuertes para precipitar las células muertas, escombros más grandes, cuerpos apoptóticos y otros organelos. Después de la centrifugación, algunos protocolos incluyen una etapa de nanofiltración, pero algunos investigators han excluido a este paso. Sin embargo, hacemos hincapié en la importancia de los fragmentos de la erradicación y de las vesículas de más de 200 nm, por lo que recomendamos como una etapa de filtración. Si un aislamiento más estrictas que se necesita, a 100 nm filtros se pueden utilizar, pero tenga en cuenta que si se utilizan fluidos viscosos, estos filtros pueden obstruirse y material exosomal se pierde. Además, un sistema de filtración de 100 nm puede afectar a la morfología de los exosomas y, además, si exosomas son a mayor escala que se pueden perder. Por lo tanto, los 200 nm filtros parece apropiado para el aislamiento exosoma. Después de la filtración, la ultracentrifugación obligatoria a 120.000 xg se utiliza para que sedimenten las exosomas. Los exosomas se pueden seguir lavadas con PBS, unida a las microesferas recubiertas de anticuerpo y se lavó, o colocado en un gradiente de sacarosa para eliminar las proteínas contaminación. Sin embargo, esto puede ser un proceso muy lento de los recursos que sostienen que no es necesario, especialmente si el volumen de la muestra inicial es pequeña y / o el contenido de ARN of los exosomas es baja, como medidas adicionales disminuirá sustancialmente el material adicional. Sin embargo, una vez más, la naturaleza de las vesículas aisladas deberían ser probadas por la presencia y la ausencia de ciertas proteínas. Hasta la fecha, ningún marcador de proteínas absolutamente único de los exosomas ha sido identificado para verificar que la muestra contiene exosomas y nada más. Como resultado, una combinación de métodos son necesarios para caracterizar los exosomas, incluida la determinación del tamaño y la morfología de los exosomas por microscopía electrónica. Además, la pureza de la muestra se puede determinar mediante microscopía electrónica, ya que este método puede proporcionar una visión general del nivel de contaminación de la muestra, por ejemplo, con grandes vesículas, como por ejemplo micropartículas, cuerpos apoptóticos o restos celulares. Además, el contenido proteico de los exosomas se puede determinar por citometría de flujo y Western blot, y la combinación de estos dos métodos da como resultado un análisis tanto de la unida a la membrana (por ejemplo, CD63 yCD81) e internalizado las proteínas (por ejemplo, Tsg101 y Alix) de los exosomas. Detección de proteínas enriquecido en los exosomas, como CD63, Tsg101 y Alix, y la ausencia de proteínas tales como el retículo endoplasmático proteína calnexina, es una indicación de que el exosoma pellet enriquecido es de hecho exosomas y no contaminar las vesículas de los otros compartimientos de la célula. El perfil de los ARN que se detecta en los exosomas es fundamentalmente diferente a la del ARN que se encuentran en las células intactas. Por lo tanto, el ARN exosomal analizados por Bioanalyzer o en gel a base de los enfoques de análisis de ARN carecen de los dos picos del 18S y 28S rRNA subunidades, que ocupan un lugar destacado en el análisis del ARN celular. Por lo tanto, argumentan que la detección de cantidades significativas de rRNA en una muestra indica que el ARN total extraído no es de origen exosomal solo, y por lo tanto que el método de aislamiento es necesario mejorar la calidad y la seguridad.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Aislamiento exosoma </td></tr><tr><td> Optima L-90K ultracentrífuga </td><td> Beckman Coulter </td><td> 65670 </td><td></td></tr><tr><td> Quick-sello de tubos de ultracentrífuga </td><td> Beckman Coulter </td><td></td><td> Dependiendo del rotor utilizado diferentes tubos se necesitan. Ti70 (342.414), Ti45 (345776) </td></tr><tr><td> Quick-el sello del tubo inalámbrico Topper kit </td><td> Beckman Coulter </td><td> 358312 </td><td></td></tr><tr><td> Filtropur Filtro de jeringa, 0.20μm </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1826.001 </td><td> Para fluidos viscosos y / o grandes volúmenes, un sistema de filtración al vacío, 0,2 m, de VWR International se puede utilizar en su lugar (514 a 0600). </td></tr><tr><td> De microscopía electrónica </td></tr><tr><td> Formvar / rejillas de níquel recubierto de carbono </td><td> Ted Pella Inc </td><td> 1GN200 </td><td></td></tr><tr><td> Ratón anti-CD63 humano </td><td> BD Bioscience </td><td> 556019 </td><td> Final de conc: 0.05μg/μl </td></tr><tr><td> Control de isotipo, IgG1k (MOPC 21) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M9269 </td><td> Final de conc: 0.05μg/μl </td></tr><tr><td> IgG anti-ratón conjugado de oro, 10 nm </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7777 </td><td> Final de conc: 1% </td></tr><tr><td> LEO 912AB Omega microscopio electrónico </td><td> Carl Zeiss NTS </td><td></td><td> O un equipo equivalente. </td></tr><tr><td> Citometría de flujo </td></tr><tr><td> 4μm aldehyd / sulfato de látex cuentas </td><td> Dinámica interfacial </td><td> 12-4000 </td><td></td></tr><tr><td> Anticuerpos para el recubrimiento de las perlas de látex </td><td></td><td></td><td> Por ejemplo, anti-CD63 de BD Bioscience (556019) </td></tr><tr><td> Intelli-Mixer RM-2L </td><td> Elmi </td><td></td><td> O un equipo equivalente. </td></tr><tr><td> IgG de suero humano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I4506 </td><td></td></tr><tr><td> Para la detección de anticuerpos </td><td> BD Bioscience </td><td></td><td> Por ejemplo: anti-CD63 PE (556.020) PE anti-CD9 (555.372) de control de isotipo anti-CD81 PE (555,676) (555,749) </td></tr><tr><td> BD FACSAria </td><td> BD Bioscience </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Western Blot </td></tr><tr><td> Transsonic T 490 DH </td><td> ELMA </td><td></td><td> O un equipo equivalente. </td></tr><tr><td> El aislamiento de ARN exosomal y análisis de ARN </td></tr><tr><td> miRCURY ARN Kit de aislamiento </td><td> Exiqon A / S </td><td> 300110 </td><td></td></tr><tr><td> Agilent 2100 Bioanalyzer </td><td> Agilent Technologies </td><td> G2939A </td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and characterization of rna-containing exosomes

El campo de la investigación exosoma se está expandiendo rápidamente, con un aumento dramático en las publicaciones en los últimos años. Estas pequeñas vesículas (30-100 nm) de origen endocítica se propuso por primera vez de funcionar como una forma de reticulocitos para erradicar el receptor de transferrina, mientras que en los eritrocitos de maduración 1, y fueron nombrados después exosomas. Exosomas se forman por gemación interna de la tarde endosomes, la producción de cuerpos multivesiculares (MVBs), y se liberan en el medio ambiente por la fusión de la MVBs con la membrana plasmática 2. Desde el primer descubrimiento de exosomas, una amplia gama de células se ha demostrado que la liberación de estas vesículas. Exosomas también se han detectado en varios fluidos biológicos, como el plasma, el líquido lavado nasal, saliva y leche materna 3-6. Además, se ha demostrado que el contenido y la función de exosomas depende de la célula de origen y las condiciones en que se producen. Una variedad de funciones han sido los demoniosconcentrada de exosomas, tales como la inducción de tolerancia frente a alergenos 7,8, la erradicación de tumores establecidos en ratones 9, la inhibición y la activación de las células asesinas naturales 10-12, la promoción de la diferenciación en las células T reguladoras 13, la estimulación de la proliferación de células T 14 y la inducción de la apoptosis de las células T 15. Año 2007 se demostró que los exosomas liberados de los mastocitos contienen ARN mensajero (ARNm) y microRNA (miRNA), y que el ARN puede ser trasladado de una celda a otra a través de exosomas. En las células receptoras, el ARNm transportados por exosomas ha demostrado ser traducido a proteínas, lo que sugiere una función reguladora de la ARN transferido 16. Además, también hemos demostrado que los exosomas derivados de las células cultivadas en el estrés oxidativo puede inducir tolerancia frente al estrés adicional en las células receptoras y por lo tanto sugieren una función biológica de la lanzadera exosomal ARN 17. Medios de cultivo celular y co fluidos biológicosntain una mezcla de vesículas y arrojar fragmentos. Un método de aislamiento de alta calidad para los exosomas, seguido por la caracterización e identificación de los exosomas y su contenido, por lo tanto, es crucial distinguir exosomas de otras vesículas y partículas. A continuación, presentamos un método para el aislamiento de los exosomas de ambos medios de cultivo de células y fluidos corporales. Este método de aislamiento se basa en la centrifugación repetida y etapas de filtración, seguida de una etapa ultracentrifugación final en el que los exosomas se precipitan. Métodos importantes para identificar los exosomas y caracterizar la morfología exosomal y contenido de proteína se ponen de relieve, incluso la microscopia electrónica, citometría de flujo y Western blot. La purificación del RNA exosomal total se basa en la cromatografía de columna de giro y el rendimiento exosomal ARN y distribución de tamaño se analizaron mediante un Bioanalyzer.

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Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

Este documento muestra los métodos para el aislamiento, purificación y detección de exosomas, así como las técnicas para el análisis de su contenido molecular. Estos métodos son adaptables para el aislamiento exosoma de ambos medios de cultivo de células y fluidos biológicos, y puede más allá del análisis de contenido molecular también ser útil en los estudios funcionales.

Aislamiento y caracterización de ARN que contienen exosomas

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

isolation-and-characterization-of-rna-containing-exosomes

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

99.2K vistas.  University of Gothenburg. Este documento muestra los métodos para el aislamiento, purificación y detección de exosomas, así como las técnicas para el análisis de su contenido molecular. Estos métodos son adaptables para el aislamiento exosoma de ambos medios de cultivo de células y fluidos biológicos, y puede más allá del análisis de contenido molecular también ser útil en los estudios funcionales.

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Generation of RNA/DNA Hybrids in Genomic DNA by Transformation using RNA-containing Oligonucleotides

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be produced to contain any desired DNA or RNA sequence and can be prepared to include a wide variety of base and sugar modifications. Moreover, oligos can be designed to mimic specific nucleic acid alterations and thus, can serve as important tools to investigate effects of DNA damage and mechanisms of repair. We found that Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos with a length between 50 and 80 nucleotides can be particularly suitable to study, in vivo, functions and consequences of chromosomal RNA/DNA hybrids and of ribonucleotides embedded into DNA. RNA/DNA hybrids can readily form during DNA replication, repair and transcription, however, very little is known about the stability of RNA/DNA hybrids in cells and to which extent these hybrids can affect the genetic integrity of cells. RNA-containing oligos, therefore, represent a perfect vector to introduce ribonucleotides into chromosomal DNA and generate RNA/DNA hybrids of chosen length and base composition. Here we present the protocol for the incorporation of ribonucleotides into the genome of the eukaryotic model system yeast /Saccharomyces cerevisiae/. Yet, our lab has utilized Thermo Scientific Dharmacon RNA-containing oligos to generate RNA/DNA hybrids at the chromosomal level in different cell systems, from bacteria to human cells.

This work shows how to form an RNA/DNA hybrid at the chromosomal level and reveal transfer of genetic information from RNA to genomic DNA in yeast cells.

Generación de ADN / ARN híbridos en el ADN genómico de transformación utilizando oligonucleótidos de ARN que contiene

Synthetic short nucleic acid polymers, oligonucleotides (oligos), are the most functional and widespread tools of molecular biology. Oligos can be ...

Investigación

Biología

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor formation. Taken together these studies suggest that resident lung MSC play a role during pulmonary tissue homeostasis, injury and repair during diseases such as pulmonary fibrosis (PF) and arterial hypertension (PAH). Here we describe a technology to define a population of resident lung MSC. The definition of this population in vivo pulmonary tissue using a define set of markers facilitates the repeated isolation of a well-characterized stem cell population by flow cytometry and the study of a specific cell type and function.

Isolation & Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

In this article we demonstrate the isolation of murine resident lung mesenchymal stem cells (lung MSC), their expansion, characterization and analysis of immunomodulatory properties.

Aislamiento y Caracterización de Hoechst Baja CD45 Negativo Mouse células madre mesenquimales de pulmón

Tissue resident mesenchymal stem cells (MSC) are important regulators of tissue repair or regeneration, fibrosis, inflammation, angiogenesis and tumor ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

Aislamiento, cultivo y caracterización funcional de ratón adulto Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived microvesicles (MVs, diameter &#62; 100 nm) is a fundamental cellular process that occurs in all living cells. These vesicles transport proteins, lipids and nucleic acids specific for their cell of origin and in vitro studies have highlighted their importance as mediators of intercellular communication. EVs have been successfully isolated from various body fluids and especially EVs in blood have been identified as promising biomarkers for cancer or infectious diseases. In order to allow the study of MV subpopulations in blood, we present a protocol for the standardized isolation and characterization of MVs from peripheral blood samples. MVs are pelleted from EDTA-anticoagulated plasma samples by differential centrifugation and typically possess a diameter of 100 - 600 nm. Due to their larger size, they can easily be studied by flow cytometry, a technique that is routinely used in clinical diagnostics and available in most laboratories. Several examples for quality control assays of the isolated MVs will be given and markers that can be used for the discrimination of different MV subpopulations in blood will be presented.

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

Aislamiento y caracterización de microvesículas de la sangre periférica

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead myocardium after MI. Although several strategies have been used to regenerate myocardium, stem cell therapy remains a major approach to replenish the dead myocardium of an MI heart. Accumulating evidence suggests the presence of resident cardiac stem cells (CSCs) in the adult heart and their endocrine and/or paracrine effects on cardiac regeneration. However, CSC isolation and their characterization and differentiation toward myocardial cells, especially cardiomyocytes, remains a technical challenge. In the present study, we provided a simple method for the isolation, characterization, and differentiation of CSCs from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient method for the isolation of CSCs, where the heart is digested by a 0.2% collagenase II solution. To characterize the isolated CSCs, we evaluated the expression of CSCs/cardiac markers Sca-1, NKX2-5, and GATA4, and pluripotency/stemness markers OCT4, SOX2, and Nanog. We also determined the proliferation potential of isolated CSCs by culturing them in a Petri dish and assessing the expression of the proliferation marker Ki-67. For evaluating the differentiation potential of CSCs, we selected seven- to ten-days cultured CSCs. We transferred them to a new plate with a cardiomyocyte differentiation medium. They are incubated in a cell culture incubator for 12 days, while the differentiation medium is changed every three days. The differentiated CSCs express cardiomyocyte-specific markers: actinin and troponin I. Thus, CSCs isolated with this protocol have stemness and cardiac markers, and they have a potential for proliferation and differentiation toward cardiomyocyte lineage.

The overall goal of this article is to standardize the protocol for the isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells (CSCs) from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient centrifugation method to isolate murine CSCs and elaborated methods for CSC culture, proliferation, and differentiation into cardiomyocytes.

Aislamiento, caracterización y diferenciación de células cardiacas desde el corazón de ratón adulto

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

Aislamiento y caracterización de fibroblastos cardíacos adultos y miofibroblastos

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the isolation of these vesicles, including ultracentrifugation, ultrafiltration, and size exclusion chromatography. However, not all are suitable for large scale exosome purification and characterization. Outlined here is a protocol for establishing cultures of primary fibroblasts isolated from adult mouse skeletal muscles, followed by purification and characterization of exosomes from the culture media of these cells. The method is based on the use of sequential centrifugation steps followed by sucrose density gradients. Purity of the exosomal preparations is then validated by western blot analyses using a battery of canonical markers (i.e., Alix, CD9, and CD81). The protocol describes how to isolate and concentrate bioactive exosomes for electron microscopy, mass spectrometry, and uptake experiments for functional studies. It can easily be scaled up or down and adapted for exosome isolation from different cell types, tissues, and biological fluids.

This protocol illustrates the 1) the isolation and culture of primary fibroblasts from the adult mouse gastrocnemius muscle as well as 2) purification and characterization of exosomes using a differential ultracentrifugation method combined with sucrose density gradients followed by western blot analyses.

Aislamiento y caracterización de exosomas de fibroblastos del músculo esquelético

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

Aislamiento y caracterización de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas primarias de ratón

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Isolation and Characterization of Intact Phycobilisome in Cyanobacteria

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. Studying the structure and composition of phycobilisome is of great interest to scientists because it reveals the evolution and divergence of photosynthesis in cyanobacteria. This protocol provides a detailed and optimized method to break cyanobacterial cells at low cost by a bead-beater efficiently. The intact phycobilisome can then be isolated from the cell extract by sucrose gradient ultracentrifugation. This method has demonstrated being suitable for both model and non-model cyanobacteria with different cell types. A step-by-step procedure is also provided to confirm the integrity and property of phycobiliproteins by 77K fluorescence spectroscopy and SDS-PAGE stained by zinc sulfate and Coomassie Blue. The isolated phycobilisome can also be subjected to further structural and compositional analyses. Overall, this protocol provides a helpful starting guide that allows researchers unfamiliar with cyanobacteria to quickly isolate and characterize intact phycobilisome.

The current protocol details the isolation of phycobilisomes from cyanobacteria by centrifugation through a discontinuous sucrose density gradient. The fractions of intact phycobilisomes are confirmed by 77K fluorescent emission spectrum and SDS-PAGE analysis. The resulting phycobilisome fractions are suitable for negative staining of TEM and mass spectrometry analysis.

Aislamiento y caracterización del ficobilisoma intacto en cianobacterias

In cyanobacteria, phycobilisome is a vital antenna protein complex that harvests light and transfers energy to photosystem I and II for photochemistry. ...

Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles

Cyanobacteria are a diverse group of photosynthetic, Gram-negative bacteria that play critical roles in global ecosystems and serve as essential biotechnology models. Recent work has demonstrated that both marine and freshwater cyanobacteria produce extracellular vesicles -&#160;small membrane-bound structures released from the outer surface of the microbes. While vesicles likely contribute to diverse biological processes, their specific functional roles in cyanobacterial biology remain largely unknown. To encourage and advance research in this area, a detailed protocol is presented for isolating, concentrating, and purifying cyanobacterial extracellular vesicles. The current work discusses methodologies that have successfully isolated vesicles from large cultures of Prochlorococcus, Synechococcus, and Synechocystis. Methods for quantifying and characterizing vesicle samples from these strains are presented. Approaches for isolating vesicles from aquatic field samples are also described. Finally, typical challenges encountered with cyanobacterial vesicle purification, methodological considerations for different downstream applications, and the trade-offs between approaches are also discussed.

The present protocol providesdetailed descriptions for isolation, concentration,and characterization of extracellular vesicles from cyanobacterial cultures. Approaches for purifying vesicles from cultures at different scales, trade-offs among methodologies, and considerations for working with field samples are also discussed.