אלסנדרה ד'אזו מחזיקה בקתדרה לתכשיטנים לילדים (JFC) בגנטיקה וריפוי גנטי. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקי NIH R01GM104981, RO1DK095169 ו-CA021764, קרן אסיזי מממפיס וארגוני הצדקה האמריקניים הלבנוניים הסוריים.

כל ההליכים בעכברים בוצעו על פי פרוטוקולים של בעלי חיים שאושרו על ידי בית החולים למחקר לילדים סנט ג'וד, הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים והנחיות המכונים הלאומיים לבריאות.
1. הכנת פתרונות ומדיה
<ol><li>הכן את תמיסת העיכול על-ידי ערבוב של 15.4 מ"ל PBS עם 2.5 מ"ל של 20 מ"ג/מ"ל קולגנאז P (ריכוז סופי של 5 מ"ג/מ"ל), 2 מ"ל של 11 U/mL dispase II (ריכוז סופי של 1.2 U/mL), ו-100 μL של 1.0 M CaCl2 (ריכוז סופי של 5 mM).</li>
	<li>הכן 500 מ"ל של פיברובלסטים ראשוניים בינוניים (DMEM מלא) על ידי ערבוב 440 מ"ל של DMEM עם 50 מ"ל של FBS (10%), 5.0 מ"ל של עט / סטרפטוקוקוס (100 U / מ"ל ו 100 מיקרוגרם / מ"ל, בהתאמה) ו 5.0 מ"ל של תוסף גלוטמין (2 מ"ל). סנן וחטא את המדיום באמצעות מסנן ואקום בגודל נקבוביות בגודל 0.22 מיקרומטר.</li>
	<li>הכינו סרום נטול אקסוזום על ידי אולטרה-צנטריפוגה בת לילה של FBS בצינורות פוליפרופילן של 38.5 מ"ל ב-100,000 x גרם ב-4°C והעבירו את הסופרנאטנט לצינור חדש.</li>
	<li>הכן 500 מ"ל של מדיום ללא אקסוזום על ידי ערבוב 440 מ"ל DMEM עם 50 מ"ל של סרום ללא אקסוזום (10%), 5 מ"ל של עט / סטרפטוקוקוס (100 U / מ"ל ו 100 מיקרוגרם / מ"ל), ו 5 מ"ל של תוסף גלוטמין (2 מ"ל). סנן וחטא את המדיום באמצעות מסנן ואקום בגודל נקבוביות בגודל 0.22 מיקרומטר.</li>
	<li>הכן 0.5 M Tris-HCl (pH 7.4) על ידי המסת 6.057 גרם של בסיס Tris ב 90 מ"ל של dH 2 O והתאמתה- pH ל 7.4 עם HCl. כוונן את עוצמת הקול ל 100 מ"ל עם dH2O.</li>
	<li>הכן 10 mM Tris-HCl (pH 7.4)/1 mM Mg(Ac)2 solution (תמיסת עבודה סוכרוז) על ידי ערבוב 97.9 מ"ל של dH 2 O עם 2 מ"ל של 0.5 M Tris-HCl (pH = 7.4) ו- 100 μL של 1 M Mg(Ac)2. הוסיפו מעכבי פרוטאז לתמיסה ממש לפני השימוש ושמרו את התמיסה על קרח.</li>
	<li>הכינו תמיסות שיפוע צפיפות סוכרוז על קרח לפי טבלה 1. פתרונות אלה מספיקים כדי להכין שני צינורות שיפוע סוכרוז.</li>
	<li>מכינים 100% TCA על ידי הוספת 40 מ"ל של dH2O עד 100 גרם אבקת TCA ומערבבים עד להמסה מלאה. כוונן את עוצמת הקול הסופית עם dH2O עד 100 מ"ל.</li>
	<li>להכין 80% אתנול על ידי ערבוב 20 מ"ל של dH2O עם 80 מ"ל של 100% אתנול.</li>
	<li>הכן את מאגר הריצה של הכתם המערבי על ידי ערבוב 1.8 ליטר של dH2O עם 200 מ"ל של חיץ ריצה 10x.</li>
	<li>הכן את מאגר העברת הכתם המערבי על ידי ערבוב 1.4 ליטר של dH2O עם 200 מ"ל של מאגר העברה 10x ו- 400 מ"ל מתנול. מצננים מראש את מאגר ההעברה ל-4°C.</li>
	<li>הכן 20x Tris-buffered מלוחים (TBS) על ידי המסת 122 גרם של בסיס Tris ו 180 גרם של נתרן כלורי ב 850 מ"ל של dH2O (pH 8.0). כוונן את עוצמת הקול ל- 1 L עם dH2O.</li>
	<li>הכן חיץ חוסם על ידי המסת 5 גרם חלב יבש ללא שומן עם 1 מ"ל של 10% Tween-20, 5 מ"ל של 20x TBS, ו 94 מ"ל של dH2O.</li>
	<li>הכן מאגר נוגדנים על ידי המסת 3 גרם של BSA עם 1 מ"ל של 10% Tween-20, 5 מ"ל של 20x TBS, ו 94 מ"ל של dH2O.</li>
	<li>הכינו את מאגר הכביסה על ידי ערבוב 100 מ"ל של 20x TBS ו-20 מ"ל של 10% Tween-20 (10x) עם 1.88 ליטר של dH2O.</li>
	<li>הכן את תמיסת הפיתוח על-ידי ערבוב נפח 1 של לומינול/שיפור עם נפח אחד של חיץ מי חמצן יציב.</li>
</ol>2. דיסקציה של שריר העכבר גסטרוקנמיוס (GA)15,16
<ol><li>הכינו צינורות של 50 מ"ל המכילים PBS של 10 מ"ל על קרח.</li>
	<li>הרדימו את העכברים בתאCO2 ולאחר מכן נקע צוואר הרחם.</li>
	<li>הסר את שריר הגסטרוקנמיוס משתי הרגליים והעבר אותם לצינור עם PBS על קרח. הערה: הסר את שריר הסולאוס משריר GA לפני העברת שריר GA ל- PBS.</li>
</ol>3. בידוד ותרבית פיברובלסטים ראשוניים של עכבר
<ol><li>שוקלים את השרירים ומעבירים אותם לצלחת של 10 ס"מ מתחת למכסה מנוע בטיחות ביולוגית. טוחנים את השרירים באזמלים עד שהוא הופך לעיסה דקה.</li>
	<li>מעבירים את משחת השרירים הטחונה דק לצינור של 50 מ"ל ומוסיפים לצינור 3.5x רקמת נפח/מ"ג של תמיסת עיכול ודגרים במשך 45 דקות ב-37°C. מערבבים היטב את המתלה עם צינור 5 מ"ל כל 10 דקות (זה יעזור לדיסוציאציה מוחלטת). הערה: לחלופין, ניתן להשתמש במפיץ רקמות לשלב זה.</li>
	<li>הוסף 20 מ"ל של DMEM להשלים את השעיית התא כדי להשבית את פתרון העיכול. מעבירים למסננת תאי ניילון 70 מיקרומטר המונחת על צינור 50 מ"ל. אסוף את הזרימה ושטוף את מסננת התא עם 5 מ"ל נוספים של DMEM מלא.</li>
	<li>צנטריפוגו את מתלה התא ב-300 x גרם בטמפרטורת החדר (RT) למשך 10 דקות והוציאו בזהירות את הסופרנטנט.</li>
	<li>להשעות מחדש את הגלולה ב 10 מ"ל של DMEM להשלים ולזרוע את התאים לתוך צלחת 10 ס"מ.</li>
	<li>תרבית את התאים ב 37 ° C, 5% CO 2, 3% O2 (מעבר 0 או P0). הערה: 1) תרביות אלה צריכות להישמר ברמת חמצן נמוכה כדי להבטיח תנאים פיזיולוגיים (רמת O 2 בשרירי השלד היא סביב2.5%)17. 2) מספר המעבר (למשל, P0) של תרבית תאים הוא תיעוד של מספר הפעמים שהתרבית עברה תת-תרבית. 3) פיברובלסטים ראשוניים ב-P0 מתורבתים באופן שגרתי עד 100% מפגש פלוס יום אחד (ורק עבור P0). זאת כדי לטהר סוגים אחרים של תאים ולהבטיח שהתאים הנמצאים בתרבית הם רק פיברובלסטים, מרוקנים מתאים מיוגניים על סמך בדיקת מיקרוסקופ. שריר השלד של חיה בוגרת בגיל חודשיים מכיל כ -2% אבות מיוגניים4. בנוסף, אבות מיוגנים בדרך כלל אינם מתחברים למנות הלא מצופות; לכן, הם הולכים לאיבוד במהלך subculturing18,19,20. תאים מיוגניים דורשים תווך שונה (F10) בתוספת 20% FBS וגורם גדילה פיברובלסטי בסיסי (bFGF)18. ב DMEM שלם, פיברובלסטים בינוניים יש קצב התרבות גבוה יותר מאשר תאים מיוגניים, אשר גורם חיסול של תאים מזהמים אלה לפני המעבר הראשון.</li>
	<li>שטוף את תאי P0 עם PBS כאשר 100% confluent בתוספת 1 יום. הוסף 1 מ"ל של תמיסת טריפסיניזציה ודגר ב 37 ° C, 5% CO 2, 3% O2 כדי לנתק את התאים. עצור את הפעילות האנזימטית באמצעות 10 מ"ל של DMEM מלא.</li>
	<li>צנטריפוגות את התאים ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב RT ו resuspend את הגלולה ב 20 מ"ל של DMEM להשלים זרע לתוך צלחת 15 ס"מ (מעבר 1 או P1). התאים גדלים עד 80%-90% מפגש וניתן להרחיב אותם עד מעבר 3. הערה: בהתאם לניסויים במורד הזרם, ניתן להשתמש במעבר 1, מעבר 2 (P2) או מעבר 3 (P3).</li>
</ol>4. זריעת תאים ואיסוף מדיום מותנה
<ol><li>שטפו את הפיברובלסטים (P1, P2 או P3) עם 10 מ"ל PBS, הוסיפו 2.5 מ"ל של תמיסת טריפסיניזציה לתאים ודגרו ב-37°C, 5% CO 2, 3% O2. עצור פעילות אנזימטית באמצעות 10 מ"ל של DMEM מלא. הערה: לאחר קטע 4, תאים ראשוניים מושלכים ואין להשתמש בהם לניסויים נוספים, מכיוון שהם משנים מאפיינים.</li>
	<li>אסוף את התאים והצנטריפוגה ב 300 x גרם ב RT במשך 10 דקות.</li>
	<li>השהה מחדש את גלולת התא ב -10 מ"ל של תווך נטול אקסוזום וספור את התאים.</li>
	<li>זרעו את התאים ב 1.5-2.0 x 106 תאים לצלחת (15 ס"מ) ודגרו ב 37 ° C, 5% CO 2, 3% O2.</li>
	<li>אספו את התווך המותנה בין 16-24 שעות בצינורות של 50 מ"ל על קרח. הערה: אם התאים אינם חופפים ב-80%, ניתן להוסיף שוב תווך חופשי אקסוזומלי טרי ולאסוף אותו לאחר תקופה נוספת של 16-24 שעות. ניתן לשלב את שני האוספים לעיבוד נוסף.</li>
</ol>5. טיהור אקסוזומים באמצעות דיפרנציאל ואולטרה-צנטריפוגה
הערה: כל השלבים מבוצעים בטמפרטורה של 4°C או על קרח. אזנו את הצינור עם צינור מלא במים בעת הצורך.
<ol><li>צנטריפוגה את התווך המותנה ב 300 x גרם במשך 10 דקות להסרת תאים חיים ולהעביר את supernatant לצינור חדש 50 מ"ל.</li>
	<li>הסר תאים מתים על ידי צנטריפוגה ב 2,000 x גרם למשך 10 דקות ולהעביר את supernatant לצינור פוליפרופילן 38.5 מ"ל.</li>
	<li>צנטריפוגה את הסופרנאטנט ב 10,000 x גרם במשך 30 דקות להסרת אברונים, גופים אפופטוטיים, ושברי ממברנה. מעבירים את הסופרנאטנט לשפופרת אולטרה-שקופה בנפח 38.5 מ"ל.</li>
	<li>אולטרה-צנטריפוגה את הסופרנאטנט ב 100,000 x גרם במשך 1.5 שעות כדי לגלול את האקסוזומים.</li>
	<li>בזהירות להשליך את supernatant, משאיר כ 1 מ"ל של מדיום מותנה, ולשטוף את גלולה exosome בנפח כולל של 30 מ"ל של PBS קר כקרח.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 100,000 x גרם במשך 1.5 שעות בזהירות להשליך את supernatant על ידי pipetting, נזהר לא להפריע גלולה exosomal.</li>
	<li>השהה מחדש את הגלולה ב- PBS קר כקרח (~ 25 μL לכל צלחת של 15 ס"מ) ומדדו את ריכוז החלבון באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA וקורא מיקרו-צלחות ב- 562 ננומטר. הערה: ריכוז החלבון נמדד על ידי דילול 1:2 עם 0.1% Triton-X100 ב-dH2O. התפוקה של אקסוזומים מצלחת של 15 ס"מ (20 מ"ל של תווך מותנה) של פיברובלסטים ראשוניים במפגש של 80% היא ~3-4 מיקרוגרם.</li>
</ol>6. אפיון אקסוזומים על ידי שיפוע צפיפות סוכרוז
<ol><li>טען את שיפוע הסוכרוז בצינור אולטרה-ברור של 13 מ"ל על ידי פיפטציה (מלמטה למעלה) את הדברים הבאים: 1.5 מ"ל של 2.0 מטר, 2.5 מ"ל של 1.3 מטר, 2.5 מ"ל של 1.16 מטר, 2.0 מ"ל של 0.8 מטר ו-2.0 מ"ל של תמיסות סוכרוז 0.5 מטר.</li>
	<li>ערבבו 30–100 מיקרוגרם של אקסוזומים עם תמיסת סוכרוז 0.25 מ' וכווננו את הנפח ל-1 מ"ל.</li>
	<li>טען בזהירות את האקסוזומים על גבי שיפועים ואולטרה צנטריפוגה את הדגימות במשך 2.5 שעות ב 100,000 x גרם ו 4 ° C.</li>
	<li>הסר את הצינורות מהאולטרה-צנטריפוגה והנח אותם על קרח ואסוף שברים של 1.0 מ"ל החל מראש השיפוע. העבר אותם צינורות 1.7 מ"ל על קרח.</li>
	<li>הוסיפו 110 μL של 100% TCA לכל צינור, ערבבו היטב ודגרו במשך 10 דקות ב-RT.</li>
	<li>צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 10,000 x גרם ו RT בזהירות להשליך את supernatant.</li>
	<li>השהה מחדש את הגלולה ב 500 μL של אתנול 80% מקורר מראש ולהשאיר את הדגימות לשטוף במשך 10 דקות ב -20 ° C.</li>
	<li>צנטריפוגה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 10,000 x גרם ו-4°C והשליכו את הסופרנטנט.</li>
	<li>יבש את הגלולה למשך 10-15 דקות ב- RT והשהה מחדש את הגלולה ב- PBS לניסויים במבחנה. מדוד את ריכוז החלבון באמצעות ערכת בדיקת חלבון BCA או השהה מחדש את הגלולה ישירות ב- 14.5 μL של dH2O, 5 μL של 4x Laemmli buffer ו- 0.5 μL של 1 M DTT עבור ניתוחי כתמים מערביים.</li>
</ol>7. זיהוי אקסוזום על ידי ניתוח כתמים מערביים
<ol><li>ערבבו 5-10 מיקרוגרם של אקסוזומים משלב 5.7 עם 5 μL של 4x Laemmli buffer, ו-0.5 μL של 1 M DTT, ולאחר מכן התאימו את הנפח הסופי ל-20 μL עם dH2O. חממו את כל הדגימות, כולל אלה בשלב 6.9, למשך 5 דקות ב-98°C.</li>
	<li>יש להעמיס את הדגימות לג'ל 10% TGX ללא כתמים ולהעמיס את סולמות החלבונים בהתאם להמלצות היצרן. הערה: בחר את אחוז הג'ל בהתאם למשקל המולקולרי של החלבון המעניין.</li>
	<li>הפעל את הג'ל ב 100 V במשך ~ 1 שעות במאגר ריצה עד צבע ההעמסה נמצא בתחתית הג'ל. הערה: זמן הפעולה עשוי להשתנות בהתאם לציוד שבו נעשה שימוש או לסוג ולאחוז הג'ל.</li>
	<li>דמיינו את הג'ל. תמונות של הג'לים נטולי הכתמים משמשות כבקרת העמסה עבור אימונובלוטים.</li>
	<li>העבירו את הג'ל באמצעות קרום PVDF למשך שעה וחצי ב-80 וולט או למשך הלילה ב-30 וולט ב-4°C.</li>
	<li>חסום את הממברנות במאגר חוסם למשך שעה אחת ב- RT.</li>
	<li>יש לדגור על הממברנות לאיתור נוגדנים ספציפיים (טבלה 2) במאגר נוגדנים למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C עם תסיסה.</li>
	<li>שטפו את הממברנות בחיץ השטיפה ודגרו על הממברנות עם הנוגדנים המשניים המתאימים (טבלה 2) למשך שעה אחת ב- RT עם תסיסה.</li>
	<li>שטפו את הממברנות במאגר הכביסה ודמיינו את הממברנות באמצעות תמיסת פיתוח ומצלמה מבוססת מצלמה. לחלופין, השתמש בסרט רנטגן כדי לפתח את הממברנות.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Doyle, L. M., Wang, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+Extracellular+Vesicles,+Their+Origin,+Composition,+Purpose,+and+Methods+for+Exosome+Isolation+and+Analysis.">Overview of Extracellular Vesicles, Their Origin, Composition, Purpose, and Methods for Exosome Isolation and Analysis.</a> Cells. 8 (7), 727 (2019).</li><li>Gurunanthan, S., Kang, M. H., Jeyaraj, M., Qasim, M., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+Isolation,+Characterization,+Biological+Function,+and+Multifarious+Therapeutic+Approaches+of+Exosomes.">Review of the Isolation, Characterization, Biological Function, and Multifarious Therapeutic Approaches of Exosomes.</a> Cells. 8 (4), 307 (2019).</li><li>Zhang, Y., Liu, Y., Liu, H., Tang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+biogenesis,+biologic+function+and+clinical+potential.">Exosomes: biogenesis, biologic function and clinical potential.</a> Cell &amp; Bioscience. 9 (19), 3070-3085 (2019).</li><li>van de Vlekkert, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excessive+exosome+release+is+the+pathogenic+pathway+linking+a+lysosomal+deficiency+to+generalized+fibrosis.">Excessive exosome release is the pathogenic pathway linking a lysosomal deficiency to generalized fibrosis.</a> Science Advances. 5 (7), 3270 (2019).</li><li>Rackov, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Vesicle-Mediated+Control+of+Cell+Function:+The+Role+of+Extracellular+Matrix+and+Microenvironment.">A Vesicle-Mediated Control of Cell Function: The Role of Extracellular Matrix and Microenvironment.</a> Frontiers in Physiology. 9, 651 (2018).</li><li>Howitt, J., Hill, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+in+the+pathology+of+neurodegenerative+diseases.">Exosomes in the pathology of neurodegenerative diseases.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (52), 26589-26597 (2016).</li><li>Jing, H., Tang, S., Lin, S., Liao, M., Chen, H., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+vesicles+in+renal+fibrosis.">The role of extracellular vesicles in renal fibrosis.</a> Cell Death and Disease. 10 (5), 367 (2019).</li><li>Asef, A., Mortaz, E., Jamaati, H., Velayati, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+role+of+extracellular+vesicles+and+exosomes+in+the+pathogenesis+of+cystic+fibrosis.">Immunologic role of extracellular vesicles and exosomes in the pathogenesis of cystic fibrosis.</a> Journal of Respiratory Diseases, Thoracic Surgery, Intensive Care and Tuberculosis. 17 (2), 66-72 (2018).</li><li>Cai, A., Cheng, X., Pan, X., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+exosomes+in+liver+physiology+and+pathology.">Emerging role of exosomes in liver physiology and pathology.</a> Hepatology Research. 47 (2), 194-203 (2017).</li><li>Machado, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+lysosomal+exocytosis+mediates+cancer+progression.">Regulated lysosomal exocytosis mediates cancer progression.</a> Science Advances. 1 (11), 1500603 (2015).</li><li>Tian, W., Liu, S., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+role+of+exosomes+in+cancer+metastasis.">Potential role of exosomes in cancer metastasis.</a> Biomed Research International. , 4649705 (2019).</li><li>Barile, L., Vassalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+Therapy+delivery+tools+and+biomarkers+of+disease.">Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of disease.</a> Pharmacology and Therapeutics. 174, 63-78 (2017).</li><li>Patel, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+exosome+isolation+methods+using+culture+supernatant+for+optimum+yield,+purity+and+downstream+applications.">Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications.</a> Science Reports. 9 (1), 5335 (2019).</li><li>Ayala-Mar, S., Donoso-Quezada, J., Gallo-Villanueva, R. C., Perez-Gonzalez, V. H., Gonz&#225;lez-Valdez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+and+challenges+in+the+recovery+and+purification+of+cellular+exosomes.">Recent advances and challenges in the recovery and purification of cellular exosomes.</a> Electrophoresis. 40 (23-24), 3036-3049 (2019).</li><li>Boutagy, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mitochondria+from+Minimal+Quantities+of+Mouse+Skeletal+Muscle+for+High+Throughput+Microplate+Respiratory+Measurements.">Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53217 (2015).</li><li>. Muscle Dissection in mouse Available from: <a target="_blank" href="https://www.youtube.com/watch?v=Wh0gXfrHaH8">https://www.youtube.com/watch?v=Wh0gXfrHaH8</a> (2016)</li><li>Mas-Bargues, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+oxygen+concentration+in+stem+cell+culture+for+regenerative+medicine.">Relevance of oxygen concentration in stem cell culture for regenerative medicine.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1195 (2019).</li><li>Bois, P. R., Grosveld, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FKHR+(FOX01a)+is+required+for+myotube+fusion+of+primary+mouse+myoblasts.">FKHR (FOX01a) is required for myotube fusion of primary mouse myoblasts.</a> The EMBO Journal. 22 (5), 1147-1157 (2003).</li><li>Machida, S., Spangenburg, E. E., Booth, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+rat+muscle+progenitor+cells+have+decreased+proliferation+and+myotube+formation+during+passages.">Primary rat muscle progenitor cells have decreased proliferation and myotube formation during passages.</a> Cell Proliferation. 37, 267-277 (2004).</li><li>Syverud, B. C., Lee, J. D., VanDusen, K. W., Larkin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+purification+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+tissue+engineering.">Isolation and purification of satellite cells for skeletal muscle tissue engineering.</a> Journal of Regenerative Medicine. 3 (2), 117 (2014).</li></ol>

לאף אחד מהכותבים אין ניגודי עניינים להצהיר.

צעד קריטי לבידוד מוצלח של אקסוזומים מאמצעי התרבות, כפי שמתואר בפרוטוקול זה, הוא הקמה ותחזוקה נכונה של תרביות פיברובלסטים ראשוניים של עכברים משרירי שלד בוגרים. תרביות אלה צריכות להישמר ברמת חמצן נמוכה כדי להבטיח תנאים פיזיולוגיים (רמת O2 בשרירי השלד היא ~2.5%)15. פיברובלסטים ראשוניים ישנו מאפיינים כאשר הם מועברים בתרבית פעמים רבות מדי. לפיכך, מספר מעבר נמוך הוא הכרחי עבור תשואה אקסוזום אידיאלי. אקסוזומים מטוהרים יש להשתמש מיד למטרות ניסיוניות או לשמור קפוא ב aliquots ב -80 ° C עד הצורך. צעד חשוב נוסף בפרוטוקול הוא שימוש בתמיסות סוכרוז המוכנות טריות בכל פעם. מגבלה של השיטה היא שהיא גוזלת זמן, מכיוון שפיברובלסטים ראשוניים אינם מפרישים בדרך כלל כמויות גבוהות של אקסוזומים, כמו תאים מפרישים אחרים. לכן, יש להשתמש בתרבויות גדולות, מה שמביא לעיבוד כמויות גדולות של מדיה מותנית.
היתרון של צנטריפוגה דיפרנציאלית המשמשת כאן הוא שהיא מייצגת גישה ניתנת להרחבה (עד ליטרים) והיא שיטת הבחירה לבודד אקסוזומים מפיברובלסטים ראשוניים. שיטה חלופית לנפחים גדולים יותר (עד 100 מ"ל לעמודה) היא כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC). שיטה זו מהירה ויכולה להפריד חלבונים מאקסוזומים. העמוד אינו פולט אקסוזומים, ולכן נדרשים שלבי ריכוז או צנטריפוגות נוספים. אחד החסרונות של שיטת SEC הוא שהעמודה יכולה להיות סתומה לאורך זמן ולהעמיס יתר על המידה. שיטות עכשוויות אחרות מבוססות על שימוש בכמויות קטנות של נוזלים ביולוגיים (כלומר, שתן, CSF, סרום, פלזמה) וערכות זמינות מסחרית. למרות שערכות אלה מבטיחות יכולת שחזור, הן יקרות ולא תמיד מייצרות תפוקה גבוהה של אקסוזומים טהורים. הפרוטוקול המתואר לטיהור אקסוזום הוא פשוט וניתן ליישם אותו על סוגים שונים של תאים, רקמות ואיברים שלמים, או נוזלים ביולוגיים אחרים בהתאם לצורך הניסוי.

אקסוזומים הם שלפוחיות חוץ-תאיות הטרוגניות שגודלן נע בין 30-150 ננומטר. הם שחקני מפתח מבוססים בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים, בהתחשב בתפוצה שלהם בכל מקום ברקמות ואיברים 1,2. אקסוזומים נושאים מטען מורכב של חלבונים, ליפידים, סוגי דנ"א וסוגי רנ"א, המשתנים בהתאם לסוג התאים שמהם הם נגזרים 1,2,3. אקסוזומים מועשרים בחלבונים בעלי תפקידים שונים (כלומר, טטרספאנינים, כולל CD9 ו- CD63) אחראים לאירועי היתוך. לדוגמה, חלבוני הלם חום HSP70 ו- HSP90 מעורבים בקשירת אנטיגן והצגתו. בנוסף, Alix, Tsg101 ושייטת משתתפים בביוגנזה ושחרור אקסוזומים, ונמצאים בשימוש נרחב כסמנים של ננו-שלפוחיות אלה 2,3,4.
אקסוזומים מכילים גם מגוון של רנ"א (כלומר, מיקרו-רנ"א, רנ"א ארוך שאינו מקודד, רנ"א ריבוזומלי) שניתן להעביר לתאים מקבלים, שם הם משפיעים על איתות במורד הזרם3. בהיותה מוקפת בקרום יחידה אחת, פעילות ביולוגית אקסוזום תלויה לא רק במטען של חלבונים וחומצות גרעין, אלא גם ברכיבי שומנים של הממברנה המגבילה1. ממברנות אקסוזומליות מועשרות בפוספטידיל-סרין, חומצה פוספטידית, כולסטרול, ספינגומיילין, חומצה ארכידונית וחומצות שומן אחרות, שכולם יכולים להשפיע על יציבות האקזוזום ועל טופולוגיית הממברנה 2,3. כתוצאה מסידור המטען והשומנים, אקסוזומים יוזמים מסלולי איתות בתאים קולטים ומשתתפים בשמירה על פיזיולוגיה תקינה של רקמות 1,2,4,5. בתנאים פתולוגיים מסוימים (כלומר, ניוון עצבי, פיברוזיס וסרטן), הם הוכחו כמעוררים ומפיצים גירויים פתולוגיים 4,6,7,8,9,10,11.
בשל יכולתם להפיץ אותות לאתרים שכנים או מרוחקים, אקסוזומים הפכו לסמנים ביולוגיים יקרי ערך לאבחון או פרוגנוזה של מצבי מחלה. בנוסף, אקסוזומים שימשו באופן ניסיוני ככלי רכב של תרכובות טיפוליות 2,12. היישום הפוטנציאלי של ננו-שלפוחיות אלה במרפאה הופך את שיטת הבידוד לחשובה יותר ויותר על מנת להשיג תפוקה מרבית, טוהר ויכולת שחזור. טכניקות שונות לבידוד אקסוזומים פותחו ויושמו. באופן כללי, ניתן לבודד אקסוזומים ממדיה מותנית של תרביות תאים או נוזלי גוף על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית, כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל ולכידת מערכת החיסון (באמצעות ערכות מסחריות). לכל גישה יתרונות וחסרונות ייחודיים שנדונו בעבר 1,2,13,14.
הפרוטוקול המתואר מתמקד ב 1) בידוד ותרבית של פיברובלסטים ראשוניים משריר גסטרוקנמיוס עכבר בוגר 2) טיהור ואפיון של אקסוזומים המשתחררים למדיום התרבית על ידי תאים אלה. פרוטוקול מבוסס היטב לבידוד אקסוזומים מפיברובלסטים ראשוניים למחקרים פונקציונליים חסר כיום. פיברובלסטים ראשוניים אינם מפרישים כמויות גדולות של אקסוזומים, מה שהופך את תהליך הבידוד והטיהור למאתגר. פרוטוקול זה מתאר טיהור של כמויות גדולות של אקסוזומים טהורים מנפחי תרבית גדולים תוך שמירה על שלמותם המורפולוגית ופעילותם התפקודית. אקסוזומים מטוהרים המתקבלים מתווך מותנה שימשו בהצלחה בניסויי קליטה חוץ גופית כדי לגרום למסלולי איתות ספציפיים בתאים המקבלים. הם שימשו גם לניתוח פרוטאומי השוואתי של מטענים אקסוזומליים מדגימות ביולוגיות מרובות4.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm dishes</td>
			<td>Midwest Scientific, TPP</td>
			<td>TP93100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 cm dishes</td>
			<td>Midwest Scientific</td>
			<td>TP93150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin Fraction V</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735094001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430R with rotors FA-35-6-30/ FA-45-48-11</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022620659/5427754008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemidoc MP imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase P</td>
			<td>Sigma, Roche</td>
			<td>11 213 857 001</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Millipore/Sigma, Roche</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion Blotter with plate electrodes</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1704070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion TGX stain-free protein gel</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>5678034</td>
			<td>10% 18-well, midi-gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Criterion vertical electrophoresis cell (midi)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>NC0165100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma, Roche</td>
			<td>04 942 078 001</td>
			<td>neutral protease, grade II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma/Millipore, Roche</td>
			<td>10708984001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modification Eagles Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Pharmco by Greenfield Global</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluostar Omega multi-mode microplate reader</td>
			<td>BMG Labtech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P Transfer membranes</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli sample buffer (4x)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium acetate solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63052-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-fat dry milk</td>
			<td>LabScientific</td>
			<td>M-0842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2/CO2 incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MC0-18M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>10,000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific, Midwest Scientific</td>
			<td>AVSC1510</td>
			<td>1.7 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protected disposable scalpels</td>
			<td>Fisher Scientific, Aspen Surgical Bard-Parker</td>
			<td>372610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Running buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific, Fisher Chemical</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stericup Quick release-GP sterile vacuum filtration system</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>S2GPU05RE</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cell strainer (70 mm)</td>
			<td>Fisher Scientific, Fisher brand</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific, Fisher Chemical</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal west Femto</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>34096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin wall Polypropylene tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>16110734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>91228-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1610719</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X100 solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td>
			<td>12604-013</td>
			<td>No phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>#1610781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-centrifuge Optima XPM</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A99842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clear tube (14x89 mm)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clear tubes (25x89 mm)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath Isotemp 220</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FS220</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of exosomes from skeletal muscle fibroblasts

אקסוזומים הם בועיות חוץ-תאיות קטנות המשתחררות כמעט על ידי כל התאים ומופרשות בכל הנוזלים הביולוגיים. שיטות רבות פותחו לבידוד שלפוחיות אלה, כולל אולטרה-צנטריפוגה, אולטרה-סינון וכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל. עם זאת, לא כולם מתאימים לטיהור ואפיון אקסוזום בקנה מידה גדול. להלן פרוטוקול לביסוס תרביות של פיברובלסטים ראשוניים שבודדו משרירי השלד של עכברים בוגרים, ולאחר מכן טיהור ואפיון של אקסוזומים מתרבית של תאים אלה. השיטה מבוססת על שימוש בשלבי צנטריפוגה רציפים ולאחריהם שיפועי צפיפות סוכרוז. טוהר התכשירים האקסוזומליים מאומת לאחר מכן על ידי ניתוחי כתמים מערביים באמצעות סוללה של סמנים קנוניים (כלומר, Alix, CD9 ו- CD81). הפרוטוקול מתאר כיצד לבודד ולרכז אקסוזומים ביו-אקטיביים עבור מיקרוסקופ אלקטרונים, ספקטרומטריית מסות וניסויי ספיגה עבור מחקרים פונקציונליים. ניתן בקלות להגדיל או להקטין אותו ולהתאים אותו לבידוד אקסוזום מסוגי תאים, רקמות ונוזלים ביולוגיים שונים.

פרוטוקול זה מתאים לטיהור אקסוזומים מכמויות גדולות של מדיום מותנה בצורה חסכונית. ההליך הוא מאוד לשחזור ועקבי. איור 1 מראה תמונה של מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) של אקסוזומים שטוהרו ממדיום התרבית של פיברובלסטים ראשוניים בעכברים. איור 2 מראה את תבנית ביטוי החלבונים של סמנים אקסוזומליים קנוניים, ואת היעדרם של מזהמים חלבוניים ציטוסוליים (LDH) ו-ER (קלנקסין). איור 3 מראה את ההתפלגות של סמנים אקסוזומליים קנוניים (Alix, CD9 ו-CD81) לאחר שיפועים של צפיפות סוכרוז.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61127/61127fig1v2.jpg"> איור 1: תמונת TEM מייצגת של אקסוזומים שבודדו ממדיום התרבית של פיברובלסטים ראשוניים של עכברים. מוצגים הגדלים האחידים יחסית של ננו-שלפוחיות אלה. מעבר לקווים שחורים מציינים את קוטר השלפוחיות הבודדות. סרגל קנה מידה = 100 ננומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61127/61127fig1v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61127/61127fig2v2.jpg"> איור 2: אימונובלוטים של ליזטים אקסוזומיים שנבדקו עם נוגדנים כנגד סמנים אקסוזומים, ציטוסוליים ו-ER. Alix, CD81, CD9, flotillin1, syndecan1, syntenin1 (exosome), cytosolic (LDH) ו- ER (calnexin) סמנים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61127/61127fig2v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61127/61127fig3v2.jpg"> איור 3: אקסוזומים מופרדים על-ידי שיפוע צפיפות סוכרוז. שברים בודדים נבדקו בכתם מערבי עם נוגדנים נגד אליקס, CD9 ו-CD81. בהתבסס על תבנית השברים של הסמנים, אקסוזומים משקעים באופן עקבי בשברים 3–6, המתאימים לצפיפויות של 1.096–1.140 גרם/מ"ל. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61127/61127fig3v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>סוכרוז (גרם)</td>
			<td>פתרון עבודה סוכרוז (מ"ל)</td>
		</tr><tr><td>2.0 מטר</td>
			<td>2.74</td>
			<td>4.0</td>
		</tr><tr><td>1.3 מטר</td>
			<td>2.67</td>
			<td>6.0</td>
		</tr><tr><td>1.16 מ'</td>
			<td>2.38</td>
			<td>6.0</td>
		</tr><tr><td>0.8 מטר</td>
			<td>1.37</td>
			<td>5.0</td>
		</tr><tr><td>0.5 מטר</td>
			<td>0.86</td>
			<td>5.0</td>
		</tr><tr><td>0.25 מטר</td>
			<td>0.26</td>
			<td>3.0</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: פתרונות שיפוע צפיפות סוכרוז.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>נוגדן</td>
			<td>מארח</td>
			<td>חברה</td>
			<td>מספר קטלוגי</td>
		</tr><tr><td>CD9</td>
			<td>חולדה</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553758</td>
		</tr><tr><td>CD81</td>
			<td>עכבר</td>
			<td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיות</td>
			<td>SC-166029</td>
		</tr><tr><td>אליקס</td>
			<td>ארנב</td>
			<td>מעבדת ד'אזו</td>
			<td>אליקס</td>
		</tr><tr><td>פלוטילין1</td>
			<td>עכבר</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610820</td>
		</tr><tr><td>סינדקאן1</td>
			<td>ארנב</td>
			<td>לייף טכנולוגיות</td>
			<td>36-2900</td>
		</tr><tr><td>סינטנין1</td>
			<td>ארנב</td>
			<td>מיליפור/סיגמא</td>
			<td>AB15272</td>
		</tr><tr><td>LDH</td>
			<td>עז</td>
			<td>כימקון</td>
			<td>AB1222</td>
		</tr><tr><td>קלנקסין</td>
			<td>עז</td>
			<td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיות</td>
			<td>SC-6465</td>
		</tr><tr><td>חולדה-HRP</td>
			<td>חמור</td>
			<td>ג'קסון אימ. מעבדת Res</td>
			<td>112-035-003</td>
		</tr><tr><td>עכבר-HRP</td>
			<td>עז</td>
			<td>ג'קסון אימ. מעבדת Res</td>
			<td>115-035-044</td>
		</tr><tr><td>Rabbit-HRP</td>
			<td>עז</td>
			<td>ג'קסון אימ. מעבדת Res</td>
			<td>111-035-144</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 2: נוגדנים ראשוניים ומשניים.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts at JoVE.com

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

פרוטוקול זה ממחיש את 1) הבידוד והתרבות של פיברובלסטים ראשוניים משריר הגסטרוקנמיוס של העכבר הבוגר, כמו גם 2) טיהור ואפיון של אקסוזומים באמצעות שיטת אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית בשילוב עם שיפועי צפיפות סוכרוז ולאחר מכן ניתוחי כתמים מערביים.

בידוד ואפיון אקסוזומים מפיברובלסטים של שרירי השלד

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

isolation-characterization-exosomes-from-skeletal-muscle

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

3.3K Views.  St. Jude Children's Research Hospital. פרוטוקול זה ממחיש את 1) הבידוד והתרבות של פיברובלסטים ראשוניים משריר הגסטרוקנמיוס של העכבר הבוגר, כמו גם 2) טיהור ואפיון של אקסוזומים באמצעות שיטת אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית בשילוב עם שיפועי צפיפות סוכרוז ולאחר מכן ניתוחי כתמים מערביים.

Video: Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a robust and reliable method for isolating relatively large numbers of proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. The authors have used micro-dissected explant cultures to analyse the growth characteristics of skeletal muscle cells in wild-type and dystrophic muscles. Each of the components of tissue growth, namely cell survival, proliferation, senescence and differentiation can be analysed separately using the methods described here. The net effect of all components of growth can be established by means of measuring explant outgrowth rates. The micro-explant method can be used to establish primary cultures from a wide range of different muscle types and ages and, as described here, has been adapted by the authors to enable the isolation of embryonic skeletal muscle precursors.
Uniquely, micro-explant cultures have been used to derive clonal (single cell origin) skeletal muscle stem cell (SMSc) lines which can be expanded and used for in vivo transplantation. In vivo transplanted SMSc behave as functional, tissue-specific, satellite cells which contribute to skeletal muscle fibre regeneration but which are also retained (in the satellite cell niche) as a small pool of undifferentiated stem cells which can be re-isolated into culture using the micro-explant method.

The micro-dissected explants technique is a robust and reliable method for isolating proliferative skeletal muscle cells from juvenile, adult or embryonic muscles as a source of skeletal muscle stem cells. Uniquely, these cells have been clonally derived to produce skeletal muscle stem cell lines used for in vivo transplantation.

למבוגרים עובריים שרירי השלד Microexplant התרבות בידוד בתאי גזע שרירי השלד

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

בידוד מיטוכונדריאלי של שריר השלד

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

טיהור אבות מן שרירי השלד

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

בידוד ואפיון של RNA המכיל Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

בידוד של דם המופק מכולים multipotent מבשרים משרירי שלד אדם

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

בידוד של המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות תפוקה גבוהה microplate נשימה

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived microvesicles (MVs, diameter &#62; 100 nm) is a fundamental cellular process that occurs in all living cells. These vesicles transport proteins, lipids and nucleic acids specific for their cell of origin and in vitro studies have highlighted their importance as mediators of intercellular communication. EVs have been successfully isolated from various body fluids and especially EVs in blood have been identified as promising biomarkers for cancer or infectious diseases. In order to allow the study of MV subpopulations in blood, we present a protocol for the standardized isolation and characterization of MVs from peripheral blood samples. MVs are pelleted from EDTA-anticoagulated plasma samples by differential centrifugation and typically possess a diameter of 100 - 600 nm. Due to their larger size, they can easily be studied by flow cytometry, a technique that is routinely used in clinical diagnostics and available in most laboratories. Several examples for quality control assays of the isolated MVs will be given and markers that can be used for the discrimination of different MV subpopulations in blood will be presented.

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

בידוד ואפיון של Microvesicles מן הדם היקפי

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

בידוד של המיטוכונדריה ללא פגע מן שרירי השלד על ידי דיפרנציאל צנטריפוגה מדידות Respirometry ברזולוציה גבוהה

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

בידוד ואפיון של מבוגרים ופיברותקיעות לב ומיופיברופיצוצים

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...