ריצ&#39;רד וו Beringer דוד L. אש, יישומים מדענים, תרמו מוצרים מדעי NanoDrop, סיוע טכני הצילומים.

<html> 1. Microvolume כימות חומצות גרעין שימוש 2000c NanoDrop ספקטרופוטומטר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל, לנקות את המשטחים אופטי העליון והתחתון של מערכת מדגם ספקטרופוטומטר microvolume השמירה על ידי pipetting 2-3 μL deionized מים נקיים על פני השטח אופטי נמוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את זרוע המנוף, על מנת להבטיח כי הדום העליון בא במגע עם המים deionized. הרם את זרוע המנוף לנגב הן משטחים אופטיים עם ונטולת מוך נקי ויבש מעבדה לנגב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת NanoDrop ובחר ביישום חומצות גרעין. השתמש נפח קטן, pipettor מכויל לבצע מדידה ריק על ידי מחלק 1 μL של המאגר על גבי משטח אופטי נמוך. מנמיכים את זרוע המנוף בחר &quot;ריק&quot; ביישום חומצות גרעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המדידה ריק תושלם, גם משטחים נקיים אופטי עם ונטולת מוך נקי ויבש מעבדה לנגב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את קבוע מתאים המדגם זה כדי להימדד. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> לדוגמה סוג </td><td> בחר אפשרות </td><td> קבועים המשמשים לחישוב ריכוז </td></tr><tr><td> dsDNA </td><td> DNA-50 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> ssDNA </td><td> DNA-33 </td><td> 33 </td></tr><tr><td> RNA </td><td> RNA-40 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> אוליגו </td><td> מנהג </td><td> 15-150 </td></tr></tbody></table> טבלה 1. אופיינית ריכוז חומצת גרעין טווחי עבור A280 מדידות ישירות באמצעות ספיגת NanoDrop microvolume ספקטרופוטומטר, ספקטרופוטומטר קובט מסורתיים מבוססי המשמשים עם microcell TrayCell קובט, וכן fluorospectrometer NanoDrop microvolume בשיתוף עם assay PicoGreen. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על 1 μL המדגם חומצות גרעין על הכן אופטי נמוך ולסגור את זרוע המנוף. כי המדידה היא בנפח עצמאית, המדגם צריך רק כדי לגשר על הפער בין שני משטחים אופטיים עבור המדידה להתבצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;מדוד&quot; תוכנת היישום. התוכנה יחשב באופן אוטומטי את גרעין ריכוז טוהר יחס חומצה. בעקבות מדידה מדגם, לסקור את הפלט רפאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התוכנה יחשב באופן אוטומטי את גרעין ריכוז טוהר יחס חומצה. בעקבות מדידה מדגם, לסקור את התמונה ספקטרלי כדי להעריך את איכות המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמה טיפוסית חומצות גרעין יהיה פרופיל אופייני מאוד. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. מדגם טיפוסי חומצות גרעין יהיה פרופיל אופייני מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקורות נפוצים של מזהמים הקשורים ספציפית טכניקות בידוד גרעין חומצה כוללים להפקת פנול / Trizol ועמודה. במקרה של מיצוי פנול / Trizol, זיהום מגיב השיורי עשוי להיות מסומן על ידי ספקטרום נורמלי בין 220-240 ננומטר, כמו גם על ידי משמרות באזור 260-280 ננומטר. לעומת זאת, guanidine שיורית מתוך מיצוי טור עשויים לתרום שיא ליד 230 ננומטר שינוי השוקת מ 230 ננומטר של כ 240 ננומטר. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. המשמרות את העליות והמורדות של דגימות B ו-C לעומת מדגם להמחיש כיצד מזהמים יכולים להשפיע על ספקטרום של דגימות חומצות גרעין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך נכונה איכות המדגם, 260/280 או 260/230 יחס צריך להיות מנותח בשילוב עם איכות רפאים הכולל. חומצות גרעין טהור בדרך כלל תשואה יחס של 260/280 ~ 1.8 ו 260/280 יחס של 2.0 ~ עבור DNA ו-RNA, בהתאמה. יחס זה תלוי pH וחוזק היוני של המאגר המשמש לייצור הריק ומדידות במדגם. פתרונות חומציים יהיה מתחת מייצגים את היחס של 0.2-0.3, ואילו הפתרון הבסיסי יהיה מעל מייצגים את היחס של 0.2-0.3. יחסי טוהר שונה באופן משמעותי עלול להעיד על נוכחות של מזהמים חלבון פנול או אחרים לספוג חזק ליד או 280 ננומטר. יחס 260/230 טוהר הוא מדד השנייה של טוהר DNA עם ערכי חומצת &quot;טהור&quot; גרעין בדרך כלל בטווח של 1.8-2.2. יחסי טוהר כי נמוכים משמעותית את ערכי צפוי עשוי להצביע על הטכניקה בידוד בשימוש עשויים לדרוש אופטימיזציה נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הספקטרופוטומטרים NanoDrop יכול לשמש גם לכמת חלבונים באמצעות ספיגת ישיר או באמצעות מבחני חלבון colorimetric. כדי להבטיח בטור reproducibility נכונה, 2-μl דגימות מומלץ עבור דגימות חלבון. עיין וידאו יופיטר הבאים: קביעת ריכוז חלבון Microvolume באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/index/Details.stp?ID=1610">https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/index/Details.stp?ID=1610</a> </li></ol>s = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. רגישות גבוהה Microvolume quantitation חומצות גרעין שימוש Fluorospectrometer NanoDrop 3300 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפגין רגישות גבוהה quantitation microvolume חומצות גרעין באמצעות NanoDrop 3300, ערכה הקרינה PicoGreen משמש. כדי להתחיל, לאזן את הסטנדרטים ערכת וכל דגימות חומצות גרעין לטמפרטורת החדר. דגימות פלורסנט אור רגיש יש לשמור ענבר או צינורות אלומיניום עטופים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1x מספיק חיץ TE לכל הסטנדרטים דגימות כדי להימדד כמו גם לפתרון PicoGreen לעבוד כי יהיה צורך. הכן חיץ 1xTE על ידי דילול בתנאי 20x TE חיץ עם מים nuclease חופשי לכל פרוטוקול של היצרן. כרכים תגובת יכול לנוע בין 200 ל μL ul קטנה כמו 10. בדוגמה זו, 10 כרכים התגובה μL יהיה מוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן סדרתי סטנדרטים בדילול dsDNA בריכוז 2x הרצוי הסופי nuclease ללא צלוחיות או צינורות. העברת 5 μL של כל אחד מן הסטנדרטים dsDNA בדילול אל הפרט שכותרתו nuclease ללא ענבר או קרקרים צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 Aliquot μL של המדגם כל dsDNA עניין לתוך ענבר nuclease ללא שכותרתו כראוי או קרקרים צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון PicoGreen עובד על פי פרוטוקול של היצרן. העברת נפח שווה של הפתרון PicoGreen עובדים כדי שכל אחת מהן מכילה גם צינור רגיל או מדגם של עניין (5 μL בדוגמה זו). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב כרכים שווה של 1x TE חיץ פתרון PicoGreen לעבוד כדי להכין את השליטה שלילית, המהווה פתרון התייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את תכולת שפופרת כל תגובה ביסודיות על ידי pipetting עדין דגירה התגובות בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. כל הסטנדרטים דגימות צריך להיות equilibrated לטמפרטורה זהה לפני המדידה כאות הקרינה מושפעת טמפרטורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את המכשיר לבצע מדידות, תחילה לנקות את המשטח העליון והתחתון של מערכת השמירה המדגם. 2-3 Pipet μL של מים על פני השטח deionized אופטי נמוך, סגור ולאחר מכן פתח את זרוע המנוף, ומוחה את כנים העליון והתחתון עם נקייה ונטולת מוך, נגב מעבדה. ודא משטחים חופשיים של מוך לפני שתמשיך כמו מוך יכול להציג פלואורסצנציה בנוכחות מקור עירור והוא יכול להפריע המדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התוכנה במכשיר, בחר את &quot;חומצות גרעין&quot; יישומים, ובחר את &quot;PicoGreen-dsDNA&quot; אפשרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ריק המכשיר, להוסיף 2 μL של 1x TE אל הכן התחתון, לסגור את הזרוע, ולחצו על &quot;ריק&quot; בתחום התוכנה במכשיר. לאחר השלמת ריק, כתם את הפתרון ריק משני משטחים של מערכת השמירה המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את הפתרון על ידי התייחסות pipetting עדין. בעזרת טיפים שימור נמוך, μL 2 פיפטה על הדום התחתונה ולסגור את הזרוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;הפניה&quot; בסוג המדידה, בחר את היחידות הרצויות. לחץ על &quot;מדוד&quot; ליזום את מחזור המדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מחזור המדידה היא מוחלטת, לפתוח את היד וביסודיות למחוק את השמירה מדגם משטחים המערכת. מדוד עד חמש משכפל התייחסות, באמצעות aliquot טרי לשכפל כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על התהליך עבור הסטנדרטים נוסף לבנות עקומת סטנדרטי. עד שבעה תקנים ניתן להשתמש. התוכנה נועדה לאחסן עד חמישה משכפל עבור כל תקן. משכפל סטנדרטים הם בממוצע כדי ליצור עקומת סטנדרט שממנו ריכוזי מדגם נקבעים באופן אוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר עקומת הסטנדרטי הוא שלם, בחר את &quot;דוגמאות&quot; הכרטיסייה, הזן את המידע המתאים מזהה מדגם ולמדוד כל מדגם לא ידוע. </li></ol>

<ol>
	<li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+and+Ionic+Strength+on+the+Spectrophotometric+Assessment+of+Nucleic+Acid+Purity.">Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity.</a> BioTechniques. 22, 474-481 (1997).</li><li>Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+Quantification+of+Nucleic+Acids:+LabelGuard+enables+photometric+quantification+of+submicroliter+samples+using+a+standard+photometer.">Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer.</a> Implen Applications Note. , (2006).</li><li>Jr, I. n. g. l. e., D, J., Crouch, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Spectrochemical analysis. , XV-590 (1988).</li><li>Van Lancker, M., Gheyssens, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+four+frequently+used+assays+for+quantitative+determination+of+DNA.">A comparison of four frequently used assays for quantitative determination of DNA.</a> Anal. Lett. 19, 615-623 (1986).</li></ol>

פיליפ Desjardins ו דברה קונקלין מועסקים על ידי Thermo Scientific NanoDrop מוצרים, Inc המייצרת את המכשירים המשמשים במאמר זה.

פרוטוקולים quantitation המוצגים כאן מבוססים על רוב מקובל microvolume מערכות. מערכות אלו מספקות אלטרנטיבות מעשיות מסורתיות מתודולוגיה חומצות גרעין quantitation, אשר מסתמכים על כרכים מדגם גדול יותר ושימוש מנגנון הבלימה. NanoDrop microvolume טכנולוגיה מעסיקה השמירה מדגם מערכת שמסתמכת על המתח מאפייני פני השטח של המדגם הנמדדים כדי ליצור עמודה נוזלי. זה חיוני כי המדגם יוצר מגע עם משטחים העליון והתחתון מדידה אופטיות עבור בטור המתאים. אם בכל נקודה על תוצאות המדידה נראה לשחזור מדויק או לא, היא ככל הנראה תוצאה של הטרוגניות מדגם או שבירה טור נוזלי. דטרגנטים ואלכוהול איזופרופיל אינם מומלצים חומרי ניקוי, כיוון שהם עלולים uncondition המדידה משטחים הדום. הדום מותנית מתרחשת כאשר מאפייני פני השטח של הידרופובי הכן נפרץ, וכתוצאה מכך השטחת אגל המדגם. כנים מותנית יכולה להוביל שבירה של הטור נוזל בזמן המדידה. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. משטח מותנה מאופיין השטחת אגל מים. משטחים הדום Uncondtioned יכול להיות משופץ באמצעות מתחם Pedestal NanoDrop שפוץ (PR-1, Thermo Scientific מוצרים NanoDrop). שכבה דקה של המתחם שפוץ מוחל על משטחי רגל העליון והתחתון, להתייבש במשך ~ 30 שניות, ולאחר מכן שפשף את השימוש נקייה ונטולת מוך יבש, מעבדה לנגב. המדינה מחודשים בהצלחה מאופיין אגל מים ואגלי כאשר מוחל על פני השטח הדום התחתונה. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. משטח משופץ מאופיין ואגלי את אגל מים. מערכות Microvolume quantitation לצמצם במידה ניכרת את צריכת מדגם להגדיל באופן משמעותי את טווח הריכוז בהשוואה למערכות כימות מסורתיים יותר. למרות quantitation microvolume יש לעתים קרובות להפוך טכנולוגיה המאפשרת בנסיבות מעורבים מסת תאים מוגבל כגון ביופסיות מחט לייזר ללכוד microdissection, את היעילות ואת קלות השימוש של מתודולוגיה זו הפכה אותה מקובל אלטרנטיבה המסורתי גרעין quantitation שיטות חומצה אפילו כאשר המדגם הוא בשפע.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NanoDrop 2000c</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>ND-2000C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NanoDrop 3300</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher Scientific</td>
<td>ND-3300</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

nanodrop microvolume quantitation of nucleic acids

מבחני Biomolecular הרף מפותח כי השימוש בהדרגה כמויות קטנות של החומר, לעיתים קרובות מניעת השימוש קובט מבוססות מכשירים קונבנציונלי עבור quantitation חומצות גרעין עבור אלה שיכולים לבצע quantitation microvolume. החזקת NanoDrop microvolume מערכת מדגם (Thermo Scientific מוצרים NanoDrop) פונקציות על ידי שילוב הטכנולוגיה סיב אופטי טבעי מתח מאפייני פני השטח כדי ללכוד ולשמר כמויות זעירות של מדגם עצמאי של מנגנון הבלימה מסורתיים כגון cuvettes או נימים. יתר על כן, המערכת מעסיקה אורכי נתיב קצר יותר, אשר התוצאה מגוון רחב של מדידות ריכוז חומצת גרעין, למעשה מבטל את הצורך לבצע דילולים. הקטנת נפח של המדגם הנדרש עבור ניתוח ספקטרוסקופיות גם מקלה על הכללת צעדים שליטה נוספת באיכות ברחבי workflows מולקולרית רבים, הגברת היעילות, ובסופו של דבר מוביל בביטחון רב יותר בתוצאות במורד הזרם. הצורך בניתוח רגישות גבוהה הניאון של מסה מוגבל התפתחה גם עם התקדמות הניסוי האחרונות. שימוש באותה טכנולוגיה שימור microvolume מדגם, מדידות פלורסנט ניתן לבצע עם μL 2 של החומר, דבר המאפשר פלורסנט מבחני דרישות נפח להצטמצם באופן משמעותי. Microreactions כזה של μL 10 פחות או יותר כעת אפשרי באמצעות fluorospectrometer ייעודי microvolume. שני microvolume גרעין quantitation פרוטוקולים חומצה יהיה הפגינו המשתמשים משולב מדגם שימור מערכות כמו חלופות מעשיות קובט פרוטוקולים מבוססי המסורתית. ראשית, שיטה ישירה A260 ספיגת באמצעות ספקטרופוטומטר microvolume מתואר. זה ואחריו הפגנה של השיטה הקרינה מבוססי המאפשרת לצמצם נפח תגובות פלואורסצנציה עם fluorospectrometer microvolume. אלו טכניקות הרומן לאפשר הערכה של ריכוזי חומצות גרעין החל 1 pg / μL עד 15,000 ng / μL עם צריכה מינימלית של המדגם.

Watch this Scientific Journal Video about NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids at JoVE.com

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

השימוש במערכות NanoDrop microvolume כחלופות מעשי ויעיל המסורתית מתודולוגיה חומצות גרעין quantitation מתוארת באמצעות הדגמה של שני פרוטוקולים microvolume quantitation חומצת גרעין.

NanoDrop Microvolume quantitation של חומצות גרעין

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

<a class="grey_button" href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/details.stp?ID=2891"> &#x4E2D;&#x6587; </a>
 
 
 <a class="grey_button" href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/details.stp?ID=2892"> Deutsch </a>
 
 
 <a class="grey_button" href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/details.stp?ID=2893"> Fran&#231;ais </a>
 
 
 <a class="grey_button" href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/details.stp?ID=2894"> Espa&ntilde;ol </a>
 
 
 <a class="grey_button" href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/Details.stp?ID=2895"> &#x65E5;&#x672C;&#x8A9E; </a>

nanodrop-microvolume-quantitation-of-nucleic-acids

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

200.9K Views.  Thermo Scientific NanoDrop Products.  中文 Deutsch Français 

Video: NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

ריכוז חלבון Microvolume קביעת באמצעות 2000c NanoDrop ספקטרופוטומטר

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

Quantitation של γH2AX מוקדים של דגימות רקמה

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

קביעת ריכוז חומצות גרעין וחלבונים שימוש Micro בנפח Bio-spec ספקטרופוטומטר Nano

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern for governments, industries and medical professionals worldwide. For example, EHECs, combined with Shigella, are responsible for the deaths of approximately 325,000 children each year and are particularly prevalent in the developing world where laboratory-based identification, common in the United States, is unavailable 1. The development and distribution of low cost, field-based, point-of-care tools to aid in the rapid identification and/or diagnosis of pathogens or disease markers could dramatically alter disease progression and patient prognosis. We have developed a tool to isolate nucleic acids and proteins from a sample by solid-phase extraction (SPE) without electricity or associated laboratory equipment 2. The isolated macromolecules can be used for diagnosis either in a forward lab or using field-based point-of-care platforms. Importantly, this method provides for the direct comparison of nucleic acid and protein data from an un-split sample, offering a confidence through corroboration of genomic and proteomic analysis.
Our isolation tool utilizes the industry standard for solid-phase nucleic acid isolation, the BOOM technology, which isolates nucleic acids from a chaotropic salt solution, usually guanidine isothiocyanate, through binding to silica-based particles or filters 3. CUBRC's proprietary solid-phase extraction chemistry is used to purify protein from chaotropic salt solutions, in this case, from the waste or flow-thru following nucleic acid isolation4.
By packaging well-characterized chemistries into a small, inexpensive and simple platform, we have generated a portable system for nucleic acid and protein extraction that can be performed under a variety of conditions. The isolated nucleic acids are stable and can be transported to a position where power is available for PCR amplification while the protein content can immediately be analyzed by hand held or other immunological-based assays. The rapid identification of disease markers in the field could significantly alter the patient's outcome by directing the proper course of treatment at an earlier stage of disease progression. The tool and method described are suitable for use with virtually any infectious agent and offer the user the redundancy of multi-macromolecule type analyses while simultaneously reducing their logistical burden.

A tool and chemistries are described to sequentially isolate nucleic acids followed by proteins from a sample without the need for electricity. The tool consists of a sorbent held within a transfer pipette while the isolation chemistries are based on solid-phase extraction principles. The isolated macromolecules can be analyzed by immuno-based and PCR-based assays.

חשמל חינם, חומצות גרעין רצופות ובידוד חלבון

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

ניתוח ובניית מבני חומצות גרעין עם 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, and participate in various signaling pathways. Caenorhabditis elegans synthesizes all of the enzymes necessary to produce a range of omega-6 and omega-3 fatty acids. This, combined with the simple anatomy and range of available genetic tools, make it an attractive model to study fatty acid function. In order to investigate the genetic pathways that mediate the physiological effects of dietary fatty acids, we have developed a method to supplement the C. elegans diet with unsaturated fatty acids. Supplementation is an effective means to alter the fatty acid composition of worms and can also be used to rescue defects in fatty acid-deficient mutants. Our method uses nematode growth medium agar (NGM) supplemented with fatty acidsodium salts. The fatty acids in the supplemented plates become incorporated into the membranes of the bacterial food source, which is then taken up by the C. elegans that feed on the supplemented bacteria. We also describe a gas chromatography protocol to monitor the changes in fatty acid composition that occur in supplemented worms. This is an efficient way to supplement the diets of both large and small populations of C. elegans, allowing for a range of applications for this method.

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a useful model to explore the functions of polyunsaturated fatty acids in development and physiology. This protocol describes an efficient method of supplementing the C. elegans diet with polyunsaturated fatty acids.

תוספת תזונתית של חומצות שומן רב בלתי רוויות ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific positions in DNA, RNA, proteins and small biomolecules. This natural methylation reaction can be expanded to a wide variety of alkylation reactions using synthetic cofactor analogues. Replacement of the reactive sulfonium center of AdoMet with an aziridine ring leads to cofactors which can be coupled with DNA by various DNA MTases. These aziridine cofactors can be equipped with reporter groups at different positions of the adenine moiety and used for Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). As a typical example we give a protocol for biotinylation of pBR322 plasmid DNA at the 5&#8217;-ATCGAT-3&#8217; sequence with the DNA MTase M.BseCI and the aziridine cofactor 6BAz in one step. Extension of the activated methyl group with unsaturated alkyl groups results in another class of AdoMet analogues which are used for methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). Since the extended side chains are activated by the sulfonium center and the unsaturated bond, these cofactors are called double-activated AdoMet analogues. These analogues not only function as cofactors for DNA MTases, like the aziridine cofactors, but also for RNA, protein and small molecule MTases. They are typically used for enzymatic modification of MTase substrates with unique functional groups which are labeled with reporter groups in a second chemical step. This is exemplified in a protocol for fluorescence labeling of histone H3 protein. A small propargyl group is transferred from the cofactor analogue SeAdoYn to the protein by the histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7/9 followed by click labeling of the alkynylated histone H3 with TAMRA azide. MTase-mediated labeling with cofactor analogues is an enabling technology for many exciting applications including identification and functional study of MTase substrates as well as DNA genotyping and methylation detection.

DNA and proteins are sequence-specifically labeled with affinity or fluorescent reporter groups using DNA or protein methyltransferases and synthetic cofactor analogues. Depending on the cofactor specificity of the enzymes, aziridine or double activated cofactor analogues are employed for one- or two-step labeling.

תיוג רצף ספציפי של חומצות גרעין וחלבונים עם Methyltransferases ואנלוגים כקו-פקטורים

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

קשירת יעילה ביותר של RNA קטן מולקולות לMicroRNA Quantitation על ידי רצף תפוקה גבוהה

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

כימות של דביקות תא האנדותל<em&gt; במבחנה</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are still not routinely applied, due to the cost and specific equipment associated with commercially available methods. Here we present a simplified method for readout of digital droplet assays using a conventional real-time PCR instrument to measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays.
We characterize the performance of the bulk readout assay using synthetic droplet mixtures and a droplet digital multiple displacement amplification (MDA) assay. Quantitative MDA particularly benefits from a digital reaction format, but our new method&#160;applies to any digital assay. For established digital assay protocols such as digital PCR, this method serves to speed up and simplify assay readout.
Our bulk readout methodology brings the advantages of partitioned assays without the need for specialized readout instrumentation. The principal limitations of the bulk readout methodology are reduced dynamic range compared with droplet-counting platforms and the need for a standard sample, although the requirements for this standard are less demanding than for a conventional real-time experiment. Quantitative whole genome amplification (WGA) is used to test for contaminants in WGA reactions and is the most sensitive way to detect the presence of DNA fragments with unknown sequences, giving the method great promise in diverse application areas including pharmaceutical quality control and astrobiology.

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Readout גורף פשוט של דיגיטלי מבחני כימות חומצות גרעין

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...