עבודה זו נתמכה על ידי R01 DK078161 מ NIDDK (LO), מלגות דוקטורט של איגוד הלב האמריקני (AB), ונר-גרן יסודות שוודיה Kungliga Fysiografiska Sällskapet, לונד, שבדיה (UB). תמיכה נוספת סופק על ידי המרכז הרפואי במיין מתקני המכון לחקר הליבה Histopathology, ביואינפורמטיקה FACS (נתמך על ידי 2P20RR18789-06) ואת מתקן בעלי חיים MMCRI.

1. הכנת ריאגנטים עבור עיכול כליות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1.5 מ&quot;ל של collagenase 0.25% (w / v) 1 Pancreatin לעכל (w / v) פתרון% יהיה צורך מיצוי של תאים אזור nephrogenic (NZCs) מ - 8 E17.5 הכליות. מכיוון Pancreatin לוקח כ 2 שעות לפזר בטמפרטורת החדר, מספיק לעכל פתרון המספר הגדול ביותר של הכליות עובריים צפוי צריכה להיעשות לפני הניסוי. הכן לעכל פתרון על ידי הראשון להוסיף 25 מ&quot;ג של collagenase אל פוספט 10 מ&quot;ל של Dulbecco שנאגרו מלוחים (DPBS) ב ברור 15, צינור מ&quot;ל צנטריפוגות סטרילית. זה קריטי, כי DPBS אינו מכיל סידן או מגנזיום כמו זה יפריע לעכל את האנזימטית. מערבבים פתרון nutator במשך 10 דקות לפרק collagenase א הוספת 100 מ&quot;ג של Pancreatin כדי collagenase מומס פתרון ומערבבים על nutator לפחות 2 שעות. לחלופין, collagenase פתרון / Pancreatin לעכל יכול להיות מעורב על nutator לילה בשעה 4 ° C. מומלץ לך ללבוש מסכה, כמו collagenase ו Pancreatin להתפזר בקלות לאטמוספרה במהלך השקילה יכול לגרות מעברי האף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו 5% עוברית שור סרום (FBS) (v / v) פתרון פתרון שנאגרו של האנק מלוחים (HBSS). היפוך לערבב. 1 מ&quot;ל של כל שפופרת של 8 הכליות יהיה צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני התרבות על ידי השלמת keratinocyte בינוני חופשי בסרום עם גלוטמין 1% (v / v) ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין (PenStrep) (v / v). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סטרילי מעיל שטוח תחתית קלקר רקמה תרבות צלחות (96, 48, 24 או 6 היטב) עם פתרון פיברונקטין האדם בריכוז של 5 מ&quot;ג 2 ס&quot;מ על פני צמיחה. 5 מ&quot;ג של אבקת פיברונקטין הוא resuspended ב 5 מ&quot;ל של סטרילית H 2 O. זה מדולל ב 01:25 DPBS סטרילי ללא סידן או מגנזיום 250 מ&quot;ל מתווסף גם כל צלחת 24 באר. פלטות מודגרת מכן במשך שעה 1 ואחריו 1 שעה ב 4 ° C. לחילופין עם פתרון פיברונקטין בטמפרטורת החדר, צלחות ניתן מודגרות לילה בשעה 4 ° C. הפתרון הוא aspirated אז במנדף זרימה למינרית לפני תוספת של בינוני / תאים. </li></ol> 2. הכליות הביתור &amp; קפסולות הסרת (בוצע בטמפרטורת החדר) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב E17.5, להקריב את אמא באמצעות הליך אישור טיפול בבעלי חיים מוסדיים שלך ועדת שימוש, להסיר את הרחם, ולמקם אותו בצלחת פטרי המכילות DPBS עם סידן ומגנזיום. תחת מיקרוסקופ לנתח, להשתמש במלקחיים &quot;שענים כדי להסיר כל העובר מן הרחם לערוף את כל העובר. לאחר המלטה כולו מתוך הרחם, להעביר את העוברים כדי בצלחת פטרי נקי המכיל DPBS מספיק סידן ומגנזיום כדי לכסות לחלוטין את העוברים והותיר אחריו כמו הרבה דם ופסולת רקמות האפשרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, לעשות חתך ההיקפי דופן הבטן של העובר ברמה של הטבור. אז במקום העובר על גבו, סיכה אותו על הכתפיים עם קבוצה אחת של מלקחיים, ולהסיר את האיברים הפנימיים מהריאות אל שלפוחית ​​השתן באמצעות סט אחר של מלקחיים. בעזרת תרגול ניתן לעשות זאת בתנועה אחת. הכליות צריך להיות מחובר לחלק האחורי של המונית של איברים. אם הכליות לא נשארים מחוברים האיברים נדחק, הם יכולים להסיר בזהירות מן הקיר הגוף הגבי. הכליות כי נפגעו במהלך תהליך זה לנתיחה אמור להיות מושלך כפי שהם יזהמו את התרבות הסופית עם סוגי תאים בלתי הולמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משם בעדינות להקניט את הכליות משאר האיברים, מקפיד לשמור על הכליות מחוברות זו לזו. החזק את הרקמה בין הכליות עם קבוצה אחת של מלקחיים ותופס את בלוטת יותרת הכליה מחוברת אחת הכליות עם מלקחיים אחרות. בלוטת יותרת הכליה צריך להיות מחובר הקפסולה כליות. לקלף בעדינות את בלוטת יותרת הכליה ועל הקפסולה הרחק סביב החלק החיצוני של הכליה, בדומה מקלפת בננה. שימו לב שלא לפצל את הכליה במחצית תוך קילוף, ולהיות בטוח שלא לפגוע ברקמת הכליה מתחת הקפסולה. בזהירות להסיר כל כמוסה הנותרים, כמו גם את השופכן אם הוא עדיין מחובר. חזור עם כליה הנותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש pipet העברת לחתוך למקום הכליות לתוך צינור קלקר 5 מ&quot;ל של HBSS. חזור על שלבים 2.2-2.4 עבור העובר כל אחד. הכליות עשוי להיות ונקווה 8 לכל צינור. עם הסרת, בפועל לנתיחה ואת הקפסולה ייקח 2-3 דקות לכל עובר. </li></ol> 3. עיכול אנזימתי של הכליות (כל הצעדים בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון HBSS מתוך 5 צינורות מ&quot;ל המכיל הכליות עם pipettor זמן בזהירות הימנעות ממגע עם הכליות. מיד להוסיף 1.5 מ&quot;ל של collagenase / Pancreatin פתרון לעכל את שפופרת המכילה 5 מ&quot;ל הכליות לפני שעבר מדגם הבאה. חזור על הפעולה עבור כל שפופרת של הכליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות מקום עם האנזים / כליות מעכל על nutator ב מראש חימם 37 ° C בחממה במשך 15 דקות. 2 דקות לפניהשלמת לעכל, הוסף 3 μl של DNase (1 U / ml) אחד טרי צינור 5 מ&quot;ל פוליסטירן עבור לעכל כל המתבצעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר במהירות מעכל מן האינקובטור, הוסף 75 μl של FBS ו להפוך 3 פעמים כדי לערבב. בואו לעמוד על הספסל במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 1.4 מ&quot;ל של ההשעיה תא אל הצינור קלקר 5 מ&quot;ל המכיל DNase (1 U / ml), תוך השארת תא הנותרים 0.2 מ&quot;ל ההשעיה והכליות מאחור. תוספת 0.2 מ&quot;ל של תמיסת השאיר אחריו יכיל זיהומים כגון תאי מטריקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא מערבבים השעיה / DNase על nutator ב מראש חימם 37 ° C בחממה במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר במהירות השעיות התא החממה ולהעביר לכל צינור Eppendorf 1.5 מ&quot;ל. ספין השעיות תא microfuge ב 325 גר &#39;במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant מתא גלולה ו resuspend גלולה ב 1 מ&quot;ל של 5% FBS / HBSS, pipetting למעלה ולמטה 5-6 פעמים. שווי כל הצינור לפני שעבר מדגם הבאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין השעיות תא microcentrifuge בבית 325 גרם במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant ומוסיפים 0.5 מ&quot;ל של מדיום keratinocyte חופשי בסרום (KSFM) עם תוספים כדי צינור כל צינור כובע לפני שעבר מדגם הבאה. לאחר בינוני נוספה כל הצינורות, בעדינות resuspend כל גלולה התא על ידי pipetting למעלה ולמטה 5-6 פעמים עם micropipette 1ml. מערבבים את כל המתלים תא צינור פוליסטירן טרי 5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום הרטיבה שתי תאים מסננת 40 מיקרון כמוסות דגש על 5 מ&quot;ל פוליסטירן צינור עגול עם תחתית KSFM לדגימה. Pass השעיות התא באמצעות כובע one מסננת התא ידי העברת עם micropipette מ&quot;ל 1. הימנע ממגע עם מסנן קצה פיפטה. איסוף זרימה דרך וחזור סינון דרך מסננת הכובע השני. הסר את מכסה תא מסננת ולהחליף עם כובע חדש צינור פוליסטירן נורמלי 5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים עם hemocytometer או תאים אחרים לספור המכשיר תאים להעביר בארות צלחת תרבות פיברונקטין מצופה בצפיפות של 100,000-200,000 תאים לכל 2 ס&quot;מ, דילול כנדרש עם KSFM עם תוספים. באופן כללי, אנו לאחזר כ 4.5x10 6 תאים בכל המלטה 10 העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים 37 ° C חממה humidified עם 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר תאים להתאושש לצרף עבור 2-4 שעות לפני גירוי בינוני עם חומרים כימיים נוספים. לעורר תאים עם תרכובת של עניין 1 עד 48 שעות. לטהר RNA לניתוח באמצעות PCR RNeasy Qiagen מיקרו ערכת הבאים הוראות היצרן או בצע את ההוראות שלהלן כדי fluorescently immunostain התאים. </li></ol> 4. הכנת ריאגנטים עבור קיבוע של תאים Immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן PFA 4%: ממיסים paraformaldehyde 4% PBS (v / v) בשעה 55 ° C עם תסיסה רגיל. מצננים לטמפרטורת החדר לפני השימוש. פתרון זה הוא רעיל ויש שהושלך מכולות פסולת המיועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון permeabilization ידי הוספת טריטון X-100 ל PBS להשיג פתרון 0.3% (v / v). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון לחסימת 5% ב-PBS עם סרום מן המינים זהה היה בשימוש להעלות את הנוגדן משנית לשמש. לדוגמה, אם יזהה נוגדן ארנבת כנגד אנטיגן היעד שלך עם חמור נגד ארנב אלקסה פלואוריד 568, להכין פתרון חסימת המכילה סרום חמור 5%. חנות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון נוגדן ראשוני על ידי הוספת את הריכוז המתאים של נוגדן לפתרון חסימת 5%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון נוגדנים משני מיד לפני השימוש. הוסף נוגדן fluorophore מצומדות בריכוז המומלץ של היצרן יחד עם גרעיני counterstain DAPI ושאר סמנים אברון כגון phalloidin לפתרון 5% חסימה. אם אחסון נדרש, לשמור על פתרון בחושך על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן גליצרול 50% / פתרון PBS (v / v) לאחסון של תאים immunostained. לחילופין, ניתן להשתמש Vectashield. </li></ol> 5. קיבוע של תאים Immunostaining <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרוטוקול הבא מיועד קיבעון והכתים של NZCs בצלחת 24 באר. כרכים נתון טוב עבור אחד. ריאגנטים צריך להיות pipetted בעדינות במהלך כל הצעדים כדי למנוע ניתוק של תאים, תסיסה צלחת לא מומלץ בשלבים הדגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא בעדינות בינוני עם 1 מ&quot;ל micropipette ומוסיפים 0.5 מ&quot;ל של PFA 4% תאים בתרבית המצורפת. דגירה במשך 15 דקות ללא הפרעה בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של 4% PFA ומוסיפים 0.5 מ&quot;ל לכל טוב של פתרון permeabilization. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון permeabilization בעדינות ולשטוף פעמיים עם 0.5 מ&quot;ל של PBS לכל ולשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ&quot;ל של חסימת פתרון דגירה בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון חסימת ולהוסיף 0.225 הפתרון העיקרי מ&quot;ל נוגדן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות או לילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון נוגדן ראשוני בעדינות ריNSE פעמיים עם 0.5 מ&quot;ל של PBS לכל ולשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.225 פתרון משני מ&quot;ל נוגדן. דגירה צלחת בחושך בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר פתרון נוגדנים משני בעדינות ולשטוף פעמיים עם 0.5 מ&quot;ל של PBS לכל ולשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.3 מ&quot;ל של גליצרול 50% / PBS פתרון (v / v) או Vectashield מספיק כדי לכסות את החלק התחתון של פני השטח היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים תמונה עם מיקרוסקופ חנות epifluorescence או עטוף בנייר כסף על 4 ° C. </li></ol> 6. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2555/2555fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. NZCs היו מטוהרים מן E17.5 עוברים, מצופה ב 200,000 תאים לס&quot;מ 2 ו מודגרות ב 37 ° C עבור סכום כולל של 24 שעות. תאים היו הדמיה לעומת השלב עם מיקרוסקופ הלייקה IRB DM הפוכה לפני מכתים immunofluorescent. (א) 20X לעומת השלב לאור NZCs לאחר 24 שעות בתרבות. (ב) תאים קובעו ונצבעו באמצעות אנטי PAX2 ארנב נוגדנים ספציפיים עבור ובתאים נפרון (אדום) משנית אלקסה פלואוריד 568 מצומדות חמור נגד הארנב. הערה גרעינים כחול counterstained עם DAPI. (ג) שלב 40X בניגוד להציג מקבץ של אבות נפרון (במרכז) לאחר 24 שעות בתרבות. (ד) תמונה של 40X NZCs מבודד LacZ + עוברים של זן Foxd1 LacZ, המבטא β-galactosidase בשליטת היזם Foxd1. Foxd1 מתבטא האוכלוסייה תא סטרומה בתוך אזור nephrogenic של הכליה המתפתחת. תאים הוכתמו ה-F-אקטין סמן phalloidin (אורגון הירוקה העיקרית המצומד), את כתם DAPI גרעיני (כחול) ואת ארנב נגד β-galactosidase (משנית - Alexa פלואוריד חמור נגד ארנב 568) לגילוי Foxd1 + סטרומה תאים ( אדום).

<ol>
	<li>Blank, U., Brown, A., Adams, D. C., Karolak, M. J., Oxburgh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP7+promotes+proliferation+of+nephron+progenitor+cells+via+a+JNK-dependent+mechanism.">BMP7 promotes proliferation of nephron progenitor cells via a JNK-dependent mechanism.</a> Development. 136, 3557-3566 (2009).</li><li>Brunskill, E. W., Aronow, B. J., Georgas, K., Rumballe, B., Valerius, M. T., Aronow, J., Kaimal, V., Jegga, A. G., Grimmond, S., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atlas+of+gene+expression+in+the+developing+kidney+at+microanatomic+resolution.">Atlas of gene expression in the developing kidney at microanatomic resolution.</a> Developmental Cell. 15, 781-791 (2008).</li><li>Godin, R. E., Takaesu, N. T., Robertson, E. J., Dudley, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+BMP7+expression+during+kidney+development.">Regulation of BMP7 expression during kidney development.</a> Development. 125, 3473-3482 (1998).</li><li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inductive+epitheliomesenchymal+interaction+in+cultured+organ+rudiments+of+the+mouse.">Inductive epitheliomesenchymal interaction in cultured organ rudiments of the mouse.</a> Science. 118, 52-55 (1953).</li><li>Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenetic+interaction+between+embryonic+mouse+tissues+separated+by+a+membrane+filter.">Morphogenetic interaction between embryonic mouse tissues separated by a membrane filter.</a> Nature. 172, 869-870 (1953).</li><li>Hatini, V., Huh, S. O., Herzlinger, D., Soares, V. C., Lai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+stromal+mesenchyme+in+kidney+morphogenesis+revealed+by+targeted+disruption+of+Winged+Helix+transcription+factor+BF-2.">Essential role of stromal mesenchyme in kidney morphogenesis revealed by targeted disruption of Winged Helix transcription factor BF-2.</a> Genes and Development. 10, 1467-1478 (1996).</li><li>Oxburgh, L., Chu, G. C., Michael, S. K., Robertson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFb+superfamily+signals+are+required+for+morphogenesis+of+the+kidney+mesenchyme+progenitor+population.">TGFb superfamily signals are required for morphogenesis of the kidney mesenchyme progenitor population.</a> Development. 131, 4593-4605 (2004).</li><li>Srinivas, S., Watanabe, T., Lin, C. S., William, C. M., Tanabe, Y., Jessell, T. M., Costantini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1, 4-4 (2001).</li><li>Yu, J., Carroll, T. J., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+regulates+proliferation+and+differentiation+of+mesenchymal+cells+in+the+mouse+metanephric+kidney.">Sonic hedgehog regulates proliferation and differentiation of mesenchymal cells in the mouse metanephric kidney.</a> Development. 129, 5301-5312 (2002).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטה לבודד והתרבות תאים מאזור nephrogenic של הכליה העוברית. זהו פיתוח של שיטת שפורסם בתחילה כחלק ממחקר של ההשפעות של טיפול BMP7 על תאים של אזור nephrogenic (בלנק et al. 2009). במחקר הראשוני, בסדרה של ניסויים כדי לאפיין את סוגי תאים מיוצג בקרב האוכלוסייה NZC נערכו. בקצרה, טיהור NZCs מן הכתבים גנטי stroma קליפת המוח (Foxd1 + / lacZ) (. Hatini et al, 1996), איסוף צינור (Hoxb7 + / cre; R26 rEYFP) (Srinivas et al, 2001;. Yu et al. , 2002), כובע mesenchyme (Bmp7 + / lacZ) (גודין et al., 1998) עולה כי כ -35% NZCs שנקטפו הם stroma קליפת המוח, 52% הם mesenchyme כובע וכי איסוף זיהום צינור מייצגת פחות מ 0.04%. Lineage סימון ניסויים באמצעות Bmp7 + / cre; R26 rEYFP זן (Oxburgh et al, 2004;.. Srinivas et al, 2001) הראה כי כ -10% NZCs עשוי להיות תאים של השושלת mesenchyme כובע כי יש הבדיל ואיבד Bmp7 הביטוי . מחקרים הכדאיות עם 7AAD הראו שיעור הישרדות NZCs מבודד של כ 95%. יש לנו חווה לאחרונה להצלחה הפרדת subpopulations בתוך התא זרימה NZCs באמצעות מיון cytometric. עם זאת, מיעוט של הממברנה הקשורים סמנים ספציפיים לכל אחד subpopulations אזור nephrogenic הגבילה ניתוחים אלו, ותאי רק כעת נגזר עכברים שנשאו גנים סמן פלואורסצנטי אינו ריאלי. היעילות של פרוטוקול זה תלוי במידה רבה על מהירות בשלב לנתח. שני תאים הישרדות היענות להגדיל את גורם לגירוי צמיחה כאשר הכליות להישאר HBSS לתקופות קצרות של זמן עד לעיכול אנזימטי. זמן ההכנה קצר יותר ולכן התוצאות הן כדאיות התא גבוהה תגובה חזקה יותר. יתר על כן, יש להקפיד בעת הסרת supernatant אחרי ספינינג ההשעיה תא כמו תא גלולה מופר בקלות שגורם לאובדן התא משמעותי. מאז עבודתו הראשונית של קליפורד Grobstein המתאר תרבות איברים עובריים (Grobstein, 1953a; Grobstein, 1953b), הכליה כבר מערכת מודל organogenesis ויחסי הגומלין בין תאים אפיתל mesenchymal בפיתוח. מחקרים אחרונים microanatomic ביטוי הגן חשפו המורכבות צפויות של סוגי תאים בתוך כל אלה תאים סלולריים (Brunskill et al., 2008), שיטות משלימות כגון תרבות NZC נדרשים כדי להבין את יחסי הגומלין בין תאים אלה במהלך nephrogenesis. המטרה הסופית של חקירה העיקרית שלנו היא להגדיר תא התנאים שבהם תאים אזור nephrogenic ניתן להרחיב ללא הגבלה הן עבור מחקרים nephrogenesis ו engraftment ב המבוגר במבחנה. מערכת תרבות NZC היא צעד חשוב לקראת מטרה זו, מחקרים מתמשכים במטרה במעבדה שלנו להגדיר את מנגנוני השליטה צמיחה בתאים אלה.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Watchmaker&#x2019;s forceps #5</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roboz</td>
<td>RS-4905</td>
<td>2 pairs required</td>
</tr>
<tr>
<td>Collagenase A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>10 103 578 001</td>
<td>Wear mask</td>
</tr>
<tr>
<td>Porcine Pancreatin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P8096</td>
<td>Wear mask</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS w/ Ca, Mg</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-513F</td>
<td>With Mg &amp; Ca</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioWhittaker</td>
<td>14-901E</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HBSS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>14175</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KSFM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco</td>
<td>10724-011</td>
<td>without added growth factors</td>
</tr>
<tr>
<td>L-Glutamine 200mM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7513</td>
<td>Use @ 1% v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P4333</td>
<td>Use @ 1% v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Fibronectin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>356008</td>
<td>Supplied as powder</td>
</tr>
<tr>
<td>24 well culture plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific </td>
<td>142485</td>
<td>Nunclon</td>
</tr>
<tr>
<td>DPBS w/o Mg &amp; Ca</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>17-512F</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5mL polystyrene tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>352235</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNase (1 U/&mu;l)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18068-015</td>
<td>4 &mu;l per 1.5 ml</td>
</tr>
<tr>
<td>40 micron cell-strainer </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>352235</td>
<td>w/cap and tube</td>
</tr>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6148</td>
<td>Use @ 4 % w/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Triton X100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>VW3929-2</td>
<td>Use @ 0.3 % v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P3813</td>
<td>Supplied as powder</td>
</tr>
<tr>
<td>Donkey serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>017-000-121</td>
<td> Use @ 5 % v/v</td>
</tr>
<tr>
<td>Rabbit anti-PAX2 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>71-6000</td>
<td>Dilute 1:100</td>
</tr>
<tr>
<td>Rabbit anti-&beta;-gal</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MP Biomedicals</td>
<td>559762</td>
<td>Dilute 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>Oregon Green 488 phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>O7466</td>
<td>Dilute 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A10042</td>
<td>Dilute 1:200</td>
</tr>
<tr>
<td>DAPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>D1306</td>
<td>Dilute 1:5000</td>
</tr>
<tr>
<td>Vectashield</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycerol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>EMD</td>
<td>GX0185-6</td>
<td>Mix 50 % with H2O</td>
</tr>
<tr>
<td>RNeasy Micro Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>74004</td>
<td>Use "DNase on column" protocol</td>
</tr>
<tr>
<td>Transfer pipettes, 3ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Falcon</td>
<td>357575</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and culture of cells from the nephrogenic zone of the embryonic mouse kidney

ההתפתחות העוברית של הכליה, נחקרה בהרחבה הן כמודל עבור אינטראקציה אפיתל-mesenchymal ב organogenesis ולקבל בהבנה את מקורותיה של מחלת כליות מולדת. לאחרונה, האפשרות של היגוי נאיבי בתאי גזע עובריים כלפי גורלם nephrogenic נחקר בתחום המתפתח של רפואה רגנרטיבית. מחקרים גנטיים בעכברים זיהו מסלולים מספר הדרושים לפיתוח כליות, קטלוג עולמי של שעתוק הגנים באיבר לאחרונה שנוצר <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a> , מתן הרגולטורים מועמד רבים של פונקציות התפתחותי חיוני. Organogenesis של הכליה מכרסם ניתן ללמוד בתרבות איברים, ודוחות רבים השתמשו בגישה זו כדי לנתח את התוצאות של יישום או חלבונים מועמד או מפילה את הביטוי של גנים מועמדים באמצעות siRNA או morpholinos. עם זאת, תחולתה של התרבות איבר ללימוד איתות המווסת גזע / תא אב בידול מול חידוש בכליות פיתוח מוגבלת איברים בתרבית מכילים דיפוזיה קומפקטי תאי מטריקס מגבילים של מקרומולקולות חלקיקי הנגיף. כדי לחקור את תא האיתות אירועים המשפיעים על גזע / תא נישה אבי בכליות פיתחנו מערכת תא העיקרי קובע את אזור nephrogenic או תא נישה ובתאים של vivo פיתוח כליה לשעבר במנותק inducer אפיתל של בידול. באמצעות עיכול אנזימטי מוגבל, תאים אזור nephrogenic יכול להיות משוחרר באופן סלקטיבי מלפתח הכליות ב E17.5. לאחר סינון, התאים האלה יכול להיות מתורבת כמו monolayer סדיר באמצעות תנאים אופטימיזציה. הגן ניתוח מרקר מוכיח כי תרבויות אלה מכילים חלוקה של סוגי תאים האופייניים לאזור nephrogenic in vivo, וכי הם שומרים על ביטוי הגן המתאים סמן בתקופת התרבות. תאים אלה הם נגישים מאוד מולקולה קטנה וטיפול חלבון רקומביננטי, והוא חשוב גם התמרה ויראלית, אשר מאוד מקלה את המחקר של גזע / אבי מועמד תופעות תא הרגולטור. הפרמטרים של תא ביולוגי בסיסי כגון התפשטות מוות של תאים, כמו גם שינויים בביטוי של סמנים מולקולריים האופייניים נפרון גזע / ובתאים in vivo יכול לשמש בהצלחה גם תוצאות הניסוי. העבודה השוטפת במעבדה שלנו באמצעות טכניקה זו הרומן תא ראשוני שמטרתו לחשוף את המנגנונים הבסיסיים הקובעים את הרגולציה של התחדשות עצמית לעומת הבחנה נפרון גזע / ובתאים.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney at JoVE.com

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

בדו&quot;ח זה אנו מתארים שיטה לבידוד והתרבות של נישה הקדמון התא הכליות עכבר עובריים שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד מסלולי איתות ויסות גזע / ובתאים של הכליה המתפתחת. אלו תאים בתרבית נגישים מאוד מולקולה קטנה וטיפול חלבון רקומביננטי, והוא חשוב גם התמרה ויראלית, המאפשרת מניפולציה יעילה של המסלולים מועמד.

בידוד והתרבות של תאים מאזור nephrogenic של הכליה עכבר עובריים

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

isolation-culture-cells-from-nephrogenic-zone-embryonic-mouse

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

18.0K Views.  Maine Medical Center Research Institute. בדו"ח זה אנו מתארים שיטה לבידוד והתרבות של נישה הקדמון התא הכליות עכבר עובריים שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד מסלולי איתות ויסות גזע / ובתאים של הכליה המתפתחת. אלו תאים בתרבית נגישים מאוד מולקולה קטנה וטיפול חלבון רקומביננטי, והוא חשוב גם התמרה ויראלית, המאפשרת מנ...

Video: Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

בידוד גזירת תאים עובריים בעכבר ז&#39;רמינל

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation and Culture of Avian Embryonic Valvular Progenitor Cells

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of endocardium surrounded by myocardium. The myocardium secretes cardiac jelly, a hyaluronan-rich gelatinous matrix, into the atrioventricular (AV) junction and outflow tract (OFT) lumen. At stage HH14 valvulogenesis begins when a subset of endocardial cells receive signals from the myocardium, undergo endocardial to mesenchymal transformation (EMT), and invade the cardiac jelly. At stage HH25 the valvular cushions are fully mesenchymalized, and it is this mesenchyme that eventually forms the valvular and septal apparatus of the heart. Understanding the mechanisms that initiate and modulate the process of EMT and cell differentiation are important because of their connection to serious congenital heart defects. In this study we present methods to isolate pre-EMT endocardial and post-EMT mesenchymal cells, which are the two different cell phenotypes of the prevalvular cushion. Pre-EMT endocardial cells can be cultured with or without the myocardium. Post-EMT AV cushion mesenchymal cells can be cultured inside mechanically constrained or stress-free collagen gels. These 3D in vitro models mimic key valvular morphogenic events and are useful for deconstructing the mechanisms of early and late stage valvulogenesis.

This article will provide a method for isolating and culturing quail or chicken HH14- valve endocardial cells and HH25 valve cushion mesenchymal cells.

בידוד והתרבות של תאים עובריים העופות אבי valvular

Proper formation and function of embryonic heart valves is critical for developmental progression. The early embryonic heart is a U-shaped tube of ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

בידוד של גזע תאים רשתית העין של העכבר

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

בידוד והתרבות של תאי גזע השיניים אפיתל ממבוגרי העכבר הארקטיק

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

בידוד של תאי Murine Valve האנדותל

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

בידוד חלבון מהעכבר עוברי שסתום לב אזור פיתוח

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina propria. EGCs play important roles in gut homeostasis through the release of various trophic factors and contribute to the integrity of the epithelial barrier. Most studies of primary enteric glial cultures use cells isolated from the myenteric plexus after enzymatic dissociation. Here, a non-enzymatic method to isolate and culture EGCs from the intestinal submucosa and lamina propria is described. After manual removal of the longitudinal muscle layer, EGCs were liberated from the lamina propria and submucosa using sequential HEPES-buffered EDTA incubations followed by incubation in commercially available non-enzymatic cell recovery solution. The EDTA incubations were sufficient to strip most of the epithelial mucosa from the lamina propria, allowing the cell recovery solution to liberate the submucosal EGCs. Any residual lamina propria and smooth muscle was discarded along with the myenteric glia. EGCs were easily identified by their ability to express glial fibrillary acidic protein (GFAP). Only about 50% of the cell suspension contained GFAP+ cells after completing tissue incubations and prior to plating on the poly-D-lysine/laminin substrate. However, after 3 days of culturing the cells in glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)-containing culture media, the cell population adhering to the substrate-coated plates comprised of &#62;95% enteric glia. We created a hybrid mouse line by breeding a hGFAP-Cre mouse to the ROSA-tdTomato reporter line to track the percentage of GFAP+ cells using endogenous cell fluorescence. Thus, non-myenteric enteric glia can be isolated by non-enzymatic methods and cultured for at least 5 days.

Here, we describe the isolation of enteric-glial cells from the intestinal-submucosa using sequential EDTA incubations to chelate divalent cations and then incubation in non-enzymatic cell recovery solution. Plating the resultant cell suspension on poly-D-lysine and laminin results in a highly enriched culture of submucosal glial cells for functional analysis.

בידוד תאי גליה המעית מן Submucosa פרופריה. מוסקולריס של העכבר למבוגרים

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. While isolating myocytes from neonatal mouse hearts is relatively straightforward, myocytes from the adult murine heart are preferred. This is because compared to neonatal cells, adult myocytes more accurately recapitulate cell function as it occurs in the adult heart in vivo. However, it is technically difficult to isolate adult mouse cardiac myocytes in the necessary quantities and viability, which contributes to an experimental impasse. Furthermore, published procedures are specific for the isolation of either atrial or ventricular myocytes at the expense of atrial and ventricular non-myocyte cells. Described here is a detailed method for isolating both atrial and ventricular cardiac myocytes, along with atrial and ventricular non-myocytes, simultaneously from a single mouse heart. Also provided are the details for optimal cell-specific culturing methods, which enhance cell viability and function. This protocol aims not only to expedite the process of adult murine cardiac cell isolation, but also to increase the yield and viability of cells for investigations of atrial and ventricular cardiac cells.

A method is described for the simultaneous isolation of myocytes and non-myocytes from both the atria and ventricles of a single adult mouse heart. This protocol results in consistent yields of highly viable cardiac myocytes and non-myocytes and details optimal cell-specific culture conditions for phenotyping and in vitro analysis.

בידוד ותרבות בו זמנית של מיוציטים פרך, מיוציטים חדריים, ולא מיוציטים מלב עכבר בוגר

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...